CN105200057B - 利用miR397a提高植物中酚类化合物含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种利用miR397a提高植物中酚类化合物含量的方法。通过构建miR397a过表达载体并获得miR397a转基因植株(例如，转基因丹参株系)，用UFLC‑QTrap‑MS/MS技术分别测定了转基因植株的根、茎和叶中丹酚酸B和迷迭香酸等酚类化合物的含量。与野生型植株相比，采用本发明获得的转基因植株根、茎和叶中丹酚酸B和迷迭香酸等酚类化合物的含量均得到不同程度的升高。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域和遗传育种领域，具体地说，涉及一种利用miR397a提高植物中酚类化合物含量的方法。
背景技术
丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)的干燥根及根茎，具有活血调经、祛瘀止痛的功效，临床上可用于心脑血管疾病、癌症及慢性肝炎、尿毒症等疾病的治疗。目前世界上以丹参为原料的药品和保健品在市场上所占份额越来越大，如复方丹参滴丸、复方丹参注射液等近百种产品，已达到数百亿元，且1997年复方丹参滴丸成为第一个向美国FDA以治疗药身份申报的品种，表明丹参首例用国际标准进行评价的传统中药，应用前景十分广阔。
根据化合物的结构特点和理化性质，可以将丹参的化学成分为两类：一类为脂溶性的丹参酮类化合物，如丹参酮(Tanshinone)I和丹参酮II A等；一类为水溶性的酚酸类化合物，如迷迭香酸和丹酚酸B等。其中，以丹参水溶性物质为主的复方丹参注射液、丹参素注射液等制剂越来越受到人们的欢迎。其中，丹参水溶性药用成分中以丹酚酸B的含量最高，2005年版和2010年版《中华人民共和国药典》均将丹酚酸B作为丹参药材质量控制的指标性成分；迷迭香酸具有抗炎、镇痛、解痛的功效，在植物中的分布较为广泛，主要存在于唇形科、紫草科、葫芦科等多种植物中，且已经研发成药物，于1990年在德国投放市场；原儿茶醛和丹参素在丹参中的含量也较高，具有很强的抗脂质氧化、抗肝纤维化、改善尿毒症等作用，二者常作为丹参原药材以及丹参制剂的质量控制指标成分，也是丹参治疗冠心病的主要有效成分。
近年来，随着丹参药材需求量的迅速增加和野生资源的减少，人工栽培丹参的品质良莠不齐，因此，如何从分子水平上提高丹参中酚类化合物的含量，培育优质品种已成为丹参资源开发中新的研究方向。经检索发现，国内外科学家采用组织培养和细胞工程、非生物诱导子诱导、基因工程技术等方式对提高丹参酚类物质的含量进行研究。通过组织培养和细胞工程、非生物诱导子诱导提高的酚类物质含量升幅不大，且随着继代次数的增加，含量逐渐降低，稳定性不高。采用转基因技术提高丹参中迷迭香酸和丹酚酸B的含量，仅为野生型丹参干燥根中迷迭香酸和丹酚酸B含量的1.15和1.79倍，因此，通过转基因技术进行丹参品种的稳定改良还有很大的提升空间。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用miR397a稳定提高植物，特别是丹参中酚类化合物含量的方法。
为了实现本发明目的，本发明首先提供miR397a在提高植物中酚类化合物含量中的应用。
所述应用具体为：在植物中过表达miR397a，获得酚类化合物含量提高的转基因株系。
前述的应用，所述植物包括丹参。
本发明还提供一种miR397a过表达载体，所述过表达载体上含有由强启动子驱动的miR397a基因cDNA序列(Seq ID No.1，下划线为miR397a成熟体序列)。
其中，所述过表达载体的出发载体为植物双元表达载体(优选为pBI121)，所述强启动子优选为CaMV35S。
本发明构建的miR397a过表达载体CaMV35Sp::miR397a的结构如图1所示。
本发明还提供含有所述过表达载体的工程菌和转基因细胞系。
本发明还提供所述过表达载体在制备转基因植物中的应用。
本发明进一步提供一种利用miR397a提高植物中迷迭香酸和丹酚酸B等酚类化合物含量的方法，将所述过表达载体转入植物中获得酚类化合物含量提高的转基因植株。其中，所述植物包括丹参。
优选地，利用农杆菌介导的方法将所述过表达载体转入植物中。采用冻融法将过表达载体转化农杆菌，具体步骤如下：
1)将GV3101农杆菌感受态细胞置于冰上，待其融化后向管中加入2-6μL质粒CaMV35Sp::miR397a，使其充分混匀后置于冰上5min，然后再将管放于液氮中速冻5min，完成后迅速将管放于37℃的金属浴中热击5min；
2)完成后将上述混合液加入1mL LB液体培养基中，28℃慢速振荡2-4h；
3)将振荡后的离心管取出，常温下3000rpm离心4min，弃掉一部分上清液，留约200μL菌液用涂布棒均匀涂在含Rif和Kan(浓度分别为200mg/L和50mg/L)的LB固体平板上，然后倒置放于28℃的恒温培养箱中培养24h；
4)在超净工作台中用已灭菌的枪头从平板上挑选3-6个农杆菌单菌落，分别加入含LB液体培养及(含Rif和Kan)的离心管中，28℃振荡过夜培养；
5)用移液器将农杆菌菌液吸取1mL加入1.5mL干净的离心管中，然后再向其中加入已灭菌的0.5mL甘油(浓度为50％)，充分混匀后保存于-80℃冰箱，用于后续植物转化实验。
miR397a是microRNA的一种，为长度21bp的内源性非编码RNA，在植物进化中高度保守，具有重要的调控功能。丹参具有基因组小，染色体少，生长条件简单，且已经初步完成基因组测序等特点，正在发展成为潜在的模式药用植物，因此miR397a在丹参中的作用研究对其他植物有一定的指导借鉴意义。
用质粒CaMV35Sp::miR397a对丹参进行遗传转化，具体方法如下：根据对993品系丹参转化体系的摸索，将OD600值为0.5的农杆菌1mL稀释20倍侵染生长状态良好的丹参叶片，侵染时间为5min，在SmT1固体培养基中25℃暗培养2天后，转入SmT2固体培养基25℃下光培养16h暗培养8h，每10天继代一次，直到长出小芽，将小芽剪下，转入SmT3固体培养基中诱导生根，直至培养成植株。
其中，SmT1培养基：MS+BAP 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L
SmT2培养基：MS+BAP 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Cef 200mg/L+Kan 50mg/L
SmT3培养基：1/2MS+Cef 200mg/L
前述的方法，用于PCR鉴定转基因植株的引物组合为：
miR397a-5F：5′-CGCACAATCCCACTATCCTTCGCAA-3′
miR397a-5R：5′-CGCTGCACTCAATGATGGTTCTCCA-3′
miR397a-3F：5′-GCCCAATGGTACCAGACAAGTCAA-3′
miR397a-3R：5′-CAAGACCGGCAACAGGATTCAATCT-3′
利用UFLC-QTrap-MS/MS技术分别测定转基因植株(例如，转基因丹参株系)的根、茎和叶中酚类化合物的含量，结果显示，与野生型植株相比，酚类化合物在转基因植株中的含量较野生型对照植株有不同程度的提高，尤以丹酚酸B和迷迭香酸含量提高程度较大。
本发明通过构建miR397a过表达载体并获得丹酚酸B和迷迭香酸等酚类化合物含量提高的转基因植株(例如，转基因丹参株系1-7)，为更好地探讨miR397a在酚类化合物生物合成中的功能提供依据，同时也为植物的分子育种及品质成因奠定了理论基础。
附图说明
图1为本发明实施例1中构建的过表达载体CaMV35Sp::miR397a的结构示意图。
图2为本发明实施例3中miR397a转基因丹参的PCR检测电泳结果；A图中M：DNA分子量标准；p：表达载体目的基因5’端序列的阳性克隆；1-7：转基因丹参株系1-7目的基因的5’端序列；wt：野生型丹参植株阴性对照；B图中M：DNA分子量标准；p：表达载体目的基因3’端序列的阳性克隆；1-7：转基因丹参株系1-7目的基因的3’端序列；wt：野生型丹参植株阴性对照。
图3为本发明实施例4中miR397a在转基因丹参叶中的表达；其中，横坐标1-7为miR397a转基因丹参的7个株系，wt为野生丹参；纵坐标为相对表达量。
图4为本发明实施例5中丹参素、迷迭香酸、原儿茶醛、丹酚酸A和丹酚酸B对照品的总离子流图；其中，横坐标为出峰时间，纵坐标为峰高。
图5A-图5C分别为本发明实施例5中miR397a转基因丹参根、茎和叶中酚类化合物的总离子流图；其中，横坐标为出峰时间，纵坐标为峰高。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1miR397a过表达载体的构建
本实施例中构建的miR397a过表达载体CaMV35Sp::miR397a的结构如图1所示。
CaMV35Sp::miR397a的出发载体为pBI121，所述过表达载体上含有由强启动子CaMV35S驱动的miR397a基因cDNA序列(Seq ID No.1，下划线为miR397a成熟体序列)。
实施例2采用农杆菌介导法对丹参进行遗传转化
1、采用冻融法将过表达载体转化农杆菌，具体步骤如下：
1)将GV3101农杆菌感受态细胞置于冰上，待其融化后向管中加入2-6μL质粒CaMV35Sp::miR397a，使其充分混匀后置于冰上5min，然后再将管放于液氮中速冻5min，完成后迅速将管放于37℃的金属浴中热击5min；
2)完成后将上述混合液加入1mL LB液体培养基中，28℃慢速振荡2-4h；
3)将振荡后的离心管取出，常温下3000rpm离心4min，弃掉一部分上清液，留约200μL菌液用涂布棒均匀涂在含Rif和Kan(浓度分别为200mg/L和50mg/L)的LB固体平板上，然后倒置放于28℃的恒温培养箱中培养24h；
4)在超净工作台中用已灭菌的枪头从平板上挑选3-6个农杆菌单菌落，分别加入含LB液体培养及(含Rif和Kan)的离心管中，28℃振荡过夜培养；
5)用移液器将农杆菌菌液吸取1mL加入1.5mL干净的离心管中，然后再向其中加入已灭菌的0.5mL甘油(浓度为50％)，充分混匀后保存于-80℃冰箱，用于后续丹参转化实验。
2、质粒CaMV35Sp::miR397a对丹参的遗传转化，具体方法如下：根据对993品系丹参转化体系的摸索，将OD600值为0.5的农杆菌1mL稀释20倍侵染生长状态良好的丹参叶片，侵染时间为5min，在SmT1固体培养基中25℃暗培养2天后，转入SmT2固体培养基25℃下光培养16h暗培养8h，每10天继代一次，直到长出小芽，将小芽剪下，转入SmT3固体培养基中诱导生根，直至培养成植株。
其中，使用的培养基配方如下：
SmT1培养基：MS+BAP 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L
SmT2培养基：MS+BAP 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Cef 200mg/L+Kan 50mg/L
SmT3培养基：1/2MS+Cef 200mg/L
实施例3转基因丹参植株的PCR鉴定
(1)植物材料
将继代后6周的抗性丹参组培苗(共7个株系)和对照组野生丹参组培苗在超净工作台中用无菌剪刀剪取其叶片，做好标记后用锡箔纸包住，迅速冻在液氮中备用。
(2)转基因丹参植株基因组DNA的提取
起始材料为液氮中冻存的丹参叶片，操作方法按北京艾德莱生物科技有限公司的CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒说明书进行：
1)取液氮中冻存的丹参叶片约100mg，在研钵中研磨成粉末，研磨过程中不断缓慢倒入液氮，防止材料解冻。
2)转移细粉到1.5mL离心管，不要解冻，加600μL 65℃预热的裂解液PL(确认已加入β-巯基乙醇至2％)，剧烈涡旋振荡混匀，用大口径枪头轻柔吹打辅助裂解。
3)65℃水浴20min，在水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。
4)加入700μL氯仿/异戊醇(体积比24:1混合)，颠倒充分混匀几分钟，13000rpm离心5min。
5)小心吸取上清到一个新的1.5mL离心管，注意不要吸到界面物质。
6)较精确估算上清量，加入1.5倍体积结合液PQ后立刻涡旋，充分混匀(此时可能出现沉淀，但不影响实验结果)。
7)将上一步所得混合物(包括可能出现的沉淀)加入一个吸附柱AC中(吸附柱放入收集管中)，13000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液(先加700μL离心，弃废液，再加入剩余的溶液，再次离心)。
8)加入500μL抑制物去除液IR，12000rpm离心30s，弃废液。
9)加入700μL漂洗液WB，12000rpm离心30s，弃废液。
10)加入500μL漂洗液WB，12000rpm离心30s，弃废液。
11)将吸附柱AC放回空收集管中，13000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
12)取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μLddH2O(洗脱缓冲液预先在65-70℃水浴中预热)，室温放置3-5min，12000rpm离心1min。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min。
13)将得到的DNA存放于-20℃。
(3)基因特异性引物的设计与合成
以上述提取的丹参基因组DNA为模板，在CaMV35Sp::miR397a载体5’端设计正向引物，在miR397a基因5’端设计反向引物，用来扩增pBI121载体的一部分序列和miR397a基因5’端的一部分序列，在miR397a基因的3’端设计正向引物，在pBI121载体的3’端设计反向引物，用来扩增载体的一部分序列和miR397a基因3’端的一部分序列，对所获得的抗性丹参植株初步鉴定是否为转基因植株。
引物由北京生工生物工程有限公司合成，引物序列如下：
miR397a-5F：5′-CGCACAATCCCACTATCCTTCGCAA-3′
miR397a-5R：5′-CGCTGCACTCAATGATGGTTCTCCA-3′
miR397a-3F：5′-GCCCAATGGTACCAGACAAGTCAA-3′
miR397a-3R：5′-CAAGACCGGCAACAGGATTCAATCT-3′
按照以下反应体系进行PCR反应(总体积20.0μL)：
PCR反应条件如下：94℃5min；94℃30sec，59℃30sec，72℃1.0min，35个循环；72℃10min。4℃保存。
反应结束后取4-5μL产物电泳检测，具有特异目DNA大小的条带即为阳性转基因丹参株系样品。
所述的转基因丹参植物PCR鉴定以pBI121-miR397a质粒做阳性对照，以野生型丹参植株做阴性对照，分别提取丹参的基因组DNA为模板，在CaMV35Sp::miR397a载体中pBI121载体的5’端设计正向引物，在miR397a基因的5’端设计反向引物，用来扩增pBI121载体的一部分序列和miR397a基因5’端的一部分序列，扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图2A所示，miR397a转基因株系1-7出现了与阳性对照一样大小的条带，而在阴性对照中没有出现；在miR397a基因的3’端设计正向引物，在pBI121载体的3’端设计反向引物，用来扩增载体的一部分序列和miR397a基因3’端的一部分序列，扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图2B所示，miR397a转基因株系1-7出现了与阳性对照一样大小的条带，而在阴性对照中没有出现。PCR结果表明成功获得了丹参miR397a转基因植株。
实施例4转基因丹参植株的表达鉴定
(1)植物材料
将继代后6周的抗性丹参组培苗(共7个株系)和对照组野生丹参组培苗在超净工作台中用无菌剪刀剪取其叶片，做好标记后用锡箔纸包住，迅速冻在液氮中备用。
(2)转基因丹参植株基因组RNA的提取
起始材料为液氮中冻存的丹参叶片，操作方法参照北京艾德莱生物科技有限公司EASY spin植物microRNA快速提取试剂盒的使用说明进行：
1)取500μL裂解液RLT Plus，转入1.5mL离心管中，加入50μL PLANTaid混匀备用。
2)液氮中研磨适量植物组织成细粉后，取50mg细粉转入上述装有RLT和PLANTaid的离心管，立即用手剧烈振荡20s，充分裂解。
3)将裂解物13000rpm离心10min，沉淀不能裂解的碎片和结合有多糖多酚的PLANTaid。
4)取裂解物上清(不要超过基因组DNA清除柱能力，如残留基因组DNA较多，可适当减少取上清量)，将裂解物上清加到DNA清除柱上(清除柱放在收集管内)。
5)立即13000rpm离心60s，收集滤液(RNA在滤液中)。
6)用微量移液器较精确估计滤过液体积(450μL左右，滤过时候损失体积应该减去)，加入1.25倍体积的无水乙醇，立即吹打混匀，不要离心。
7)立刻将混合物(每次少于700μL，多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中(吸附柱放入收集管中)，13000rpm离心30s，弃废液。
8)加入700μL Wash Solution I，12000rpm离心30s，弃废液。
9)加入500μL Wash Solution 2/3，12000rpm离心30s，弃废液。
10)重复步骤9)。
11)将吸附柱RA放回空收集管中，13000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
12)取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，在吸附膜的中间部位加40μLRNase free Water，室温放置1min，12000rpm离心1min。
13)将得到的RNA可立即用于下游反应或尽快冻存于-80℃保存待用。
(3)加poly A
将上述提取的含miRNA的RNA加poly A，操作方法参照Applied Biosystems公司Poly(A)Tailing Kit试剂盒的使用说明进行：
1)在微量离心管中配制下述反应液(总体积19.2μL)：
2)加0.8μL E-PAP后混匀。
3)37℃温育1h。
4)最终的反应液于-20℃保存。
(4)RNA的定量与完整性检测
1)凝胶电泳检测RNA的完整性检测
取2μL提取的RNA样品进行凝胶电泳，琼脂糖凝胶浓度为1.2％，电压为120V，电泳15min。经凝胶成像系统检测显示出较分明的两条带，且前后两条带亮度比接近2:1，表明RNA是完整的，可用于后续实验。
2)RNA的定量及纯度检测
在NanoDrop 2000C Spectrophotometer检测器上测定RNA样品的浓度，观察在260nm和280nm波长下样品的OD值，判断其纯度。当OD260/OD280的比值为1.8-2.0时，表示RNA的纯度较好。
(5)基因特异性引物设计与合成
实时定量PCR(RT-PCR)的引物序列如表1所示：
表1 RT-PCR引物
(6)cDNA第一链的合成
以RNA为模板，按照Invitrogen公司的SuperScriptШ试剂盒操作，具体步骤如下：
1)在1.5mL离心管中配制下述反应液(总体积13.0μL)：
2)将上述物质混匀后进行瞬间离心，65℃温育5min，置于冰上约2min，加入如下试剂(总体积20.0μL)：
3)将上述物质混匀后进行瞬间离心，50℃温育60min使其充分反应。
4)70℃加热15min终止反应，-20℃保存待用。
(7)实时定量PCR
实时定量PCR选用Bio-Red公司的CFX96TM real-time PCR检测系统，参照Takara公司的SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)说明书，以丹参5.8S基因作为内参基因。
具体步骤如下：
1)在96孔板中分别配制下述反应液(总体积20.0μL)：
PCR反应条件如下：95℃30sec；95℃5sec，60℃18sec，72℃15sec，40个循环；95℃10sec。4℃保存。
其中，95℃10sec检测熔解曲线。RT-PCR数据处理采用2-ΔΔCq方法，Cq代表阈值的循环数。3个生物学重复的基因表达数据进行均一化处理。采用SPSS(Version 19.0)进行ANOVA分析，当P<0.05为差异显著表达，P<0.01为差异极显著表达。
转基因植株的表达鉴定通过将经Kan抗性初步筛选的丹参抗性植株和对照组野生型植株用EASY spin植物microRNA快速提取试剂盒提取RNA，以野生型丹参植株做阴性对照，以丹参5.8S基因作为内参基因，结果如图3所示。结果表明，miR397a在转基因植物中成功过表达，过表达的量为非转基因植物的7-39倍，分析结果表明，miR397a在转基因植物中成功过表达。
实施例5基于UFLC-QTrap-MS/MS的miR397a转基因植株中酚类化合物的含量分析
(1)UFLC-QTrap-MS/MS色谱检测条件和质谱检测条件以及对照品储备液的制备
1)色谱检测条件和质谱检测条件
色谱柱为SHISEIDO Capcell core C18column(50mm×2.1mm,2.7μm)；流动相为0.1％甲酸-水(A相)和乙腈-0.1％甲酸(B相)，梯度洗脱程序如下：0.01-5.0min，A相从90％降至70％；5.0-10.0min，A相从70％降至10％；10.0-12.00min，A相保持10％；12.0-15.0min，A相瞬间回到90％的起始浓度并保持3min。柱温：30℃；进样量：2μL；流速：0.30mL·min-1。
2)对照品储备液的制备
分别精密称取丹参素、迷迭香酸、原儿茶醛、丹酚酸A和丹酚酸B对照品适量，用70％甲醇溶解，作为储备液，分别配制成每毫升溶液中含有丹参素、迷迭香酸、原儿茶醛、丹酚酸A和丹酚酸B各4.9μg、2.7μg、3.1μg、12.2μg和12μg。
本实施例中采用的流动相梯度洗脱程序，丹参素保留时间为0.77min，峰形良好；迷迭香酸保留时间为4.62min，峰形良好；原儿茶醛保留时间为1.49min，峰形良好；丹酚酸A保留时间为5.60min，峰形良好；丹酚酸B保留时间为5.20min，峰形良好。结果可以保证丹参素、迷迭香酸、原儿茶醛、丹酚酸A和丹酚酸B与丹参中其他酚类化合物成分的分离。
(2)绘制标准曲线
取丹参素、迷迭香酸、原儿茶醛、丹酚酸A和丹酚酸B对照品储备液，分别用甲醇-水(7:3,v/v)溶液稀释得到不同浓度的对照品溶液，分别进样2.0μL，记录色谱图及色谱参数，对照品总离子流图见图4。以丹参素、迷迭香酸、原儿茶醛、丹酚酸A和丹酚酸B定量离子的峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，各酚类化合物的线性回归方程如下：
丹参素的线性回归方程：y＝124x+137(r2＝0.9999)
迷迭香酸的线性回归方程：y＝223x+2.78e+004(r2＝0.9984)
原儿茶醛的线性回归方程：y＝1.53e+003x+2.26e+003(r2＝1.0000)
丹酚酸B的线性回归方程：y＝82.3x+3.42e+003(r2＝0.9987)
丹酚酸A的线性回归方程：y＝154x+-1.84e+003(r2＝0.9994)
上述回归方程中，x表示样品的峰面积，y表示样品的浓度，单位ng/mL，r表示相关系数。
(3)供试品溶液的制备
将继代后6周的抗性丹参组培苗(共7个株系)和对照组野生丹参组培苗分别取其根、茎和叶放入预先用液氮冷冻的研钵中研磨，研磨后精密称取0.1g，加入2mL甲醇-水(7:3,v/v)，超声提取20min，5000rpm离心5min后，上清液过0.22μm有机滤膜，转入进样瓶，进样2.0μL。记录各样品中根、茎和叶的丹参素、迷迭香酸、原儿茶醛、丹酚酸A和丹酚酸B峰面积，代入线性回归方程，计算即可得到各个供试品溶液待测物质的含量。
用UFLC-QTrap-MS/MS技术分别测定转基因丹参株系根、茎和叶中丹参素、迷迭香酸、原儿茶醛、丹酚酸A和丹酚酸B的含量，总离子流结果分别见图5A、图5B和图5C。由图5可见，与野生型丹参相比，酚类化合物在转基因植株中的含量较野生型对照植株有不同程度的升高，尤以丹酚酸B和迷迭香酸含量升高程度较大。丹酚酸B在miR397a转基因丹参根、茎、叶中的含量分别是野生型丹参根、茎、叶的2.31-24.65倍，1.23-35.84倍和1.43-4.48倍；迷迭香酸在miR397a转基因丹参根、茎、叶中的含量分别是野生型丹参根、茎、叶的18-125.09倍，1.26-14.47倍和1.55-6.09倍。
上述实施例仅以转基因丹参为例进行说明。鉴于miR397a在不同种类植物酚类化合物生物合成中的功能近似，因此，在其它种类植物中过表达miR397a，获得丹酚酸B和迷迭香酸等酚类化合物含量升高的转基因株系均属于本发明的范围。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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Claims (3)
1.一种利用miR397a提高丹参中丹酚酸B和迷迭香酸含量的方法，其特征在于，将携带有如Seq ID No.1所示的miR397a基因cDNA序列的表达载体转入丹参中获得丹酚酸B和迷迭香酸含量提高的转基因植株：
其中，所述表达载体的出发载体为pBI121，miR397a基因的cDNA序列由强启动子CaMV35S驱动。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用农杆菌介导的方法将所述表达载体转入丹参中。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，转基因植株的PCR鉴定引物组合为：
miR397a-5F：5′-CGCACAATCCCACTATCCTTCGCAA-3′
miR397a-5R：5′-CGCTGCACTCAATGATGGTTCTCCA-3′
miR397a-3F：5′-GCCCAATGGTACCAGACAAGTCAA-3′
miR397a-3R：5′-CAAGACCGGCAACAGGATTCAATCT-3′。
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