CN103184215A - 一种从大鲵体表粘液中提取基因组dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种从大鲵体表粘液中提取基因组DNA的方法。所述方法按下列步骤进行：1、保存样本；2、置换乙醇；3、裂解细胞；4、沉淀蛋白；5、沉淀DNA；6、洗涤DNA；7、获取DNA。将160微升1mol/L的氯化钠水溶液、40微升100mmol/LpH值为8.0的Tris–HCl水溶液、2微升浓度为100mmol/L且pH值为8.0的EDTANa2水溶液，在常温下混匀，加入160微升质量百分比浓度为10%的SDS水溶液和20微升浓度为10mg/mL的蛋白酶K水溶液，迅速混匀，制成所需的裂解液。本发明采用大鲵体表粘液或褪皮作为基因组DNA提取材料，对大鲵机体不造成任何损伤。
Description
技术领域
本发明涉及到生物工程领域，特别涉及到一种从大鲵体表粘液中提取基因组DNA的方法。
背景技术
大鲵（Andrias）隶属于两栖纲有尾目真螈类隐鳃鲵科，是世界上现存个体最大的两栖动物。隐鳃鲵科现存2属3种，其中大鲵属有2个种，即分布于我国的中国大鲵（Andrias davidianus Blanchard, 1871）和分布在日本的日本大鲵（Andrias japonicus Temminck, 1836）；隐鳃鲵属仅有隐鳃鲵（Cryptobranshus alleganiensis Daudin, 1803）一个种，分布于美国东北部，又称美洲大鲵。由于人类活动的不断增多，如水库修建、森林砍伐、矿山开采、化肥农药使用等使大鲵的栖息地遭到严重破坏，以及人为的过度捕捞使大鲵的自然种群数量不断下降，甚至造成某些种群的灭绝。目前，隐鳃鲵科这三个现存物种都处于不同程度的濒危状态。如何保护现存的野生种群，恢复自然栖息地的生态功能、采取科学的繁殖配对措施以避免近交衰退和遗传多样性丢失，已成为当前大鲵保护和养殖中面临的关键问题。从物种保护的角度，种群遗传结构研究可以鉴定种群的遗传信息，变化规律，指导具体的生态恢复实践，避免在人工繁殖过程中近亲交配以及帮助管理者划定保护区、制定保护计划等。目前国内外已经开展了一些有关大鲵种群遗传和分子生物学相关的研究工作，但大多以大鲵的肌肉、肝脏、血液等组织作为材料提取基因组DNA，对大鲵的机体造成损伤，既违背了保护的目的又对有限的大鲵资源造成一定的损失。同时现有技术多采用传统酚—氯仿法提取大鲵基因组，操作步骤繁多，费时费力，且对实验操作人员和环境具有一定的危害。
发明内容
本发明的目的在于提供一种既经济可行又操作简便，且不伤害大鲵本体的从大鲵体表粘液中提取基因组DNA的方法，其目的一为保护濒危水生物种，其目的二为满足遗传育种和科学研究的需要。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种从大鲵体表粘液中提取基因组DNA的方法，其特征在于：所述方法按下列步骤进行：
1、保存样本：无创伤的从大鲵体表采集大鲵体表粘液或体表褪皮，将采集到的粘液或体表褪皮置于体积百分比浓度为90%的乙醇中脱水，并在常温常压下保存；
2、置换乙醇：将步骤（1）中所保存的大鲵体表粘液或体表褪皮取出，置于无菌EP管中，加入无菌蒸馏水，在4-10 °C的温度下浸泡4-8小时，弃去上清液，留下粘液块备用；
3、裂解细胞：向步骤（2）获得的粘液块中加入400微升裂解液，颠倒混匀，在37-56 °C的温度下孵育4-8小时，在前3个小时内每隔30分钟轻轻摇动无菌EP管，以利于释放DNA；
4、沉淀蛋白：向步骤（3）的裂解液中，加入300微升浓度为6 mol/L氯化钠饱和溶液，立即剧烈震动10-30秒，在常温下用离心机在转速为12000转/分钟离心分离10-15分钟，然后收取上清液备用；
5、沉淀DNA：向步骤（4）获取的上清液中加入等体积的异丙醇，在-20至-30 °C温度下放置2-6小时，在4-10 °C温度下，用离心机在转速为12000转/分钟离心分离10-15分钟，然后收取沉淀沉淀物备用；
6、洗涤DNA：向步骤（5）获得的沉淀物中加入体积百分比浓度为70%的乙醇溶液，洗涤沉淀物1-3次；
7、获取DNA：向步骤（6）获取的洗涤后的沉淀物中加入30微升无菌超纯水，使沉淀物溶解，此时获得大鲵的基因组DNA，并在-20至-30 °C条件下保存备用。
所述步骤3中裂解液按下列方法制备：在常温下，将160微升浓度为 1 mol/L的 氯化钠水溶液、40微升浓度为100 mmol/L且 pH值为8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐水溶液、2微升浓度为100 mmol/L且 pH值为8.0的乙二胺四乙酸二钠水溶液，在常温下混匀，然后加入160微升质量百分比浓度为10%的十二烷基硫酸钠水溶液和20微升浓度为10 mg/mL 的蛋白酶K水溶液，迅速混匀，制成裂解细胞时所需的裂解液。
本发明的积极效果为：
1、本发明采用大鲵体表粘液或褪皮作为基因组DNA提取材料，对大鲵机体不造成任何损伤；
2、该方法提取材料直接固定于酒精中，方便保存；
3、所述提取的DNA方法区别于传统的酚—氯仿法，简便快速；
4、该方法所提取的DNA能用于大鲵基因指纹分析、亲子鉴定、家系结构组成等遗传学和分子生物学应用与基础研究中。
附图说明
图1、基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图；
图中：M：为DL2000的分子量标准；1：为大鲵体表粘液为材料提取的基因组；2：为大鲵体表褪的皮为材料提取的基因组。
图2、PCR扩增琼脂凝胶电泳图；
图中：M：为DL2000的分子量标准；1：为大鲵体表粘液为材料提取的基因组；2：为大鲵体表褪的皮为材料提取的基因组。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明的具体实施方式。
实施例一
1、裂解液的制备
将160微升 1 mol/L 氯化钠（NaCl）水溶液、40微升100 mmol/L pH值为8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris–HCl）水溶液、2微升100 mmol/L 且pH值为8.0乙二胺四乙酸二钠（EDTANa2）水溶液在常温下混匀，然后加入160微升质量百分比浓度为10%的十二烷基硫酸钠（SDS）水溶液和20微升浓度为10 mg/mL 的蛋白酶K水溶液，并迅速混匀制成所需的裂解液。
2、保存样本：无创伤的从大鲵体表采集大鲵体表粘液或体表褪皮，将采集到的粘液或体表褪皮置于体积百分比浓度为90%的乙醇中脱水，并在常温常压下保存备用；
3、置换乙醇：将步骤2中所获取的粘液或褪皮取出，置于无菌EP管中，加入无菌蒸馏水，在4°C的温度下浸泡8小时，弃去上清液，留下粘液块备用；
4、裂解细胞：向步骤3获得的粘液块中加入400微升裂解液，颠倒混匀，在56 °C的温度下孵育8小时，在前3个小时内每隔30分钟轻轻摇动无菌EP管，以利于释放DNA；
5、沉淀蛋白：向步骤4的裂解液中，加入300微升浓度为6 mol/L氯化钠饱和溶液，立即剧烈震动30秒，在常温下用离心机在转速为12000转/分钟离心分离15分钟，然后收取上清液备用；
6、沉淀DNA：向步骤5获取的上清液中加入等体积的异丙醇，在-20°C温度下放置6小时，在4°C温度下，用离心机在转速为12000转/分钟离心分离10分钟，然后收取沉淀沉淀物备用；
7、洗涤DNA：向步骤6获得的沉淀物中加入体积百分比浓度为70%的乙醇溶液，洗涤沉淀物3次；
8、获取DNA：向步骤7获取的洗涤后的沉淀物中加入30微升无菌超纯水，使沉淀物溶解，此时获得大鲵的基因组DNA，并在-20°C条件下保存备用。
实例二
1、裂解液的制备
将160微升 1 mol/L 氯化钠（NaCl）水溶液、40微升100 mmol/L pH值为8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris–HCl）水溶液、2微升100 mmol/L 且pH值为8.0乙二胺四乙酸二钠（EDTANa2）水溶液在常温下混匀，然后加入160微升质量百分比浓度为10%的十二烷基硫酸钠（SDS）水溶液和20微升浓度为10 mg/mL 的蛋白酶K水溶液，并迅速混匀制成所需的裂解液。
2、保存样本：无创伤的从大鲵体表采集大鲵体表粘液或体表褪皮，将采集到的粘液或体表褪皮置于体积百分比浓度为90%的乙醇中脱水，并在常温常压下保存备用；
3、置换乙醇：将步骤2中所获取的粘液或褪皮取出，置于无菌EP管中，加入无菌蒸馏水，在10°C的温度下浸泡4小时，弃去上清液，留下粘液块备用；
4、裂解细胞：向步骤3获得的粘液块中加入400微升裂解液，颠倒混匀，在37 °C的温度下孵育6小时，在前3个小时内每隔30分钟轻轻摇动无菌EP管，以利于释放DNA；
5、沉淀蛋白：向步骤4的裂解液中，加入300微升浓度为6 mol/L氯化钠饱和溶液，立即剧烈震动20秒，在常温下用离心机在转速为12000转/分钟离心分离10分钟，然后收取上清液备用；
6、沉淀DNA：向步骤5获取的上清液中加入等体积的异丙醇，在-25°C温度下放置4小时，在10°C温度下，用离心机在转速为12000转/分钟离心分离15分钟，然后收取沉淀沉淀物备用；
7、洗涤DNA：向步骤6获得的沉淀物中加入体积百分比浓度为70%的乙醇溶液，洗涤沉淀物2次；
8、获取DNA：向步骤7获取的洗涤后的沉淀物中加入30微升无菌超纯水，使沉淀物溶解，此时获得大鲵的基因组DNA，并在-25°C条件下保存备用。
实施例三
1、裂解液的制备
将160微升 1 mol/L 氯化钠（NaCl）水溶液、40微升100 mmol/L pH值为8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris–HCl）水溶液、2微升100 mmol/L 且pH值为8.0乙二胺四乙酸二钠（EDTANa2）水溶液在常温下混匀，然后加入160微升质量百分比浓度为10%的十二烷基硫酸钠（SDS）水溶液和20微升浓度为10 mg/mL 的蛋白酶K水溶液，并迅速混匀制成所需的裂解液。
2、保存样本：无创伤的从大鲵体表采集大鲵体表粘液或体表褪皮，将采集到的粘液或体表褪皮置于体积百分比浓度为90%的乙醇中脱水，并在常温常压下保存备用；
3、置换乙醇：将步骤2中所获取的粘液或褪皮取出，置于无菌EP管中，加入无菌蒸馏水，在8°C的温度下浸泡6小时，弃去上清液，留下粘液块备用；
4、裂解细胞：向步骤3获得的粘液块中加入400微升裂解液，颠倒混匀，在48 °C的温度下孵育4小时，在前3个小时内每隔30分钟轻轻摇动无菌EP管，以利于释放DNA；
5、沉淀蛋白：向步骤4的裂解液中，加入300微升浓度为6 mol/L氯化钠饱和溶液，立即剧烈震动10秒，在常温下用离心机在转速为12000转/分钟离心分离12分钟，然后收取上清液备用；
6、沉淀DNA：向步骤5获取的上清液中加入等体积的异丙醇，在-30°C温度下放置2小时，在6°C温度下，用离心机在转速为12000转/分钟离心分离12分钟，然后收取沉淀沉淀物备用；
7、洗涤DNA：向步骤6获得的沉淀物中加入体积百分比浓度为70%的乙醇溶液，洗涤沉淀物1次；
8、获取DNA：向步骤7获取的洗涤后的沉淀物中加入30微升无菌超纯水，使沉淀物溶解，此时获得大鲵的基因组DNA，并在-30°C条件下保存备用。
实例检测结果
1、将所获得的DNA进行进行1%琼脂糖凝胶电泳（见图1），电泳结果显示，从大鲵的体表粘液和体表褪的皮中均可提取到基因组DNA。
2、将获取的基因组作为模板应用线粒体NADH1基因分子标记引物（上游引物：ATGGCAGAGCTTGGTAATTGCAAAAG；下游引物：GGATTTTAACCTCTATATTACACTC）进行聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）。PCR扩增体系为25微升，含有50纳克基因组DNA，0.5单位Taq DNA聚合酶，1× PCR缓冲液（含有1.5 mmol/L Mg2+），上下游引物各0.25 μmol/L引物，150 μmol/L dNTP。PCR反应条件如下：94 °C 5 min；94 °C 45 s，58 °C 45 s，72 °C 1 min，循环35次；72 °C 10 min。PCR结束后，将产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳（见图2），结果显示所提取的基因组DNA可以较好的扩增到目的基因。
以上所述仅是本发明的非限定实施方式，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思和不作出创造性劳动的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种从大鲵体表粘液中提取基因组DNA的方法，其特征在于：所述方法按下列步骤进行：
（1）保存样本：无创伤的从大鲵体表采集大鲵体表粘液或体表褪皮，将采集到的粘液或体表褪皮置于体积百分比浓度为90%的乙醇中脱水，并在常温常压下保存；
（2）置换乙醇：将步骤（1）中所保存的大鲵体表粘液或体表褪皮取出，置于无菌EP管中，加入无菌蒸馏水，在4-10 ℃的温度下浸泡4-8小时，弃去上清液，留下粘液块备用；
（3）裂解细胞：向步骤（2）获得的粘液块中加入400微升裂解液，颠倒混匀，在37-56 ℃的温度下孵育4-8小时，在前3个小时内每隔30分钟轻轻摇动无菌EP管，以利于释放DNA；
（4）沉淀蛋白：向步骤（3）的裂解液中，加入300微升浓度为6 mol/L氯化钠饱和溶液，立即剧烈震动10-30秒，在常温下用离心机在转速为12000转/分钟离心分离10-15分钟，然后收取上清液备用；
（5）沉淀DNA：向步骤（4）获取的上清液中加入等体积的异丙醇，在-20至-30 ℃温度下放置2-6小时，在4-10 ℃温度下，用离心机在转速为12000转/分钟离心分离10-15分钟，然后收取沉淀沉淀物备用；
（6）洗涤DNA：向步骤（5）获得的沉淀物中加入体积百分比浓度为70%的乙醇溶液，洗涤沉淀物1-3次；
（7）获取DNA：向步骤（6）获取的洗涤后的沉淀物中加入30微升无菌超纯水，使沉淀物溶解，此时获得大鲵的基因组DNA，并在-20至-30 ℃条件下保存备用。
2.根据权利要求1所述的从大鲵体表粘液中提取基因组DNA的方法，其特征在于：步骤（3）中所述裂解液按下列方法制备：常温下，将160微升浓度为 1 mol/L的 氯化钠水溶液、40微升浓度为100 mmol/L且 pH值为8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐水溶液、2微升100 mmol/L且 pH值为8.0的乙二胺四乙酸二钠水溶液，在常温下混匀，然后加入160微升质量百分比浓度为10%的十二烷基硫酸钠水溶液和20微升浓度为10 mg/mL的蛋白酶K水溶液，迅速混匀，制成裂解细胞时所需的裂解液。
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