CN103275968A

CN103275968A - 一种快速提取棉花单粒种子dna的方法

Info

Publication number: CN103275968A
Application number: CN2013101630827A
Authority: CN
Inventors: 刘国栋; 王芙蓉; 张军; 张景霞; 张传云
Original assignee: Shandong Cotton Research Center
Current assignee: Shandong Cotton Research Center
Priority date: 2013-05-06
Filing date: 2013-05-06
Publication date: 2013-09-04

Abstract

本发明提供了一种快速提取棉花单粒种子DNA的方法，属于分子生物技术领域。本发明选用萌动的单粒棉种种仁作为DNA提取材料，直接在裂解液中打碎、裂解，经过多次离心、沉淀，提取得到棉花种子DNA。该方法操作简便，可快速进行大批量DNA提取，耗时少、提取过程中减少化学试剂的使用，减少了污染，适用于利用SSR标记快速鉴定棉花品种纯度过程中DNA样品的获得。

Description

一种快速提取棉花单粒种子DNA的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种快速提取棉花单粒种子DNA的方法。

背景技术

近年来，分子标记技术越来越广泛地应用于作物种子纯度及品种真实性检测研究中，而影响分子标记鉴定效率的瓶颈是DNA的提取。棉花分子纯度检测中，一般是从棉株叶片中提取DNA样品，由于棉花幼苗培养周期较长，所以利用叶片提取DNA的方法不能满足于商业化生产中棉花种子纯度快速鉴定的要求。而直接利用种子提取DNA无疑将会缩短种子纯度检测的时间，但作物种子中富含蛋白、淀粉等物质，因而增加了DNA提取的困难。棉花种子除富含蛋白外，还含有棉酚、多糖、单宁等次生代谢物，这些代谢物在细胞破裂时容易氧化，且氧化后与蛋白质、核酸等发生不可逆反应，形成棕色胶状复合物，因此棉花种子DNA提取的步骤较其他作物更为复杂。随着植物DNA提取技术的不断发展，种子DNA提取技术也在逐步完善。传统的棉花种子DNA提取方法包括组织破碎、细胞裂解、去除蛋白质及RNA等杂质、沉淀DNA、漂洗DNA和溶解等六个步骤。该方法应用于棉花种子纯度的快速鉴定尚存在以下不足之处：（1）传统方法破碎种子主要通过液氮研磨、粉碎器粉碎等方法，由于种子器官较叶片硬，破碎比较困难，而且一次只能处理一粒种子，操作时间较长，且易交叉污染；（2）细胞裂解环节一般包括提取缓冲液预处理和裂解缓冲液裂解两个步骤，过程繁琐；（3）去除蛋白等杂质过程中选用苯酚和氯仿等有机溶剂，易造成环境污染并且有损操作者健康。

种子商业化生产需要对种子纯度进行快速准确地鉴定，分子标记技术为实现种子纯度的快速检测提供了技术支撑。而分子检测中简化DNA提取过程是快速鉴定种子纯度的关键，目前适合于棉花种子纯度检测的DNA快速提取方法研究还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单、安全、快速的提取棉花种子DNA的方法，以解决传统方法中棉花种子DNA提取过程繁琐、耗时较长的问题，满足种子纯度快速鉴定的需要。

本发明提供一种提取棉花单粒种子DNA的方法，包括以下步骤：

1）将棉花种子于水中浸泡至种仁松软后，剥掉种皮，得到萌动松软的种仁；

2）将步骤1）得到的种仁加入裂解缓冲液中，粉碎；

3）水浴、离心、取上清液，加入异丙醇，混匀；

4）离心，用乙醇洗涤沉淀，干燥；

5）加双蒸水溶解，再次离心，取上清液，得到。

其中，步骤2）的裂解缓冲液，其成分为2%CTAB，0.02mol/LEDTA，1.4mol/L NaCl，0.1mol/LTris-HCl（pH=7.5），2%PVP，1%β-巯基乙醇。

步骤2）的裂解缓冲液的加入量为700μl。

本发明方法中，步骤3）60-65℃水浴10-30min，振荡2-3次。

步骤3）离心条件为10000-12000r/min离心5-10min。

步骤3）上清液中加0.6-1倍体积预冷的异丙醇。

本发明方法中，步骤4）12000r/min离心2min，倒掉上清液，沉淀中加入1ml70%乙醇洗涤沉淀，空气中干燥。

步骤5）中加入200μl双蒸水。

步骤5）中，加入双蒸水溶解30min-2h，12000r/min离心1min。

步骤5）中，取150μl上清液，得到DNA提取样品。

本发明提供了上述方法在棉花品种分子标记中的应用。

本发明DNA提取材料选用萌动的种仁。种仁直接在裂解液中打碎、裂解，省去了提取液预处理。裂解离心后直接用异丙醇沉淀DNA，省略了苯酚：氯仿：异戊醇去除蛋白质步骤，不使用有毒试剂，既保护了操作者又降低了实验成本，最主要的是大大提高了DNA提取速度。本发明方法提取棉花种子DNA，所用时间短，操作简单，且提取效率高。与现有的棉花种子DNA提取方法相比，本发明提供的方法能快速的提取DNA，能同时满足快速和高效两个方面，因此能够更好的配合分子标记技术进行棉花种子纯度检测。

附图说明

图1为提取DNA时DNA溶解时间对PCR扩增产物的影响；其中1-3：DNA样品溶解10min；4-6：DNA样品溶解30min；7-9：DNA样品溶解2h；10-12：DNA样品溶解24h。

图2为DNA稀释倍数对PCR扩增产物的影响；其中，1-4：DNA样品稀释20倍；5-8：DNA样品稀释30倍；9-12：DNA样品稀释35倍；13-16：DNA样品稀释40倍；17-20：DNA样品稀释45倍；21-24：DNA样品稀释50倍；25-28：DNA样品稀释80倍；29-32：DNA样品稀释100倍。

图3DNA样品溶解30min和DNA样品稀释35倍时的PCR扩增产物；其中1-24：鲁6269单粒种子DNA溶解30min、稀释35倍。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，实施例中所用的生化试剂均为市售。

以棉花品种鲁棉研37号和鲁6269为实验材料，通过具体实例对本发明做进一步的描述。具体实例统一采用10μl PCR扩增体系，具体组分及程序如下。取1.2μl PCR扩增后产物，用浓度为8%的非变性PAGE（聚丙烯酰胺凝胶）电泳检测。

PCR扩增反应体系：10×PCR Buffer1μl，10mM dNTP Mix0.2μl，SSR正、反向引物（10μmol/L）各0.6μl，5U Taq DNA聚合酶0.1μl，待测样品DNA2μl，ddH₂O6.6μl。

PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性40s，55℃退火45s，72℃延伸50s，循环35次；72℃延伸5min；4℃保存。

实施例1本发明方法提取DNA的溶解时间对PCR扩增的影响

（1）DNA提取

将鲁棉研37号种子室温条件下浸泡20小时待种仁松软后，选取12粒浸泡后的种子，剥掉种皮，将萌动的种仁放入12个2ml离心管中，每管再加入700μl裂解缓冲液。

裂解缓冲液（组成成分：2%CTAB，0.02mol/L EDTA，1.4mol/LNaCl，0.1mol/LTris-HCl（pH7.5），2%PVP，1%β-巯基乙醇），使用组织研磨仪进行粉碎。65℃水浴20min，间隔10min轻摇一次。12000r/min离心8min，取500μl上清液，加入0.7倍体积预冷的异丙醇，混合均匀，12000r/min离心2min，倒掉上清液，加入1ml70%乙醇洗涤沉淀，空气中干燥30min后，加入200μl双蒸水，用枪头搅匀使DNA溶解，DNA的溶解时间设定4个梯度，分别为：10min、30min、2h、24h。然后12000r/min离心1min，取150μl上清液，上清液即为DNA提取样品。

（2）PCR扩增

将上述DNA提取样品稀释35倍后，选用SSR引物NAU1048，取2μl DNA样品进行PCR扩增（PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性40s，55℃退火45s，72℃延伸50s，循环35次；72℃延伸5min；4℃保存），用浓度为8%的非变性PAGE（聚丙烯酰胺凝胶）电泳检测PCR扩增产物。

（3）结果检测

由图1可知，PCR扩增产物受到DNA溶解时间的影响，DNA溶解时间在30min以内时，样品的目标带较弱，DNA溶解时间在30min-2h之间时，样品有清晰的目标带，DNA溶解时间在24h后，样品的目标带不清晰。说明该方法提取DNA的质量受DNA溶解时间的影响较大，其PCR扩增产物在DNA溶解30min-2h之间时目标带最清晰。

实施例2本发明方法提取的DNA样品的稀释倍数对PCR扩增的影响

（1）DNA提取

将鲁棉研37号的干种子泡在水中，室温条件下浸泡20小时种仁松软后，选取12粒种子，剥掉种皮，将萌动的种仁放入12个2ml离心管中，每管再加入700μl裂解缓冲液（组成成分：2%CTAB，0.02mol/L EDTA，1.4mol/L NaCl，0.1mol/LTris-HCl，2%PVP,1%β-巯基乙醇），粉碎。60℃水浴25min，间隔10min左右轻摇一次。10000r/min离心9min，取500μl上清液，加入0.8倍体积预冷的异丙醇，混合均匀，12000r/min离心2min，倒掉上清液，加入1ml70%乙醇洗涤沉淀，空气中干燥30min后，加入200μl双蒸水，用枪头搅匀使DNA溶解，DNA溶解30min后。12000r/min离心1min，取150μl上清液，上清液即为DNA提取样品。

（2）PCR扩增

将上述DNA提取样品分别稀释：20倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、80倍和100倍。（用倍数表示浓度就是为了省掉检测浓度这个步骤，从而提高PCR检测的速度。）取2μl上述不同稀释倍数的DNA样品进行PCR扩增，选用SSR引物NAU1048，用浓度为8%的非变性PAGE（聚丙烯酰胺凝胶）电泳检测PCR扩增产物（PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性40s，55℃退火45s，72℃延伸50s，循环35次；72℃延伸5min；4℃保存）。

（3）结果检测

由图2可知，PCR扩增产物受DNA样品稀释倍数的影响较小，DNA样品的稀释倍数从20倍到100倍均能得到较好的目标带，且DNA样品的稀释倍数为30-40倍时，目标带最清晰。DNA样品的稀释倍数在20-100倍时，PCR扩增产物在样品间的差异不显著，稀释倍数为30-40倍时样品目标带最清晰，稀释倍数为20-100倍时，均能得到较好的目标带。因此，说明该方法提取的DNA有很宽的浓度适应范围（稀释20倍-100倍），足以保证该方法的实用性和可行性。

实施例3本发明方法在PCR检测中的应用

（1）DNA提取

将鲁6269的干种子室温条件下浸泡20小时，选取24粒种子，剥掉种皮，将萌动的种仁放入24个2ml离心管中，再加入700μl裂解缓冲液（组成成分：2%CTAB，0.02mol/L EDTA，1.4mol/L NaCl，0.1mol/LTris-HCl，2%PVP，1%β-巯基乙醇），在组织研磨仪上粉碎。65℃水浴20min，间隔10min左右轻摇一次。12000r/min离心6min，取500μl上清液，加入0.7倍体积预冷的异丙醇，混合均匀，12000r/min离心2min，倒掉上清液，加入1ml70%乙醇洗涤沉淀，空气中干燥30min后，加入200μl双蒸水，用枪头搅匀使DNA溶解，DNA溶解30min后，12000r/min离心1min，取150μl上清液，上清液即为DNA提取样品。

（2）PCR扩增

将上述DNA提取样品稀释35倍后，取2μl DNA模板进行PCR扩增，选用SSR引物NAU1048，用浓度为8%的非变性PAGE（聚丙烯酰胺凝胶）电泳检测PCR扩增产物（PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性40s，55℃退火45s，72℃延伸50s，循环35次；72℃延伸5min；4℃保存。）。（根据前面确定的步骤提取的DNA稀释35倍时，PCR扩增效果较好。）

（3）结果检测

由图3可知，所有PCR扩增产物均显示很清晰的目标带。所有DNA样品的PCR扩增产物均较清晰，DNA样品溶解30min，DNA样品稀释35倍，能保证得到较好的PCR扩增产物。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种提取棉花单粒种子DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将棉花种子于水中浸泡至种仁松软后，剥掉种皮，得到萌动的松软种仁；

2）将步骤1）得到的种仁加入裂解缓冲液中，粉碎；

3）水浴、离心、取上清液，加入异丙醇，混匀；

4）离心，用乙醇洗涤沉淀，干燥；

5）加双蒸水溶解，再次离心，取上清液，得到。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）的裂解缓冲液，其成分为2%CTAB，0.02mol/L EDTA，1.4mol/L NaCl，0.1mol/LTri-HCl，pH=7.5，2%PVP，1%β-巯基乙醇。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）的裂解缓冲液的加入量为700μl。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）60-65℃水浴10-30min，期间振荡2-3次。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）离心条件为10000-12000r/min离心5-10min。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）上清液中加0.6-1倍体积预冷的异丙醇。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4）12000r/min离心2min，倒掉上清液，沉淀中加入1ml70%乙醇洗涤沉淀，空气中干燥。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5）中加入200μl双蒸水。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5）中加入双蒸水溶解30min-2h，12000r/min离心1min。

10.权利要求1～9任一所述的方法在棉花品种分子标记中的应用。