CN114085920B - 一种淫羊藿的dna条形码、引物对及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种淫羊藿的DNA条形码、引物对及其应用，本发明所提供的箭叶淫羊藿“黔藿1号”的DNA条形码如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4所示，所述引物对序列：ITS2序列扩增正向引物：ITS2F:5'‑ATGCGATACTTGGTGTGAAT‑3'，反向引物ITS2R:5'‑GACGCTTCTCCAGACTACAAT‑3'；psbA‑trnH序列扩增正向引物：psbAF:5'‑GTTATGCATGAACGTAATGCTC‑3'；反向引物trnHR:5'‑CGCGCATGGTGGATTCACAATCC‑3'。采用本发明的所鉴定的材料不受地域环境的影响，可以通过一对或多对引物可快速的鉴别目标物种。

Description

一种淫羊藿的DNA条形码、引物对及其应用
技术领域
本发明属于中药材DNA分子鉴定及应用的技术领域，更具体地，涉及对中药材箭叶淫羊藿优良品种“黔藿1号”核糖体上一条基因ITS2和叶绿体上的一条基因psbA-trnH进行PCR扩增并测序，利用两条基因扩增的序列建立“黔藿1号”的条形码。同时，筛选SRAP引物对，建立“黔藿1号”区别于淫羊藿属其他物种的特异性条带。
背景技术
中药材淫羊藿Epimedii folium是小檗科淫羊藿属植物淫羊藿Epimedium brevicornuMaxim.、箭叶淫羊藿Epimedium sagittatum(Sieb. et Zucc.) Maxim.、柔毛淫羊藿Epimedium pubescensMaxim.或朝鲜淫羊藿Epimedium koreanumNakai的干燥叶，是我国传统大宗药材，其性温、味辛、甘，归肝、肾经，具补肾阳、强筋骨、祛风湿等功效，临床上主要用于肾阳虚衰、阳痿遗精、筋骨痿软、风湿痹痛、麻木拘挛等症。
“黔藿1号”为贵州省非主要农作物和食用菌品种认定专家委员会中药材专业委员会于2021年认定通过的中药材箭叶淫羊藿优良品种，其品质优（叶片总黄酮醇苷含量达到14.8%，是目前发现的淫羊藿属植物中总黄酮醇苷含量最高的一个种）、产量高（以根段茎繁育的种苗在种植2年后田间产量可达到鲜叶360 kg/亩），主要种植于贵州省黔东南、黔南一带。
小檗科淫羊藿属下有41个物种，被历版《中国药典》收载作为中药材淫羊藿的物种仅有淫羊藿、箭叶淫羊藿、柔毛淫羊藿和朝鲜淫羊藿4个，巫山淫羊藿被《中国药典》单独收载。淫羊藿属植物野生资源丰富，在我国分布较广，加之淫羊藿属于我国传统大宗药材且下游开发的产品较多，对淫羊藿药材的需求量大，过去主要靠采挖野生资源为主，导致野生资源濒临灭绝状态，同时，因野生资源杂乱，质量参差不齐，导致下游产品质量不稳定，最终疗效不稳定也是必然。随着我国中医药事业的发展，中医药必将走出国门，对中药材质量的要求不断提高，药材基源可追溯，种苗繁育、种植、采收、加工、包装等环节规范化的文件、政策相应出台并实施。“黔藿1号”属于人工选育出的具备特异性、稳定性和一致性的箭叶淫羊藿优良品种，在加工端如何保证所需原料即为“黔藿1号”仍需要一个可操作、易于实施的技术手段。
为保证中药材箭叶淫羊藿质量稳定、临床疗效可靠，需建立一种可明确箭叶淫羊藿优良品种“黔藿1号”基源的定性鉴别和定量鉴定相结合的方法，以保护“黔藿1号”的真实性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种淫羊藿“黔藿1号”的DNA条形码、引物对及其应用。
本发明所提供的箭叶淫羊藿“黔藿1号”的DNA条形码，
包含ITS2序列：Composition 104 A; 130 C; 137 G; 114 T; 0 OTHER
Percentage: 21.4% A; 26.8% C; 28.2% G; 23.5% T; 0.0%OTHER
Molecular Weight (kDa): ssDNA: 149.85 dsDNA: 299.03
SEQ ID NO.1:GAATTGCAGA ATCCCGTGAA CCATCGAGTC TTTGAACGCA AGTTGCGCCCAAGGCCATTAGGTCGAGGGC ACGTCTGCCT GGGCGTCACG CACAGCGTCG CTCCCACCAT GATGCCTTTGTTCTGTTATC GGGCAACTGC AACGTGGCTT GGGAAGCGGA TATTGGCCCC CCGTACCTTT GTAGGCGCGGCCGGCCTAAAATTCGGCCCT CGGCGACGAG CGTCACGATC AGTGGTGGTT
SEQ ID NO.2: GAATAACCCC TTTGTCATAG ACCGGTATCG TGTTGTTTCG TCGTCTATTTGGGCCATATGGACCCTTGCG TGTCGTATAA ACGACATTCA CTCTGCGACC CCAGGTCAGG CGGGACTACCCGCTGAGTTT AAGCATATCA ATAAGCGGAG GAGAAGAAAC TTACAAGGAT TCCCTTAGTA ACGGCGAGCGAACCGGGATCAGCCCAGCTT GGGAATCGGG CGACTTCGTT GTCCGAATTG TAGTC 。
以及psbA-trnH序列：
Composition 155 A; 83 C; 95 G; 205 T; 0 OTHER
Percentage: 28.8% A; 15.4% C; 17.7% G; 38.1% T; 0.0%OTHER
Molecular Weight (kDa): ssDNA: 166.08 dsDNA: 331.59
SEQ ID NO.3: AGGACATTCC CCGCAGTCAG CTGCTGTTGA GGCTCCATCT ACAAATGGCTAAGACGTAGGTCTTTTTCTA TTCAAGTAAT TGAATAATTG AATTTTTATA ATAGCGACCC ACCCTCCCGCCCTTGTAAAG ATGTTGGGAC GTTCTTGTGC ATTGGATATT TTTTGATTTT TTGCTTCATA CTCATTTTTTTGTTTTTTTGCTTTTAGTAG AAAAAGCATT ACTATATCAA CAGGACTCCT TCATTATTAC CCTATTGTCCTATTGCTTCA
SEQ ID NO.4:TATCTTTTGT TTCTTTGGAT TTTTTGATCT TTTTATCGTG TTAGTTCGCTAGTTCGCTTTTTCGTATTGT TGTCTAGTGA TTAAATGGTT AATTTTTTTT TTTTTTTTTT CTAAAAAGCATAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAGGAAAGA AATACTAAAG TACAAAGGTA GAGTGGAAAA TTGATTCTTTCGTTCTTTTAAGTTAAGAAA TTAAAAGAGC AAAGGGACCC AAGTGGACAA AGGGATTGGA GTGGGGATCACCCCATGC 。
一种定量鉴别箭叶淫羊藿优良品种“黔藿1号”的DNA条形码的PCR引物对，其特征在于：所述引物序列：
ITS2序列扩增正向引物：ITS2F: 5'-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3'，
反向引物ITS2R: 5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3'。
psbA-trnH序列扩增正向引物：psbAF: 5'-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3'；
反向引物trnHR: 5'-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3'
一种定量鉴定箭叶淫羊藿“黔藿1号”的方法，包括以下步骤：
（1）从待测样品中提取DNA；
（2）以步骤（1）中提取的DNA为模板，利用PCR引物进行ITS2的扩增；以无菌水为PCR空白对照，以箭叶淫羊藿“黔藿1号”基因组DNA为PCR阳性对照，所述PCR引物：ITS2序列扩增正向引物：ITS2F: 5'-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3'，
反向引物ITS2R: 5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3'；
（3）取步骤（2）扩增出的核苷酸片段用琼脂糖凝胶电泳分离，置于凝胶成像系统中观察，当空白对照扩增无任何带型，阳性对照有与理论相符的清晰、单一条带则说明PCR结果可靠；
（4）以ITS2的PCR扩增引物作为测序引物，使用DNA测序仪对目的条带进行双向测序，进而获得待测样品DNA的ITS2序列；设置以加去离子水代替加模板DNA的的PCR反应为阴性对照；
（5）以步骤（1）中提取的DNA为模板，利用PCR引物进行psbA-trnH的扩增；以无菌水为PCR空白对照，以箭叶淫羊藿“黔藿1号”基因组DNA为PCR阳性对照，所述PCR引物：psbA-trnH序列扩增正向引物：psbAF: 5'-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3'；
反向引物trnHR: 5'-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3'；
（6）以psbA-trnH的PCR扩增引物作为测序引物，使用DNA测序仪对目的条带进行双向测序，进而获得待测样品DNA的psbA-trnH序列；设置以加去离子水代替加模板DNA的的PCR反应为阴性对照；
若获得的序列与SEQ ID NO.1 至SEQ ID NO.4中的相似度≥99%，则为“黔藿1号”这个物种，若低于这个值则为其他物种。
上述定量鉴定箭叶淫羊藿“黔藿1号”的方法，更为具体的：包括以下步骤进行：
(a)将小檗科淫羊藿属植株的幼嫩组织用75%乙醇擦拭表面，然后用灭菌后的超纯水冲洗，用无菌纸擦拭干净，放入液氮速冻，使用研钵粉碎成细粉，然后采用DNA提取试剂盒Plant DNA Kit (D3485)进行DNA的分离和纯化，提取过程严格按照试剂盒使用说明书提取基因组DNA；
进一步地，吸取步骤(a)中的DNA样品溶液2 µL，以Elution Buffer作为空白溶液，用NANO DROP1000分光光度计检测DNA样品溶液的浓度及纯度，纯度要求在1.8~2.0范围，浓度及纯度判定合格进入下一步操作程序；
(b)进一步地，配制含2 µL TS-GelRed核酸凝胶染料Ver.2的1%琼脂糖凝胶，具备配制步骤为：称取凝胶用琼脂粉0.30 g，置于含35 mL去离子水的体积为250 mL的三角瓶中，将三角瓶置于微波炉中，加热溶解琼脂，取出，待琼脂液温度在60 ℃时，使用移液器加入2 µL TS-GelRed核酸凝胶染料Ver.2，混匀后立即倒入制胶模子，待完全凝固后，加入步骤(a)中的DNA样品溶液4 µL，loading Buffer 1µL，在含0.5×TBE缓冲液的水平电泳仪中，90 V电压下电泳时间30 min，电泳结束后取出琼脂糖凝胶，在凝胶成像系统下拍照，检测DNA质量，合格的DNA样品表现为：在凝胶中为一明亮条带，条带前后无明显白色斑点；DNA质量判定合格进入下一步操作程序。
(c)进一步地，配制步骤(a)中DNA样品液ITS2的PCR扩增体系25 µL，其中ITS2正向引物（序列为：ITS2F: 5'-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3'）溶液1 µL，ITS2反向引物（序列为：ITS2R: 5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3'）溶液1 µL，步骤(a)中的DNA样品液1 µL，金牌Mix溶液 22 µL。设置以加去离子水代替加模板DNA的PCR反应为阴性对照；
(d)进一步地，在PCR扩增仪上设置ITS2的PCR扩增程序（94 ℃ 5 min；94 ℃ 30s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，40个循环；72 ℃ 10 min）对步骤(c)中的扩增体系进行PCR扩增；
(e)PCR扩增结束后，取步骤(d)中的PCR扩增产物5 µL，用1%琼脂糖凝胶（内含2 µLTS-GelRed核酸凝胶染料Ver.2，配制方法同步骤(b)）检测步骤(d)的扩增情况，电泳条件为 90 V，电泳时间30 min。电泳后，PCR产物在琼脂糖凝胶相应位置应出现一条明亮的目的条带，阴性对照无条带；
(f)进一步地，在紫外灯下迅速切取步骤(e)中的PCR扩增产物目的条带，采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行纯化，以ITS2的PCR扩增引物作为测序引物，使用DNA测序仪对目的条带进行双向测序。
(g)采用Chromos(version 1.62)软件对步骤(f)中测序峰图进行校正，去除引物区以及结果两端信号弱或重叠峰区域，同时保证序列方向与PCR扩增正向引物方向一致；
(h)采用DNAMAN6.0软件对步骤(g)中校正后的序列进行拼接，进而获得小檗科淫羊藿属植物中DNA的ITS2序列；
(i)更进一步地，配制步骤(a)中DNA样品液psbA-trnH的PCR扩增体系25 µL，其中psbA-trnH正向引物（序列为：psbAF: 5'-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3'）溶液1 µL，psbA-trnH反向引物（序列为：trnHR: 5'-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3'）溶液1 µL，步骤(a)中的DNA样液1 µL，金牌Mix溶液 22 µL；设置以加去离子水代替加模板DNA的的PCR反应为阴性对照；
(j)更进一步地，在PCR扩增仪上设置psbA-trnH的PCR扩增程序（94 ℃ 5 min；94℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，30个循环；72 ℃ 7 min）对步骤(i)的扩增体系进行PCR扩增；
(k)更进一步地，步骤(j)的PCR扩增程序结束后，取步骤(j)中的PCR扩增产物5 µL，用1%琼脂糖凝胶（内含2 µL TS-GelRed核酸凝胶染料Ver.2，配制方法同步骤(b)）检测步骤(j)的扩增情况，电泳条件为 90 V，电泳时间30 min。电泳后，PCR产物在琼脂糖凝胶相应位置应出现一条明亮的目的条带，阴性对照无条带；
(l)更进一步地，在紫外灯下迅速切取步骤(k)中的PCR扩增产物目的条带，采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行纯化，然后以psbA-trnH的PCR扩增引物作为测序引物，使用DNA测序仪对目的条带进行双向测序；
更进一步地，采用Chromos (version 1.62)软件对步骤(l)中测序峰图进行校正，去除引物区以及结果两端信号弱或重叠峰区域，同时保证序列方向与PCR扩增正向引物方向一致；
(m)更进一步地，采用采用DNAMAN6.0软件对步骤(l)中校正后的序列进行拼接，进而获得小檗科淫羊藿属植物DNA中psbA-trnH的序列；
若步骤(h)和(m)中获得的序列与SEQ ID NO.1 至SEQ ID NO.4中的相似度≥99%，则为“黔藿1号”这个物种，若低于这个值则为淫羊藿属的其他物种。
一种定性鉴定箭叶淫羊藿“黔藿1号”的方法，包括以下步骤：
（1）在“相关序列扩增多态性(Sequence-related amplified polymorphism,SRAP)”提供的上、下游引物表中分别随机选取各18条，自由组合成324对引物，对待测样品的DNA进行PCR扩增，从中筛选出重复性好、扩增条带清晰且多态性丰富的引物组合；
（2） 对PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，以筛选重复性好、扩增条带清晰且多态性丰富的引物组合。
（3）电泳结束后，进行染色、显色，并置于Chemi Doc TM凝胶成像系统下拍照保存。
若聚丙烯酰胺凝胶电泳谱带显示附图1中的泳道图，则为“黔藿1号”这个物种，若不是则为其他物种。
上述定量鉴定箭叶淫羊藿“黔藿1号”的方法中，聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂配制方法如下：
20%过硫酸铵溶液的配制：称取20 g过硫酸铵用蒸馏水溶解，并定容至100 mL，即可；
8%聚丙烯酰胺凝胶配制：首先分别加入32.1 mL 30% Acr-Bis（29:1）、24 mL 5×TBE缓冲液、60.25 mL超纯水、75 µL PAGE胶促凝剂，最后加入750µL20%过硫酸铵溶液，搅拌混匀，即得；
银染液的配制：称取0.1 g硝酸银加入蒸馏水溶解，定容至1 L；
显色液的配制：称取20 g氢氧化钠加入蒸馏水溶解，定容至1 L，使用前加入3 mL甲醛溶液，即得；
上述的定性鉴定箭叶淫羊藿“黔藿1号”的方法中，用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶对扩增产物进行电泳检测，缓冲液为 0.5×TBE，电压（V）=120 V，电泳时间90 min。
本发明的有益效果：所鉴定的材料不受地域环境的影响，通过一对或多对引物可快速的鉴别目标物种。
附图说明
图1是本发明的“黔藿1号”定性鉴别Me18-Em10引物组合的PAGE凝胶电泳图；
图2是本发明的15份淫羊藿种质DNA水平凝胶电泳鉴定图。
图3是本发明的15份淫羊藿种质UPGMA聚类图。
具体实施方式
实施例1
定量鉴别：
本发明所提供的中药材箭叶淫羊藿优良品种“黔藿1号”的基因条形码以区别于小檗科淫羊藿属的其他物种的方法的应用，包括以下步骤：
从小檗科（Berberidaceae）淫羊藿属（EpimediumLinn. ）植物（目前《中国植物志》记载有41个种，《中国药典》收载四个种作为淫羊藿药材的基源植物，巫山淫羊藿单独列出）活体植株上取幼嫩组织（如根、茎、叶片等）提取其基因组DNA作为模板，可按照包括以下步骤的方法进行：
(a)将小檗科（Berberidaceae）淫羊藿属（EpimediumLinn. ）植株的幼嫩组织用75%乙醇擦拭表面，然后用灭菌后的超纯水冲洗，用无菌纸擦拭干净，放入液氮速冻，使用研钵粉碎成细粉，然后采用DNA提取试剂盒Plant DNA Kit (D3485)进行DNA的分离和纯化，提取过程严格按照试剂盒使用说明书提取基因组DNA。
进一步地，吸取步骤(a)中的DNA样品溶液2 µL，以Elution Buffer作为空白溶液，用NANO DROP1000分光光度计检测DNA样品溶液的浓度及纯度，纯度要求在1.8~2.0范围，浓度及纯度判定合格进入下一步操作程序。
(b)进一步地，配制含2 µL TS-GelRed核酸凝胶染料Ver.2的1%琼脂糖凝胶，具备配制步骤为：称取凝胶用琼脂粉0.30 g，置于含35 mL去离子水的体积为250 mL的三角瓶中，将三角瓶置于微波炉中，加热溶解琼脂，取出，待琼脂液温度在60 ℃时，使用移液器加入2 µL TS-GelRed核酸凝胶染料Ver.2，混匀后立即倒入制胶模子，待完全凝固后，加入步骤(a)中的DNA样品溶液4 µL，loading Buffer 1µL，在含0.5×TBE缓冲液的水平电泳仪中，90 V电压下电泳时间30 min，电泳结束后取出琼脂糖凝胶，在凝胶成像系统下拍照，检测DNA质量，合格的DNA样品表现为：在凝胶中为一明亮条带，条带前后无明显白色斑点。DNA质量判定合格进入下一步操作程序。
(c)进一步地，配制步骤(a)中DNA样品液ITS2的PCR扩增体系25 µL，其中ITS2正向引物（序列为：ITS2F: 5'-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3'）溶液1 µL，ITS2反向引物（序列为：ITS2R:5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3'）溶液1 µL，步骤(a)中的DNA样品液1 µL，金牌Mix溶液 22 µL。设置以加去离子水代替加模板DNA的PCR反应为阴性对照。
(d)进一步地，在PCR扩增仪上设置ITS2的PCR扩增程序（94 ℃ 5 min；94 ℃ 30s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，40个循环；72 ℃ 10 min）对步骤(c)中的扩增体系进行PCR扩增。
(e)PCR扩增结束后，取步骤(d)中的PCR扩增产物5 µL，用1%琼脂糖凝胶（内含2 µLTS-GelRed核酸凝胶染料Ver.2，配制方法同步骤(b)）检测步骤(d)的扩增情况，电泳条件为 90 V，电泳时间30 min。电泳后，PCR产物在琼脂糖凝胶相应位置应出现一条明亮的目的条带，阴性对照无条带。
(f)进一步地，在紫外灯下迅速切取步骤(e)中的PCR扩增产物目的条带，采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行纯化，以ITS2的PCR扩增引物作为测序引物，使用DNA测序仪对目的条带进行双向测序。
(g)采用Chromos(version 1.62)软件对步骤(f)中测序峰图进行校正，去除引物区以及结果两端信号弱或重叠峰区域，同时保证序列方向与PCR扩增正向引物方向一致。
(h)采用DNAMAN6.0软件对步骤(g)中校正后的序列进行拼接，进而获得小檗科淫羊藿属植物中DNA的ITS2序列。
(i)更进一步地，配制步骤(a)中DNA样品液psbA-trnH的PCR扩增体系25 µL，其中psbA-trnH正向引物（序列为：psbAF: 5'-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3'）溶液1 µL，psbA-trnH反向引物（序列为：trnHR: 5'-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3'）溶液1 µL，步骤(a)中的DNA样液1 µL，金牌Mix溶液 22 µL。设置以加去离子水代替加模板DNA的的PCR反应为阴性对照。
(j)更进一步地，在PCR扩增仪上设置psbA-trnH的PCR扩增程序（94 ℃ 5 min；94℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，30个循环；72 ℃ 7 min）对步骤(i)的扩增体系进行PCR扩增。
(k)更进一步地，步骤(j)的PCR扩增程序结束后，取步骤(j)中的PCR扩增产物5 µL，用1%琼脂糖凝胶（内含2 µL TS-GelRed核酸凝胶染料Ver.2，配制方法同步骤(b)）检测步骤(j)的扩增情况，电泳条件为 90 V，电泳时间30 min。电泳后，PCR产物在琼脂糖凝胶相应位置应出现一条明亮的目的条带，阴性对照无条带。
(l)更进一步地，在紫外灯下迅速切取步骤(k)中的PCR扩增产物目的条带，采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行纯化，然后以psbA-trnH的PCR扩增引物作为测序引物，使用DNA测序仪对目的条带进行双向测序。
更进一步地，采用Chromos (version 1.62)软件对步骤(l)中测序峰图进行校正，去除引物区以及结果两端信号弱或重叠峰区域，同时保证序列方向与PCR扩增正向引物方向一致。
(m)更进一步地，采用采用DNAMAN6.0软件对步骤(l)中校正后的序列进行拼接，进而获得小檗科淫羊藿属植物DNA中psbA-trnH的序列。
若步骤(h)和(m)中获得的序列与SEQ ID NO.1 至SEQ ID NO.4中的相似度≥99%，则为“黔藿1号”这个物种，若低于这个值则为淫羊藿属的其他物种。
定性鉴别：
本发明所提供的鉴别中药材箭叶淫羊藿优良品种“黔藿1号”的引物对以区别于小檗科淫羊藿属的其他物种的方法的应用，包括以下步骤：
(n)在“相关序列扩增多态性(Sequence-related amplifiedpolymorphism,SRAP)”提供的上、下游引物表中分别随机选取各18条（见附表1），自由组合成324对引物，进行PCR扩增，从中筛选出重复性好、扩增条带清晰且多态性丰富的引物组合。具体的PCR扩增过程包括以下步骤：
(o)利用步骤(a)的方法提取小檗科淫羊藿属植物的基因组DNA。
(p)进一步地，配制SRAP-PCR扩增体系，体系总体积为25 µL，其中步骤(o)中的DNA样品液1 µL，步骤(n)中的上、下游引物对溶液各1 µL，金牌Mix溶液 22 µL。
(q)进一步地，在PCR扩增仪上设置扩增步骤(p)中的体系，反应程序为94 ℃ 5min；94 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min，4℃保存。
对步骤 (q)中的PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，以筛选重复性好、扩增条带清晰且多态性丰富的引物组合。具体的聚丙烯酰胺凝胶电泳过程包括以下步骤：
聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂配制：
20%过硫酸铵溶液的配制：称取20 g过硫酸铵用蒸馏水溶解，并定容至100 mL，即可。
8%聚丙烯酰胺凝胶配制：首先分别加入32.1 mL 30% Acr-Bis（29:1）、24 mL 5×TBE缓冲液、60.25 mL超纯水、75 µL PAGE胶促凝剂，最后加入750µL20%过硫酸铵溶液，搅拌混匀，即得。
银染液的配制：称取0.1 g硝酸银加入蒸馏水溶解，定容至1 L。
显色液的配制：称取20 g氢氧化钠加入蒸馏水溶解，定容至1 L，使用前加入3 mL甲醛溶液，即得。
(r)进一步地，用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶对步骤(q)中的扩增产物进行电泳检测，缓冲液为 0.5×TBE，电压（V）=120 V，电泳时间90 min。
(s)进一步地，步骤(r)电泳结束后，将玻璃板取下，揭去凹型玻璃板，去掉底部的琼脂糖凝胶，将胶取下放入染色盘中，用蒸馏水冲洗两次，倒入适量的染色液，置于摇床上染色10 min。
(t)进一步地，步骤(s)显色结束后，倒出染色液，蒸馏水冲洗两次，倒入显色液，轻摇至显出清晰条带。
(u)进一步地，步骤(t)结束后，倒出显色液，蒸馏水冲洗两次，置于Chemi Doc TM凝胶成像系统下拍照保存。
更进一步地，若步骤(u)中聚丙烯酰胺凝胶电泳谱带显示附图1中的泳道图，则为“黔藿1号”这个物种，若不是则为小檗科淫羊藿属其他物种。
附表
表1 SRAP-PCR反应引物
编号 上游引物（5，-3，） 编号 下游引物（5，-3，）
Me1 TGAGTCCAAACCGGATA Em1 GACTGCGTACGAATTATT
Me2 TGAGTCCAAACCGGAGC Em2 GACTGCGTACGAATTTGC
Me3 TGAGTCCAAACCGGAAT Em3 GACTGCGTACGAATTGAC
Me4 TGAGTCCAAACCGGACC Em4 GACTGCGTACGAATTTGA
Me5 TGAGTCCAAACCGGAAG Em5 GACTGCGTACGAATTAAC
Me6 TGAGTCCAAACCGGACA Em6 GACTGCGTACGAATTGCA
Me7 TGAGTCCAAACCGGACG Em7 GACTGCGTACGAATTCAA
Me8 TGAGTCCAAACCGGACT Em8 GACTGCGTACGAATTCA
Me9 TGAGTCCAAACCGGAGG Em9 GACTGCGTACGAATTAG
Me10 TGAGTCCAAACCGGAAA Em10 GACTGCGTACGAATTCAT
Me11 TGAGTCCAAACCGGAAC Em11 GACTGCGTACGAATTCTA
Me12 TGAGTCCAAACCGGAGA Em12 GACTGCGTACGAATTCTC
Me13 TGAGTCCAAACCGGAAG Em13 GACTGCGTACGAATTCTG
Me14 TGAGTCCAAACCGGTAG Em14 GACTGCGTACGAATTCTT
Me15 TGAGTCCAAACCGGCAT Em15 GACTGCGTACGAATTGAT
Me17 TGAGTCCTTTCCGGTAA Em17 GACTGCGTACGAATTCGA
Me18 TGAGTCCTTTCCGGTCC Em18 GACTGCGTACGAATTCCA
Me19 TGAGTCCTTTCCGGTGC Em19 GACTGCGTACGAATTCCT
箭叶淫羊藿优良品种“黔藿1号”ITS2序列
Composition 104 A; 130 C; 137 G; 114 T; 0 OTHER
Percentage: 21.4% A; 26.8% C; 28.2% G; 23.5% T; 0.0%OTHER
Molecular Weight (kDa): ssDNA: 149.85 dsDNA: 299.03
1 GAATTGCAGA ATCCCGTGAA CCATCGAGTC TTTGAACGCA AGTTGCGCCC AAGGCCATTA
61 GGTCGAGGGC ACGTCTGCCT GGGCGTCACG CACAGCGTCG CTCCCACCAT GATGCCTTTG
121 TTCTGTTATC GGGCAACTGC AACGTGGCTT GGGAAGCGGA TATTGGCCCC CCGTACCTTT
181 GTAGGCGCGG CCGGCCTAAA ATTCGGCCCT CGGCGACGAG CGTCACGATC AGTGGTGGTT
241 GAATAACCCC TTTGTCATAG ACCGGTATCG TGTTGTTTCG TCGTCTATTT GGGCCATATG
301 GACCCTTGCG TGTCGTATAA ACGACATTCA CTCTGCGACC CCAGGTCAGG CGGGACTACC
361 CGCTGAGTTT AAGCATATCA ATAAGCGGAG GAGAAGAAAC TTACAAGGAT TCCCTTAGTA
421 ACGGCGAGCG AACCGGGATC AGCCCAGCTT GGGAATCGGG CGACTTCGTT GTCCGAATTG
481 TAGTC
箭叶淫羊藿优良品种“黔藿1号”psbA-trnH序列
Composition 155 A; 83 C; 95 G; 205 T; 0 OTHER
Percentage: 28.8% A; 15.4% C; 17.7% G; 38.1% T; 0.0%OTHER
Molecular Weight (kDa): ssDNA: 166.08 dsDNA: 331.59
1 AGGACATTCC CCGCAGTCAG CTGCTGTTGA GGCTCCATCT ACAAATGGCT AAGACGTAGG
61 TCTTTTTCTA TTCAAGTAAT TGAATAATTG AATTTTTATA ATAGCGACCC ACCCTCCCGC
121 CCTTGTAAAG ATGTTGGGAC GTTCTTGTGC ATTGGATATT TTTTGATTTT TTGCTTCATA
181 CTCATTTTTT TGTTTTTTTG CTTTTAGTAG AAAAAGCATT ACTATATCAA CAGGACTCCT
241 TCATTATTAC CCTATTGTCC TATTGCTTCA TATCTTTTGT TTCTTTGGAT TTTTTGATCT
301 TTTTATCGTG TTAGTTCGCT AGTTCGCTTT TTCGTATTGT TGTCTAGTGA TTAAATGGTT
361 AATTTTTTTT TTTTTTTTTT CTAAAAAGCA TAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAGGAAAGA
421 AATACTAAAG TACAAAGGTA GAGTGGAAAA TTGATTCTTT CGTTCTTTTA AGTTAAGAAA
481 TTAAAAGAGC AAAGGGACCC AAGTGGACAA AGGGATTGGA GTGGGGATCA CCCCATGC
序列表
<110> 贵州贵基生物医药有限公司
<120> 一种淫羊藿的DNA条形码、引物对及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 485
<212> DNA
<213> 箭叶淫羊藿(Epimedium sagittatum (Sieb. et Zucc.) Maxim.)
<400> 2
gaattgcaga atcccgtgaa ccatcgagtc tttgaacgca agttgcgccc aaggccatta 60
ggtcgagggc acgtctgcct gggcgtcacg cacagcgtcg ctcccaccat gatgcctttg 120
ttctgttatc gggcaactgc aacgtggctt gggaagcgga tattggcccc ccgtaccttt 180
gtaggcgcgg ccggcctaaa attcggccct cggcgacgag cgtcacgatc agtggtggtt 240
gaataacccc tttgtcatag accggtatcg tgttgtttcg tcgtctattt gggccatatg 300
gacccttgcg tgtcgtataa acgacattca ctctgcgacc ccaggtcagg cgggactacc 360
cgctgagttt aagcatatca ataagcggag gagaagaaac ttacaaggat tcccttagta 420
acggcgagcg aaccgggatc agcccagctt gggaatcggg cgacttcgtt gtccgaattg 480
tagtc 485
<210> 2
<211> 538
<212> DNA
<213> 箭叶淫羊藿(Epimedium sagittatum (Sieb. et Zucc.) Maxim.)
<400> 2
aggacattcc ccgcagtcag ctgctgttga ggctccatct acaaatggct aagacgtagg 60
tctttttcta ttcaagtaat tgaataattg aatttttata atagcgaccc accctcccgc 120
ccttgtaaag atgttgggac gttcttgtgc attggatatt ttttgatttt ttgcttcata 180
ctcatttttt tgtttttttg cttttagtag aaaaagcatt actatatcaa caggactcct 240
tcattattac cctattgtcc tattgcttca tatcttttgt ttctttggat tttttgatct 300
ttttatcgtg ttagttcgct agttcgcttt ttcgtattgt tgtctagtga ttaaatggtt 360
aatttttttt tttttttttt ctaaaaagca taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaggaaaga 420
aatactaaag tacaaaggta gagtggaaaa ttgattcttt cgttctttta agttaagaaa 480
ttaaaagagc aaagggaccc aagtggacaa agggattgga gtggggatca ccccatgc 538

Claims (4)

1.一种箭叶淫羊藿“黔藿1号”的DNA分子，其特征在于：
包含ITS2序列：如SEQ ID NO.1 和SEQ ID NO.2 所示；
以及psbA-trnH序列：如SEQ ID NO.3 和SEQ ID NO.4所示。
2.权利要求1所述的箭叶淫羊藿“黔藿1号”的DNA分子在鉴别箭叶淫羊藿“黔藿1号”物种中的应用。
3.一种如权利要求1所述的箭叶淫羊藿“黔藿1号”的DNA分子的用途，其特征在于：用于鉴定箭叶淫羊藿“黔藿1号”这个品种。
4.一种鉴定箭叶淫羊藿“黔藿1号”的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）从待测样品中提取DNA；
（2）以步骤（1）中提取的DNA为模板，利用PCR引物进行ITS2的扩增；以无菌水为PCR空白对照，以箭叶淫羊藿“黔藿1号”基因组DNA为PCR阳性对照，所述PCR引物：ITS2序列扩增正向引物：ITS2F: 5'-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3'，
反向引物ITS2R: 5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3'；
（3）取步骤（2）扩增出的核苷酸片段用琼脂糖凝胶电泳分离，置于凝胶成像系统中观察，当空白对照扩增无任何带型，阳性对照有与理论相符的清晰、单一条带则说明PCR结果可靠；
（4）以ITS2的PCR扩增引物作为测序引物，使用DNA测序仪对目的条带进行双向测序，进而获得待测样品DNA的ITS2序列；设置以加去离子水代替加模板DNA的PCR反应为阴性对照；
（5）以步骤（1）中提取的DNA为模板，利用PCR引物进行psbA-trnH的扩增；以无菌水为PCR空白对照，以箭叶淫羊藿“黔藿1号”基因组DNA为PCR阳性对照，所述PCR引物：psbA-trnH序列扩增正向引物：psbAF: 5'-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3'；
反向引物trnHR: 5'-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3'；
（6）以psbA-trnH的PCR扩增引物作为测序引物，使用DNA测序仪对目的条带进行双向测序，进而获得待测样品DNA的psbA-trnH序列；设置以加去离子水代替加模板DNA的PCR反应为阴性对照；
若步骤（4）测序获得的ITS2序列与SEQ ID NO.1 至SEQ ID NO.2比较，步骤（6）测序获得的psbA-trnH序列与SEQ ID NO.3 至SEQ ID NO.4比较，相似度均≥99%，则为“黔藿1号”这个物种，若低于这个值则为其他物种。
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中药材DNA条形码分子鉴定指导原则;陈士林等;中国中药杂志;第38卷(第2期);第142页1.2.3节 *
基于ITS2序列的15种淫羊藿属药用植物分类鉴定研究;严福林等;种子;第38卷(第6期);第46页 图1 *
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