CN111575277A - 一种提取单个摇蚊科蛹期蜕皮dna的方法 - Google Patents

一种提取单个摇蚊科蛹期蜕皮dna的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提取单个摇蚊科蛹期蜕皮DNA的方法。属于动物分子生物学技术领域。该方法包括如下步骤：预处理、裂解离心、洗脱、富集、酶解、抽提、离心、沉淀、溶解、扩增和电泳检测。与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：用蒸馏水处理用以去除杂质，防止干扰提取；通过0.9％NaCl溶液缓慢的渗透作用影响，能使摇蚊蛹期蜕皮上残存的细胞在温和的状态下，逐渐恢复生理活性，并促使细胞中交联的蛋白质与DNA逐步解离；采用本发明方法提取的摇蚊科蛹期蜕皮DNA浓度可达到0.908ng/μl，纯度可达到1.89。

Description

一种提取单个摇蚊科蛹期蜕皮DNA的方法
技术领域
本发明涉及动物分子生物学技术领域，更具体的说是涉及一种提取单个摇蚊科蛹期蜕皮DNA的方法。
背景技术
摇蚊，为昆虫纲双翅目长角亚目昆虫。因不同种属之间生态要求和生活习性的多样性，对环境因子敏感性的差异使得他们成为水环境生物监测的优良指示物。某些种类可携带病原体引起哮喘、霍乱、皮炎等疾病，危害人类健康，一些种类是重要的农业和渔业害虫，危害水稻、莼菜等农作物。
摇蚊蛹期是正在发育中的、具有双层体壁的成虫雏体，它衔接了幼虫和成虫两个阶段，既与两个虫态有部分相似的结构、性状，又具独特的形态特征和生活习性。蛹期研究在摇蚊亚科高级阶元研究中具有重要价值。此外，摇蚊蛹期蜕皮能快速、全面的了解采集样点的物种组成，其研究成果可广泛应用于系统学、分类学和生物多样性等领域。
然而，由于不同属种摇蚊科蛹期蜕皮形态差异较小，因此在摇蚊蛹的准确鉴定方面存在一定困难。近年来，结合DNA条形码技术对不同虫期的配套研究已成为研究热点，被广泛应用于物种鉴定方面。DNA条形码技术可以有效解决摇蚊科不同虫态配套、近缘种区分以及部分物种的快速鉴定问题。
DNA条形码数据的获得一般包括以下几个步骤：提取总DNA，PCR扩增目的基因，琼脂糖凝胶电泳和微量蛋白核酸仪检测，割胶回收纯化，测序，分析和处理数据。其中，提取总DNA这一步非常关键，直接影响了后续扩增、测序和鉴定的准确性。
相对于幼虫和成虫，摇蚊蛹期蜕皮时残留的DNA数量很少，使用传统CTAB法重复10次依然无法提取出蛹皮DNA，仅存在痕量DNA。通过传统的CTAB、SDS、NaCl和试剂盒法等提取DNA时前期DNA从蛹皮中无法完全脱离和有效富集，获得的总DNA纯度和质量达不到后续实验要求，目前常规提取DNA方法提取摇蚊蛹期蜕皮的平均DNA量为0.003ng/μl～0.020ng/μl,导致摇蚊蛹皮的分子鉴定难以进行。
综上，如何提供一种质量高、纯度大的提取摇蚊科蛹期蜕皮痕量DNA的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种提取单个摇蚊科蛹期蜕皮DNA的方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种提取单个摇蚊科蛹期蜕皮DNA的方法，包括如下步骤：
(1)预处理：经过蒸馏水除杂和0.9％NaCl溶液浸泡处理得到预处理摇蚊蛹期蜕皮；
用蒸馏水处理用以去除杂质，防止干扰提取；
通过0.9％NaCl溶液缓慢的渗透作用影响，能使摇蚊蛹期蜕皮上残存的细胞在温和的状态下，逐渐恢复生理活性，并促使细胞中交联的蛋白质与DNA逐步解离。
(2)裂解离心：取预处理摇蚊蛹期蜕皮加入裂解液进行研磨，之后8000rpm离心1min，取上清液1；
(3)洗脱、富集：将所述上清液1经过硅胶膜离心吸附柱洗脱后得到摇蚊蛹期蜕皮粗DNA；
洗脱液成分包括10mmol/L的Tris-HCl和1mmol/L的EDTA，pH＝8.5；
(4)酶解：使用蛋白酶K和RNA酶对摇蚊蛹期蜕皮粗DNA进行酶解，得酶解液；
(5)抽提、离心、沉淀、溶解：将酶解液依次经氯仿-异戊醇、等体积的饱和酚和氯仿-异戊醇、异丙醇和75％乙醇处理后，即得到摇蚊蛹期蜕皮DNA，之后用ddH2O进行溶解；
(6)扩增、电泳检测。
优选的，步骤(1)的具体操作为：
(11)蒸馏水除杂：取单个摇蚊蛹期蜕皮，使用25℃蒸馏水浸泡5～8min，之后更换蒸馏水重复1次；
(12)0.9％NaCl溶液浸泡处理：蒸馏水除杂后，使用0.9％NaCl溶液浸泡1h，之后更换0.9％NaCl重复2次。
优选的，蒸馏水和0.9％NaCl溶液的添加量均为完全没过摇蚊蛹期蜕皮1～2cm高度。
优选的，步骤(2)中所述裂解液的成分包括：终质量浓度2％的CTAB、终质量浓度0.5％的SDS、0.03M的EDTA、0.1M的Tris-HCl、1M的NaCl、终质量浓度1％的PVP和终质量浓度0.1％的β-巯基乙醇。
优选的，步骤(2)中可将所述预处理摇蚊蛹期蜕皮先处理成长、宽均小于2mm的小段。
处理成长、宽均小于2mm的小段可以促使裂解完全。
优选的，步骤(3)的具体操作为：
(31)取硅胶膜离心吸附柱加入上清液1，之后加入等体积0.01mol/L的PBS缓冲液，震荡混匀，将硅胶膜离心吸附柱放入收集管，静止5～8min后，10000rpm离心1min，弃废液；
(32)用洗脱液反复冲洗硅胶膜离心吸附柱，静止5～8min后，10000rpm离心1min，弃废液；
(33)向硅胶膜离心吸附柱中添加65℃预热的洗脱液，充分震荡后室温放置10min，10000rpm离心2分钟，重复1次，收集管中液体即为摇蚊蛹期蜕皮粗DNA。
优选的，步骤(4)的具体操作为：向步骤(3)得到的摇蚊蛹期蜕皮粗DNA中添加20μl蛋白酶K及15μl RNA酶，混匀后，68℃水浴进行过夜消化处理，在最初3h内，每30min手动颠倒混合摇匀一次。
优选的，步骤(5)的具体操作为：
(51)向酶解液中加入氯仿-异戊醇溶液，混匀后静置，之后10000rpm离心25min，取上清液，重复此操作1次，将两次上清液混合得上清液2；
氯仿和异戊醇的体积比为24:1；
(52)向上清液2中加入饱和酚和氯仿-异戊醇溶液，混匀后静置15min，之后8000rpm离心5min，取上清，得上清液3；
所述饱和酚和氯仿-异戊醇溶液体积相等；
氯仿和异戊醇的体积比为24:1；
(53)向上清液3中添加其0.5倍体积的异丙醇，混匀，于冰上沉淀20min，9000rpm离心25min，弃上清，得沉淀1；
(54)向沉淀1中加入75％乙醇，12000rpm离心7min，弃上清，重复该操作1次，即得到摇蚊科蛹期蜕皮DNA；
(55)之后加入ddH2O进行溶解。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：(1)用蒸馏水处理用以去除杂质，防止干扰提取；(2)通过0.9％NaCl溶液缓慢的渗透作用影响，能使摇蚊蛹期蜕皮上残存的细胞在温和的状态下，逐渐恢复生理活性，并促使细胞中交联的蛋白质与DNA逐步解离；(3)采用本发明方法提取的摇蚊科蛹期蜕皮DNA浓度可达到0.908ng/μl，纯度可达到1.89。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明方法的流程图；
图2附图为本发明实施例2中PCR扩增COI基因图，其中，第1泳道为8Kp Marker，第2、3、4、5泳道分别为同物种、同大小、相同羽化时间摇蚊科蛹期蜕皮(红裸须摇蚊Propsilocerus akamusi)提取DNA之后的PCR结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
CTAB、SDS、EB购自普博欣生物工程有限公司；
EDTA、Tris-HCl、蛋白酶K、dNTPs、Taq酶购自上海生工；
RNA酶、硅胶膜离心吸附柱购自北京鼎国生物工程有限公司。
本发明未提及的药剂为常规实验药剂，采购自市售渠道；未提及的实验方法为常规实验方法，在此不再一一赘述。
实施例1
(1)预处理：
(11)取单个摇蚊蛹期蜕皮，用25℃蒸馏水浸泡5min，之后更换蒸馏水重复1次，蒸馏水添加量为完全没过摇蚊蛹期蜕皮1～2cm高度，用以去除杂质，防止干扰提取。
(12)蒸馏水浸泡后，再使用0.9％NaCl溶液浸泡，添加量为完全没过摇蚊蛹期蜕皮1-2cm高度，每1h换一次，换两次共计3h，得预处理摇蚊蛹期蜕皮。
(2)裂解离心：
(21)裂解液的配制：称取CTAB 2g、SDS 0.5g、0.5M的EDTA 6ml、1M的Tris-HCl10ml、5M NaCl 20ml、PVP1g和β-巯基乙醇0.1ml，蒸馏水补至100ml。
(22)将预处理摇蚊蛹期蜕皮置于Ep管内，使用解剖剪将摇蚊蛹期蜕皮剪碎成长、宽均小于2mm的小段，添加1.5ml裂解液，用研磨棒对其进行充分研磨，8000rpm离心1min，得上清液1。
(3)洗脱、富集：
(31)洗脱液的配制：包括10mmol/L Tris-HCl和1mmol/L EDTA，pH＝8.5。
(32)取1支硅胶膜离心吸附柱，加入上清液1，加入等体积0.01mol/L的PBS缓冲液，震荡混匀，将硅胶膜离心吸附柱放入收集管，静止5min后，10000rpm离心1min。倒掉收集管中的废液。
(33)用200μl洗脱液反复冲洗硅胶膜离心吸附柱，静止5min后，10000rpm离心1min，将废液倒掉。向吸附柱中添加100μl65℃预热的洗脱液，充分震荡洗脱残存的DNA，室温放置10min后，10000rpm离心2分钟，再添加100μl65℃预热的洗脱液至硅胶膜离心吸附柱膜中央，10000rpm离心2分钟后，将收集管中的液体转移到Ep管中，即为富集的摇蚊蛹期蜕皮粗DNA。
(4)酶解：
向Ep管中添加20μl蛋白酶K，再加入15μl RNA酶，混匀后，将Ep管置于68℃水浴锅中进行过夜消化处理。在刚开始水浴加热的3h内，每30min对样品手动颠倒混合摇匀一次。
(5)抽提、离心、沉淀、溶解：
(51)酶解后，向Ep管中加入450μl氯仿-异戊醇(氯仿：异戊醇体积比＝24:1)，上下颠倒混匀，静置5min后，在10000rpm的离心机中离心25min，留上清液，转移到另一个Ep管中，重复此操作一次，将两次离心的上清液均转移至同一Ep管中，得上清液2。
(52)向上清液2中加300μl饱和酚和300μl氯仿-异戊醇(氯仿：异戊醇体积比＝24:1)，充分摇晃混匀后静置15min，于8000rpm离心5min，取上清，转移到另一Ep管中，得上清液3。
(53)向上清液3中添加0.5倍其体积的异丙醇，混匀，于冰上沉淀20min，9000rpm离心25min，弃上清，得沉淀1。
(54)向沉淀1中加400μl 75％乙醇，12000rpm离心7min，弃上清。重复该操作一次，即得摇蚊蛹期蜕皮DNA。
(55)加30μl ddH2O对摇蚊蛹期蜕皮DNA进行溶解。
实施例2 PCR扩增线粒体细胞色素C氧化酶亚基I基因(COI基因)
(1)PCR反应体系：
总体系50μl：ddH2O 32.4μl，10ⅹPCR Buffer 5μl，dNTPs(2.5mmol/L)4μl，通用引物LCO和HCO(10μmol/L)各2μl，Taq酶(500U，2.5U/ul)0.6μl，DNA模板4μl。
(2)PCR反应条件：
94℃预变性5min；94℃变性10s；55℃退火30s；72℃延伸60s；35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
(3)配置1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，结果如图2所示。
图2中，第1泳道为8Kp Marker，第2、3、4、5泳道分别为同物种、同大小、相同羽化时间摇蚊科蛹期蜕皮(红裸须摇蚊Propsilocerus akamusi)提取DNA之后的PCR结果，经过四组重复可得本发明方法可稳定获得摇蚊蛹期蜕皮DNA并能成功扩增。
(2)COI基因约为658bp，在Marker第1、2条带之间，结果符合预期。
实施例3 DNA提取方法对比试验
验证常规方法与实施例1记载方法对单个摇蚊蛹期蜕皮DNA提取的效果差异。
通过传统CTAB方法、市场售卖DNA提取试剂盒按照步骤方法以及实施例1记载的方法，取1μl经过ddH2O溶解后的，按照CTAB方法、试剂盒方法和实施例1记载方法提取的DNA，使用NanoDrop 2000仪器检测。
NanoDrop 2000使用高能量氙灯，光线透过测试的样品后，部分光线被吸收，NanoDrop通过将透过样品后成分复杂的光分解为光谱线，计算样品的吸光值从而转化成样品的浓度。
计算公式：A＝-lg(I/I0)＝-lgT＝kLc，
其中，A为吸光度；k为摩尔吸收系数；L为被分析物质的光程；c为物质的浓度。
同时在此过程中，可同时测定OD260和OD280的比值。
测定结果如表1所示。
表1 DNA提取方法对比试验结果
比较 总DNA的浓度(ng/μl) 纯度(OD<sub>260</sub>/OD<sub>280</sub>)
CTAB方法 0.003 0.92
E.Z.N.A试剂盒 0.010 1.00
Qiangen试剂盒 0.020 1.02
本发明的方法 0.908 1.89
结论：本发明的方法较常规方法DNA浓度高，纯度高。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (8)

1.一种提取单个摇蚊科蛹期蜕皮DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)预处理：经过蒸馏水除杂和0.9％NaCl溶液浸泡处理得到预处理摇蚊蛹期蜕皮；
(2)裂解离心：取预处理摇蚊蛹期蜕皮加入裂解液进行研磨，之后8000rpm离心1min，取上清液1；
(3)洗脱、富集：将所述上清液1经过硅胶膜离心吸附柱洗脱后得到摇蚊蛹期蜕皮粗DNA；
洗脱液成分包括10mmol/L的Tris-HCl和1mmol/L的EDTA，pH＝8.5；
(4)酶解：使用蛋白酶K和RNA酶对摇蚊蛹期蜕皮粗DNA进行酶解，得酶解液；
(5)抽提、离心、沉淀、溶解：将酶解液依次经氯仿-异戊醇、等体积的饱和酚和氯仿-异戊醇、异丙醇和75％乙醇处理后，即得到摇蚊蛹期蜕皮DNA，之后用ddH2O进行溶解；
(6)扩增、电泳检测。
2.如权利要求1所述的一种提取单个摇蚊科蛹期蜕皮DNA的方法，其特征在于，步骤(1)的具体操作为：
(11)蒸馏水除杂：取单个摇蚊蛹期蜕皮，使用25℃蒸馏水浸泡5～8min，之后更换蒸馏水重复1次；
(12)0.9％NaCl溶液浸泡处理：蒸馏水除杂后，使用0.9％NaCl溶液浸泡1h，之后更换0.9％NaCl重复2次。
3.如权利要求1所述的一种提取单个摇蚊科蛹期蜕皮DNA的方法，其特征在于，蒸馏水和0.9％NaCl溶液的添加量均为完全没过摇蚊蛹期蜕皮1～2cm高度。
4.如权利要求1所述的一种提取单个摇蚊科蛹期蜕皮DNA的方法，其特征在于，步骤(2)中所述裂解液的成分包括：终质量浓度2％的CTAB、终质量浓度0.5％的SDS、0.03M的EDTA、0.1M的Tris-HCl、1M的NaCl、终质量浓度1％的PVP和终质量浓度0.1％的β-巯基乙醇。
5.如权利要求1所述的一种提取单个摇蚊科蛹期蜕皮DNA的方法，其特征在于，步骤(2)中可将所述预处理摇蚊蛹期蜕皮先处理成长、宽均小于2mm的小段。
6.如权利要求1所述的一种提取单个摇蚊科蛹期蜕皮DNA的方法，其特征在于，步骤(3)的具体操作为：
(31)取硅胶膜离心吸附柱加入上清液1，之后加入等体积0.01mol/L的PBS缓冲液，震荡混匀，将硅胶膜离心吸附柱放入收集管，静止5～8min后，10000rpm离心1min，弃废液；
(32)用洗脱液反复冲洗硅胶膜离心吸附柱，静止5～8min后，10000rpm离心1min，弃废液；
(33)向硅胶膜离心吸附柱中添加65℃预热的洗脱液，充分震荡后室温放置10min，10000rpm离心2分钟，重复1次，收集管中液体即为摇蚊蛹期蜕皮粗DNA。
7.如权利要求1所述的一种提取单个摇蚊科蛹期蜕皮DNA的方法，其特征在于，步骤(4)的具体操作为：向步骤(3)得到的摇蚊蛹期蜕皮粗DNA中添加20μl蛋白酶K及15μl RNA酶，混匀后，68℃水浴进行过夜消化处理，在最初3h内，每30min手动颠倒混合摇匀一次。
8.如权利要求1所述的一种提取单个摇蚊科蛹期蜕皮DNA的方法，其特征在于，步骤(5)的具体操作为：
(51)向酶解液中加入氯仿-异戊醇溶液，混匀后静置，之后10000rpm离心25min，取上清液，重复此操作1次，将两次上清液混合得上清液2；
氯仿和异戊醇的体积比为24:1；
(52)向上清液2中加入饱和酚和氯仿-异戊醇溶液，混匀后静置15min，之后8000rpm离心5min，取上清，得上清液3；
所述饱和酚和氯仿-异戊醇溶液体积相等；
氯仿和异戊醇的体积比为24:1；
(53)向上清液3中添加其0.5倍体积的异丙醇，混匀，于冰上沉淀20min，9000rpm离心25min，弃上清，得沉淀1；
(54)向沉淀1中加入75％乙醇，12000rpm离心7min，弃上清，重复该操作1次，即得到摇蚊科蛹期蜕皮DNA；
(55)之后加入ddH2O进行溶解。
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