CN112522220A - 一种参与丹参酮生物合成的丹参cyp71be37的基因克隆引物、功能及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了丹参中一条参与调控丹参酮合成的细胞色素P450基因CYP71BE37的编码基因序列；本发明所提供的CYP71BE37基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述基因编码蛋白质具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。本发明检测了CYP71BE37在丹参组织中的表达情况，发现其在丹参花和根的周皮部高丰度表达；构建了CYP71BE37‑RNAi载体及CYP71BE37‑过表达(CYP71BE37‑oe)载体，通过发根农杆菌介导的丹参遗传转化获得转基因毛状根阳性株系；超高效液相色谱(UPLC)检测分析发现，在CYP71BE37‑RNAi株系中，丹参酮类化合物含量显著降低，而在CYP71BE37‑oe株系中，丹参酮类化合物含量升高。本发明提供的CYP71BE37具有催化产生丹参酮类化合物的能力，为利用生物技术手段提高丹参酮类化合物的含量奠定基础。

Description

一种参与丹参酮生物合成的丹参CYP71BE37的基因克隆引物、 功能及应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学和植物基因工程领域，具体涉及一种参与调控丹参酮生物合成的CYP71BE37的基因克隆和功能研究。

背景技术

中药丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)的干燥根和根茎，是最常用的大宗药材之一。丹参具有扩张冠脉、抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗心律失常、清除自由基和保护心肌、改善微循环和血液流变、治疗痛经、抗肿瘤、抗炎、保肝以及抗菌等药理作用。丹参酮类化合物和丹酚酸类化合物是丹参的主要活性成分。其中，丹参酮类化合物主要分布于丹参根及根的周皮中，包括二氢丹参酮I(DT-I)、隐丹参酮(CT)、丹参酮I(T-I)和丹参酮IIA(T-IIA)等，在治疗心脑血管疾病方面发挥重要作用。丹参酮为二萜类化合物，其生物合成途径可分为三部分，第一部分是萜类化合物前体异戊烯基二磷酸(IPP)和烯丙基二磷酸(DMAPP)的合成；第二部分是丹参酮骨架化合物——次丹参酮二烯的合成；第三部分是骨架化合物的修饰过程，包括氧化、甲基化、脱羧等。目前，丹参酮生物合成途径研究已取得一定进展，但仍未被彻底阐明，主要是仍有大量参与丹参酮骨架化合物氧化的关键酶(主要为细胞色素P450)仍未被鉴定。

细胞色素P450(Cytochrome P450，CYP450)是一种血红蛋白结合蛋白，具有单加氧酶活性，是植物基因组中最大的超基因家族之一，也是参与植物次生代谢途径最大的氧化酶超家族，具有复杂的底物选择性和催化活性。CYP450在自然界以单体或二聚体的形式普遍存在，参与植物中多种化合物的修饰，特别是多结构类型的萜类化合物的生物合成。随着分子生物学及相关生物技术的不断发展，CYP450在植物次生代谢途径中的功能正在逐步得以验证。近年来，利用异源表达和RNA干扰等技术使得CYP450在紫杉酚、青蒿素、植物抗毒素等代谢途径中的重要作用逐渐被解析。

近年来，丹参酮类化合物的生物合成途径被初步解析，三个参与丹参酮类化合物结构修饰的CYP450基因CYP76AH1、CYP76AH3和CYP76AK1得到功能验证，其中，CYP76AH1催化次丹参酮二烯合成铁锈醇；CYP76AH3催化铁锈醇可以同时合成11-羟基铁锈醇、柳杉酚和11-羟基柳杉酚。CYP76AK1可分别羟基化11-羟基铁锈醇和11-羟基柳杉酚的C20位点生成11，20-二羟基铁锈醇和1，20-二羟基柳杉酚。据推测的丹参酮生物合成途径，仍会有其他CYP450参与丹参酮的生物合成过程。

发明内容

本发明的目的在于提供一种参与调控丹参酮生物合成的细胞色素P450基因CYP71BE37的基因及其编码的蛋白质。

本发明提供的CYP71BE37基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明提供的CYP71BE37基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明设计出了扩增CYP71BE37基因特异性片段的引物，其碱基序列如SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：基于丹参全基因组及不同丹参器官/组织转录组差异表达分析筛选出可能调控丹参酮合成的CYP450基因CYP71BE37的编码基因。

利用实时荧光定量PCR技术检测CYP71BE37基因在丹参不同组织、器官中的表达谱。

构建一种含有CYP71BE37基因特异性片段的正向和反向序列的植物RNAi双元表达载体。

构建一种含有CYP71BE37基因全长序列的植物过表达双元表达载体。

本发明通过发根农杆菌侵染丹参叶片，获得CYP71BE37-RNAi(RNAi)阳性毛状根及CYP71BE37-oe(过表达)阳性毛状根。

本发明利用超高效液相色谱法检测发现丹参酮类化合物的含量在CYP71BE37-RNAi转基因毛状根阳性株系中显著降低，在CYP71BE37-oe转基因毛状根阳性株系中升高(尤其隐丹参酮和丹参酮IIA含量变化较为显著)。本发明验证了CYP71BE37参与调控丹参酮的生物合成，为利用合成生物学提高丹参酮的产量奠定基础。

附图说明

图1所示CYP71BE37基因在丹参不同组织/器官(R：根 S：茎 L：叶 F：花 R1：周皮R2：韧皮部 R3：木质部)中的表达谱，其在丹参的花和根的周皮部显著高表达。

图2所示为CYP71BE37在CYP71BE37-RNAi转基因毛状根中表达量降低(A)及在CYP71BE37-oe转基因毛状根中表达量上升(B)。

图3所示为发根农杆菌ACCC10060介导的遗传转化获得的丹参转基因毛状根在液体培养基中摇床培养四个月后的形态。

图4所示为UPLC分析CYP71BE37-RNAi转基因毛状根中二氢丹参酮I(DT-1)、隐丹参酮(CT)、丹参酮I(T-I)和丹参酮IIA(T-IIA)的含量降低。

图5所示为UPLC分析CYP71BE37-oe转基因毛状根中二氢丹参酮I(DT-1)、隐丹参酮(CT)、丹参酮I(T-I)和丹参酮IIA(T-IIA)的含量升高。

具体实施方式

以下结合实例详细说明本发明。实施是为更好的理解本发明，但不限定于本发明。以下实施方法中的实验方法均为常规方法，所涉及的实验试剂均为常规生化试剂。

实施例1丹参CYP71BE37基因的克隆

1.1丹参总RNA的提取

取丹参(99-3株系)的不同组织部位的新鲜材料，清洗干净，混匀，用液氮速冻后，迅速用研钵研碎，采用RNAprep Pure Plant Kit(TIANGEN，China)试剂盒提取丹参总RNA，用普通琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，分光光度计检测其纯度和浓度。

1.2丹参CYP71BE37的基因克隆

以提取的丹参总RNA为模板，经PrimeScript^TM II 1st Strand cDNA SynthesisKit(Takara，Japan)试剂盒合成cDNA；基于丹参基因组数据，根据CYP71BE37基因序列的开放阅读框设计基因全长扩增引物，F：5′-ATGGACTTCCAGTTTCCATCT-3′，R：5′-TTATTGAACAGGCAAAGGGTTT-3′。使用Pyrobest DNA Polymerase(Takara，Japan)聚合酶克隆CYP71BE37全长基因，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，回收扩增产物的目的片段后连接pEASY-Blunt Zero克隆载体测序。PCR扩增得到CYP71BE37基因的核苷酸序列长度为1497bp，编码498个氨基酸，详细序列见序列表中的SEQ ID No.1和SEQID No.2。

实施例2丹参CYP71BE37的组织表达特异性检测

采集2年生丹参99-3株系的不同器官(根、茎、叶、花)及根不同组织(周皮、韧皮部、木质部)的样品后，分别提取RNA，经逆转录获得cDNA，以此cDNA为模板，利用实时荧光定量PCR方法，扩增程序为：95℃ 30s；40个循环：95℃ 5s，60℃ 34s；使用ABI 7500 real-timePCR基因表达定量检测系统，以丹参管家基因Actin(HM231319.1)作为内参基因，采用2^-ΔΔCt方法计算基因的相对表达量。结果如图1所示：发现CYP71BE37在丹参花和根的周皮部显著高丰度表达。

实施例3丹参CYP71BE37转基因毛状根的获得和基因表达量检测

3.1 RNAi引物设计及PCR扩增

挑选CYP71BE37基因中一段长为145bp的特异性片段作为RNAi目标区域(位于基因的476-620bp)，对目标区域设计引物(CYP71BE37-RNAiF/R)，根据Gateway使用原理，在引物的5′端添加attB序列。过表达引物(CYP71BE37-oeF/R)在CYP71BE37基因的全长引物的5′端添加attB序列。引物序列如下表。

3.2构建CYP71BE37-RNAi载体和CYP71BE37-过表达载体

BP反应：在PCR反应管中加入25ng attB-PCR回收产物，75ng pDONR221入门载体，1μL BP clonase II enzyme，补充ddH₂O至5μL；轻轻混匀后，于25℃孵育1小时以上；再加入0.5μL的蛋白激酶K，混匀后37℃孵育10min；转入DH5α感受态细胞，用含50mg/L Kan(卡那霉素)抗性的LB固体培养基筛选培养，再对克隆利用PCR进行检测。LR反应：在PCR反应管中加入75ng pDONR221-RNAi/oe回收产物，75ng pK7GWIWG2D(II)/pK7WG2D受体载体(pDONR221-RNAi回收产物连接pK7GWIWG2D(II)载体，pDONR221-oe回收产物连接pK7WG2D载体)，1μL LRclonase II enzyme，补充ddH₂O至5μL；轻轻混匀后，于25℃温育1小时以上；再加入0.5μL的蛋白激酶K，混匀后37℃孵育10min；转入DH5α感受态细胞，用含50mg/L Spec(壮观霉素)抗性的LB固体培养基筛选培养，经PCR检测后将阳性克隆送测；测序正确的克隆提取重组质粒pK7GWIWG2D(II)/pK7WG2D-CYP71BE37，转入发根农杆菌ACCC10060中。

3.3发根农杆菌ACCC10060侵染丹参叶片

用转入pK7GWIWG2D(II)/pK7WG2D载体的发根农杆菌作为对照菌株，同时侵染丹参叶片。选取生长旺盛的丹参组培苗，取其幼嫩叶片，剪成0.5cm²的叶盘，置于MS培养基平板上25℃预培养2-3天；用50mg/L Spec+50mg/L Rif的液体YEB培养基分别培养含重组质粒(pK7GWIWG2D(II)/pK7WG2D-CYP71BE37)和空载体(pK7GWIWG2D(II)/pK7WG2D)的发根农杆菌ACCC10060菌株，28℃摇培至OD₆₀₀达到0.4-0.6；将菌液离心，富集菌体后用等体积的MS液体培养基重悬菌体(MS-plasmid)，将预培养的叶盘置于MS-plasmid中，浸泡10min后用无菌滤纸吸去多余菌液，置于MS平板上，25℃黑暗条件下共培养48-72h；将共培养的叶盘分别用无菌水和含500mg/L Car(羧苄青霉素)的无菌水中浸泡10min，用滤纸吸去多余水分后置于含500mg/L Car+50mg/L Kan的MS平板上，25℃黑暗条件下筛选培养，每10天更换一次培养基。选择长势良好的毛状根，待其长至2.0-3.0cm后切下，置于含200mg/L Car+15mg/L Kan+0.1mg/L IAA的6，7-V平板上刺激一周后转入不含IAA的平板上，长出较多侧根后，利用荧光显微镜检测GFP的表达情况判断转基因的毛状根是否为阳性株系。将阳性株系移至6，7-V液体培养基中，120rpm，25℃黑暗条件下扩大培养。

3.4检测转基因毛状根的基因表达量

毛状根液体摇床培养1个月后，提取RNA，利用实时荧光定量PCR方法检测CYP71BE37-RNAi(BE37i-1)和CYP71BE37-oe(BE37oe-3、BE37oe-6、BE37oe-11)转基因阳性株系中基因表达量，如图2所示。与RNAi对照株系(pki)相比，株系BE37i-1中基因的抑制率为0.38；与过表达对照株系(pkoe)相比，株系BE37oe-3、BE37oe-6、BE37oe-11中基因的过表达倍数分别为3.53、2.89、6.04。

实施例4 UPLC检测转基因毛状根中丹参酮类化合物含量

4.1样品前处理

将摇床培养4个月后的CYP71BE37转基因毛状根在液体培养基中取出后拍照，如图3所示。将毛状根烘干后称重，使用球磨仪打粉，每100mg毛状根用0.5ml甲醇提取，提取物超声处理30min，8,000g离心10min，用0.22μm尼龙过滤器将上清过滤至棕色液相小瓶中，待进样。

4.2 UPLC检测丹参酮类化合物的含量

采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1×100mm，1.7μm；Waters)；检测波长，255nm；柱温，25℃；流速，0.25mL/min；进样量，2μL，流动相：甲醇(A)-水(B)，梯度洗脱条件为20-60％A(0-5min)，60-70％A(5-20min)，70-80％A(20-25min)，80-100％A(25-26min)，100％A(26-30min)；记录各丹参酮组分的峰面积，代入线性回归方程后，计算即得样品丹参酮含量。结果显示，CYP71BE37-RNAi转基因毛状根中二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA的含量降低明显(图4)；CYP71BE37-oe转基因毛状根中四种丹参酮类化合物的含量升高，其中隐丹参酮和丹参酮IIA的含量升高较显著(图5)。

本发明首次基于丹参全基因组筛选并克隆CYP71BE37基因，验证发现CYP71BE37参与调控丹参酮的生物合成，为提高丹参酮产量和利用合成生物学解决丹参资源紧张问题奠定基础。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出对于技术领域普通人员来说在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些也应视为在本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种参与调控丹参酮生物合成的细胞色素P450基因CYP71BE37的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的参与调控丹参酮生物合成的相关基因CYP71BE37，其特征在于，所述基因CYP71BE37编码蛋白质的氨基酸残基序列如SEQ ID No.2所示。

3.一种植物RNAi双元表达载体，其特征在于所述RNAi载体含有CYP71BE37特异性片段的正向和反向序列以及特异性片段的引物序列。

4.一种植物过表达的双元表达载体，其特征在于所述过表达载体含有CYP71BE37的基因全长序列。

5.权利要求1编码细胞色素P450基因CYP71BE37在植物基因工程中的应用，其特征在于CYP71BE37在细菌、真菌和高等植物中通过基因工程手段调控丹参酮类化合物的生物合成。

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