CN106148329A - 一种提取陈化烟叶表面真菌基因组的方法 - Google Patents

一种提取陈化烟叶表面真菌基因组的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种提取陈化烟叶表面真菌基因组的方法。该方法包括陈化烟叶表面真菌富集和基因组DNA的提取两个主要步骤，通过缓冲液浸泡和梯度离心富集真菌，经液氮研磨破壁，采用试剂盒提取真菌基因组DNA。液氮研磨可充分裂解真菌细胞壁，提高真菌DNA的提取效率，包含了创新专利抑制因子去除可有效提高基因组的获得率。本发明方法能够有效，快速的提取陈化烟叶表面真菌的基因组DNA。

Description

一种提取陈化烟叶表面真菌基因组的方法
技术领域
本发明涉及微生物学领域，具体涉及一种提取陈化烟叶表面真菌基因组DNA的方法。
背景技术
新鲜的烤烟烟叶成熟后采集进行初烤，再经过打叶复烤等处理后进入陈化阶段，陈化阶段能够调整、改善烟叶品质，保持烟叶质量的稳定性，是卷烟生产中必不可少的处理阶段。进行陈化处理的烟叶表面和内部寄附了丰富的微生物，并且陈化中的烤烟烟叶富含各类化合物，包括糖类、蛋白质、烟碱等，满足微生物生存的营养条件，烟叶内的许多物质具有亲水性，能够从陈化环境中吸收水分，在合适条件下，导致烤烟烟叶表面上滋生大量的微生物，细菌、霉菌是主要的两大类群。
在烟叶陈化发酵过程中，微生物作用扮演着重要的作用，微生物和它们分泌的酶能够缩短烟叶发酵时间、转化或降解烟叶中影响烟叶品质的大分子化合物、降低烟碱含量和增加香气含量等。各类真菌存在于陈化的各个阶段，这些真菌在繁衍中能够减少烟叶中的烟碱等有害物质的含量，同时，真菌产生的酶还能促成各类化学反应的进行，产生许多具有特殊气味的香料物质。然而，真菌的菌丝和孢子在适宜的环境条件下会不断生长、繁殖，造成烟草的大量霉变，从而丧失制烟价值，影响烟叶品质。所以研究烟叶上真菌来提高烟叶品质和降低其对烟叶的危害具有较大的实践意义。
对于烟草微生物的研究，传统的纯培养研究方法具有很大的局限性，环境中拥有大量的微生物，但可培养的微生物只占1％左右，而大部分的微生物是无法通过培养获得的。许多学者利用宏基因组的方法，直接从样品中获取样品的基因组，对基因组进行克隆，将克隆条带处理后测序，鉴定各类微生物的种类，发掘更多的新物种，客观全面的揭示样品中微生物的多样性。在这类免培养的研究方法中提取到纯度较高的基因组是后续实验的基础。
目前市场上的普通国产DNA提取试剂盒虽能得到质量较高的基因组DNA，但只是针对纯培养得到的微生物，对于直接从环境样品中提取微生物基因组DNA，用普通试剂盒效果较差，非微生物物质会堵塞DNA吸附柱，并且提取的DNA质量不稳定。手工提取样品基因组的方法效率较低，并且容易导致基因组的损失。直接利用普通试剂盒提取烟叶表面真菌的基因组DNA时，细小的烟叶碎片及尘土会堵塞DNA吸附柱，影响效率，甚至导致实验中断，烤烟烟叶浸泡后会有部分油性物质溢出，在遇到一些化合物时会形成粘性较大絮状物，这也会堵塞吸附柱。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术不足，提供一种提取陈化烟叶表面真菌基因组DNA的方法，从而实现高效方便提取大量烤烟烟叶表面真菌基因组DNA。
本发明提取陈化烟叶表面真菌基因组DNA的方法，其特征在于该方法包括陈化烟叶表面真菌富集、使用液氮研磨处理真菌富集物和使用试剂盒提取样品基因组DNA的三个主要步骤，通过缓冲液浸泡和梯度离心让陈化烟叶表面真菌富集，经液氮研磨破壁处理真菌富集物，采用试剂盒提取真菌基因组DNA。
提取陈化烟叶表面真菌基因组DNA的具体步骤如下：
(1)陈化烟叶表面真菌的富集
称取250g～300g的烟叶样品，剪碎，平均分装成4份，每份加入1000mL的pH 7.0PBS缓冲液，充分震荡2～3小时；用双层纱布过滤收集浸泡液，将过滤液离心(10000×g，4℃)15～20min，弃上清；加入20ml无菌去离子水溶解沉淀，将其转移至50ml离心管中，再加入DNaseⅠ至终浓度为1u/mL，涡旋震荡混匀后于37℃恒温水浴30min；加入0.5mol/L EDTA(pH＝8.0)至终浓度20mmol/L，涡旋震荡混匀后于65℃恒温水浴10min，离心(12000r/min，4℃)15～20min，弃上清，沉淀即为真菌富集物；
(2)使用液氮研磨处理真菌富集物
称取2～3g沉淀，置于预冷研钵中加液氮覆盖，用力充分研磨至粉末状；
(3)使用试剂盒提取样品基因组
采用DNA Isolation Kit提取烟叶表面真菌总DNA，具体操作步骤如下：加入0.25g上述研磨后的粉末到一个PowerBead Tubes中，轻轻涡旋混匀，加入60μlSolution C1，上下颠倒数次混匀；把PowerBead Tubes固定在涡旋仪适配器上，最大转速(3200r/min)涡旋连续振荡10min，室温10000×g离心30s；转移上清至一个干净的2mlCollection Tube中，加入250μl Solution C2到上清中，涡旋混匀5s，4℃孵育5min，室温10000×g离心1min；避开沉淀小珠，转移上清≤600μl到一个新的收集管中，加入200μlSolution C3到上清中，涡旋混匀，4℃孵育5min，室温10000×g离心1min；避开沉淀小珠，转移上清≤750μl到一个新的收集管中，加入1200μl Solution C4到上清中，涡旋混匀5s，加载约675μl上清到Spin Filter中，室温10000×g离心1min，弃去滤液，继续加载675μl上清，室温10000×g离心1min，重复直至过滤完所有上清；加入500μl Solution C5到SpinFilter中，室温10000×g离心30s，弃去上清，室温10000×g离心1min；小心转移Spinfilter(旋转过滤器)到2ml Collection Tube中，加入100μl Solution C6到白色滤膜中心，室温10000×g离心30s，弃去Spin Filter；将总DNA样品放置-20℃的冰箱中保存，备用。
本发明方法采用了液氮研磨与试剂盒提取相结合的方法，一方面用液氮研磨可充分裂解真菌细胞壁，提高真菌DNA提取效率，还可以避免烟叶碎末影响试剂盒离心柱膜的通透性的弊端，另一方面结合试剂盒提取可以有效提高基因组的获得率。
本发明具有如下优点：液氮研磨的处理可有效裂解真菌细胞壁，提高真菌基因组DNA提取效率，还可以有效避免烟叶碎末影响试剂盒离心柱膜的通透性的弊端；试剂盒提取可以有效提高基因组的获得率，DNA Isolation Kit包含了创新专利抑制因子去除(IRT)，可用于提取所有类型环境样品高质量DNA，IRT(抑制因子去除技术)含有组分可沉淀那些会影响DNA纯度和下游实验的非DNA的有机、无机物质，如腐植酸、细胞碎片、蛋白质等，有效提高基因组的获得率，提取出来的高质量DNA可直接用于下游实验，无需进一步纯化。
本发明方法针对烟叶样品的特殊性进行设计，避免烟叶碎沫等对实验的不良影响。此方法可以运用于全部的陈化烟叶表面真菌基因组的提取，具有应用范围广、提取效率高的特点。
本发明方法提供的方法应用于云南省K326、红大等品种的陈化烤烟烟叶真菌基因组的提取，都达到良好的提取效果，提取的基因组均可用于各类分子学实验。
附图说明
图1是利用手提方法CTAB法提取K326品种陈化中的烟叶表面真菌18S rRNA基因扩增的琼脂糖凝胶电泳图谱；
图2是利用手提方法尿素法提取K326品种陈化中的烟叶表面真菌18S rRNA基因扩增的琼脂糖凝胶电泳图谱；
图3是经液氮研磨处理和试剂盒相结合的方法提取K326品种陈化中的烟叶表面真菌18S rRNA基因扩增的琼脂糖凝胶电泳图谱。
具体实施方式
下面通过附图和实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中所使用的方法如无特殊说明，均为常规方法；实施例中所使用的材料、试剂如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
本发明前期处理烟叶样品时，所有接触到的工具必须经过灭菌或酒精擦拭，以免带入外界真菌污染样品。在富集真菌时，要保证每次离心的时间15～20min，若离心时间较少则影响富集真菌的种类和数量，增加最终实验结果的误差。实验过程中，加入DNaseⅠ降解游离DNA片段后要将其完全去除，否则会影响后续的实验，如DNA的提取、PCR等，收集中间相时要尽量避免吸取到下层沉淀物质，否则会影响试剂盒吸附柱的使用。
本发明提取陈化烟叶表面真菌基因组的方法按以下步骤进行：
(1)称取250g～300g的烟叶样品，剪碎，平均分装成4份，每份加入1000mL的pH7.0PBS缓冲液，28℃，170rpm摇床充分震荡培养2～3小时。
(2)用双层纱布过滤收集浸泡液，将过滤液离心(10000×g，4℃)15～20min，弃上清；加入20ml无菌去离子水溶解沉淀，将其转移至50ml离心管中，再加入DNaseⅠ至终浓度为1u/mL，涡旋震荡混匀后于37℃恒温水浴30min；加入0.5mol/L EDTA(pH＝8.0)至终浓度20mmol/L，涡旋震荡混匀后于65℃恒温水浴10min，离心(12000r/min，4℃)15～20min，弃上清，沉淀即为真菌富集物。
(3)使用液氮研磨处理真菌富集物
称取2～3g沉淀，置于预冷研钵中加液氮覆盖，用力充分研磨(反复加液氮研磨)至粉末状。
(4)使用试剂盒提取样品基因组
采用DNA Isolation Kit提取总DNA，具体操作步骤如下：
1)加入0.25g上述研磨后的粉末到一个PowerBead Tubes中；
2)轻轻涡旋混匀；
3)检测Solution C1，若出现沉淀，60℃水浴至全溶解；
4)加入60μl Solution C1，上下颠倒数次混匀；
5)把PowerBead Tubes固定在涡旋仪适配器上，最大转速(3200r/min，若涡旋仪达不到此速度，可适当延长5～10min)涡旋连续振荡10min(若使用24头适配器同时处理12个样品，涡旋时间延长5-10min)；
6)室温10000×g离心30s；
7)转移上清至一个干净的2ml Collection Tube(试剂盒提供)中；
8)加入250μl Solution C2到上清中，涡旋混匀5s，4℃孵育5min；
9)室温10000×g离心1min；
10)避开沉淀小珠，转移上清≤600μl到一个新的收集管中；
11)加入200μl Solution C3到上清中，涡旋混匀，4℃孵育5min；
12)室温10000×g离心1min；
13)避开沉淀小珠，转移上清≤750μl到一个新的收集管中；
14)加入1200μl Solution C4(Solution C4使用前先摇匀)到上清中，涡旋混匀5s；
15)加载约675μl上清到旋转过滤器(Spin Filter)中，室温10000×g离心1min；弃去滤液，继续加载675μl上清，室温10000×g离心1min；重复直至过滤完所有上清；
16)加入500μl Solution C5到旋转过滤器(Spin Filter)中，室温10000×g离心30s；
17)弃去上清；
18)室温10000×g离心1min；
19)小心转移Spin filter到2ml Collection Tube(试剂盒提供)中，尽量避免Solution C5污染；
20)加入100μl Solution C6到白色滤膜中心；
21)室温10000×g离心30s；
22)弃去旋转过滤器(Spin Filter)。将提取的总DNA样品立即进行18S rRNA基因扩增检测，判断基因组提取是否成功。将提取成功的基因组-20℃保存，用于后续实验。
利用18S rRNA基因扩增的通用引物，以提取的基因组为模板，在45～55℃退火，进行琼脂糖凝胶电泳并观察结果，如果能够扩增出真菌的18S rRNA基因，证明成功提取了基因组。
实施例1：利用CTAB法提取品种为K326烤烟在陈化中的烟叶表面真菌基因组基因组，包括以下步骤：
(1)试剂的制备：
样品前处理试剂有0.5M EDTA(pH＝8.0)、1M Tris-HCl溶液、CTAB溶液、0.2％(V/V)β-巯基乙醇、酚：氯仿：异戊醇、异丙醇、质量百分比浓度70％的乙醇；所述试剂的配制方法如下：
所述0.5M EDTA(pH＝8.0)的配制：取186.1g Na2EDTA·2H2O，用NaOH(约20g)调节pH＝8.0，用过滤的ddH2O混合至1L，灭菌(121℃，15min)，室温保存。
所述1MTris-HCl(pH＝8.0)的配制：称取Tris-base 121.1g，将其溶解在800ml去离子水中，加入约42ml浓盐酸将其pH调至8.0，最后，加去离子水定容至1L，灭菌(121℃，15min)，室温保存。
所述2％CTAB提取液的配制：称取20g CTAB，81.9g NaCl；量取1M Tris-HCl(pH＝8.0)溶液100ml，0.5M EDTA(pH＝8.0)溶液40ml；加去离子水定容至1L，灭菌(121℃，15min)，室温保存，使用前加0.2％(V/V)β-巯基乙醇。
所述1L PBS缓冲液的配制(pH＝7.0)：称取0.24g KH2PO4、1.44g Na2HPO4、8.0gNaCl、0.2g KCl溶于700mL去离子水中，待完全溶解后，加HCl调节pH至7.0，加去离子水定容至1L，灭菌(121℃，15min)，室温保存。
其他试剂可通过试剂公司购买。
(2)烟叶样品的前处理
称取250g～300g的烟叶样品，剪碎，平均分装成4份，每份加入1000mL的pH 7.0PBS缓冲液，28℃，170rpm摇床充分震荡培养2～3小时。用双层纱布过滤收集浸泡液，将过滤液离心(10000×g，4℃)15～20min，弃上清，加入20ml无菌去离子水溶解沉淀，将其转移至50ml离心管中，再加入DNaseⅠ至终浓度为1u/mL，涡旋震荡混匀后于37℃恒温水浴30min，加入0.5mol/L EDTA(pH＝8.0)至终浓度20mmol/L，涡旋震荡混匀后于65℃恒温水浴10min，离心(12000r/min，4℃)15～20min，弃上清，沉淀即为真菌富集物。
(3)CTAB法提取DNA
1)称取2～3g沉淀，置于预冷研钵中加液氮覆盖，快速用力研磨至粉末状
2)向研钵中加入约600μl，65℃预热的CTAB缓冲液，将其与研磨后的粉末混匀
3)将液体转移至1.5ml的离心管内，涡旋震荡后于65℃水浴1h，每20min上下颠倒轻轻混匀一次
4)水浴结束后取出离心管，在每个离心管中加入等体积的4℃预冷后的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，上下颠倒混匀后，12000r/min，4℃，离心15min
5)离心后将上清转入新的1.5ml离心管中，再次加入等体积的4℃预冷后的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，上下颠倒混匀，12000r/min，4℃，离心15min
6)离心后将上清转入新的1.5ml离心管中，并向上清中加入-20℃预冷后的异丙醇(0.6倍体积)，上下颠倒混匀，置于-20℃的冰箱中沉淀至少2h
7)沉淀时间结束后从冰箱取出离心管，12000r/min，4℃，离心15min，取沉淀。向离心管中加入1ml，-20℃预冷后的体积分数为70％的乙醇，反复吹打漂洗沉淀，12000r/min，4℃，离心15min，弃液体，取沉淀。再重复此操作一次
8)将装有沉淀的离心管倒置于无菌滤纸上，并置于超净工作台自然风干，风干后，向每管加入50μl的双蒸水溶解DNA
9)溶解后的DNA于-20℃冰箱中保存
(4)18S rRNA基因扩增检测提取的DNA基因组
利用18S rRNA基因扩增的通用引物，以提取的基因组为模板，在53℃退火，进行琼脂糖凝胶电泳并观察结果，如果能够扩增出真菌的18S rRNA基因，证明成功提取了基因组。
由电泳图谱1我们可以发现：2、3、4泳道没有明显的DNA目的条带，其中2、3、4泳道为三个样品的重复实验，表明本实验的DNA提取是失败的。
实施例2：利用手提方法尿素法提取K326品种陈化中的烟叶表面真菌基因组
(1)样品前处理试剂的配制
样品前处理试剂有pH 7.0PBS缓冲液，尿素提取液(7M Urea、50mM Tris-HCl(pH＝8.0)、62.5mM NaCl、l％SDS)，苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，异丙醇，3M NaAc，质量百分比浓度70％乙醇。
所述l％SDS(十二烷基硫酸钠)的配制：称取10g的SDS溶于约0.9L去离子水中，用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解，最后，用去离子水定容至1L。
所述1M Tris-HCl(pH＝8.0，终浓度1M)的配制：称取Tris-base 121.1g，将其溶解在800ml去离子水中，加入约42ml浓盐酸将其pH调至8.0，最后，加去离子水定容至1L，灭菌(121℃，15min)，室温保存。50mM Tris-HCl是将1M Tris-HCl稀释20倍。
所述62.5mM NaCl的配制：溶解3.65g NaCl于足量的去离子水中，用去离子水定容至1L，灭菌(121℃，15min)，室温保存。
所述3M NaAc的配制：称取40.8g NaAc·3H2O溶解于40ml去离子水中，搅拌待其完全溶解后，加入冰醋酸调节pH至5.2，加去离子水定容至100ml，灭菌(121℃，15min)，室温保存。
所述10mg/ml RNase A的配制：将RNaseA溶解于0.01M的醋酸钠缓冲液中(pH＝5.2)，使终浓度为10mg/mL，沸水煮15min，放在室温下，缓慢冷却，用0.1体积的1M Tris-HCl(pH＝8.0)调整pH至7.4左右，分装小管保存在-20℃备用。
所述1L PBS缓冲液的配制(pH＝7.0)：称取0.24g KH2PO4、1.44g Na2HPO4、8.0gNaCl、0.2g KCl溶于700mL去离子水中，待完全溶解后，加HCl调节pH至7.0，加去离子水定容至1L，灭菌(121℃，15min)，室温保存。
其他试剂可通过试剂公司购买。
(2)烟叶样品的前处理
称取250g～300g的烟叶样品，剪碎，平均分装成4份，每份加入1000mL的pH 7.0PBS缓冲液，28℃，170rpm摇床充分震荡培养2～3小时。用双层纱布过滤收集浸泡液，将过滤液离心(10000×g，4℃)15～20min，弃上清，加入20ml无菌去离子水溶解沉淀，将其转移至50ml离心管中，再加入DNaseⅠ至终浓度为1u/mL，涡旋震荡混匀后于37℃恒温水浴30min，加入0.5mol/L EDTA(pH＝0.8)至终浓度20mmol/L，涡旋震荡混匀后于65℃恒温水浴10min，离心(12000r/min，4℃)15～20min，弃上清，沉淀即为真菌富集物。
(3)利用手提方法尿素法提取真菌基因组
1)收集菌丝，液氮研磨细后分装进1.5ml离心管中，加满尿素提取液(7M Urea、50mMTris-HCl(pH＝8.0)、62.5mM NaCl、l％SDS)，摇匀
2)12000r/min，4℃，离心5min，吸取上清液，上清液12000r/min，4℃，再次离心5min。
3)将上清液移入另一新离心管中，加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)溶液，用力振荡数次混匀，12000r/min，4℃，离心5min。
4)取上清到一新离心管中，加入等体积的异丙醇和1/10体积的3M NaAc(pH＝5.2)，-20℃放置20min，12000r/min，4℃，离心5min。
5)弃上清液，倒置使管壁液体流尽，70％乙醇洗沉淀2次(12000r/min，5min)，干燥(室温或真空抽干)，溶于50μl双蒸水中，加入RNase A(10mg/ml)2μl，37℃水浴30min，-20℃保存备用。
(4)18S rRNA基因扩增检测提取的DNA基因组
利用18S rRNA基因扩增的通用引物，以提取的基因组为模板，在53℃退火，进行琼脂糖凝胶电泳并观察结果，如果能够扩增出真菌的18S rRNA基因，证明成功提取了基因组。
由电泳图谱2我们可以发现：2、3、4泳道没有明显的DNA目的条带，其中2、3、4泳道为三个样品的重复实验，表明本实验的DNA提取是失败的。
实施例3：利用液氮研磨处理和试剂盒相结合的方法提取K326品种陈化中的烟叶表面真菌基因组
(1)样品前处理试剂的配制
样品前处理试剂有pH 7.0PBS缓冲液，其配制方法见案例一。DNA提取试剂盒采用DNA Isolation Kit。
(2)烟叶样品的前处理
称取250g～300g的烟叶样品，剪碎，平均分装成4份，每份加入1000mL的pH 7.0PBS缓冲液，28℃，170rpm摇床充分震荡培养2～3小时。用双层纱布过滤收集浸泡液，将过滤液离心(10000×g，4℃)15～20min，弃上清，加入20ml无菌去离子水溶解沉淀，将其转移至50ml离心管中，再加入DNaseⅠ至终浓度为1u/mL，涡旋震荡混匀后于37℃恒温水浴30min，加入0.5mol/L EDTA(pH＝8.0)至终浓度20mmol/L，涡旋震荡混匀后于65℃恒温水浴10min，离心(12000r/min，4℃)15～20min，弃上清，沉淀即为真菌富集物。
(3)利用液氮研磨处理和试剂盒相结合的方法提取真菌基因组
称取2～3g沉淀，置于预冷研钵中加液氮覆盖，用力充分研磨(反复加液氮研磨)至粉末状。
采用DNA Isolation Kit提取总DNA，具体操作步骤如下
1)加入0.25g研磨后的粉末到一个PowerBead Tubes中。
2)轻轻涡旋混匀。
3)检测Solution C1，若出现沉淀，60℃水浴至全溶解。
4)加入60μl Solution C1，上下颠倒数次混匀。
5)把PowerBead Tubes固定在涡旋仪适配器上，最大转速(3200rpm，若涡旋仪达不到此速度，可适当延长5～10min)涡旋连续振荡10min(若使用24头适配器同时处理12个样品，涡旋时间延长5-10min)。
6)室温10000×g离心30s。
7)转移上清至一个干净的2ml Collection Tube(试剂盒提供)中。
8)加入250μl Solution C2到上清中，涡旋混匀5s，4℃孵育5min。
9)室温10000×g离心1min。
10)避开沉淀小珠，转移上清≤600μl到一个新的收集管中。
11)加入200μl Solution C3到上清中，涡旋混匀，4℃孵育5min。
12)室温10000×g离心1min。
13)避开沉淀小珠，转移上清≤750μl到一个新的收集管中。
14)加入1200μl Solution C4(Solution C4使用前先摇匀)到上清中，涡旋混匀5s。
15)加载约675μl上清到Spin Filter中，室温10000×g离心1min；弃去滤液，继续加载675μl上清，室温10000×g离心1min；重复直至过滤完所有上清。
16)加入500μl Solution C5到Spin Filter中，室温10000×g离心30s。
17)弃去上清。
18)室温10000×g离心1min。
19)小心转移Spin filter到2ml Collection Tube(试剂盒提供)中，尽量避免Solution C5污染。
20)加入100μl Solution C6到白色滤膜中心。
21)室温10000×g离心30s
22)弃去Spin Filter。将总DNA样品放置-20℃的冰箱中保存，备用。
(4)18S rRNA基因扩增检测提取的DNA基因组
利用18S rRNA基因扩增的通用引物，以提取的基因组为模板，在53℃退火，进行琼脂糖凝胶电泳并观察结果，如果能够扩增出真菌的18S rRNA基因，证明成功提取了基因组。
由电泳图谱3我们可以发现：2、3、4泳道有明显的18S rRNA基因扩增目的条带，大小约为550bp～600bp，2、3、4泳道为三个样品的重复实验，表明本实验的DNA提取是成功的。
本发明方法使用液氮研磨的处理样品，可以充分裂解真菌细胞壁，提高真菌DNA的提取效率，避免烟叶碎末及尘土影响试剂盒离心柱膜的通透性；DNA IsolationKit包含了创新专利抑制因子去除(IRT)，可用于提取所有类型环境样品高质量DNA，试剂盒组分Solution C2和Solution C3是IRT(抑制因子去除技术)重要组成部分，含有组分可沉淀那些会影响DNA纯度和下游实验的非DNA的有机、无机物质，如腐植酸、细胞碎片、蛋白质等，有效提高基因组的获得率，提取出来的高质量DNA可直接用于下游实验，无需进一步纯化，采用本发明可最大限度地提取烟叶样品中真菌的基因组DNA。

Claims (2)

1.一种提取陈化烟叶表面真菌基因组DNA的方法，其特征在于该方法包括陈化烟叶表面真菌富集、使用液氮研磨处理真菌富集物和使用试剂盒提取样品基因组DNA的三个主要步骤，通过缓冲液浸泡和梯度离心让陈化烟叶表面真菌富集，经液氮研磨破壁处理真菌富集物，采用试剂盒提取真菌基因组DNA。
2.根据权利要求1所述的提取陈化烟叶表面真菌基因组DNA的方法，其特征在于具体步骤如下：
(1)陈化烟叶表面真菌的富集
称取250g～300g的烟叶样品，剪碎，平均分装成4份，每份加入1000mL的pH 7.0PBS缓冲液，充分震荡2～3小时；用双层纱布过滤收集浸泡液，将过滤液离心(10000×g，4℃)15～20min，弃上清；加入20ml无菌去离子水溶解沉淀，将其转移至50ml离心管中，再加入DNaseⅠ至终浓度为1u/mL，涡旋震荡混匀后于37℃恒温水浴30min；加入0.5mol/L EDTA(pH＝8.0)至终浓度20mmol/L，涡旋震荡混匀后于65℃恒温水浴10min，离心(12000r/min，4℃)15～20min，弃上清，沉淀即为真菌富集物；
(2)使用液氮研磨处理真菌富集物
称取2～3g沉淀，置于预冷研钵中加液氮覆盖，用力充分研磨至粉末状；
(3)使用试剂盒提取样品基因组
采用DNA Isolation Kit试剂盒提取烟叶表面真菌总DNA，具体操作步骤如下：加入0.25g上述研磨后的粉末到一个PowerBead Tubes中，轻轻涡旋混匀，加入60μlSolution C1，上下颠倒数次混匀；把PowerBead Tubes固定在涡旋仪适配器上，最大转速(3200r/min)涡旋连续振荡10min，室温10000×g离心30s；转移上清至一个干净的2mlCollection Tube中，加入250μl Solution C2到上清中，涡旋混匀5s，4℃孵育5min，室温10000×g离心1min；避开沉淀小珠，转移上清≤600μl到一个新的收集管中，加入200μlSolution C3到上清中，涡旋混匀，4℃孵育5min，室温10000×g离心1min；避开沉淀小珠，转移上清≤750μl到一个新的收集管中，加入1200μl Solution C4到上清中，涡旋混匀5s，加载约675μl上清到Spin Filter中，室温10000×g离心1min，弃去滤液，继续加载675μl上清，室温10000×g离心1min，重复直至过滤完所有上清；加入500μl Solution C5到旋转过滤器(Spin Filter)中，室温10000×g离心30s，弃去上清，室温10000×g离心1min；小心转移Spin filter到2ml Collection Tube中，加入100μl Solution C6到白色滤膜中心，室温10000×g离心30s，弃去旋转过滤器(Spin Filter)；将总DNA样品放置-20℃的冰箱中保存，备用。
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