CN114774406B - 一种从蔷薇属植物组织中提取总rna的方法 - Google Patents

一种从蔷薇属植物组织中提取总rna的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种从蔷薇属植物组织中提取总RNA的方法。具体地公开了一种从蔷薇属植物组织中提取总RNA的方法，所述方法包括将蔷薇属植物组织经液氮研磨后，进行连续三次裂解和提取的步骤，所述三次裂解和提取分别采用溶液A、溶液B和溶液C进行裂解，并公开了溶液A、溶液B和溶液C的组分。本发明方法有效解决了次生代谢物质、蛋白质、和DNA等对RNA提取的干扰问题，显著提高了蔷薇属植物组织总RNA的提取质量和效率。本发明方法具有高效率、高质量、低成本、周期短、稳定好、操作简单和易于广泛应用等优点，提取的总RNA完整性好、纯度高、得率高，可直接用于RT‑PCR、cDNA文库构建等下游分子生物学实验。

Description

一种从蔷薇属植物组织中提取总RNA的方法
技术领域
本发明属于植物分子生物学技术领域，具体涉及一种从蔷薇属植物根、茎、叶、花、果实等组织中提取高质量总RNA的方法。
背景技术
植物组织总RNA的提取是开展基因的克隆、表达、功能及调控等分子生物学研究的实验基础。纯度高且完整性好的高质量总RNA是进行RT-PCR、RT-qPCR、Northern杂交、cDNA文库构建和转录组学分析等分子生物学实验的关键。RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA，必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶(ribonuclease，RNase)对RNA的降解，而且植物组织RNA的提取较动物和微生物困难，如酚类物质氧化后可使RNA活性丧失，多糖可形成难溶胶状物质与RNA一起被沉淀，所以细胞内RNA分子的多样性和易被降解决定了其提取过程的复杂性。目前植物组织总RNA的提取方法有很多，如常规的Trizol法、CTAB法、SDS法等通常用于普通植物组织总RNA的提取，针对复杂植物组织总RNA的提取，现在虽然也有一些改良的方法(如改良Trizol法、改良CTAB法、改良SDS法等)能够从一些复杂植物组织中成功地提取出总RNA，但是由于植物的多样性，不同植物或相同植物的不同组织中干扰总RNA分离纯化的因素各不同，因此需要根据植物材料的具体特点开发有针对性的RNA提取方法，从而获得高质量的植物组织总RNA。
蔷薇属(Rosa L.)植物多为直立、蔓延或攀援灌木，是世界著名的园林观赏植物，其组织中不仅富含多糖、多酚、有机酸类、黄酮类、萜醇类、皂苷类、鞣质、色素等次生代谢物质，而且RNase活性较高，造成RNA提取过程的难分离、褐化、氧化和降解，导致从中提取高质量的总RNA一直比较困难。目前已报道的关于蔷薇属植物组织总RNA的提取方法仅单一适用于幼嫩叶、幼嫩根或花瓣，而适用于蔷薇属植物各个组织的总RNA提取方法还未见报道。赵小兰等(2005)采用LiCl-尿素法和CTAB酸酚法分别提取了多花蔷薇幼嫩叶和幼嫩根的总RNA。谢吉容等(2007)采用CTAB多级沉淀法和改良异硫氰酸胍法提取了月季花瓣的总RNA。蒋昌华等(2008)采用天泽基因工程有限公司生产的植物RNAout提取试剂盒提取了月季刚展开嫩叶的总RNA。冯立国等(2013)采用改良CTAB法提取了玫瑰花组织的总RNA。申请者通过多次实验发现这些方法对于样品中次生代谢物质的去除不彻底，且RNA提取质量和效率低，稳定性差，广谱性小，不能满足RT-PCR、RT-qPCR、Northern杂交、cDNA文库构建和转录组学分析等分子生物学实验操作的需要，同时申请者查阅文献，也未见这些方法后续的广泛和大量应用。另外，现今市场上出售的多糖多酚植物组织总RNA提取试剂盒，虽然可以从蔷薇属植物组织中提取高质量的总RNA(刘航程等，2021)，但总RNA的完整性不佳，得率较低，且成本高，仅适合少量RNA的提取。因此，随着蔷薇属植物分子生物学研究的深入，迫切需要一种成本低廉、操作简便、稳定性好、效率高、具有广谱性的从蔷薇属植物组织中提取高质量总RNA的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何简便、稳定、高效、广谱和/或成本低廉地从蔷薇属植物组织中提取纯度高、完整性好的高质量总RNA，和/或，解决基因组DNA、蛋白质及次生代谢物质对蔷薇属植物组织总RNA提取的干扰问题。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种从蔷薇属植物组织中提取总RNA的方法，所述方法包括将蔷薇属植物组织经液氮研磨得到粉末，将所述粉末进行三次裂解和提取后再进行氯仿抽提和异丙醇沉淀，得到蔷薇属植物组织总RNA，所述三次裂解和提取分别采用溶液A、溶液B和溶液C进行裂解提取，其中：
所述溶液A的溶质可由三羟甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸(EDTA)、氯化钾(KCl)、氯化钠(NaCl)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、β-巯基乙醇(β-ME)和湿润剂P-40(Nonidet P-40，NP-40)组成；
所述溶液B的溶质可由三羟甲基氨基甲烷(Tris)、氯化锂(LiCl)、十二烷基肌氨酸钠(SLS)、聚乙二醇8000(PEG8000)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)组成；
所述溶液C的溶质可由异硫氰酸胍(GITC)、醋酸钠(NaAc)、水饱和酚、8-羟基喹啉(8-HQ)和β-巯基乙醇(β-ME)组成。
上述方法中，所述溶液A的组成可为：0.1M三羟甲基氨基甲烷(Tris)、0.05M乙二胺四乙酸(EDTA)、0.5M氯化钾(KCl)、1.5M氯化钠(NaCl)、20g/L十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、体积分数为4％的β-巯基乙醇(β-ME)和体积分数为4％的湿润剂P-40(Nonidet P-40，NP-40)，其余为水。
上述方法中，所述溶液B的组成可为：0.1M三羟甲基氨基甲烷(Tris)、2M氯化锂(LiCl)、20g/L十二烷基肌氨酸钠(SLS)、100g/L聚乙二醇8000(PEG8000)和40g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，其余为水。
上述方法中，所述溶液C的组成可为：4M异硫氰酸胍(GITC)、0.2M醋酸钠(NaAc)、体积分数为50％的水饱和酚、1g/L 8-羟基喹啉(8-HQ)和体积分数为2％的β-巯基乙醇(β-ME)，其余为水。
上述方法中，所述三次裂解和提取包括如下步骤：
(1)将所述粉末与所述溶液A涡旋混匀，静置3-5min，离心，吸取上清液；
(2)将步骤(1)得到的上清液与所述溶液B振荡混匀，静置3-5min，离心，吸取上清液；
(3)将步骤(2)得到的上清液与所述溶液C，振荡混匀，静置3-5min，完成所述三次裂解和提取。
上述方法中，所述溶液A的pH值可为8.0。
上述方法中，所述溶液B的pH值可为8.0。
上述方法中，所述溶液C的pH值可为4.8。
上述方法中，所述蔷薇属植物组织可包括根、茎、叶、花和/或果实。
本发明还提供了本文中任一所述的方法在蔷薇属植物基因研究和/或构建蔷薇属植物cDNA文库中的应用。
进一步地，所述溶液A的配制方法可为：Tris-HCl溶液(1M，pH 8.0)10mL，EDTA溶液(0.5M，pH 8.0)10mL，KCl 3.675g，NaCl 8.766g，CTAB 2g，β-ME 4mL，NP-40 4mL，最后加水至100mL，用盐酸(HCl)或氢氧化钠(NaOH)调节溶液pH为8.0。
进一步地，所述溶液B的配制方法可为：Tris-HCl溶液(1M，pH 8.0)10mL，LiCl8.478g，SLS2g，PEG8000 10g，PVP 4g，最后加水至100mL，用HCl调节溶液pH为8.0。
进一步地，所述溶液C的配制方法可为：GITC 47.264g，NaAc溶液(2M，pH 4.8)10mL，8-HQ 0.1g，水饱和酚50mL，β-ME 2mL，最后加水至100mL，用醋酸(HAc)调节溶液pH为4.8。
进一步地，所述Tris-HCl溶液(1M，pH 8.0)的配制方法可为：121.14g Tris,加800mL水溶解后，用HCl调节pH为8.0，再加水定容到1L。
所述EDTA溶液(0.5M，pH 8.0)的配制方法可为：146.12g EDTA，加入800mL水溶解后，用NaOH调节pH为8.0，再加水定容到1L。
所述NaAc溶液(2M，pH 4.8)的配制方法可为：164.06g NaAc，加入800mL水溶解后，用HAc调节pH为4.8，再加水定容到1L。
进一步地，所述的水均为无酶无菌水(DNase/RNase-Free Water)。
进一步地，所述从蔷薇属植物组织中提取总RNA的方法可包括如下步骤：
(1)称取0.1-0.5g蔷薇属植物组织放入经液氮预冷的研钵中，加入0.01-0.02g交联聚维酮(PVPP，交联聚乙烯吡咯烷酮)，在液氮中充分研磨成粉末(细粉)；
(2)将所述粉末(细粉)迅速转移到含有0.5-1mL溶液A的无RNA酶离心管中，涡旋混匀，静置3-5min，10000-13000rpm离心5-10min；
(3)吸取上清液至新的无RNA酶离心管中，加入等体积的溶液B，振荡混匀，静置3-5min，10000-13000rpm离心5-10min；
(4)吸取上清液至新的无RNA酶离心管中，加入2倍体积的溶液C，振荡混匀，静置3-5min；
(5)再加入0.4倍体积的氯仿(三氯甲烷)，振荡混匀15s，静置3-5min，10000-13000rpm离心10-15min；
(6)吸取上清液至新的无RNA酶离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，静置5-10min，10000-13000rpm离心5-10min；
(7)倒弃上清液，加入1-2mL 75％乙醇轻轻颠倒洗涤RNA沉淀，5000-7500rpm离心3-5min，倒弃上清液，重复清洗一次；
(8)倒弃上清液，离心收集残液，用移液枪吸除残液，空气干燥RNA沉淀5-10min；
(9)加入30-100μL焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水，溶解RNA沉淀，于-80℃保存备用；
进一步地，步骤(1)中所述蔷薇属植物组织可为新鲜的或-80℃保存的蔷薇属植物组织。
其中，所述溶液A的组成可为：0.1M三羟甲基氨基甲烷(Tris)、0.05M乙二胺四乙酸(EDTA)、0.5M氯化钾(KCl)、1.5M氯化钠(NaCl)、20g/L十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、体积分数为4％的β-巯基乙醇(β-ME)和体积分数为4％的湿润剂P-40(Nonidet P-40，NP-40)，其余为水；所述溶液B的组成可为：0.1M三羟甲基氨基甲烷(Tris)、2M氯化锂(LiCl)、20g/L十二烷基肌氨酸钠(SLS)、100g/L聚乙二醇8000(PEG8000)和40g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，其余为水；所述溶液C的组成可为：4M异硫氰酸胍(GITC)、0.2M醋酸钠(NaAc)、体积分数为50％的水饱和酚、1g/L 8-羟基喹啉(8-HQ)和体积分数为2％的β-巯基乙醇(β-ME)，其余为水。
本文所述溶液A、溶液B和溶液C的组分及其浓度是本申请的某一种实现方式中具体采用的，证实具有较好提取某一蔷薇属植物组织总RNA效果的配方，不排除在本申请优选配方的基础上进行化学剂量允许范围内的调整，例如本申请剂量正负5％左右偏差，都能够基本上达到本申请的效果。
本文所有离心步骤均可在常温(室温，如25℃)或低温(4℃)条件下完成。
本文所述蔷薇属植物包括野蔷薇、月季、玫瑰、黄刺玫但不限于此。
本发明人经过大量的试验研究，针对蔷薇属植物组织富含多糖、多酚、有机酸类、黄酮类、萜醇类、皂苷类、鞣质、色素等次生代谢物质严重影响高质量RNA提取的问题，获得了满足本发明目的的一种高效快速提取蔷薇属植物组织总RNA的方法，提出了从蔷薇属植物组织中提取总RNA的关键步骤：植物材料经液氮研磨后，进行连续三次裂解和提取，再结合氯仿抽提和异丙醇沉淀，有效解决了次生代谢物质、蛋白质、和DNA等对RNA提取的干扰问题，显著提高了蔷薇属植物组织总RNA的提取质量和效率，利用本发明方法提取的总RNA能够满足蔷薇属植物分子生物学实验的需要，克服了以往无法同时对蔷薇属植物不同组织总RNA进行同时提取的缺陷。
本发明的有益效果如下：
(1)本发明方法通过依次加入溶液A、溶液B、溶液C反应后，离心吸取上清液，再结合氯仿抽提和异丙醇沉淀，有效克服了多糖、多酚等次生代谢物以及基因组DNA和蛋白质等对RNA提取的影响，从而解决了蔷薇属植物RNA难提取的问题，提高了蔷薇属植物RNA提取的质量和产量。
(2)本发明方法的RNA提取液中，Tris、NaAc等缓冲液可以稳定反应体系的pH；CTAB、SLS、异硫氰酸胍可以使细胞充分裂解，蛋白质彻底变性，有利于蛋白质与核酸的分离；KCl、NaCl、LiCl等高浓度的中性盐既可以促使蛋白质与核酸的分离，又可以增加多糖在盐溶液中的溶解；PEG8000可以聚沉多糖等大分子次生代谢杂质；PVP、β-巯基乙醇即可以抑制多酚类、色素类等物质的氧化作用，又可以阻止酚类、萜类等物质与核酸的结合；CTAB、SLS、异硫氰酸胍、EDTA、苯酚(水饱和酚)、β-巯基乙醇、NP-40、8-羟基喹啉等可以有效抑制RNase的活性；酸性苯酚可促使RNA进入水相，与留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。
(3)本发明方法适用于不同植物类型的、不同保存时间的、不同发育时期的或不同组织部位的蔷薇属植物材料的总RNA提取，有别于其他已报道的方法仅适用于某一种蔷薇属植物的某一幼嫩组织总RNA的提取。另外，本申请所需的样本起始量相对较小，操作流程也相对简单，整个过程仅需1-1.5小时即可完成，大大缩短了提取时长，最终所得的总RNA降解较少，得率较高。
(4)本发明方法与商业化多糖多酚植物总RNA提取试剂盒相比，所提取的总RNA不仅完整性更好，可以抽提出5s RNA和小RNA，能满足小RNA建库的要求，而且所使用的药品都为普通生化试剂，不依赖于任何过滤柱，大大降低了实验成本，经核算本发明方法提取1例样本的成本为8元左右，约是试剂盒提取费用的1/4。
(5)本发明方法具有高效率、高质量、低成本、周期短、稳定好、操作简单和易于广泛应用等优点，提取的总RNA完整性好、纯度高、得率高，可以直接用于RT-PCR、RT-qPCR、Northern杂交、cDNA文库构建和高通量测序等下游分子生物学实验。
附图说明
图1为采用本发明方法从蔷薇属植物不同组织中提取的总RNA的琼脂糖凝胶电泳图谱。图1中A为野蔷薇；图1中B为月季；图1中C为玫瑰；图1中D为黄刺玫。
图2为黄刺玫不同组织的总RNA反转录所得cDNA的琼脂糖凝胶电泳图谱。
图3为采用RT-PCR方法从月季不同组织中扩增RcACTIN基因片段的琼脂糖凝胶电泳图谱。
图4为采用RT-qPCR方法检测野蔷薇RmDFR基因在不同组织中的相对表达量分析图。
图5为玫瑰不同组织的总RNA的质量检测图。
图6为采用其他方法从野蔷薇成熟组织中提取的总RNA的琼脂糖凝胶电泳图谱。图6中A为改良Trizol法；图6中B为改良异硫氰酸胍法；图6中C为改良CTAB法；图6中D为LiCl-尿素法；图6中E为多糖多酚植物总RNA提取试剂盒法。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的植物材料，如无特殊说明，均采自荆楚理工学院蔷薇基地。公众可从申请人处获得该植物材料，该植物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中所有试剂和耗材均进行RNase灭活处理。
下述实施例中所有离心步骤均可在常温(室温，如25℃)或低温(4℃)条件下完成。
下述实施例中的湿润剂P-40是Nonidet P-40(NP-40)，为北京索莱宝科技有限公司产品，CAS：9016-45-9。
实施例1、从蔷薇属植物组织中提取总RNA的方法
本实施例分别从野蔷薇、月季(‘月月粉’品种)、玫瑰(‘紫枝’品种)、黄刺玫的各个组织(根、茎、叶、花和果实)中提取总RNA，包括以下步骤：
(1)分别称取0.2g根、茎、叶、花和果实放入经液氮预冷的研钵中，加入0.01g PVPP(交联聚维酮，交联聚乙烯吡咯烷酮)，在液氮中充分研磨成细粉；
(2)将样品粉末(细粉)迅速转移到含有0.6mL溶液A的1.5mL RNase-free离心管(无RNA酶的离心管)中，涡旋混匀，静置3min，12000rpm离心5min；
(3)吸取上清液至新的1.5mL RNase-free离心管中，加入等体积的溶液B，振荡混匀，静置3min，12000rpm离心5min；
(4)吸取上清液均分至两个新的1.5mL RNase-free离心管中，分别加入2倍体积的溶液C，振荡混匀，静置3min；
(5)再加入0.4倍体积的氯仿(三氯甲烷)，振荡混匀15s，静置3min，12000rpm离心10min；
(6)吸取上清液至新的1.5mL RNase-free离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，静置5min，12000rpm离心10min；
(7)倒弃上清液，加入1mL 75％乙醇轻轻颠倒洗涤RNA沉淀，7000rpm离心3min，倒弃上清液，重复清洗一次；
(8)倒弃上清液，短暂离心收集残液，用移液枪吸除残液，空气干燥RNA沉淀5-10min；
(9)加入50μL焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水，溶解RNA沉淀，于-80℃保存备用；
步骤(1)中所述蔷薇属植物组织(根、茎、叶、花和果实)可为新鲜的或-80℃保存的蔷薇属植物组织。
其中溶液A的组成为：0.1M三羟甲基氨基甲烷(Tris)、0.05M乙二胺四乙酸(EDTA)、0.5M氯化钾(KCl)、1.5M氯化钠(NaCl)、20g/L十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、体积分数为4％的β-巯基乙醇(β-ME)和体积分数为4％的湿润剂P-40(Nonidet P-40，NP-40)，其余为水；
溶液B的组成为：0.1M三羟甲基氨基甲烷(Tris)、2M氯化锂(LiCl)、20g/L十二烷基肌氨酸钠(SLS)、100g/L聚乙二醇8000(PEG8000)和40g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，其余为水；
溶液C的组成为：4M异硫氰酸胍(GITC)、0.2M醋酸钠(NaAc)、体积分数为50％的水饱和酚、1g/L 8-羟基喹啉(8-HQ)和体积分数为2％的β-巯基乙醇(β-ME)，其余为水。
溶液A、溶液B、溶液C的具体配制方法如下：
溶液A的配制方法为：Tris-HCl溶液(1M，pH 8.0)10mL，EDTA溶液(0.5M，pH 8.0)10mL，KCl 3.675g，NaCl 8.766g，CTAB 2g，β-ME 4mL，NP-40 4mL，最后加水至100mL，用盐酸(HCl)或氢氧化钠(NaOH)调节溶液pH为8.0。
溶液B的配制方法为：Tris-HCl溶液(1M，pH 8.0)10mL，LiCl 8.478g，SLS 2g，PEG8000 10g，PVP 4g，最后加水至100mL，用HCl调节溶液pH为8.0。
溶液C的配制方法为：GITC 47.264g，NaAc溶液(2M，pH 4.8)10mL，8-HQ 0.1g，水饱和酚50mL，β-ME 2mL，最后加水至100mL，用醋酸(HAc)调节溶液pH为4.8。
其中，Tris-HCl溶液(1M，pH 8.0)的配制方法为：121.14g Tris,加800mL水溶解后，用HCl调节pH为8.0，再加水定容到1L。
EDTA溶液(0.5M，pH 8.0)的配制方法为：146.12g EDTA，加入800mL水溶解后，用NaOH调节pH为8.0，再加水定容到1L。
NaAc溶液(2M，pH 4.8)的配制方法为：164.06g NaAc，加入800mL水溶解后，用HAc调节pH为4.8，再加水定容到1L。
所述的水均为无酶无菌水(DNase/RNase-Free Water)。
RNA质量检测：取2μL RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，取2μL RNA样品利用超微量分光光度计检测其纯度和浓度，剩余的RNA样品于-80℃保存备用。结果如图1和表1所示。
从图1中可以看出，采用本发明方法从野蔷薇、月季、玫瑰、黄刺玫蔷薇属植物的根、茎、叶、花、果实各个组织中提取的总RNA，经1％琼脂糖凝胶电泳后，均可见28S、18S、5S三条rRNA条带清晰完整，其中28S rRNA条带亮度约是18S rRNA条带亮度的2倍，并且未见DNA和蛋白质的污染，也未见降解现象，说明本发明方法能够从蔷薇属植物的各组织中提取质量高、完整性好的总RNA。
从表1中可以看出，采用本发明方法从野蔷薇、月季、玫瑰、黄刺玫蔷薇属植物的根、茎、叶、花、果实各个组织中提取的总RNA，经Nanodrop超微量分光光度计检测后，A260/A280和A260/A230的比值均在1.8-2.0之间，说明本发明方法从蔷薇属植物的各组织中提取的RNA纯度较高，质量较好，没有明显的降解和污染。
表1：采用本发明方法从蔷薇属植物不同组织中提取的总RNA的检测结果
实施例2：黄刺玫不同组织的总RNA反转录合成的cDNA质量检测
1、以实施例1中获得的黄刺玫根、茎、叶、花和果实的总RNA为模板，利用诺唯赞生物科技有限公司的II Reverse Transcriptase反转录试剂盒进行反转录(RT)，分别合成黄刺玫根的cDNA，茎的cDNA，叶的cDNA，花的cDNA，果实的cDNA，于-20℃保存备用。
2、将步骤1中获得的黄刺玫各个组织的cDNA经1％琼脂糖凝胶电泳进行检测分析。电泳成像结果(图2)显示，cDNA条带主要分布在0.5～1.0kb之间，分布范围广且浓度高，说明本发明方法提取的黄刺玫不同组织的总RNA反转录合成的cDNA质量较好，能够满足后续相关分子生物学试验的要求。
实施例3：应用RT-PCR方法扩增月季RcACTIN基因片段
1、以实施例1中获得的月季根、茎、叶、花和果实的总RNA为模板，利用诺唯赞生物科技有限公司的II Reverse Transcriptase反转录试剂盒进行反转录(RT)，分别合成月季根的cDNA，茎的cDNA，叶的cDNA，花的cDNA，果实的cDNA，于-20℃保存备用。
2、以步骤1中获得的月季各个组织的cDNA为模板，RcACTIN-F(5’-TGGGACTGGAATGGTCAA-3’)和RcACTIN-R(5’-GATGCTAAGATAGAGCCTCCG-3’)为引物进行聚合酶链式反应(PCR)，扩增月季RcACTIN基因(RcHm_v2.0_Chr3g0466761)的片段。
PCR反应体系：25μL 2×Taq PCR预混液，5μL cDNA模板，10μL 1μM F引物和10μL 1μM R引物。
PCR反应程序：94℃预变性5min，94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸30sec，35个循环；72℃延伸10min。
3、获得的PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳进行检测分析，同时由擎科生物科技有限公司进行测序分析。电泳成像结果(图3)和测序结果显示，PCR产物条带清晰单一，DNA片段大小为1008bp，符合预期结果，且其核苷酸序列与参考序列相一致，说明本发明方法提取的月季不同组织的总RNA反转录合成的cDNA质量较好，进一步说明本发明的方法提取的总RNA质量高，能够满足后续的基因克隆等分子生物学试验的要求。
实施例4：应用RT-qPCR方法检测野蔷薇RmDFR基因在不同组织中的相对表达量
1、以实施例1中获得的野蔷薇根、茎、叶、花和果实的总RNA为模板，利用诺唯赞生物科技有限公司的II Reverse Transcriptase反转录试剂盒进行反转录(RT)，分别合成野蔷薇根的cDNA，茎的cDNA，叶的cDNA，花的cDNA，果实的cDNA，于-20℃保存备用。
2、对步骤1中获得的野蔷薇各个组织的cDNA中RmDFR基因的相对表达量进行荧光实时定量(qPCR)分析。
RmDFR基因的检测引物为：RmDFR-F(5’-AAGCAAGGCCAATTCATTCA-3’)和RmDFR-R(5’-GGACCTTTGGCAAGTTCTCC-3’)。
RmACTIN基因的检测引物为：RmACTIN-F(5’-GAAACTGCCAAAACCAGCTCT-3’)和RmACTIN-R(5’-TGGTCTCATGGATACCAGCA-3’)。
反应体系：10μL 2×SYBR、2μL 1μM F引物、2μL 1μM R引物、1μL cDNA模板和5μLddH2O。
反应程序：95℃预变性15min，95℃变性10sec，60℃退火/延伸1min，40个循环。
3、RmACTIN基因作为内参基因，RmDFR基因的相对表达量计算公式为2-△△Ct，最后利用GraphPad Prism 8做图。结果(图4)显示，在野蔷薇根、茎、叶、花和果实中均能检测到RmDFR基因的表达，但在各组织中的表达量不同，其中在果实和茎中的表达量较高，其次是花和根，而在叶中的表达量相对较低，这一结果与刘航程等(刘航程，孙爽，徐秀琴，邱黎斌，苏青玲，张晓玉，仇悦璇，赖艳，张蔚，胡永峰.‘月月粉’和野蔷薇花青素合成酶基因的鉴定与表达分析[J].分子植物育种，2021，19(06):1811-1821.)报道的相一致，说明本发明方法提取的野蔷薇不同组织的总RNA反转录合成的cDNA质量较好，能够满足后续的基因表达分析等分子生物学试验的要求。
实施例5：玫瑰不同组织的总RNA样品建库合格性检测
采用生物芯片分析系统Aglient 2100Bioanalyzer对实施例1中获得的玫瑰根、茎、叶、花和果实的总RNA进行纯化后质量检测分析。结果(图5)显示，RNA样品的峰图基线均较为平整，其中28S/18S的比值均大于等于1.5，RIN(RNA integrity number)值在8.0-9.0之间，说明本发明方法提取的玫瑰不同组织的总RNA的完整性和质量非常好，能够满足后续的高通量测序等分子生物学试验的要求。
实施例6：本发明方法与其他方法从野蔷薇成熟组织中提取总RNA的效果比较
本实施例具体涉及本发明方法与改良Trizol法(购自北京天根生化科技有限公司，目录号为DP424)、改良异硫氰酸胍法(谢吉容，程再全，黄兴奇，唐开学.月季花瓣的RNA提取方法[J].云南农业大学学报，2007(04)：480-484.)、改良CTAB法(冯立国，李婷琳，陈陈，栾晓芳，丁晗，张健.玫瑰花组织总RNA提取方法研究[J].扬州大学学报，2013，34(04)：104-107.)、LiCl-尿素法(赵小兰，苏晓华，赵梁军.多花蔷薇总RNA提取方法[J].中国生物工程杂志，2005(09)：89-93.)、EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒法(购自北京艾德莱生物科技有限公司，目录号为RN38)从野蔷薇茎、叶、花等成熟组织中提取总RNA的效果比较。
结果显示，采用改良Trizol法从野蔷薇茎、叶、花中提取的总RNA经琼脂糖凝胶电泳后，未见28S、18S、5S三条rRNA条带，说明未能提取出总RNA(图6中A)；采用改良异硫氰酸胍法从野蔷薇茎、叶、花中提取的总RNA经琼脂糖凝胶电泳后，可见28S和18S rRNA条带微弱、弥散，5S rRNA条带浓亮，说明总RNA得率较低，且降解严重(图6中B)；采用改良CTAB法从野蔷薇茎、叶、花中提取的总RNA经琼脂糖凝胶电泳后，可见28S、18S、5S三条rRNA条带微弱、模糊、弥散，基因组DNA和蛋白质等杂质条带清晰、明亮(图6中C)，说明总RNA得率较低，且杂质较多；采用LiCl-尿素法从野蔷薇茎、叶、花中提取的总RNA经琼脂糖凝胶电泳后，可见28S、18S、5S三条rRNA条带清晰但浅淡，基因组DNA条带明显(图6中D)，说明总RNA得率较低，且有基因组DNA污染；采用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒法从野蔷薇茎、叶、花中提取的总RNA经琼脂糖凝胶电泳后，可见28S和18S rRNA条带清晰、明亮，其中28S rRNA条带亮度约是18S rRNA条带亮度的2倍，并且未见DNA和蛋白质的污染，也未见降解现象，但未见5S rRNA条带(图6中E)，说明总RNA完整性不佳。
本发明方法提取的蔷薇属植物各组织中的总RNA质量好、纯度高、得率高(图1和表1)，而且所需时间短、成本低、稳定性好(表2)，与上述的方法相比，是为提取蔷薇属植物组织总RNA的理想方法。
表2不同提取方法对时间和试剂的消耗要求
提取方法 实验时间 单位价格
本发明方法 1.5小时 8元
改良Trizol法 1小时 8元
改良异硫氰酸胍法 1小时 6元
改良CTAB法 2天 7元
LiCl-尿素法 3小时 8元
试剂盒法 1小时 30元
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (6)

1.一种从蔷薇属植物组织中提取总RNA的方法，其特征在于，所述方法包括将蔷薇属植物组织经液氮研磨得到粉末，将所述粉末进行三次裂解和提取后再进行氯仿抽提和异丙醇沉淀，得到蔷薇属植物组织总RNA，所述三次裂解和提取分别采用溶液A、溶液B和溶液C进行裂解提取，其中：
所述溶液A的组成为：
0.1M三羟甲基氨基甲烷、0.05M乙二胺四乙酸、0.5M氯化钾、1.5M氯化钠、20g/L十六烷基三甲基溴化铵、体积分数为4％的β-巯基乙醇和体积分数为4％的湿润剂P-40，其余为水；
所述溶液B的组成为：0.1M三羟甲基氨基甲烷、2M氯化锂、20g/L十二烷基肌氨酸钠、100g/L聚乙二醇8000和40g/L聚乙烯吡咯烷酮，其余为水；
所述溶液C的组成为：4M异硫氰酸胍、0.2M醋酸钠、体积分数为50％的水饱和酚、1g/L8-羟基喹啉和体积分数为2％的β-巯基乙醇，其余为水；
所述三次裂解和提取包括如下步骤：
(1)将所述粉末与所述溶液A涡旋混匀，静置3-5min，离心，吸取上清液；
(2)将步骤(1)得到的上清液与所述溶液B振荡混匀，静置3-5min，离心，吸取上清液；
(3)将步骤(2)得到的上清液与所述溶液C，振荡混匀，静置3-5min，完成所述三次裂解和提取。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶液A的pH值为8.0。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶液B的pH值为8.0。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶液C的pH值为4.8。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于，所述蔷薇属植物组织包括根、茎、叶、花和/或果实。
6.权利要求1-4中任一所述的方法在蔷薇属植物基因研究和/或构建蔷薇属植物cDNA文库中的应用。
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