CN102888423B - 一种植物双元表达载体pMHZ111及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物双元表达载体pMHZ111、植物双元干扰表达载体pMHZ111-SQS-SA和pMHZ111-SQE-SA，转化到农杆菌GV3101中，再将农杆菌GV3101转染人参愈伤组织，获得了人参主要的药理活性成分，人参皂苷的含量及构成发生了改变的转基因人参植株，为中医药行业提供特殊类型的中药资源。同时也深入地了解了人参皂苷的生物合成途径及其所调控的分子遗传学基础，从而在分子水平上实现皂苷生物合成的人工调控，是发展生物技术大量生产人参皂苷的打下了基础。

Description

一种植物双元表达载体pMHZ111及应用

技术领域

本发明属生物技术领域，具体地说是一种植物双元表达载体pMHZ111及其在改变人参皂苷含量的应用。 

背景技术

人参（Panax ginseng C.A.Mey.）为我国古老而名贵的药用植物，系五加科（Araliaceaae）人参属植物，是一种具有潜力的药用植物，在人类保健和医疗上应用广泛。医学和药理研究证明，人参皂苷为人参的主要有效成分之一， 

人参皂苷（Ginsenoside，GS）是人参主要的药理活性成分，至今人们已经从人参植物中分离出至少40多种人参皂苷单体，按人参皂苷在薄层色谱中Rf值的大小，由小到大命名为R₀、Ra、Rb₁、Rb₂、Rb₃、Rc、Rd、Re、Rf、Rg₁、Rg₂、Rg₃ 等。人参皂苷均属于三萜类皂苷，可分为三大类：第一类二醇型，如人参皂苷Rb₁、Rb₂、Rc、Rd、Rh₂等；第二类三醇型，如人参皂苷Re、Rf、Rg₁、Rg₂、Rh₁等；第三类齐墩果酸型, 如人参皂苷R₀、Rh₃ 等。其中二醇型和三醇型皂苷占绝大多数，被认为是人参的最主要活性成分。人参皂苷除单体皂苷外还含有蛋白质、酶类、多肽、氨基酸、人参多糖、人参挥发油、人参二醇、人参三醇等。

人参皂苷属于三萜类皂苷。四环三萜类物质是以异戊二烯为基本结构单元，其合成符合异戊二烯合成途径。近年来研究表明，植物类异戊二烯的生物合成至少存在2 条途径，即甲羟戊酸途径和丙酮酸/磷酸甘油醛途径。大量文献报道，甲羟戊酸途径是皂苷三萜苷元合成必要途径。目前对三萜皂苷的生物合成途径已有一些了解，研究证明三萜皂苷的合成首先通过甲羟戊酸途径合成2，3-氧化鲨烯，随后在氧化鲨烯环化酶（squalene oxide cyclase，OSC）的作用下形成各种三萜类。最后经细胞色素P450、糖基转移酶（GT）和β-糖苷酶的作用，形成各种类型的三萜皂苷（Dong et al.，2005）。 

三萜皂苷的生物合成途径至少存在两条，一条一般以甲羟戊酸为前体，即甲羟戊酸途径，它在细胞质中进行，并以糖酵解产物乙酰辅酶A作为初供体。甾体类和倍半萜化合物通过这一途径合成。主要分为三个阶段：①活性异戊二烯单位一异戊烯焦磷酸酯(isopentenyl一pyrophosphate，IPP)和γ，γ一二甲基丙烯基焦磷酸酯(dimethylally pyrophosphate，DMAPP)的生物合成；②鲨烯 (squalene)的生物合成及环化；③环上复杂的官能团的反应过程，最后形成完整的三萜皂苷分子。整个三萜皂苷的生物合成过程包括鲨烯合酶 (squalene synthase，SQS)、鲨烯环氧酶 (squalene epoxidase，SE)、法呢基焦磷酸合酶(famesyl pyrophosphate synthase，FPS)、单加氧化酶(monooxygenase，MO)、氧化鲨烯环化酶 (oxidosqualene cyelase，OSC)、羊毛脂甾醇合酶 (lanosterol synthase，LSS)、β一香树素合酶(β一Amyrin Synthase，bAS) 、环阿屯醇合酶 (Cyeloartenol Synthase，CAS)、达玛烷型合酶 (dammarenediol synthase，DMS)和羽扇豆型合酶 (Iupeol synthase，LS)等一系列酶的催化。其环上官能团的合成主要有细胞色素P₄₅₀(Cytoehrome P₄₅₀)、糖基转移酶(glyeosyltransferase，β一glyeosylase)、β一糖苷酶(β一glyeoside hydrolase，β一glyeosidase)等多种酶的催化，使三萜的种类更多样化，并形成复杂的糖苷化合物。鲨烯是三萜、甾醇、胆固醇等物质生物合成重要的共同前体，是鲨烯合酶SQS催化合成的产物。SQS在鲨烯后续生物合成支路中处于关键地位。SQS所催化的反应在三萜生物合成途径中，位于碳源从类异戊二烯途径流向萜类、甾醇合成途径的分支上，是生物合成三萜、甾醇、胆固醇等萜烯类重要物质过程中的一个关键酶，其含量和活性决定了后续产物的合成^[66]。目前己有酵母 (AF092497，AB012604)、小鼠(NM_010191)、大鼠(M95591)、人(L06105，X69141)及12科17属41条植物SQS的cDNA序列已在GenBank登录(至2008一03一01)，如Panax ginseng ABI22078、AB010148，Centella asiatica AY787628，Artemisia annua AF302464，Arabjdopsis thalisna D29017，Oryza sativa AB007501等。 

鲨烯环氧酶（squalene epoxidase，SQE）是一种单加氧酶，它是三萜皂苷生物合成途径中的关键酶之一，其基因所编码的酶可催化鲨烯（squalene）生成 2,3-氧化鲨烯。SQE 主要作用于单氧态氧化鲨烯生成 2,3-氧化鲨烯，2,3-氧化鲨烯是植物体内甾体、皂苷、倍半萜等许多萜类衍生物质的合成前体，这些物质在植物的生长发育或抗病过程中具有重要作用。据目前研究表明，SQE 基因在不同物种中均有表达。 

RNA 干扰（RNAi）主要是通过双链 RNA 的介导，特异性地降解相应序列的靶mRNA，从而阻断相应基因表达，是一种转录后水平的基因沉默方法。 

发明内容

本发明的目的是提供一种植物双元表达载体和一种植物双元干扰表达载体。 

一种植物双元表达载体pMHZ111，它是将PDK基因插入了基础载体pCLD04541中； 

所述的PDK基因，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

一种植物双元表达载体pCLD04541-PDK制备方法，它包括： 

1）以克隆载体pHANNIBAL为模板，用引物：

P1：5’-AGC GAATTC TAGTATAAAATAGTTAAGTG-3’

P2：5’-ATG GAATTC CAATCCAAATGTAAGATC-3’

进行PCR扩增；获得其碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示的PDK基因；插入pMD218T载体中克隆；

2）采用限制性内切酶EcoR Ι分别酶切基础载体pCLD04541和pMD18T-PDK，试剂盒回收纯化目的基因，采用T4 DNA连接酶进行连接。

一种植物双元干扰表达载体pMHZ111 -SQS-SA，它是在pCLD04541中插入了其碱基序列如序列表SEQ ID NO.4所示的PDK -SQS-SA。 

一种植物双元干扰表达载体pMHZ111 - SQE-SA，它是在pCLD04541中插入了其碱基序列如序列表SEQ ID NO.7所示的PDK -SQE-SA。 

一种植物双元干扰表达载体pMHZ111 -SQS-SA制备方法，它包括： 

1）利用 Trizol 法提取人参总RNA，反转录为cDNA，以cDNA 为模板，分别用引物：

正义基因上游引物（SQS-S1）：5'-  TCTAGA CTTGACACTGTTGAGGATG- 3’

正义基因下游引物（SQS-S2）：5'-  GGATCC TGTAGCCAAATCTTCTGCC- 3'

反义基因上游引物（SQS-A1）：5'-  CTCGAG TTGACACTGTTGAGGATGA- 3'

反义基因下游引物（SQS-A2）：5'-  AAGCTT  TCTGTAGCCAAATCTTCTG- 3'

克隆 SQS基因的正义SQS-S及反义片段SQS-A，分别连接到pMD18T上，获得pMD18T-SQS-S 和pMD18T- SQS-A；

2）采用限制性内切酶Xba Ⅰ和BamH Ⅰ分别酶切一种植物双元表达载体pCLD04541-PDK和pMD18T-SQS-S，试剂盒回收纯化目的基因，采用T4 DNA连接酶进行连接；

3）采用限制性内切酶XhoⅠ和HindⅢ分别酶切pMHZ111-SQS-S和pMD18T-SQS-A，试剂盒回收纯化目的基因，采用T4 DNA连接酶进行连接。

一种植物双元干扰表达载体pMHZ111 -SQE-SA制备方法，它包括： 

1）利用 Trizol 法提取人参总RNA，反转录为cDNA，以cDNA 为模板，分别用引物：

正义基因上游引物（SQE-S1）：5’-TGC TCTAGA CACTTTTATTAGGGGATGC-3’

正义基因下游引物（SQE-S2）：5’-CGC GGATCC AAGAAGTGGAGAAATAGGC-3’

反义基因上游引物（SQE-A1）：5’-CCGCTCGAGCACTTTTATTAGGGGATGC-3’

反义基因下游引物（SQE-A2）：5’-CCCAAGCTTAAGAAGTGGAGAAATAGGC-3’

克隆 SQE基因的正义SQE-S及反义片段SQE-A，分别连接到pMD18T上，获得pMD18T-SQE-S 和pMD18T- SQE-A；

2）采用限制性内切酶Xba Ⅰ和BamH Ⅰ分别酶切一种植物双元表达载体pMHZ111和pMD18T-SQE-S，试剂盒回收纯化目的基因，采用T4 DNA连接酶进行连接；

3）采用限制性内切酶XhoⅠ和HindⅢ分别酶切pMHZ111-SQE-S和pMD18T-SQE-A，试剂盒回收纯化目的基因，采用T4 DNA连接酶进行连接。

本发明的又一目的是提供一种转基因人参的制备方法。 

一种转基因人参的制备方法，它包括：以人参叶片，制备人参愈伤组织；将一种植物双元干扰表达载体pMHZ111 -SQS-SA ，转化到农杆菌GV3101中，再将农杆菌GV3101转染人参愈伤组织，培育人参种苗。 

一种转基因人参的制备方法，它包括：以人参叶片，制备人参愈伤组织；将一种植物双元干扰表达载体pMHZ111-SQE-SA ，转化到农杆菌GV3101中，再将农杆菌GV3101转染人参愈伤组织，培育人参种苗。 

本发明提供了一种植物双元表达载体pMHZ111、植物双元干扰表达载体pMHZ111 -SQS-SA和pMHZ111 -SQE-SA，转化到农杆菌GV3101中，再将农杆菌GV3101转染人参愈伤组织，获得了人参主要的药理活性成分，人参皂苷的含量及构成发生了改变的转基因人参植株，为中医药行业提供特殊类型的中药资源。同时也深入地了解了人参皂苷的生物合成途径及其所调控的分子遗传学基础，从而在分子水平上实现皂苷生物合成的人工调控，是发展生物技术大量生产人参皂苷的打下了基础。 

附图说明

图1. PDK基因PCR扩增结果； 

图2 . 基础载体pCLD04541图谱；

图3. 载体pMHZ111图谱；

图4. 基础载体pSLJ1711图谱；

图5. 载体pMHZ112图谱；

图6. 植物双元表达载体pMHZ111 和 pSLJ1711-PDK酶切验证；其中，1-5. pMHZ111，6.PDK PCR prodrct,7-1. pSLJ1711-PDK,12.Uncut  pMHZ111,13. Uncut pSLJ1711-PDK,14.λ/HindⅢ；

图7. SQS基因正义及反义片段的PCR扩增结果；M: D2000maker; 1. 水为模板阴性对照；

2: SQS正义基因片段(SQS-S)；3:SQS反义基因片段(SQS-A)；

图8. pMD18T-SQS-S和pMD18T-SQS-A酶切鉴定结果；M: D2000maker; 1. pMD18T-SQS-S酶切鉴定结果；2: pMD18T-SQS-A酶切鉴定结果；

图9. pMHZ111-SQS-SA载体构建策略；

图10. pMHZ111-SQS-SA交叉双酶切结果；M: D2000maker; 1. pMHZ111-SQS-SA XbaⅠ/Hind Ⅲ酶切鉴定结果；2: pMHZ111-SQS-SA XhoⅠ/BamHⅠ酶切鉴定结果；

图11. pMHZ111-SQS-SA人参愈伤组织转化后PCR鉴定结果；

图12. 实时定量 PCR 的电泳检测；1-3: 非转化愈伤组织的 SQS 基因表达量;4-6: 阳性愈伤组织的 SQS 基因表达量；

图13. SQE基因正义及反义片段的PCR扩增结果；M: D2000maker; 1: SQE正义基因片段(SQE-S)；2:SQS反义基因片段(SQE-A)；

图14. A：pMD18T-SQE-S和B：pMD18T-SQE-A酶切鉴定结果；

图15. pMHZ112-SQE-SA载体构建策略；

图16. pMHZ112-SQE-SA交叉双酶切结果；M: D2000maker; 1. pSLJ1711-PDK-SQE-SA XbaⅠ/Hind Ⅲ酶切鉴定结果；2: pSLJ1711-PDK-SQE-SA XhoⅠ/BamHⅠ酶切鉴定结果；

图17. pMHZ112-SQE-SA人参愈伤组织转化后PCR鉴定结果。

具体实施方式：

实施例1   PDK基因片段的克隆

（1）根据GenBank登录的PDK基因序列（AJ311872.1），采用Primer 5.0软件设计上下游引物，并引入EcoRΙ酶切位点。

上游引物（PDK-P1）：5’-AGC GAATTC TAGTATAAAATAGTTAAGTG-3’ 

下游引物（PDK-P2）：5’-ATG GAATTC CAATCCAAATGTAAGATC-3’

（2）以克隆载体pHANNIBAL（购自GATEWAY公司）为模板，采用Ex Taq DNA聚合酶对PDK基因进行PCR扩增。

PCR反应体系： 

PCR运行条件：94℃预变性5min；94℃变性1min，43℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃总延伸10min。反应结束后取1μl进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示成功扩增出PDK基因，如图1所示。

（3）PDK基因与pMD18T的连接、转化 

采用Axygen公司DNA凝胶回收试剂盒，按照说明书操作，对扩增目的基因进行回收，回收片段与克隆载体pMD18T进行连接。

连接体系： 

连接条件：16℃连接过夜。

采用电击法将连接产物转化E.coli DH10B感受态细胞，并筛选重组阳性克隆子。 

(1)配制平板，每升包括：15g LB 培养基, 15g琼脂, 2 mL 7.5mg/mL四环素, 75ul 200mg/mL IPTG 和 3mL 20mg/mL X-gal 。 

(2)  1.5ul DNA 电击转化 20ul E.coli DH10B 设置的电压制条件： 

电压  370 V  ,电容   330uF , 电阻   4K ohms ,电阻抗  低,充电率 快

(3) 电击后的产物加入1mL SOC培养基， 37oC  200 rpm 复苏1 h,

(4) 将复苏后的细胞涂在含有四环素, IPTG 和 X-gal的平板上，培养基完全将细胞吸干，放到37oC培养24 hours，长出单菌落。

（4）pMD18T-PDK的鉴定及序列分析 

按试剂盒说明书操作提取筛选疑似阳性克隆子质粒。采用EcoRΙ限制性内切酶对所提取的质粒载体进行酶切鉴定，酶切体系如下：

反应条件：37℃水浴2 h。结束后，经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测表明，成功获得了重组表达载体pMD8T-PDK。

将重组质粒送往北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序，测序结果经Blast比对分析表明，所扩增的PDK基因与GenBank登录的序列相似。其碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示。 

实施例2  植物双元表达载体pMHZ111的构建

以pCLD04541为基础载体（载体图谱如图2所示），采用常规限制性内切酶酶切、连接的方法分别将PDK基因插入基础载体pCLD04541上，构建植物双元表达载体pCLD04541-PDK。

（1）PDK基因的插入 

采用限制性内切酶EcoR Ι分别酶切基础载体pCLD04541和pMD18T-PDK，试剂盒回收纯化目的基因，采用T4 DNA连接酶进行连接。

连接体系如下： 

反应条件：21℃连接5 h，4℃过夜。

采用电击法将连接产物转化E.coli DH10B感受态细胞，筛选重组阳性克隆子，并采用测序的方法筛选正向连接产物pMHZ111。 

采用电击法将连接产物转化E.coli DH10B感受态细胞，筛选重组阳性克隆子，并采用测序的方法筛选正向连接产物，即获得植物双元表达载体pMHZ111，载体图谱如图3所示。 

实施例3  植物双元表达载体pMHZ112的构建

以pSLJ1711为基础载体（载体图谱如图4所示），采用常规限制性内切酶酶切、连接的方法分别将PDK基因基础载体pSLJ1711上，构建植物双元表达载体pMHZ112。构建方法同实施例2相同。载体图谱如图5所示。

实施例4  验证植物双元表达载体pMHZ111和pMHZ112

1试剂

(1)溶液I: 最终浓度            1 L

              50mM葡萄糖                9g

              10mM EDTA,pH8.0            20mL 0.5M

              25mM Tris-HCl,pH8.0          25mL 1M

4oC保存

(2) 溶液II:        最终浓度            100mL   现用现配

               0.2N NaOH                  5mL 4N

               1%SDS                      5mL 20%

               H2O                        90mL

 (3) 溶液 III: (3M KOAc)

       60mL of 5M 醋酸钾

       28.5mL 冰醋酸

       11.5mL H2O

pH 调至 4.8 - 5.3. 室温保存.

2 步骤

(1)将单菌落接到2mL含有四环素的LB液体培养基中，37oC，250RPM，培养16-20 小时。

(2)吸取1mL菌液加到1.5mL离心管中，8000 rpm离心10分钟，弃上清，用涡旋器分散菌体，加入0.2mL 溶液I，轻轻混匀，冰浴5分钟 

(3) 加入0.4 mL 溶液 II, 轻轻混匀，冰浴5分钟

(4) 加入 0.3mL 溶液III, 轻轻混匀，冰浴15分钟或-80oC 放置5分钟.

(5)颠倒混匀几次后，立即13,000rpm 离心15 分钟.

(6) 小心吸取上清液0.7mL 放入新的离心管中. 避免吸入白色沉淀。加0.58mL 异丙醇, 颠倒混匀, 13,000rpm 离心 10 分钟，收集 DNA.

(7) 弃上清, 用预冷的 70% 乙醇洗涤, 13,rpm 离心 2分钟.

(8) 倒掉70% 乙醇,吹干，, 加 40 ul 1XTE buffer(pH8.0) 回溶.

(9) 取 4ul DNA 溶液, 加入 BamH I and Hind III 37oC 酶切2小时，10ul 酶切体系:

                       

 其结果如图6所示

实施例5  人参SQS基因RNA干扰表达载体pMHZ111-SQS-SA和pMHZ112-SQS-SA的构建

（1）人参SQS基因正义及反义片段的克隆

根据GenBank登录的SQS基因序列（AB010148）设计正义及反义基因片段的引物，其中正义基因上下游引物分别引入XbaⅠ和BamH Ⅰ酶切位点，反义基因上下游引物分别引入Xho Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点。

正义基因上游引物（SQS-S1）：5'-  TCTAGA CTTGACACTGTTGAGGATG- 3’ 

正义基因下游引物（SQS-S2）：5'-  GGATCC TGTAGCCAAATCTTCTGCC- 3'

反义基因上游引物（SQS-A1）：5'-  CTCGAG TTGACACTGTTGAGGATGA- 3'

反义基因下游引物（SQS-A2）：5'-  AAGCTT  TCTGTAGCCAAATCTTCTG- 3'

利用 Trizol 法提取人参总RNA，反转录为cDNA，以cDNA 为模板克隆 SQS基因正义及反义片段。

PCR反应体系： 

PCR运行条件：

①SQS基因正义片段：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次，72℃后延伸5min。

②SQS基因反义片段：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，循环25次，72℃后延伸5min。 

③反应结束后取1μl进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示成功扩增出SQS基因正义及反义片段，如图7所示。 

（2）人参SQS基因正义及反义片段的序列鉴定 

采用V-gene公司DNA凝胶回收试剂盒，按照说明书操作，对扩增目的基因进行回收，回收片段与克隆载体pMD18T进行连接，分别构建pMD18T-SQS-S和pMD18T-SQS-A。

连接体系： 

连接条件：16℃连接过夜。

采用常规CaCl₂法将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，并筛选重组阳性克隆子。 

对筛选的阳性克隆子分别进行双酶切鉴定，pMD18T-SQS-S双酶切反应体系： 

反应条件：37℃温浴2h，65℃温浴15min，4℃保存。取5 μL进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示成功获得了重组表达载体pMD18T-SQS-S，如图8所示。

pMD18T-SQS-A双酶切反应体系： 

反应条件：37℃温浴2h，65℃温浴15min，4℃保存。取5 μL进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示成功获得了重组表达载体pMD18T-SQS-A，如图8所示。

将上述鉴定正确的pMD18T-SQS-S和pMD18T-SQS-A进行序列测定，结果表明扩增序列与已知公布（AB010148）的序列同源性为99%。SQS-S和SQS-A其碱基序列分别如序列表SEQ ID NO.2、3所示。 

（3）RNA干扰表达载体pMHZ111-SQS-SA 和pMHZ112-SQS-SA的构建（构建策略如图9所示） 

① pMHZ111-SQS-SA的构建

采用限制性内切酶Xba Ⅰ和BamH Ⅰ分别酶切pMHZ111和pMD18T-SQS-S，酶切反应体系和反应条件同实施例6（2）中所述。试剂盒回收纯化目的基因，采用T4 DNA连接酶进行连接。

连接体系如下： 

反应条件：21℃连接6 h，4℃过夜。

采用常规CaCl₂法将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，筛选重组阳性克隆子，构建 pMHZ111-SQS-S。 

采用限制性内切酶XhoⅠ和Hind Ⅲ分别酶切pMHZ111-SQS-S和pMD18T-SQS-A，酶切反应体系和反应条件同实施例6（2）中所述。试剂盒回收纯化目的基因，采用T4 DNA连接酶进行连接。 

连接体系如下： 

反应条件：21℃连接6 h，4℃过夜。

采用电击法将连接产物转化农杆菌GV3101感受态细胞，筛选重组阳性克隆子，提取质粒后，用限制性内切酶XbaⅠ/Hind Ⅲ和XhoⅠ/BamHⅠ进行交叉双酶切，如图10所示，切出约1.1 kb 条带（SQS-S或SQS-A + PDK），与理论值相符。SQS-A -PDK- SQS-S，筒称：PDK-SQS-SA，其碱基序列分别如序列表SEQ ID NO.4所示。 

表明成功构建了pMHZ111-SQS-SA  RNA干扰载体。 

② pMHZ112-SQS-SA的构建，具体步骤构建pMHZ111-SQS-SA相同。 

实施例6  RNA干扰表达载体pMHZ111-SQS-SA和pMHZ112-SQS-SA的功能检测

（1）人参愈伤组织转化实验

以5 年生人参叶片诱导得到的人参愈伤组织为材料。将pMHZ111-SQS-SA RNA/农杆菌GV3101菌液（OD₅₅₀ = 0.6）与人参愈伤组织细胞混合震荡，侵染8-10 min后转移至共培养培养基（MS + 0.5 mg /L BA + 0.1 mg /L NAA) 上，于23℃下暗培养3 d，再转入筛选培养基（MS + 0.5 mg /L BA + 0.1 mg /L NAA + 400 mg /L Cef + 30 mg /L Kan），23℃暗培养，每2周更换一次培养基，筛选抗性愈伤组织，提取呈阳性人参愈伤组织的DNA，分别用引物SQS-S1 / PDK内含子引物1 （5'-AGCGAATTCTAGTATAAAATAGTTAAGTG-3'）和SQS-A1 / PDK内含子引物2 （5'-ATGGAATTCCAATCCAAATGTAAGATC-3'）进行扩增，如图11所示，扩增了大小约为1.1 kb的条带（SA + PDK），与理论值相符，证明干扰载体已成功转化人参愈伤组织。

（2）SQS 基因表达量分析 

常规Trizol法提取呈阳性的人参愈伤组织总RNA，反转录为cDNA。利用实时定量PCR方法检测SQS基因表达的表达量。

PCR反应体系： 

PCR 运行条件：95℃预变性 5 min；95℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30s；共30个循环；72℃总延伸5min。反应结束后取1μl进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，如图12所示。

（3）皂苷含量测定 

以呈阳性和非转化（对照品）的人参愈伤组织为材料，采用常规索氏技术提取人参皂苷，采用HPLC法测定样品中6种单体皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd的含量。结果表明，在测定的6种人参皂苷中，Rg1、Re、Rc单体皂苷含量的下降， Rb1、Rb2、Rd单体有所升高，说明已利用RNAi手段，通过抑制SQS基因的表达，使人参皂苷含量相应发生了变化。

pMHZ112-SQS-SA的功能检测，其结果如表1、2、3、4所示。 

实施例7 人参SQE基因RNA干扰表达载体pMHZ111-SQE-SA和pMHZ112-SQE-SA的构建

（1）人参SQE基因正义及反义片段的克隆

参考GenBank登录的五加科植物SQE基因（AB003516 、AB122078 、FJ393274、EU131089、DQ457054、DQ386734）序列进行比对，找到 SQE 基因的保守区域位于1135-1469 bp，根据该保守序列，设计正义及反义基因片段的引物，其中正义基因上下游引物分别引入Xba Ⅰ和BamHⅠ酶切位点，反义基因上下游引物分别引入Xho Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点。

正义基因上游引物（SQE-S1）：5’-TGC TCTAGA CACTTTTATTAGGGGATGC-3’ 

正义基因下游引物（SQE-S2）：5’-CGC GGATCC AAGAAGTGGAGAAATAGGC-3’

反义基因上游引物（SQE-A1）：5’-CCGCTCGAGCACTTTTATTAGGGGATGC-3’

反义基因下游引物（SQE-A2）：5’-CCCAAGCTTAAGAAGTGGAGAAATAGGC-3’

利用 Trizol 法提取人参总RNA，反转录为cDNA，以cDNA 为模板克隆 SQE基因正义及反义片段。

PCR反应体系： 

PCR运行条件：94℃预变性5min；94℃变性30 s，50-60℃退火30s，72℃延伸30 s，共35个循环；72℃总延伸5 min。反应结束后取1μl进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示成功扩增出SQE基因正义及反义片段，如图13所示。

（2）人参SQE基因正义及反义片段的序列鉴定 

方法同实施例6中（2）所述，构建pMD18T-SQE-S和pMD18T-SQE-A，分别用Xba Ⅰ/BamHⅠ和Xho Ⅰ/Hind Ⅲ 进行酶切鉴定，结果如图14所示。SQE-S和SQE-A其碱基序列分别如序列表SEQ ID NO.5、6所示。

（3）RNA干扰表达载体pMHZ111-SQE-SA和pSLJ1711-PDK-SQE-SA的构建（构建策略如图15所示） 

方法同实施例6中（3）所述，构建RNA干扰表达载体pMHZ111-SQE-SA和pMHZ112-SQE-SA，用Xba Ⅰ/BamHⅠ和Xho Ⅰ/Hind Ⅲ 进行酶切鉴定，结果如图16所示。SQE-A -PDK- SQE-S，筒称：PDK-SQE-SA，其碱基序列分别如序列表SEQ ID NO.7所示。

实施例8  RNA干扰表达载体pMHZ111-SQE-SA和pMHZ112-SQE-SA的功能检测

（1）人参愈伤组织转化实验

方法同实施例7中（1）所述，不同的是PCR鉴定所用的引物是SQE-S1 / PDK内含子引物2和SQE-A2 / PDK内含子引物1，PCR鉴定结果如图17所示。

（2）皂苷含量测定 

方法同实施例7中（3）所述，测定6种主要单体皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd的含量，结果在转化空质粒、 pMHZ111-SQE-SA和pMHZ112-SQE-SA重组质粒的人参愈伤组织中均检测出Rg1、Re、Rb1、Rc 这4种单体皂苷，通过RNAi 干扰抑制 SQE 基因的表达，可以使人参单体皂苷含量发生相应的改变。结果见表1、2、3和4。

 表1各皂苷单体峰面积 

Table.1 the Ginsenoside peaks areas

表2 人参愈伤组织中皂苷含量的变化(×10^-4g/mL)

Table.2the changes of Ginsenoside content of Ginseng callus

表3 皂苷含量(×10^-4g/mL)

表4 皂苷含量(×10^-4g/mL)

SEQUENCE LISTING

 

<110> 吉林农业大学

 

<120>一种植物双元表达载体pMHZ111及应用

 

<160>  7    

 

<210>  1

<211>  729

<212>  DNA

<213>  人工

 

<400>  1

tagtataaaa tagttaagtg atgttaatta gtatgattat aataatatag ttgttataat     60

tgtgaaaaaa taatttataa atatattgtt tacataaaca acatagtaat gtaaaaaaat    120

atgacaagtg atgtgtaaga cgaagaagat aaaagttgag agtaagtata ttatttttaa    180

tgaatttgat cgaacatgta agatgatata ctagcattaa tatttgtttt aatcataata    240

gtaattctag ctggtttgat gaattaaata tcaatgataa aatactatag taaaaataag    300

aataaataaa ttaaaataat atttttttat gattaatagt ttattatata attaaatatc    360

tataccatta ctaaatattt tagtttaaaa gttaataaat attttgttag aaattccaat    420

ctgcttgtaa tttatcaata aacaaaatat taaataacaa gctaaagtaa caaataatat    480

caaactaata gaaacagtaa tctaatgtaa caaaacataa tctaatgcta atataacaaa    540

gcgcaagatc tatcatttta tatagtatta ttttcaatca acattcttat taatttctaa    600

ataatacttg tagttttatt aacttctaaa tggattgact attaattaaa tgaattagtc    660

gaacatgaat aaacaaggta acatgataga tcatgtcatt gtgttatcat tgatcttaca    720

tttggattg                                                729

  

<210>  2

<211>  358

<212>  cDNA

<213>  人工

 

<400>  2

 

tctgtagcca aatcttctgc cccagaggca tggaagagct ttgacaaccc taatccaact     60

agtcctgccg catagtgaca atattcatca taaccatcaa ttgtctccac ctccttgcat    120

ataaattttg ccattcctgc acccattctc attgtaatat cttctattgc ctccttgtaa    180

ccgcttccaa gatccagaga agcattagaa acatgatgga attcatccat gagaactttg    240

tattccttcg taccacatga aaagtgccag tcgttatcat atatgtggcg atgaaaagcc    300

atcaatattg gtactttaac ctctgtagat atgcttgtgt catcctcaac agtgtcaa      358

 

<210>  3

<211>  358

<212>  cDNA

<213>  人工

 

<400>  3

ttgacactgt tgaggatgac acaagcatat ctacagaggt taaagtacca atagtgatgg     60

cttttcattg ccacatatat gataacgact ggcacttttc atgtggtacg aaggaataca    120

aagttctcat ggatgagttc catcacgttt ctaatgcttt tctggatctt ggaagcggtt    180

acaaggaggc aatagaagat attacaatga gaatgggtgc aggaatggca aaatttttat    240

gcaaggaggt ggagacaatt gatgattatg atgaatactg tcactatgtg gcaggactag    300

ttggattagg gttgtcaaag ctcttccatg cctctggggc agaagatttg gctacaga      358

 

<210>  4

<211>  1481

<212>  cDNA

<213>  人工

 

<400>  4

 

ctcgagttga cactgttgag gatgacacaa gcatatctac agaggttaaa gtaccaatag     60

tgatggcttt tcattgccac atatatgata acgactggca cttttcatgt ggtacgaagg    120

aatacaaagt tctcatggat gagttccatc acgtttctaa tgcttttctg gatcttggaa    180

gcggttacaa ggaggcaata gaagatatta caatgagaat gggtgcagga atggcaaaat    240

ttttatgcaa ggaggtggag acaattgatg attatgatga atactgtcac tatgtggcag    300

gactagttgg attagggttg tcaaagctct tccatgcctc tggggcagaa gatttggcta    360

cagaaagctt gaattctagt ataaaatagt taagtgatgt taattagtat gattataata    420

atatagttgt tataattgtg aaaaaataat ttataaatat attgtttaca taaacaacat    480

agtaatgtaa aaaaatatga caagtgatgt gtaagacgaa gaagataaaa gttgagagta    540

agtatattat ttttaatgaa tttgatcgaa catgtaagat gatatactag cattaatatt    600

tgttttaatc ataatagtaa ttctagctgg tttgatgaat taaatatcaa tgataaaata    660

ctatagtaaa aataagaata aataaattaa aataatattt ttttatgatt aatagtttat    720

tatataatta aatatctata ccattactaa atattttagt ttaaaagtta ataaatattt    780

tgttagaaat tccaatctgc ttgtaattta tcaataaaca aaatattaaa taacaagcta    840

aagtaacaaa taatatcaaa ctaatagaaa cagtaatcta atgtaacaaa acataatcta    900

atgctaatat aacaaagcgc aagatctatc attttatata gtattatttt caatcaacat    960

tcttattaat ttctaaataa tacttgtagt tttattaact tctaaatgga ttgactatta   1020

attaaatgaa ttagtcgaac atgaataaac aaggtaacat gatagatcat gtcattgtgt   1080

tatcattgat cttacatttg gattggaatt cggatcctct gtagccaaat cttctgcccc   1140

agaggcatgg aagagctttg acaaccctaa tccaactagt cctgccgcat agtgacaata   1200

ttcatcataa ccatcaattg tctccacctc cttgcatata aattttgcca ttcctgcacc   1260

cattctcatt gtaatatctt ctattgcctc cttgtaaccg cttccaagat ccagagaagc   1320

attagaaaca tgatggaatt catccatgag aactttgtat tccttcgtac cacatgaaaa   1380

gtgccagtcg ttatcatata tgtggcgatg aaaagccatc aatattggta ctttaacctc   1440

tgtagatatg cttgtgtcat cctcaacagt gtcaatctag a                       1481

 

 

 

<210>  5

<211>  364

<212>  cDNA

<213>  人工

 

<400>  5

aagaagtgga gaaataggct aattggacgc gggtttaggc cagaaagtaa agcaattggc     60

ccttgagaac aaattcctcc gaggctcaga taatcaaaac acgcattgcg cgtttcttgc    120

cttgctttat caggtgatgc acaaaaaact ttataaaggg cacctgccaa tgtatttata    180

gtagacgcca cgggcttacg aagggtgtaa aaggattcga gatatttgca gagggttgac    240

gagtcatgga gatcgcgtaa aggtctaaga agatcccgga tcaagacaat atcggacaga    300

gccactgtca ttcccccgcc ggttaaagga tggcgcatat tgaaagcatc ccctaataaa    360

agtg                                                     364

 

 

<210>  6

<211> 364

<212>  cDNA

<213>  人工

 

 

<400>  6

cacttttatt aggggatgct ttcaatatgc gccatccttt aaccggcggg ggaatgacag      60

tggctctgtc cgatattgtc ttgatccggg atcttcttag acctttacgc gatctccatg     120

actcatcaac cctctgcaaa tatctcgaat ccttttacac ccttcgtaag cccgtggcat     180

ctactataaa tacattggca ggtgcccttt ataaagtttt ttgtgcatca cctgataaag     240

caaggcaaga aatgcgcaat gcgtgttttg attatctgag cctcggagga atttgttccc     300

aagggccaat tgctttactt tctggcctaa acccgcgtcc aattagccta tttctccact     360

tctt                                                     364

<210>  7

<211> 364

<212>  cDNA

<213>  人工

 

 

<400>  7

ctcgagcact tttattaggg gatgctttca atatgcgcca tcctttaacc ggcgggggaa     60

tgacagtggc tctgtccgat attgtcttga tccgggatct tcttagacct ttacgcgatc    120

tccatgactc atcaaccctc tgcaaatatc tcgaatcctt ttacaccctt cgtaagcccg    180

tggcatctac tataaataca ttggcaggtg ccctttataa agttttttgt gcatcacctg    240

ataaagcaag gcaagaaatg cgcaatgcgt gttttgatta tctgagcctc ggaggaattt    300

gttcccaagg gccaattgct ttactttctg gcctaaaccc gcgtccaatt agcctatttc    360

tccacttctt aagcttgaat tctagtataa aatagttaag tgatgttaat tagtatgatt    420

ataataatat agttgttata attgtgaaaa aataatttat aaatatattg tttacataaa    480

caacatagta atgtaaaaaa atatgacaag tgatgtgtaa gacgaagaag ataaaagttg    540

agagtaagta tattattttt aatgaatttg atcgaacatg taagatgata tactagcatt    600

aatatttgtt ttaatcataa tagtaattct agctggtttg atgaattaaa tatcaatgat    660

aaaatactat agtaaaaata agaataaata aattaaaata atattttttt atgattaata    720

gtttattata taattaaata tctataccat tactaaatat tttagtttaa aagttaataa    780

atattttgtt agaaattcca atctgcttgt aatttatcaa taaacaaaat attaaataac    840

aagctaaagt aacaaataat atcaaactaa tagaaacagt aatctaatgt aacaaaacat    900

aatctaatgc taatataaca aagcgcaaga tctatcattt tatatagtat tattttcaat    960

caacattctt attaatttct aaataatact tgtagtttta ttaacttcta aatggattga   1020

ctattaatta aatgaattag tcgaacatga ataaacaagg taacatgata gatcatgtca   1080

ttgtgttatc attgatctta catttggatt ggaattcgga tccaagaagt ggagaaatag   1140

gctaattgga cgcgggttta ggccagaaag taaagcaatt ggcccttgag aacaaattcc   1200

tccgaggctc agataatcaa aacacgcatt gcgcgtttct tgccttgctt tatcaggtga   1260

tgcacaaaaa actttataaa gggcacctgc caatgtattt atagtagacg ccacgggctt   1320

acgaagggtg taaaaggatt cgagatattt gcagagggtt gacgagtcat ggagatcgcg   1380

taaaggtcta agaagatccc ggatcaagac aatatcggac agagccactg tcattccccc   1440

gccggttaaa ggatggcgca tattgaaagc atcccctaat aaaagtgtct aga          1493

 

 

Claims (3)

1.一种植物双元干扰表达载体pMHZ111 - SQE-SA，它是在pCLD04541中插入了其碱基序列如序列表SEQ ID NO.7所示的PDK -SQE-SA。

2.一种植物双元干扰表达载体pMHZ111 -SQE-SA制备方法，它包括：

1）利用 Trizol 法提取人参总RNA，反转录为cDNA，以cDNA 为模板，分别用引物：

正义基因上游引物（SQE-S1）：5’-TGC TCTAGA CACTTTTATTAGGGGATGC-3’

正义基因下游引物（SQE-S2）：5’-CGC GGATCC AAGAAGTGGAGAAATAGGC-3’

反义基因上游引物（SQE-A1）：5’-CCGCTCGAGCACTTTTATTAGGGGATGC-3’

反义基因下游引物（SQE-A2）：5’-CCCAAGCTTAAGAAGTGGAGAAATAGGC-3’

克隆 SQE基因的正义SQE-S及反义片段SQE-A，分别连接到pMD18T上，获得pMD18T-SQE-S 和pMD18T- SQE-A；

2）采用限制性内切酶Xba Ⅰ和BamH Ⅰ分别酶切一种植物双元表达载体pMHZ111和pMD18T-SQE-S，试剂盒回收纯化目的基因，采用T4 DNA连接酶进行连接；

3）采用限制性内切酶XhoⅠ和HindⅢ分别酶切pMHZ111-SQE-S和pMD18T-SQE-A，试剂盒回收纯化目的基因，采用T4 DNA连接酶进行连接。

3.一种转基因人参的制备方法，它包括：以人参叶片，制备人参愈伤组织；将权利要求1所述的一种植物双元干扰表达载体pMHZ111-SQE-SA ，转化到农杆菌GV3101中，再将农杆菌GV3101转染人参愈伤组织，培育人参种苗。

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