CN104404030B - 一种快速提取植物基因组dna的试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，通过对传统CTAB法提取基因组的方法进行了优化而开发了一种适用于PCR扩增的通用型快速提取植物基因组DNA的试剂盒及方法，可用于多种植物基因组DNA的快速提取，满足植物分子生物学和遗传学的研究及转基因农作物的快速鉴定。试剂盒的组成包括：平衡液、裂解液、DNA结合液、DNA洗涤液、DNA洗脱液、DNA吸附柱。本发明利用硅基质与DNA在不同盐离子浓度和PH条件下的结合程度不同从而达到分离、纯化DNA的目的。本方法操作快速、简单，15min就能完成DNA的提取，提取过程中无需酚、氯仿抽提，避免了有机溶剂的污染，采用本发明方法提取的DNA对于300‑4500bp的植物内源基因和外源转入基因均有良好的扩增效果。

Description

一种快速提取植物基因组DNA的试剂盒及方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，通过对传统CTAB法提取基因组的方法进行了优化而开发了一种适用于PCR扩增的通用型快速提取植物基因组DNA的试剂盒及方法，可用于多种植物基因组DNA的快速提取，满足植物分子生物学和遗传学的研究及转基因农作物的快速鉴定。

背景技术

自1994年世界上首例转基因植物产品——耐储藏转基因番茄在美国获准商业化生产，投放市场以来，由于转基因作物和转基因食品在作物抗逆性或食物营养价值和风味的改善等方面具有传统食品无可比拟的优势，而迅速席卷全球。根据国际农业生物技术应用服务组织（ISAAA）的报告，2012年全球转基因农作物种植面积为1.7亿公顷，相当于中国的全部耕地面积，涉及到的改良性状主要有生长发育、品质改良、产量潜力、抗除草剂、抗病、抗虫、抗逆境等。据Cropnosis公司估计，2012年转基因作物的市场价值将达到150亿美元，到2015年将有40个国家的2000万农民种植转基因作物，种植面积将达2亿公顷（CJames. 2012. Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2012. ISAAABrief No. 44. ISAAA: Ithaca, NY）。转基因作物的推广应用在带来巨大的社会经济效益的同时，转基因产品的安全性也引起了人们的极大关注。包括中国在内的很多国家要求企业在产品包装上对转基因食品进行“强制性标识”，让消费者拥有获悉食品是否为转基因食品的知情权，以便消费者可以自主选择是否购买、食用转基因食品，鉴于此，国家和食品监督机构对转基因食品的检测显得尤为重要。

转基因食品的检测可以在核酸和蛋白水平上，PCR作为一种在短时间内能够快速、灵敏、准确地扩增出转基因食品中特定外源基因的核酸检测法，被广泛地应用于转基因农作物和食品的检测中。然而DNA样品制备的速度和质量是PCR检测方法的主要限速因素。传统的基因组DNA提取方法如CTAB法和SDS法（JJ Doyle等. 1987. A rapid DNA isolationprocedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin19, 11–15; D Goldenberger等. 1995. A simple “universal”DNA extractionprocedure using SDS and proteinase K is compatible with direct PCRamplification. Genome Research 4, 368–370），多是采用离子型表面活性剂（CTAB法和SDS）裂解样品细胞，使基因组释放出来，再通过苯酚/氯仿/异戊醇的多次抽提去除蛋白，最后经过异丙醇或者乙醇沉淀得到纯度高、完整性好的DNA分子。该传统方法中，存在反复离心、沉淀的步骤，操作繁琐且耗时长，整个基因组提取过程需要2-3h。而药品中苯酚、氯仿和异戊醇的使用，一方面存在一定毒性，对操作人员可能造成一定伤害；另一方面可能导致有机溶剂残留在基因组样品中从而造成下游试验无法顺利进行，这些因素严重影响了实验进度，显然不能满足快速检测的需要。

碱裂解法（H Wang等. 1993. A simple method of preparing plant samplesfor PCR. Nucleic Acids Research 21, 4153–4154〕直接利用NaOH溶液使细胞膜溶解，蛋白变性，释放基因组DNA，再经过TE缓冲液稀释中和之后，就得到了DNA溶液，可直接用于PCR扩增，是目前最为常见的快速简便提取基因组DNA的方法。但得到的DNA由于不经过任何纯化处理，含量和纯度都很低，含有大量色素，蛋白质，多糖等可能抑制PCR反应的杂质，并且由于NaOH会打断DNA片段，所以该方法扩增的上限为1000bp左右的基因，而对于较长的基因而言，这种提取方法显然不适用。

目前市场上出现了多种商品化的植物基因组提取纯化试剂盒，常见的有北京康为世纪生物科技有限公司植物基因组DNA提取试剂盒(CW0553)、Biomega公司提DNA试剂盒、北京全式金生物技术有限公司快速提取植物gDNA试剂(AD301)、QIAGEN公司的DNeasy PlantMini Kit(69104)、Omega BioTek公司的Plant DNA Mini Kit(D3485)、美国MOBIO强力植物DNA提取试剂盒Power Plant^TM DNA Isolation Kit(13200-50)等。不同的植物DNA提取试剂盒，分离原理也不同。有的利用核酸的分子量差异分离DNA，有的利用特异性基质与DNA结合从而达到分离DNA的目的，如磁珠、离子交换柱等。虽然DNA提取试剂盒包含提取植物DNA所需的试剂和必要的耗材，操作简单，但其价格昂贵且提取量较少；有些公司开发的试剂盒同样会用到氯仿等有机试剂，无法避免有机溶剂的污染问题。而且，比如全式金快速提取植物gDNA试剂的说明书上写明其扩增上限是2000bp，说明其无法保证基因组的完整性，对大片段基因PCR扩增的限制作用较为明显。

针对上述不足，迫切需要一种快速、简便、高效、经济、通用性较好且能保证基因组完整性的DNA提取方法。

发明内容

鉴于上述背景，本发明提供了一种快速、高效提取植物基因组DNA的试剂盒及方法。

本发明首先提供了一种快速提取植物基因组DNA的试剂盒，其组成包括：

（1）Balance Buffer（平衡液）：2mM Tris-HCl，pH 13.00；

（2）Lysis Buffer（裂解液）：10% CTAB；

（3）DNA Binding Buffer（DNA结合液）：5.0M盐酸胍，30%异丙醇；

（4）Wash Buffer（DNA洗涤液）：20mM NaCl，20mM Tris-HCl，80% ethanol，pH 7.5；

（5）Elution Buffer（DNA洗脱液）：20μg/ mL的RNA酶，10mM Tris-HCl，pH 8.5；

（6）DNA吸附柱。

所述的铝盒和小钢珠购自市场，DNA吸附柱为硅胶柱。

本发明还提供了利用所述试剂盒快速提取植物DNA的方法，依次包括以下步骤：

(1)向DNA吸附柱中加200μl Balance Buffer，12000rpm离心30S，对柱子进行预处理，以增加其与DNA的结合率；

(2)取30-50mg植物组织放到2ml的EP管中，加入2粒灭菌的小钢珠；

(3)将上述样品直接放入液氮中，待植物组织冻硬后立即捞出放入铝盒，盖上盖，快速振摇数下；

(4)重复步骤(3) 2-3次使植物组织研磨彻底；

(5)加入65℃预热的100μl Lysis Buffer，轻柔颠倒混匀2min；

(6)随后加入600μl Binding Buffer，轻柔颠倒混匀；

(7) 将EP管倒过来盖子向下，在盖子下压上一块磁铁，再轻轻翻过来使小钢珠被吸到盖子上，压着磁铁开盖，将小钢珠弹入回收盒中（钢珠洗净灭菌后可重复使用）；

(8) 将步骤(7)中的混合液，室温12,000rpm离心1min；

(9) 取上清液加到Balance Buffer预处理过的DNA吸附柱中，室温12,000rpm离心30S，弃收集管中的液体；

(10) 向DNA吸附柱中加入300μl Binding Buffer，室温12,000rpm离心30S，弃收集管中的液体；

(11) 向DNA吸附柱中加入650μl Wash Buffer，室温12,000rpm离心30S，弃收集管中的液体；

(12) 重复步骤(11)；

(13) 室温12,000rpm离心2min；

(14) 将DNA吸附柱转移到新的1.5ml EP管中，加入65℃预热的Elution Buffer30μl，室温静置2min；

(15) 12,000rpm离心1min，即得到DNA样品。

本发明利用硅基质与DNA在不同盐离子浓度和PH条件下的结合程度不同从而达到分离、纯化DNA的目的。本方法操作快速、简单，15min就能完成DNA的提取，提取过程中无需酚、氯仿抽提，避免了有机溶剂的污染，且后期PCR扩增结果显示，采用本发明方法提取的DNA对于300-4500bp的植物内源基因和外源转入基因均有良好的扩增效果。从而解决了现有提取技术耗时长、使用有毒的有机试剂、提取的DNA片段较短等问题，以满足植物原材料尤其是转基因作物快速分子检测的需要。

本发明的优点和有益效果为：

(1) 在组织破碎步骤中，用小钢珠取代了研磨杆或研钵研磨，降低了实验耗时和成本，在大幅度降低操作人员工作量的同时提高了工作效率。使用小钢珠配套2mL离心管（eppendorf管）进行研磨，同时兼顾了研磨和水浴操作，省去了原来液氮研磨过程中转移材料和洗涤研钵的操作；

(2) 本发明使用CTAB作为裂解液，与碱裂解法相比可以更好的保持基因组的完整性，可扩增到更长的基因片段；同时，较常规的CTAB法相比，CTAB的用量增加了5倍，即由2%增加至10%，可更好的针对次生代谢产物多的植物样品；

(3) 在DNA分离纯化过程中，本发明使用了硅胶柱，并且增加了柱子的预处理步骤和加大了DNA结合液的使用量，可明显增加硅胶柱与DNA的结合率；另外，通过优化洗涤液的配方，一方面可以充分的去除蛋白、多糖等其他的杂质，另一方面由于不使用苯酚、氯仿等有机试剂，可避免其对操作人员造成的毒害和有机试剂的残留对下游试验的抑制作用；

(4) 在DNA洗脱的步骤中，通过65℃预热Elution Buffer，来加快分子的热运动，使DNA分子更容易与硅胶柱分离，最大程度的保证DNA的洗脱效率。

本发明操作简单、速度快，仅15min就可以完成样品的提取，提取到的基因组更加完整且纯度高，能更好地满足分子生物学的需求。经PCR检测发现，本发明提取的基因组对植物内源基因和外源基因均有良好的扩增效果，且与传统碱裂解法相比，明显提高了对于大片段基因的检测效率，对于4500bp的基因，仍可以得到令人满意的实验结果（图6）。

附图说明

图1为使用本发明的方法提取的多种植物基因组DNA电泳图谱。图中样品依次为：M，全式金公司Transmitted 15K DNA Marker；1，木瓜；2，马铃薯；3，甜菜；4，西红柿； 5，油菜；6，水稻；7，黄瓜；8，玉米；9，大豆。

图2为多种植物基因组叶绿体23S rDNA的扩增结果。图中样品依次为：M，天根公司DNA DL2,000 Marker；1，甜菜；2，油菜；3，木瓜；4，大豆；5，马铃薯；6，西红柿；7，黄瓜；8，玉米；9，水稻；10，空白对照。

图3为六种方法提取的基因组DNA电泳图谱。图中样品依次为：M，全式金公司Transmitted 15K DNA Marker；1，CTAB法提取的基因组DNA；2，SDS法提取的基因组DNA；3，碱裂解法提取的基因组DNA；4，本方法提取的基因组DNA；5，Biomega公司提DNA试剂盒方法提取的基因组DNA；6，康为公司提DNA试剂盒方法提取的基因组DNA。

图4为六种方法提取的基因组DNA 560bp目的片段的扩增结果。图中样品依次为：M，天根公司Marker Ⅲ；1，空白对照；2-4，CTAB法为模板PCR产物；5-7，SDS法为模板PCR产物；8-10，碱裂解法为模板PCR产物；11-13，本方法为模板PCR产物；14-16，Biomega公司DNA提取试剂盒方法为模板PCR产物；17-19，康为公司DNA提取试剂盒方法为模板PCR产物。

图5为六种方法提取的基因组DNA 2000bp目的片段的扩增结果。图中样品依次为：M，天根公司Marker Ⅲ；1，空白对照；2-4，CTAB法为模板PCR产物；5-7，SDS法为模板PCR产物；8-10，碱裂解法为模板PCR产物；11-13，本方法为模板PCR产物；14-16，Biomega公司DNA提取试剂盒方法为模板PCR产物；17-19，康为公司DNA提取试剂盒方法为模板PCR产物。

图6为六种方法提取的基因组DNA 4500bp目的片段的扩增结果。图中样品依次为：M，天根公司Marker Ⅲ；1，空白对照；2-4，CTAB法为模板PCR产物；5-7，SDS法为模板PCR产物；8-10，碱裂解法为模板PCR产物；11-13，本方法为模板PCR产物；14-16，Biomega公司DNA提取试剂盒方法为模板PCR产物；17-19，康为公司DNA提取试剂盒方法为模板PCR产物。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明进一步说明，只是为清楚地说明本发明所作的举例，不应理解为对本发明的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换仍处于本发明的保护范围之中。

实施例1

采用本发明的方法提取不同农作物的基因组DNA

目前，批准的商业化转基因农作物有大豆、玉米、油菜、甜菜、马铃薯、水稻、西红柿、黄瓜、番木瓜等等。作为一种适用于检测转基因产品的快速植物基因组制备方法，我们希望这种方法，可以具有普适性，因此，我们选择了目前批准商业化的转基因农作物作为我们的检测对象。

具体步骤如下：

一、不同农作物基因组DNA的提取

(1) 转基因大豆、玉米、水稻、马铃薯叶片为本实验室保存；油菜、甜菜、西红柿、黄瓜、番木瓜购自永辉超市，取可食用部分，放入2ml的EP管中，加入2粒灭菌的小钢珠后直接放入液氮中，待植物组织冻硬后立即捞出放入铝盒，盖上盖，快速振摇数下；重复此步骤2-3次使植物组织研磨彻底；

(2) 加入65℃预热的100μl Lysis Buffer [Lysis Buffer（裂解液）：10% CTAB]，温育2min，期间轻柔颠倒混匀；

(3) 加入600μl Binding Buffer [DNA Binding Buffer（DNA结合液）：5.0M盐酸胍，30%异丙醇]，轻柔颠倒混匀；

(4) 向DNA吸附柱中加200μl Balance Buffer [Balance Buffer（平衡液）：2mMTris-HCl，pH 13.00]，12000rpm离心30S，对柱子进行预处理；

(5) 将步骤(3)中的混合液，室温12,000rpm离心1min；

(6) 取上清液加到预处理过的硅胶柱中，室温12,000rpm离心30S，弃收集管中的液体；

(7) 向硅胶柱中加入300μl Binding Buffer，室温12,000rpm离心30S，弃收集管中的液体；

(8) 向硅胶柱中加入650μl Wash Buffer [Wash Buffer（DNA洗涤液）：20mMNaCl，20mM Tris-HCl，80% ethanol，pH 7.5]，室温12,000rpm离心30S，弃收集管中的液体；

(9) 重复步骤(8)；

(10) 室温12,000rpm离心2min；

(11) 将硅胶柱转移到新的1.5ml EP管中，加入65℃预热的Elution Buffer 30μl[Elution Buffer（DNA洗脱液）：20μg/ mL RNA酶，10mM Tris-HCl，pH 8.5]，室温静置2min；

(12) 12,000rpm离心1min，即得到DNA样品。

二、PCR检测

根据植物叶绿体23S rDNA的序列，设计通用引物GFR，对提取的植物基因组进行PCR检测。

引物序列为：

GFR-F: 5’-AGTTGGTGAACTGATGACA-3’

GFR-R: 5’-GGTCTGACACAAGGTTAGA-3’

PCR扩增所用试剂购自TAKARA公司，反应的体系为：2.5μl 10×rTaq PCR Buffer(Mg²⁺ plus)，2.5μl MgCl₂ (25mM)，2μl dNTP mix (2.5mM each)，0.5μl GFR-F (10μM)，0.5μl GFR-R (10μM)，1μl不同样品的DNA，0.2μl rTaq Polymerase，PCR-Grade H2O补足体积（总体积25μl）。

PCR反应的条件为：94℃ 7min → [94℃ 30s → 56℃ 30s → 72℃ 30s] ×35cicles → 72℃ 10min → 4℃。

三、琼脂糖凝胶电泳分析

基因组DNA和PCR扩增产物分别用0.8%和1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测，上样缓冲液为10×LoadingBuffer，电泳缓冲液为1×TAE，分子量标准Marker为DL2, 000，EB染色，紫外凝胶成像仪在312nm下观察并拍照。

结果表明，以本发明的方法提取上述样品，均能得到电泳可见的基因组（图1）；用通用引物GFR扩增叶绿体23S rDNA，所有样品都能获得大小约为360bp的目的条带且亮度差异不大（图2）。由此可见，本发明方法可用于市面上常见转基因农产品的检测，不论是新鲜的植物组织（如油菜、西红柿）还是淀粉（如马铃薯、大米）、蛋白（如大豆）含量较多的样品都可以达到良好的检测效果，具有广泛的适用性。

实施例2

采用本发明的方法与实验室常见方法提取的基因组DNA的对比

在实施例1中所扩增的基因为约360bp的植物内标基因，因此有较好的扩增效果，然而对于较大的外源基因，本发明方法是否有自己的优势呢？为了比较该方法与实验室常用的CTAB提取法、SDS提取法、碱裂解提取法和试剂盒提取法的差异，本例选择转Os12g24050基因转基因水稻进行检测。

具体步骤如下：

一、采用六种不同方法提取转基因水稻基因组DNA

按照实施例1的本发明的方法和CTAB提取法、SDS提取法、碱裂解提取法、Biomega公司DNA提取试剂盒和康为公司DNA提取试剂盒提取基因组。CTAB法参照（JJ Doyle等.1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaftissue. Phytochemical Bulletin 19, 11–15）；SDS法参照（D Goldenberger等. 1995. Asimple “universal”DNA extraction procedure using SDS and proteinase K iscompatible with direct PCR amplification. Genome Research 4, 368–370）；碱裂解法参照（H Wang等. 1993. A simple method of preparing plant samples for PCR.Nucleic Acids Research 21, 4153–4154〕；Biomega公司DNA提取试剂盒和康为公司DNA提取试剂盒参照公司说明书。

二、六种方法获得的基因组DNA浓度和纯度对比

(1)用分光光度计检测六种方法所提取核酸的浓度和纯度，检测结果见表1；

(2)用琼脂糖凝胶电泳检测所提取的目的DNA片段，电泳对比结果见图3。

三、六种不同方法对不同片段大小的基因的扩增效果

分别用上述方法提取的DNA为模板，进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测。选用的引物分别为elf，扩增片段为560bp；Os12g24050-1，扩增片段为2000bp；Os12g24050-2，扩增片段为4500bp。

引物序列为：

elf-F: 5’-TTGTGCTGGATGAAGCTGATG-3’

elf-R: 5’-GGAAGGAGCTGGAAGATATCATAGA-3’

Os12g24050-1-F: 5’-AACTGAAAGAGTATAGGCGGGC-3’

Os12g24050-1-R: 5’-AGTCATAGCCTTGCGCTGTAAT-3’

Os12g24050-2-F: 5’-GGCGGGGAAGGTGGAGAAC-3’

Os12g24050-2-R: 5’-GCCAATGCAGGAGGAAGAG-3’。

PCR反应体系中模板DNA为200ng，反应条件中2000bp延伸时间为2min，4500bp延伸时间为5min，其余同实施例1。PCR扩增产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测（图4-图6）。

表1 六种不同方法提取基因组的浓度、纯度比较

表1和图3的结果表明，CTAB提取法、SDS提取法获得的基因组DNA的浓度最高，Biomega公司DNA提取试剂盒所提取的基因组DNA的浓度与纯度与本发明方法所得基因组DNA结果相近，康为公司DNA提取试剂盒和碱裂解提取法获得的基因组DNA的浓度最低且康为公司产品表现出DNA的降解，碱裂解法提取出来的基因组DNA电泳图谱没有跑出条带。

尽管如此，对提取的基因组以elf为引物进行PCR扩增后，所有样品均得到560bp的目的条带且不同的提取方法没有什么差别（图4）。然而对于2000bp和4500bp大片段的外源基因，碱裂解法已经扩增不到目的片段，而此时本发明方法提取的基因组扩增结果比较理想，甚至比CTAB法和SDS法提取的基因组的扩增效果更好，目的片段越大，本发明方法的优势越明显（图5和图6）。此外，虽然Biomega公司和康为公司DNA提取试剂盒提取的基因组扩增效果与本发明方法相当，但这两种方法都用到了有毒的氯仿，且提取时间需要1小时以上。

综合以上结果，本发明的方法与其他DNA提取法相比能够更快、更好的获得高质量、高完整性的基因组。本发明的方法不但操作简单，提取速度快，而且对于大片段基因的扩增具有无可比拟的优势，适用于新鲜样品及转基因农作物的快速检测。

<110> 福建农林大学

<120> 一种快速提取植物基因组DNA的试剂盒及方法

<160> 8

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

AGTTGGTGAACTGATGACA

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

GGTCTGACACAAGGTTAGA

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

TTGTGCTGGATGAAGCTGATG

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

GGAAGGAGCTGGAAGATATCATAGA

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

AACTGAAAGAGTATAGGCGGGC

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

AGTCATAGCCTTGCGCTGTAAT

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

GGCGGGGAAGGTGGAGAAC

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

GCCAATGCAGGAGGAAGAG

Claims (2)

1.一种快速提取植物基因组DNA 的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的组成包括：

（1）平衡液：2mM Tris-HCl，pH 13.00 ；

（2）裂解液：10% CTAB ；

（3）DNA 结合液：5.0M 盐酸胍，30% 异丙醇；

（4）DNA 洗涤液：20mM NaCl，20mM Tris-HCl，80% 乙醇，pH 7.5 ；

（5）DNA 洗脱液：20μg/ mL RNA 酶，10mM Tris-HCl，pH 8.5 ；

（6）DNA 吸附柱，所述吸附柱为硅胶柱。

2.一种利用权利要求1 所述试剂盒快速提取植物DNA 的方法，其特征在于：依次包括以下步骤：

(1) 向DNA 吸附柱中加200μl 平衡液，12000rpm 离心30s ；

(2) 取30-50mg 植物组织放到2ml 的EP 管中，加入2 粒灭菌的小钢珠后直接放入液氮中，待植物组织冻硬后立即捞出放入铝盒，盖上盖，快速振摇数下；重复此步骤2-3 次使植物组织研磨彻底；

(3) 加入65℃预热的100μl 裂解液，温育2min，期间轻柔颠倒混匀，随后加入600μlDNA 结合液，轻柔颠倒混匀；

(4) 将EP 管倒过来盖子向下，在盖子下压上一块磁铁，再轻轻翻过来使小钢珠被吸到盖子上，压着磁铁开盖，将小钢珠弹入回收盒中后，室温12,000rpm 离心1min ；

(5) 取上清液加到平衡液预处理过的DNA 吸附柱中，室温12,000rpm 离心30s，弃收集管中的液体；

(6) 向DNA 吸附柱中加入300μl DNA 结合液，室温12,000rpm 离心30s，弃收集管中的液体；

(7) 向DNA 吸附柱中加入650μl DNA 洗涤液，室温12,000rpm 离心30s，弃收集管中的液体；重复此步骤1 次后，室温12,000rpm 离心2min ；

(8) 将DNA 吸附柱转移到新的1.5ml EP 管中，加入65℃预热的DNA 洗脱液30μl，室温静置2min 后，12,000rpm 离心1min，即得到DNA 样品。