CN102703430B - 一种提取普洱茶渥堆发酵过程中微生物总dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高质量提取普洱茶渥堆发酵过程中微生物总DNA的方法，本方法包括使用超声波及涡旋震荡使普洱茶表面分离微生物；使用洗涤缓冲液对微生物进行洗涤；使用DNA提取液对微生物总DNA的粗提，对粗提DNA进行纯化的步骤。本发明方法成本低廉，DNA提取率高，提取的DNA完整性好、纯度高、不经过纯化和稀释即能达到PCR的要求，纯化后DNA能满足分子生物学研究的要求，同时所提取的DNA覆盖细菌和真菌，能满足后续微生物多样性和功能基因、宏基因组学等研究的要求。
Description
技术领域
本发明涉及一种提取普洱茶渥堆发酵过程中微生物总DNA的方法，属于微生物领域。
背景技术
普洱茶(Pu-erh tea) 以云南的大叶茶(C. sinensis var. assamica)等大叶种茶的晒青毛茶 (普洱青茶，Pu-erh green tea)为原料，经过后发酵工艺生产而成的散茶和紧压茶。现代普洱茶生产工艺中渥堆发酵是生产普洱茶的关键工序，其生产过程中的微生物种类和数量直接影响普洱茶风味的形成，因此，微生物在普洱熟茶的渥堆发酵中起着重要的作用。然而，目前以形态学和生理生化指标为主要指标的检测和分类方法由于受到培养条件和模拟培养技术的限制，实际上所能检测到的微生物与实际上含有的微生物还有较大的差别。近些年，以DNA为主要指针研究环境中微生物的群落组成及基因功能能直接从分子水平对微生物进行研究。如何获得完整的、纯度高的普洱茶渥堆发酵过程中微生物总DNA是对普洱茶中微生物分子生物学研究的基础。但是由于普洱茶茶叶本身含有很复杂的次生代谢产物，在渥堆过程中在微生物的作用下使普洱茶的成分转化分解的更为复杂，无机与有机化合物繁多，茶多酚、茶多糖、茶色素等交织混合，加之生产过程粗犷，金属离子等都存在其中，这些因素都严重的影响普洱茶微生物总DNA的高质量提取。因此，建立普洱茶渥堆发酵过程中微生物总DNA的提取工艺对研究其微生物分子生物学研究、普洱茶品质的提升及普洱茶生产工艺的改进都有重要意义。
目前对普洱茶微生物总DNA的提取的主要问题就是微生物以普洱茶茶叶为底物进行复杂的次生代谢，微生物表面甚至体内都粘附残存有大量的茶多酚、茶多糖、醌类等，使得提取较高质量的微生物总DNA非常困难。按照目前的方法提取出的普洱茶微生物总DNA，提取过程难以避免茶多酚、醌类等与DNA结合，提取出来的DNA杂质含量偏高，不能直接进行PCR扩增等后续分子生物学的研究；目前的方法还存在提取过程中细胞裂解率不充分，DNA与茶多酚、醌类等结合导致提取过程中损失过大等，导致提取率偏低。
发明内容
本发明的目的是提供了一种提取普洱茶渥堆发酵过程中微生物总DNA的方法，该方法通过对普洱茶样品震荡洗涤，分离并洗涤微生物，减少茶多酚，醌类，金属等对DNA提取的影响，获得高纯度，大片段的微生物总DNA，提取出的DNA能直接用于PCR等后续分子生物学的研究。
本发明提供的普洱茶渥堆发酵过程中微生物总DNA的提取方法包括以下步骤：
（1）样品的预处理：取1-3g普洱茶渥堆发酵过程中的茶叶，剪碎至0.5-1cm，在茶叶中加入20-30mL洗涤缓冲液，静置20min后，超声波清洗仪中震荡处理10-15min，再涡旋震荡45-60s，取上清液；将上清液置于60-70℃水浴处理3-9min，低速离心后，取上清液高速离心收集菌体，在菌体中加入5-10mL洗涤缓冲液，混匀，再在60-70℃水浴处理3-9min，高速离心收集菌体；重复上述洗涤过程2-3次，直到菌体颜色接近白色，离心沉淀后上清液无颜色；
（2）DNA的粗提：向步骤（1）中所收集到的菌体中加入液氮，使菌体在液氮的作用下结成块状，充分研磨后，在普洱茶中以1.0mL/g的量加入DNA提取液，继续研磨充分后，加入蛋白酶K，55℃水浴处理30min，60-70℃水浴处理45~60min；然后加入等体积的的氯仿-异戊醇混合液，摇匀后10000g离心10min，回收水相，重复提取一次；在回收的水相中加入水相等体积的异丙醇和1/10水相体积的3M醋酸钠，混匀后-20℃放置30-45分钟，13000~15000g离心15~20分钟，沉淀用体积百分比浓度为75%的乙醇洗涤2次，室温干燥后，加入50~150μLddH2O，即得粗提的DNA溶液；
（3）DNA的纯化：在粗提的DNA溶液中加入RNase A酶，37℃水浴1-2h，用双蒸水稀释至500μL后，加入等体积Tris饱和酚，充分混匀，室温下10000g离心10min，回收水相并在其中加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，充分混匀，室温下10000g离心10min，回收水相，在回收的水相中加入2倍水相体积的无水乙醇和1/10水相体积的3M醋酸钠，混匀后-20℃放置20-30分钟，最后在13000~15000g下离心15~20分钟，取沉淀室温干燥后，加入50-150μLddH2O，即得纯化后的DNA。
本发明中所述洗涤缓冲液为含有80~100mM 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，20~50mM 乙二胺四乙酸二钠， 1~2%（W/V）聚乙烯吡咯烷酮， 0.05~0.1%（V/V）吐温20 ，1~1.5M NaCl， pH为7.5~8.0的溶液；
本发明中所述低速离心是指100~200g离心1~2min，高速离心是指6000~8000g离心6~8min。
本发明中所述DNA提取液是含有80~100mM 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，20~50mM 乙二胺四乙酸二钠，1~1.5M NaCl，1~2% （W/V）十六烷基三甲基溴化铵和1~2%（V/V）β-巯基乙醇的混合溶液。
本发明中所述蛋白酶K的添加量为0.05~0.1mg/mL。
本发明中所述氯仿-异戊醇混合液是氯仿和异戊醇按体积比24：1混合的溶液。
本发明中所述RNaseA酶在粗提DNA溶液中的添加量为0.25~0.5mg/ mL。
本发明中所述的普洱茶样本为任何工艺规模下渥堆发酵过程中的普洱茶熟茶。
本发明在提取DNA之前，对渥堆发酵过程中的普洱茶样品剪碎，加入洗涤缓冲液静置一段时间，有助于增加普洱茶吸水膨胀，增加与洗涤缓冲液接触面积，更好的使菌体洗涤出来；在对分离出的菌体进行洗涤去除与菌体表面附着的茶多酚、茶色素等代谢产物的时候，使用涡旋震荡与水浴相结合的方法，涡旋震荡使洗涤缓冲液高强度的冲刷菌体表面从而有利于分离黏着在菌体表面的茶多酚、茶色素等代谢产物，水浴使分离的菌体在热作用下，表面附着的茶多酚、茶色素等代谢产物洗涤的更加彻底。
本方法分离出的菌体颜色接近白色，提取出的DNA沉淀为白色。
本发明所提取得到的粗提DNA即可达到PCR的要求，能够使用细菌及真菌通用引物进行PCR，说明普洱茶渥堆发酵过程中微生物所黏着的茶多酚，茶色素等得到有效的去除，通过本方法获得的总基因组片段大小为15kb以上，加入RNase A纯化后，OD260/OD280=1.8~
1.9，OD260/OD230=1.6~1.7，可以满足分子生物学实验需求。
本发明方法简单高效，不需要购买试剂盒，所用试剂均为实验室常规试剂，提取及纯化DNA操作简单，成本低，DNA提取率高，获得的DNA完整性好，纯度高，不经过纯化和稀释即能达到PCR的要求，纯化后DNA能满足分子生物学研究的要求，同时所提取的DNA覆盖细菌和真菌，能满足后续微生物多样性和功能基因、宏基因组学等研究的要求。
附图说明
图1为利用本发明以渥堆发酵过程中的普洱茶为样品，所提取的未经纯化的粗提微生物总DNA琼脂糖凝胶电泳图；其中：M为15kb Marker；1、2、3分别为三个不同发酵程度的普洱茶样品的粗提总DNA。
图2为利用本发明以渥堆发酵过程中的普洱茶为样品，所提取的纯化后的微生物总DNA琼脂糖凝胶电泳图；其中：M是2kb Marker； 1、2、3分别为三个不同发酵程度的普洱茶样品的纯化后总DNA。
图3为以本发明所得未经纯化的普洱茶微生物的总DNA为模版，PCR扩增的16S rDNA的琼脂糖凝胶电泳图；其中：M是15kb Marker；1、2、3分别是以三个样品的粗提总DNA为模版的细菌16S rDNA的扩增产物。
图4以本发明所得未经纯化的普洱茶微生物的总DNA为模版，PCR扩增的18S rDNA的琼脂糖凝胶电泳图；其中：M是15kb Marker；1、2、3分别是以三个样品的粗提总DNA为模版的细菌18S rDNA的扩增产物。
具体实施方式
下面通过附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中试剂如无特殊说明均为常规试剂或用常规方法配制的试剂。
实施例1：本提取普洱茶渥堆发酵过程中微生物总DNA的方法，具体操作如下：
普洱茶渥堆发酵的样品采至正在生产过程中的普洱茶生产车间，采样点为普洱茶堆表面以下3cm处，多点采样混匀为1个样品（编号为1），取样时间为渥堆发酵10天（为一翻过后3天），堆芯温度64℃，含水量为23.88%。
（1）样品的洗涤：每个样品称取3g普洱茶样品，剪碎至0.5-1cm间大小，转入50mL离心管中，向样品加入30mL洗涤缓冲液，静置20min，超声波清洗仪中震荡10min，涡旋震荡60s后，取上清液；将上清液置于60℃水浴处理9min，100×g 离心2min，收集上清液，上清液6000×g离心8min，弃上清，在菌体沉淀中加入10mL洗涤缓冲液，混匀后转入10mL离心管中，涡旋震荡混匀，再在65℃水浴处理6min，6000g离心8min收集菌体，按照此方法重复洗涤2次菌体，洗涤至所得菌体颜色接近白色，离心沉淀后上清液无颜色；
（2）DNA的粗提：向步骤（1）中所收集到的菌体中加入液氮，使沉淀在液氮的作用下结成块状，置于研钵中，加入液氮充分研磨后，在普洱茶中以1.0mL/g的量加入DNA提取液，继续研磨充分后，提取液转移到离心管中，加入蛋白酶K（蛋白酶K的添加量为0.05mg/mL），在55℃下水浴处理30分钟，60℃水浴60分钟；然后加入等体积的的氯仿-异戊醇混合液（体积比24：1），摇匀后以10000g离心10min，回收水相于新的离心管中，重复提取一次；在回收的水相中加入水相等体积的异丙醇和1/10水相体积的3M醋酸钠，混匀后-20℃放置45分钟，15000×g下离心15分钟，沉淀用体积百分比浓度为75%的乙醇洗涤2次，室温干燥后，加入150μLddH2O，即得粗提的DNA溶液；
（3）DNA的纯化：在粗提的DNA溶液中加入RNase A酶（添加量为0.25mg/ mL），37℃水浴60min，用双蒸水稀释至500μL后加入等体积Tris饱和酚，充分混匀，室温下10000g离心10min，回收水相于新离心管中，加入等体积氯仿-异戊醇混合液（体积比24：1），充分混匀，室温下10000g离心10min，回收水相于新离心管中，在回收的水相中加入2倍水相体积无水乙醇和1/10水相体积的3M醋酸钠，混匀后-20℃放置30分钟，最后在15000×g下离心15分钟，取沉淀室温干燥后，加入150μLddH2O，即得纯化后的的DNA。
应用于本实施例中的洗涤缓冲液为含有100mM 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，50mM 乙二胺四乙酸二钠， 1%（W/V）聚乙烯吡咯烷酮，体积百分百0.05% （V/V）吐温20 ，1.5M NaCl，pH为8.0的溶液；
DNA提取液为含有100mM 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，20mM 乙二胺四乙酸二钠，1.5M NaCl ，2%（W/V）十六烷基三甲基溴化铵，1%（V/V）β-巯基乙醇的混合溶液；
分别对未纯化的粗提DNA和纯化后的DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，所用的琼脂糖电泳浓度为0.8%（W/V），电泳缓冲液为1×TAE，Marker最大条带为15kb，所使用的核酸染料为bioteke 核酸染料GLODVIEW，结果分别为图1泳道1，图2泳道1。
分别使用细菌16S rDNA、真菌的18 rDNA序列中保守序列进行PCR扩增，并检测结果，操作步骤如下：
选择细菌的16S rDNA扩增通用引物27F(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)和1492R：(5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3)为引物进行PCR扩增，引物间隔长度约1500bp。
20μL的PCR反应体系为：0.5μL未经纯化的DNA为模版，250μM dNTP each，引物0.1μM，10×Buffer（with MgCl2）2μL，TaqDNA聚合酶1U，加去离子水补足至20 μL，扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火35s，72℃延伸1.5min，32个循环；72℃延伸7min。
选择真菌的18S rDNA扩增通用引物ITS3:(5-GCATCGATGACGCAGC -3)和ITS4：(5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3)为引物进行PCR扩增，引物间隔长度约300bp，
20μL的PCR反应体系为：0.5μL未经纯化的DNA为模版，250μM dNTP each，引物0.1μM，10×Buffer（with MgCl2）2μL，TaqDNA聚合酶1U，加去离子水补足至20 μL，扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30min，32个循环；72℃延伸7min。
PCR扩增产物均采用1%的琼脂糖凝胶电泳，DNA分子标记采用大小为2000bp的Maker，其余方法按照上述微生物总DNA的琼脂糖电泳方法进行电泳检测，结果图3泳道1、图4泳道1。
经过琼脂糖凝胶电泳检测总DNA结果（见图1泳道1，图2泳道1）表明，所提取的DNA完整性好；经过琼脂糖凝胶电泳检测细菌通用引物PCR扩增产物结果(图3泳道1）与真菌通用引物PCR扩增产物结果(图4泳道1），表明分别在1500bp和300bp左右有明显的扩增条带，符合细菌和真菌的特征条带，表明该方法提取的微生物总DNA能同时提取出普洱茶渥堆发酵过程中细菌和真菌的总DNA，同时验证该种方法所提取的DNA即使没有后面的纯化步骤和稀释步骤依然能达到PCR反应的要求；此外，纯化后的DNA经过紫外分光光度仪上测定OD260/OD280=1.87，OD260/OD230=1.65，表明纯化后所提取的DNA纯度高，杂质含量少，提取的DNA可以满足分子生物学的实验需求。
实施例2：本提取普洱茶渥堆发酵过程中微生物总DNA的方法，具体操作如下：
普洱茶渥堆发酵的样品采至正在生产过程中的普洱茶生产车间，采样点为普洱茶堆表面以下3cm处，多点采样混匀1个样品（编号为2），取样时间为渥堆发酵20天（为二翻过后4天），堆芯温度63℃，含水量为23.24%。
（1）样品的洗涤：每个样品称取1g普洱茶样品，剪碎至0.5-1cm间大小，转入50mL离心管中，向样品加入20mL洗涤缓冲液，静置20min，超声波清洗仪中震荡15min，涡旋震荡45s后，取上清液；将上清液置于70℃水浴处理3min，200×g 离心1min，收集上清液，上清液8000×g离心6min，弃上清，在菌体沉淀中加入5mL洗涤缓冲液，混匀后转入10mL离心管中，涡旋震荡混匀，再在70℃水浴处理3min，8000g离心6min收集菌体，按照此方法反复洗涤菌体3次，洗涤至所得菌体颜色接近白色，离心沉淀后上清液无颜色；
（2）DNA的粗提：向步骤（1）中所收集到的菌体中加入液氮，使沉淀在液氮的作用下结成块状，置于研钵中，加入液氮充分研磨后，在普洱茶中以1.0mL/g的量加入DNA提取液，继续研磨充分后，提取液转移到离心管中，加入蛋白酶K（添加量为0.1mg/mL），在55℃下水浴处理30分钟，70℃水浴45分钟；然后加入等体积的的氯仿-异戊醇混合液（体积比24：1），摇匀后以10000g离心10min，回收水相于新的离心管中，重复提取一次；在回收的水相中加入水相等体积异丙醇和1/10水相体积的3M醋酸钠，混匀后-20℃放置30分钟，13000×g下离心20分钟，沉淀用体积百分比浓度为75%的乙醇洗涤2次，室温干燥后，加入50μLddH2O，即得粗提的DNA溶液；
（3）DNA的纯化：在粗提的DNA溶液中加入RNase A酶（添加量为0.5mg/ mL），37℃水浴120min，用双蒸水稀释至500μL后加入等体积Tris饱和酚，充分混匀，室温下10000g离心10min，回收水相于新离心管中，加入等体积氯仿-异戊醇混合液（体积比24：1），充分混匀，室温下10000g离心10min，回收水相于新离心管中，在回收的水相中加入2倍水相体积的无水乙醇和1/10水相体积的3M醋酸钠，混匀后-20℃放置20分钟，最后在13000×g下离心20分钟，取沉淀室温干燥后，加入50μLddH2O，即得纯化后的的DNA溶液。
应用于本实施例中的洗涤缓冲液为含有80mM 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，20mM 乙二胺四乙酸二钠，2%（W/V）聚乙烯吡咯烷酮，0.1%（V/V）吐温20 ，1M NaCl，pH为7.5的溶液；
DNA提取液为含有80mM 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，50mM 乙二胺四乙酸二钠，1M NaCl，1%（W/V）十六烷基三甲基溴化铵，1.5%（V/V）β-巯基乙醇的混合溶液；
分别对未纯化的粗提DNA和纯化后的DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测方法同实施例1，电泳结果分别为图1泳道2，图2泳道2
分别使用细菌16S rDNA、真菌的18 rDNA序列中保守序列进行PCR扩增，所用方法同实施例1，电泳结果分别为图3泳道2，图3泳道2。
经过琼脂糖凝胶电泳检测总DNA结果（见图1泳道2，图2泳道2）表明，所提取的DNA完整性好；经过琼脂糖凝胶电泳检测细菌通用引物PCR扩增产物结果(图3泳道2）与真菌通用引物PCR扩增产物结果(图4泳道2），表明分别在1500bp和300bp左右有明显的扩增条带，符合细菌和真菌的特征条带，表明该方法提取的微生物总DNA能同时提取出普洱茶渥堆发酵过程中细菌和真菌的总DNA，同时验证该种方法所提取的DNA即使没有后面的纯化步骤和稀释步骤依然能达到PCR反应的要求；此外，纯化后的DNA经过紫外分光光度仪上测定OD260/OD280=1.85，OD260/OD230=1.64表明纯化后所提取的DNA纯度高，杂质含量少，提取的DNA可以满足分子生物学的实验需求。
实施例3：本提取普洱茶渥堆发酵过程中微生物总DNA的方法，具体操作如下：
普洱茶渥堆发酵的样品采至正在生产过程中的普洱茶生产车间，采样点为普洱茶堆表面以下3cm处，多点采样混匀为1个样品（编号为3），取样时间为渥堆发酵30天（为三翻过后5天），堆芯温度62℃，含水量为23.11%。
（1）样品的洗涤：每个样品称取2g普洱茶样品，剪碎至0.5-1cm间大小，转入50mL离心管中，向样品加入25mL洗涤缓冲液，静置20min，超声波清洗仪中震荡12min，涡旋震荡50s后，取上清液；将上清液置于65℃水浴处理6min，150×g 离心1.5min，收集上清液，上清液7000g离心7min，弃上清，在菌体沉淀中加入7mL洗涤缓冲液，混匀后转入10mL离心管中，涡旋震荡混匀，再在60℃水浴处理9min，7000g离心7min收集菌体，按照此方法反复洗涤菌体2次，洗涤至所得菌体颜色接近白色，离心沉淀后上清液无颜色；
（2）DNA的粗提：向步骤（1）中所收集到的菌体中加入液氮，使沉淀在液氮的作用下结成块状，置于研钵中，加入液氮充分研磨后，在普洱茶中以1.0mL/g的量加入DNA提取液，继续研磨充分后，提取液转移到离心管中，加入蛋白酶K（添加量为0.06mg/mL），在55℃下水浴处理30分钟，65℃水浴50分钟；然后加入等体积的的氯仿-异戊醇混合液（体积比24：1），摇匀后以10000g离心10min，回收水相于新的离心管中，重复提取一次；在回收的水相中加入等体积异丙醇和1/10水相体积的3M醋酸钠，混匀后-20℃放置35分钟，14000×g下离心17分钟，沉淀用体积百分比浓度为75%的乙醇洗涤2次，室温干燥后，加入100μLddH2O，即得粗提的DNA溶液；
（3）DNA的纯化：在粗提的DNA溶液中加入RNase A酶（加入量为0.3mg/ mL），37℃水浴75min，用双蒸水稀释至500μL后加入等体积Tris饱和酚，充分混匀，室温下10000g离心10min，回收水相于新离心管中，加入等体积氯仿-异戊醇混合液（体积比24：1），充分混匀，室温下10000g离心10min，回收水相于新离心管中，在回收的水相中加入2倍水相体积无水乙醇和1/10水相体积的3M醋酸钠，混匀后-20℃放置25分钟，最后在14000×g下离心17分钟，取沉淀室温干燥后，加入100μLddH2O，即得纯化后的的DNA。
应用于本实施例中的洗涤缓冲液为含有90mM 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，30mM 乙二胺四乙酸二钠，1.5%（W/V） 聚乙烯吡咯烷酮，0.06%（W/V）吐温20 ，1.2M NaCl，pH为7.8的溶液；
DNA提取液为含有90mM 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，30mM 乙二胺四乙酸二钠，1.2M NaCl ，1.5%（W/V）十六烷基三甲基溴化铵，1%（V/V）β-巯基乙醇的混合溶液；
分别对未纯化的粗提DNA和纯化后的DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测方法同实施例1，电泳结果分别为图1泳道3，图2泳道3
分别使用细菌16S rDNA、真菌的18 rDNA序列中保守序列进行PCR扩增及检测，所用方法同实施例1，电泳结果分别为图3泳道3，图3泳道3
经过琼脂糖凝胶电泳检测总DNA结果（见图1泳道3，图2泳道3）表明，所提取的DNA完整性好；经过琼脂糖凝胶电泳检测细菌通用引物PCR扩增产物结果(图3泳道3）与真菌通用引物PCR扩增产物结果(图4泳道3），表明分别在1500bp和300bp左右有明显的扩增条带，符合细菌和真菌的特征条带，表明该方法提取的微生物总DNA能同时提取出普洱茶渥堆发酵过程中细菌和真菌的总DNA，同时验证该种方法所提取的DNA即使没有后面的纯化步骤和稀释步骤依然能达到PCR反应的要求；此外，纯化后的DNA经过紫外分光光度仪上测定OD260/OD280=1.89，OD260/OD230=1.66表明纯化后所提取的DNA纯度高，杂质含量少，提取的DNA可以满足分子生物学的实验需求。
序列表
<110> 昆明理工大学
<120> 一种提取普洱茶渥堆发酵过程中微生物总DNA的方法
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggttaccttg ttacgactt 19
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcatcgatga cgcagc 16
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tcctccgctt attgatatgc 20
Claims (4)
1.一种提取普洱茶渥堆发酵过程中微生物总DNA的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）样品的预处理：取1-3g普洱茶渥堆发酵过程中的茶叶，剪碎至0.5-1cm，在茶叶中加入20-30mL洗涤缓冲液，静置20min后，超声波清洗仪中震荡处理10-15min，再涡旋震荡45-60s，取上清液；将上清液置于60-70℃水浴处理3-9min，低速离心后，取上清液高速离心收集菌体，在菌体中加入5-10mL洗涤缓冲液，混匀，再在60-70℃水浴处理3-9min，高速离心收集菌体；重复上述洗涤过程2-3次，直到菌体颜色接近白色，离心沉淀后上清液无颜色；
（2）DNA的粗提：向步骤（1）中所收集到的菌体中加入液氮，充分研磨后，在菌体中以1.0mL/g的量加入DNA提取液，继续研磨充分后，加入蛋白酶K，55℃水浴处理30min，60-70℃水浴处理45~60min；然后加入等体积的的氯仿-异戊醇混合液，摇匀后10000g离心10min，回收水相，重复提取一次；在回收的水相中加入水相等体积的异丙醇和1/10水相体积的3M醋酸钠，混匀后-20℃放置30-45分钟，13000~15000g离心15~20分钟，沉淀用体积百分比浓度为75%的乙醇洗涤2次，室温干燥后，加入50~150μLddH2O，即得粗提的DNA溶液；
（3）DNA的纯化：在粗提的DNA溶液中加入RNase A，37℃水浴1-2h，用双蒸水稀释至500μL后，加入等体积Tris饱和酚，充分混匀，室温下10000g离心10min，回收水相并在其中加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，充分混匀，室温下10000g离心10min，回收水相，在回收的水相中加入2倍水相体积的无水乙醇和1/10水相体积的3M醋酸钠，混匀后-20℃放置20-30分钟，最后在13000~15000g下离心15~20分钟，取沉淀室温干燥后，加入50-150μLddH2O，即得纯化后的DNA；
其中所述洗涤缓冲液是含有80~100mM 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，20~50mM 乙二胺四乙酸二钠，质量体积百分比1~2%聚乙烯吡咯烷酮， 体积百分比0.05~0.1%吐温20 和1~1.5M NaCl， pH为7.5~8.0的溶液；
所述DNA提取液是含有80~100mM 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，20~50mM 乙二胺四乙酸二钠，1~1.5M NaCl，质量体积百分比1~2%十六烷基三甲基溴化铵和体积百分比1~2%β-巯基乙醇的混合溶液；
所述低速离心是指100~200g离心1~2min，高速离心是指6000~8000g离心6~8min。
2.根据权利要求1所述的提取普洱茶渥堆发酵过程中微生物总DNA的方法，其特征在于：蛋白酶K的添加量为0.05~0.1mg/mL。
3.根据权利要求1所述的提取普洱茶渥堆发酵过程中微生物总DNA的方法，其特征在于：氯仿-异戊醇混合液是氯仿和异戊醇按体积比24：1混合的溶液。
4.根据权利要求1所述的提取普洱茶渥堆发酵过程中微生物总DNA的方法，其特征在于： RNaseA在粗提DNA溶液中的添加量为0.25~0.5mg/ mL。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20131127 Termination date: 20150604 |
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| EXPY | Termination of patent right or utility model |