CN110452904B

CN110452904B - 一种大豆基因组dna提取试剂盒及提取方法

Info

Publication number: CN110452904B
Application number: CN201910684679.3A
Authority: CN
Inventors: 王俊; 杨学珍; 徐瑞新; 周彦辰; 陈玲玲; 胡伟; 祁平
Original assignee: Yangtze University
Current assignee: Yangtze University
Priority date: 2019-07-26
Filing date: 2019-07-26
Publication date: 2021-07-27
Anticipated expiration: 2039-07-26
Also published as: CN110452904A

Abstract

本发明提供了一种大豆基因组DNA提取试剂盒，所述试剂盒包括用于裂解细胞的裂解液，所述裂解液包括高盐高PH提取液和2％的β‑巯基乙醇；其中所述高盐高PH提取液包括总溶液以及质量与所述总溶液体积比为10％的十二烷基硫酸钠；所述总溶液包括终浓度为35mM的六水合氯化镁，终浓度为400mM的氯化钾，终浓度为200mM的蔗糖，终浓度为200mM的Tris‑base，终浓度为25mM的EDTA·2Na；本发明还提供了一种大豆基因组DNA提取方法；本发明提供的一种大豆基因组DNA提取试剂盒及提取方法，提取的DNA含量高，纯度高，能够满足后续分子生物学研究的需要。

Description

一种大豆基因组DNA提取试剂盒及提取方法

技术领域

本发明涉及DNA提取技术领域，尤其涉及一种大豆基因组DNA提取试剂盒及提取方法。

背景技术

DNA在生物学实验中是最普遍利用的生物分子。分子生物学分析中，基因组DNA的提取是其成功的关键。不同植物甚至是同一类植物，其组织材料的的来源、部位、形态等内在的特点的差异，尤其是植物体内中次生代谢产物多酚类化合物可介导DNA降解，多糖能抑制限制酶、连接酶及DNA聚合酶的生物活性，因此在提取基因组DNA时需要选择不同的方法或做一些特殊的处理。

本发明人在研究中采用CATB法提取大豆基因组DNA，得到的样品中仍含有RNA、以及未被去除的多糖及其他一些次生代谢物质，DNA含量低、纯度低。因此开发一种DNA含量高，纯度高的大豆基因组DNA提取试剂盒及提取方法，成为亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了一种大豆基因组DNA提取试剂盒及提取方法，提取的DNA含量高，纯度高，能够满足后续分子生物学研究的需要。

本发明是这样实现的：

本发明的目的之一在于提供了一种大豆基因组DNA提取试剂盒，所述试剂盒包括用于裂解细胞的裂解液，所述裂解液包括高盐高PH提取液和2％的β-巯基乙醇；其中所述高盐高PH提取液包括总溶液以及质量与所述总溶液体积比为 10％的十二烷基硫酸钠；所述总溶液包括终浓度为35mM的六水合氯化镁，终浓度为400mM的氯化钾，终浓度为200mM的蔗糖，终浓度为200mM的 Tris-base，终浓度为25mM的EDTA·2Na。

本发明的目的之二在于提供一种大豆基因组DNA提取方法，所述方法包括如下步骤：

步骤1、原材料的处理：将大豆幼嫩叶片或大豆种子经处理得到大豆粉；

步骤2、溶液的配制：分别配制好所述裂解液，清洗液以及洗脱液；所述裂解液包括高盐高PH提取液和2％的β-巯基乙醇；所述高盐高PH提取液包括总溶液以及质量与所述总溶液体积比为10％的十二烷基硫酸钠；所述总溶液包括终浓度为35mM的六水合氯化镁，终浓度为400mM的氯化钾，终浓度为200mM 的蔗糖，终浓度为200mM的Tris-base，终浓度为25mM的EDTA·2Na；

步骤3、DNA的提取：在大豆粉中加入所述高盐高PH提取液，颠倒混匀后加入所述2％的β-巯基乙醇，液氮冷冻后37℃水浴，待其溶解为冰水混合物后震荡，再反复冻融2～6次；

步骤4、杂质的去除：加入清洗液去除杂质；

步骤5、大豆基因组DNA的溶解：杂质去除后风干，加入洗脱液溶解即可。

本发明具有的有益效果是：

本发明提供的一种大豆基因组DNA提取试剂盒及提取方法，与对比例1 的方法(CATB法)提取大豆基因组DNA相比，分别用核酸蛋白检测仪检测法、琼脂糖凝胶电泳法和PCR扩增法对两种方法提取的DNA样品分别进行检测，结果表明本发明提供的方法提取的DNA含量高，纯度高，且提取效果稳定，能够满足后续分子生物学研究的需要；具体地：

(1)核酸蛋白仪检测表明：本发明提供的高盐高PH法得到的DNA OD₂₆₀/OD₂₈₀均为1.8～2.0，说明蛋白质、多糖、RNA完全去除；对比例1的方法(CATB法)得到的DNA OD₂₆₀/OD₂₈₀均大于2.0，说明蛋白质去除彻底，但 RNA未除干净。

(2)琼脂糖凝胶电泳表明：本发明提供的高盐高PH法得到的DNA只有一条清晰整齐的主带表明有效的去除了大豆嫩叶或者大豆种子中的多糖及其他次生代谢物质，RNA也降解完全；对比例1的方法(CATB法)得到的DNA有两条带，说明样品中仍含有未被去除的多糖及其他一些次生代谢物质。

(3)PCR扩增法表明：两种方法提取的DNA样品均可进行PCR扩增，也可用作SRAP研究，本发明提供的高盐高PH法提取的样品扩增出的条带比较清晰。

附图说明

图1为本发明实施例1与对比例1两种方法提取大豆基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测结果；其中泳道1-3：对比例1提取中豆41的叶片DNA；泳道4-6：实施例1提取中豆41叶片DNA；泳道7-9：对比例1提取天隆1号大豆叶片 DNA；泳道10-12：实施例1提取天隆1号叶片DNA；泳道13-15：对比例1提取中豆41的种子DNA；泳道16-18：实施例1提取中豆41种子DNA；泳道19-21：对比例1提取天隆1号大豆种子DNA；泳道22-24：实施例1提取天隆1号种子DNA；

图2为SSR引物对本发明实施例1与对比例1两种方法提取的大豆叶片和种子DNA的扩增情况；泳道1-3：对比例1的CTAB法提取中豆41叶片DNA；泳道4-6：实施例1的高盐高PH法提取中豆41叶片DNA；泳道7-9：对比例1 的CTAB法提取天隆1号叶片DNA；泳道10-12：实施例1的高盐高PH法提取天隆1号叶片DNA；泳道13-15：对比例1的CTAB法提取中豆41种子DNA；泳道16-18：实施例1的高盐高PH法提取中豆41种子DNA；泳道19-21：对比例1的CTAB法提取天隆1号种子DNA；泳道22-24：实施例1的高盐高PH 法提取天隆1号种子DNA。

具体实施方式

实施例1

一、试剂配制

1、母液配制：

表1

试剂名称	分子量(g/mol)	称量(g)	终体积	终浓度
					六水合氯化镁(MgCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O)	203.3	10.15	50mL	1M
氯化钾(KCl)	74.55	14.92	50mL	4M
					无水醋酸钠(NaAc)	82.01	12.3	50mL	3M(pH5.2)
无水醋酸纳(NaAc)	82.01	12.3	50mL	3M(pH5.6)
					蔗糖(C<sub>12</sub>H<sub>22</sub>O<sub>11</sub>)	82.01	17.12	50mL	1M
Tris-base(C<sub>4</sub>H<sub>11</sub>NO<sub>3</sub>)	121.1	6.055	50mL	1M
					EDTA·2Na(C<sub>10</sub>H<sub>14</sub>N<sub>2</sub>Na<sub>2</sub>O<sub>8</sub>·2H<sub>2</sub>O)	372.24	2.33	50mL	125mM

注：EDTA·2Na只能溶解于碱性环境，可于Tris-base混合配制。

2、高盐高pH核酸提取液(Extraction Buffer，pH 9.0，KOH)

表2

注意：配制时，先加入1-5，用1MKOH和1MHCl调节pH到9.0，然后加入SDS，充分溶解后，定容到100mL。

2、2％的β-巯基乙醇；

2、PCI：酚：氯仿：异戊醇(25：24：1，v/v/v)；

3、CI：氯仿：异戊醇(24：1，v/v)；

4、醋酸钠：配制3M，pH5.2的醋酸钠和3M，pH5.6的醋酸钠；

5、无水乙醇，预冷乙醇时需将无水乙醇提前放置于-80℃，至少1小时以上；

6、洗脱液包括10mM，pH＝8.0的Tris或者pH＝8.0的超纯水中的任意一种

二、原材料的处理

采集的大豆幼嫩叶片放入2mL的离心管中，在离心管中放入0.5cm直径的钢珠，放入液氮中冷冻后在高通量研磨仪上打碎，称取50mg粉末放入-80℃冰箱保存。挑取干燥的大豆种子，用小熊磨样机打碎，过筛后称取50mg豆粉常温保存备用。

三、DNA的提取

在装有材料的离心管中加入900uL的高盐高PH提取液，上下颠倒混匀后加入2％的β-巯基乙醇，液氮冷冻后放入37℃水浴锅，待其溶解为冰水混合物时放入高通量研磨仪剧烈震荡3分钟(50HZ/min)，反复冻融三次，使其充分释放DNA。

四、杂质的去除

S1、加入700uL的酚氯仿异戊醇(25：24：1)，剧烈震荡后静置分层， 12000rmp，4℃离心10分钟。

S2、吸取上清，加入500uL的氯仿异戊醇(24：1)，剧烈震荡后静置分层， 12000rmp，4℃离心10分钟。再重复此步骤一次。

S3、取上清，加入1/10体积的Sodium acetate醋酸钠(3M，pH5.2)，混匀，然后加入2.5倍溶液体积预冷乙醇(100％，可提前放置于-80℃保存1小时以上)，混匀，静置5分钟，沉淀核酸。8000rpm离心5分钟，弃上(RNA)，保留沉淀。

S4、往沉淀中加入0.5mL Sodium acetate(3M，pH5.6)，溶解沉淀5分钟，可用移液枪吹打助溶，然后8000rpm离心5分钟。

S5、将上清转入2mL离心管，加入溶液3倍体积预冷的无水乙醇，静置5 分钟，待DNA充分沉淀后，12000rpm离心20分钟。

S6、弃上清，用75％乙醇洗涤DNA2次。

五、大豆基因组DNA的溶解

通风橱内风干10分钟，加入100uL ddH₂O溶解沉淀。

对比例1

1、CATB法提取液：2％CTAB，0.1moL/LTris HCl(pH8.0)，0.02moL/LEDTA (pH8.0)，1.4moL/LNaCl，2％-巯基乙醇，3％PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，备用。

2、原材料的处理：采集的大豆幼嫩叶片放入2mL的离心管中，在离心管中放入0.5cm直径的钢珠，放入液氮中冷冻后在高通量研磨仪上打碎，称取50mg 粉末放入-80℃冰箱保存。挑取干燥的大豆种子，用小熊磨样机打碎，过筛后称取50mg豆粉常温保存备用。

3、DNA的提取：加入700uL2％的CTAB抽提液，轻轻搅动后倒入灭菌离心管中，置于65℃水浴槽中，每隔10分钟轻轻摇动，使其充分释放DNA。

4、杂质的去除：同实施例1。

5、大豆基因组DNA的溶解：同实施例1。

实验例

1、核酸蛋白仪检测

取实施例1以及对比例1中提取的样品，以无菌去离子水为空白，用超微量分光光度计(Spectrophotometer：NanoDrop2000)测定波长为260nm和280nm 的吸光度值，即A260和A280，按照NanoDrop2000仪器使用说明书进行测定。利用纯dsDNA的A260/A280比值，评估提取DNA的纯度，以及测定DNA含量，本发明的试剂盒及其方法提取得到的DNA纯度和含量测定见表3。

表3

	OD260	OD280	260/280	浓度(ng/μl)
					对比例1	0.077	0.036	2.13	4.98
实施例1	0.084	0.045	1.86	29.82

由表3可知，核酸蛋白仪检测表明：本发明提供实施例1得到的DNA OD₂₆₀/OD₂₈₀均为1.8～2.0，说明蛋白质、多糖、RNA完全去除；对比例1的方法(CATB法)得到的DNA OD₂₆₀/OD₂₈₀均大于2.0，说明蛋白质去除彻底，但 RNA未除干净。

2、琼脂糖凝胶电泳

用1％琼脂糖凝胶分别对进行对比例1以及实施例1提取的DNA样品DNA 检测，结果如图1所示。

由图1可知，实施例1和对比例1提取DNA的效果不同，具体地：

对比例1提取的DNA样品中，点样孔带亮点，说明该样品中仍含有未被去除的多糖及其他一些次生代谢物质，这些物质具有粘连性，使得DNA分子无法全部离开点样孔或点样速度较慢，在点样孔上形成亮点；同时RNA没有去除干净，因而有两条带。

实施例1提取的DNA样品中，呈现一条清晰整齐的主带，说明所提取的 DNA完整性较好，基本上无断裂、无降解现象，RNA降解完全，说明本发明提供的方法能有效去除大豆中的多糖及其他次生代谢物质，为大豆基因组DNA提取的有效方法。

3、PCR扩增法检测

采用SSR引物分别对实施例1和对比例1提取DNA进行扩增，并用1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。

由图2可知，两种方法提取的DNA样品均可进行PCR扩增，都可用作分子生物学研究；但与对比例1相比，实施例例1提取的DNA样品扩增出的条带比较清晰，特别是大片段条带更亮。

综上所述，本发明提供的一种大豆基因组DNA提取试剂盒及提取方法，与对比例1的方法(CATB法)提取大豆基因组DNA相比，分别用核酸蛋白检测仪检测法、琼脂糖凝胶电泳法和PCR扩增法对两种方法提取的DNA样品分别进行检测，结果表明本发明提供的方法提取的DNA含量高，纯度高，且提取效果稳定，能够满足后续分子生物学研究的需要

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种大豆基因组DNA提取试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于裂解细胞的裂解液，所述裂解液包括高盐高PH提取液和2％的β-巯基乙醇；其中所述高盐高PH提取液包括总溶液以及十二烷基硫酸钠；

所述总溶液包括：终浓度为35mM的六水合氯化镁，终浓度为400mM的氯化钾，终浓度为200mM的蔗糖，终浓度为200mM的Tris-base，终浓度为25mM的EDTA·2Na；将总溶液配制完成后，调节pH至9.0，然后加入质量与所述总溶液体积比为10％的十二烷基硫酸钠，即得所述高盐高PH提取液。

2.如权利要求1所述的大豆基因组DNA提取试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于去除杂质的清洗液；以及用于洗脱DNA的洗脱液。

3.如权利要求2所述的大豆基因组DNA提取试剂盒，其特征在于，所述清洗液包括酚氯仿异戊醇，氯仿异戊醇，醋酸钠，无水乙醇，75％乙醇；所述酚氯仿异戊醇中苯酚、氯仿、异戊醇的体积比为25：24：1；所述氯仿异戊醇中氯仿、异戊醇的体积比为24：1。

4.如权利要求2所述的大豆基因组DNA提取试剂盒，其特征在于，所述洗脱液包括10mM，pH＝8.0的Tris或者pH＝8.0的超纯水中的任意一种。

5.一种大豆基因组DNA提取方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤1、溶液的配制：分别配制好裂解液，清洗液以及洗脱液；所述裂解液包括高盐高PH提取液和2％的β-巯基乙醇；所述高盐高PH提取液包括总溶液以及十二烷基硫酸钠；所述总溶液包括：终浓度为35mM的六水合氯化镁，终浓度为400mM的氯化钾，终浓度为200mM的蔗糖，终浓度为200mM的Tris-base，终浓度为25mM的EDTA·2Na，将总溶液配制完成后，调节pH至9.0，然后加入质量与所述总溶液体积比为10％的十二烷基硫酸钠，即得所述高盐高PH提取液；

步骤2、原材料的处理：将大豆幼嫩叶片或大豆种子经处理得到大豆粉；

步骤3、DNA的提取：在大豆粉中加入所述高盐高PH提取液，颠倒混匀后加入所述2％的β-巯基乙醇，液氮冷冻后37℃水浴，待其溶解为冰水混合物后振荡，再反复冻融2～6次；

步骤4、杂质的去除：加入清洗液去除杂质，其中所述清洗液包括：酚氯仿异戊醇；氯仿异戊醇；3M，pH5.2的醋酸钠；3M，pH5.6的醋酸钠；无水乙醇；75％乙醇；所述酚氯仿异戊醇中苯酚、氯仿、异戊醇的体积比为25：24：1；所述氯仿异戊醇中氯仿、异戊醇的体积比为24：1；

6.如权利要求5所述大豆基因组DNA提取方法，其特征在于，所述步骤2中，将采集的大豆幼嫩叶片放入离心管中，放入0.5cm直径的钢珠，放入液氮中冷冻后在高通量研磨仪上打碎，得到大豆粉放入-80℃冰箱保存；或挑取干燥的大豆种子，打碎，过筛后得到大豆粉常温保存备用。

7.如权利要求5所述大豆基因组DNA提取方法，其特征在于，所述步骤4具体包括：

S1、加入所述酚氯仿异戊醇，剧烈震荡后静置分层，12000rmp，4℃离心10分钟；

S2、吸取上清，加入所述氯仿异戊醇，剧烈震荡后静置分层，12000rmp，4℃离心10分钟；再重复此步骤一次；

S3、取上清，加入1/10体积的所述3M，pH5.2的醋酸钠，混匀，然后加入2.5倍溶液体积预冷乙醇，混匀，静置5分钟，沉淀核酸；8000rpm离心5分钟，弃上清，保留沉淀；

S4、往沉淀中加入所述3M，pH5.6的醋酸钠，溶解沉淀5分钟，然后8000rpm 离心5分钟；

S5、将上清转入新的离心管，加入溶液3倍体积预冷的无水乙醇，静置5分钟，待DNA充分沉淀后，12000rpm离心20分钟；

S6、弃上清，用75％乙醇洗涤DNA 2次。

8.如权利要求5所述大豆基因组DNA提取方法，其特征在于，所述步骤3中，所述振荡采用高通量研磨仪，震荡时间为3分钟，振荡频率为50HZ/min。