CN112626075B - 一种调控丹参酮合成的SmAP2/ERF152基因的克隆引物、功能及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了丹参中一条参与调控丹参酮合成的AP2/ERF转录因子SmAP2/ERF152的编码基因序列；本发明提供的SmAP2/ERF152基因具有SEQ ID No.1所示核苷酸序列，所述基因编码蛋白质具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列。本发明检测了SmAP2/ERF152在丹参植株中的表达情况，发现其在丹参根和根的周皮部高丰度表达；亚细胞定位实验表明SmAP2/ERF152定位于细胞核；转录激活实验表明SmAP2/ERF152具有转录激活活性；构建了SmAP2/ERF152‑RNAi载体及SmAP2/ERF152‑过表达(SmAP2/ERF152‑oe)载体，通过发根农杆菌介导的丹参遗传转化获得转基因毛状根阳性株系；化学检测分析发现，在SmAP2/ERF152‑RNAi株系中，隐丹参酮和丹参酮IIA含量降低，而在SmAP2/ERF152‑oe株系中，隐丹参酮和丹参酮IIA的含量显著升高。本发明提供的SmAP2/ERF152具有正向调控丹参酮生物合成的功能，为利用生物技术提高丹参酮类化合物含量奠定基础。

Description

一种调控丹参酮合成的SmAP2/ERF152基因的克隆引物、功能 及应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学和植物基因工程领域，具体涉及一种参与调控丹参酮生物合成的SmAP2/ERF152的基因克隆和功能研究。

背景技术

丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)是中国的一种传统中草药，以其干燥的根和根茎入药。丹参酮类化合物为丹参主要活性成分之一，其主要分布于丹参根及根的周皮中，包括二氢丹参酮I(DT-I)、隐丹参酮(CT)、丹参酮I(T-I)和丹参酮IIA(T-IIA)等，其中隐丹参酮能预防和治疗缺血性疾病、冠状动脉疾病和阿尔茨海默症；丹参酮IIA在保护心肌细胞、抗心肌梗死、抗心绞痛、抗动脉粥样硬化、扩张血管和改善微循环等方面发挥显著作用。目前，由于传统种植丹参品质下降，导致市场上的丹参酮供不应求，丹参酮合成途径与代谢工程的研究成为热点领域。AP2/ERF转录因子是植物中最大的转录因子基因家族之一，在调节植物生长发育、调控活性成分生物合成和植物对环境的胁迫响应中发挥重要作用。转录因子可激活次生代谢物合成途径中多个基因协同表达，从而启动次生代谢途径。因此，转录因子基因工程可为植物次生代谢遗传改良以及合成生物学研究提供重要的靶基因和调控元件。

发明内容

本发明的目的在于提供一种参与调控丹参酮生物合成的AP2/ERF转录因子SmAP2/ERF152的基因及其编码的蛋白质。

本发明提供的SmAP2/ERF152基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明提供的SmAP2/ERF152基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明设计出了扩增SmAP2/ERF152基因特异性片段的引物，其碱基序列如SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：基于丹参全基因组及不同丹参器官/组织转录组差异表达分析筛选出可能调控丹参酮合成的AP2/ERF转录因子SmAP2/ERF152的编码基因。

利用实时荧光定量PCR技术检测SmAP2/ERF152基因在丹参不同组织、器官中的表达谱。

构建重组质粒pCAMBIA1302-GFP-SmAP2/ERF152，转化根癌农杆菌GV3101，瞬时侵染烟草叶片，荧光共聚焦显微镜观察GFP荧光，发现SmAP2/ERF152定位于细胞核中。

构建重组质粒pGBKT7-SmAP2/ERF152，转化酵母AH109，检测SmAP2/ERF152的转录激活活性，发现SmAP2/ERF152具有转录激活活性。

构建一种含有SmAP2/ERF152基因特异性片段的正向和反向序列的植物RNAi双元表达载体。

构建一种含有SmAP2/ERF152基因全长序列的植物过表达双元表达载体。

本发明通过发根农杆菌侵染丹参叶片，获得SmAP2/ERF152-RNAi(RNAi)阳性毛状根及SmAP2/ERF152-oe(过表达)阳性毛状根。

本发明利用超高效液相色谱法(UPLC)检测发现隐丹参酮和丹参酮IIA的含量在SmAP2/ERF152-RNAi转基因毛状根阳性株系中降低，在SmAP2/ERF152-oe转基因毛状根阳性株系中显著升高。

本发明采用实时荧光定量PCR技术检测丹参酮合成相关关键酶基因的表达量在SmAP2/ERF152-RNAi和SmAP2/ERF152-oe转基因毛状根阳性株系中的表达量变化。

本发明验证了SmAP2/ERF152参与调控丹参酮的生物合成，为利用代谢工程或合成生物学提高丹参酮的产量奠定基础。

附图说明

图1所示SmAP2/ERF152在丹参不同器官/组织(R：根；S：茎；L：叶；F：花；R1：周皮；R2：韧皮部；R3：木质部)中的表达谱，其在丹参的根和根的周皮部显著高表达。

图2所示为亚细胞定位实验中SmAP2/ERF152定位于细胞核中。

图3所示为SmAP2/ERF152具有转录激活活性。

图4所示为SmAP2/ERF152在SmAP2/ERF152-RNAi转基因毛状根中表达量降低(A)及在SmAP2/ERF152-oe转基因毛状根中表达量上升(B)。

图5所示为发根农杆菌ACCC10060介导的遗传转化获得的丹参转基因毛状根在液体培养基中摇床培养四个月后的形态。

图6所示为UPLC分析SmAP2/ERF152-RNAi转基因毛状根中隐丹参酮(CT)和丹参酮IIA(T-IIA)的含量降低，SmAP2/ERF152-oe转基因毛状根中隐丹参酮(CT)和丹参酮IIA(T-IIA)的含量显著升高。

图7所示为丹参酮合成途径关键酶基因的表达量在SmAP2/ERF152-RNAi转基因毛状根中的变化。

图8所示为丹参酮合成途径关键酶基因的表达量在SmAP2/ERF152-oe转基因毛状根中的变化。

具体实施方式

以下结合实例详细说明本发明。实施是为更好的理解本发明，但不限定于本发明。以下实施方法中的实验方法均为常规方法，所涉及的实验试剂均为常规生化试剂。

实施例1丹参SmAP2/ERF152基因的克隆

根据SmAP2/ERF152序列的开放阅读框设计基因全长扩增引物，以丹参的cDNA为模板，PCR扩增得到SmAP2/ERF152基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1，基因全长624bp。将核苷酸序列翻译后推导出SmAP2/ERF152的氨基酸序列，包含207个氨基酸残基，如SEQ ID No.2。

实施例2丹参SmAP2/ERF152的组织表达特异性检测

采集2年生丹参99-3株系的不同器官(根、茎、叶、花)及根不同组织(周皮、韧皮部、木质部)的样品后，分别提取RNA，经逆转录获得cDNA，以此cDNA为模板，利用实时荧光定量PCR方法，扩增程序为：95℃ 30s；40个循环：95℃ 5s，60℃ 34s；使用ABI 7500 real-timePCR基因表达定量检测系统，以丹参管家基因Actin(HM231319.1)作为内参基因，采用2^-ΔΔCt方法计算基因的相对表达量。结果如图1所示：发现SmAP2/ERF152在丹参根和根的周皮部显著高丰度表达。

实施例3丹参SmAP2/ERF152亚细胞定位实验

3.1构建重组质粒pCAMBIA1302-GFP-SmAP2/ERF152

设计带酶切位点的全长扩增引物(R引物去掉终止密码子)，F：5′-GGAAGATCTATGGGCGTGGAGAGTGAATCAA-3′R：5′-ACTAGTAAGAGAGTATAACAAACTCTCCAAATACTC-3′。

3.2重组质粒pCAMBIA1302-GFP-SmAP2/ERF152转化根癌农杆菌GV3101

将重组质粒pCAMBIA1302-GFP-SmAP2/ERF152及空载体pCAMBIA1302-GFP转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101的感受态细胞，步骤如下：取10μL构建好的重组质粒pCAMBIA1302-GFP-SmAP2/ERF152及空载体pCAMBIA1302-GFP质粒，加入到100μLGV3101农杆菌感受态细胞中，轻轻吹打混匀，冰浴30min；液氮中速冻3min，37℃水浴3min后转入冰上放置3min；加入1mL不含抗生素的YEB液体培养基，28℃ 150rpm震荡培养4-6h，4000rpm离心4min；保留100-200μL上清液，用枪头轻轻重悬菌体，均匀涂布于含50mg/L利福平(Rif)+15mg/L庆大霉素(Gm)+50mg/L卡那霉素(Kan)的YEB平板上，28℃倒置培养48h至出现单菌落。

3.3根癌农杆菌瞬时侵染烟草叶片

挑选鉴定正确的含重组质粒pCAMBIA1302-GFP-SmAP2/ERF152的GV3101阳性克隆以及只含空载体pCAMBIA1302-GFP质粒的GV3101克隆及p19的单克隆(p19的作用为防止基因沉默并促进基因表达)，分别接种于含有50mg/L Rif+15mg/L Gm+50mg/L Kan的YEB液体培养基中，28℃、180rpm震荡培养24h；取500μL菌液转接到50mL含50mg/L Rif+15mg/L Gm+50mg/L Kan的YEB液体培养基中，28℃过夜培养至OD₆₀₀至0.4-0.6，冰上放置30min，8000g离心10min，集菌，用1mL烟草注射液重悬菌体。烟草注射液配方为：1mL 1M MgCl₂，1mL1M MES，100μL 0.2M乙酰丁香酮和98mL ddH₂O。按SmAP2/ERF152∶p19体积比＝1∶0.6的比例混合后，28℃避光放置2-4h。挑选长势较好的烟草叶片(一般选取生长3-4周的烟草叶片)，用1mL注射器于烟草叶片下表皮注射菌液与烟草注射液的混合液。

3.4激光共聚焦显微镜观察叶片荧光

注射完毕的烟草植株于培养室继续培养2-4天后取出，剪下注射器针眼四周约0.5cm²大小的叶片，置于DAPI染液中，室温染色5-10min，吸除DAPI染液，用PBS洗涤2-3次，每次3-5分钟，利用共聚焦显微镜观察叶片荧光，如图2所示。

实施例4丹参SmAP2/ERF152转录激活活性

4.1构建重组质粒pGBKT7-SmAP2/ERF152

设计带酶切位点的全长扩增引物扩增SmAP2/ERF152的开放阅读框序列，F：5′-GGAATTCATGGGCGTGGAGAGTGAATCAA-3′R：5′-CCCGGGTTAAAGAGAGTATAACAAACTCTCCAAATACTC-3′，构建重组质粒pGBKT7-SmAP2/ERF152。

4.2重组质粒pGBKT7-SmAP2/ERF152转入酵母AH109

以pGBKT7空载体为阴性对照，将酵母菌液涂于SD/-Trp单缺平板上，3天后挑取相应的酵母菌落在新的SD/-Trp培养基上划3-5mm的短线，30℃培养2-4天，挑菌接种到液体SD/-Trp培养基中扩繁到足量做菌落PCR验证，将成功转化质粒的菌液分别稀释到原菌的1、1/10、1/100，取5μL滴在SD/-Trp、SD/-Trp/-His/-Ade+X-α-gal(X-α-gal的浓度为4mg·ml^-1)的三缺酵母培养平板上，培养3天后观察并拍照记录，结果如图3所示。

实施例5丹参SmAP2/ERF152转基因毛状根的获得和基因表达量检测

5.1 RNAi引物设计及PCR扩增

挑选SmAP2/ERF152基因中一段长为176bp的特异性片段作为RNAi目标区域(位于基因的59-234bp)，对目标区域设计引物(SmAP2/ERF152-RNAiF/R)，根据Gateway使用原理，在引物的5′端添加attB序列。过表达引物(SmAP2/ERF152-oeF/R)在SmAP2/ERF152基因的全长引物的5′端添加attB序列。引物序列如下表。

5.2构建SmAP2/ERF152-RNAi载体和SmAP2/ERF152-oe载体

BP反应：在PCR反应管中加入25ng attB-PCR回收产物，75ng pDONR221入门载体，1μL BP clonase II enzyme，补充ddH₂O至5μL；轻轻混匀后，于25℃孵育1小时以上；再加入0.5μL的蛋白激酶K，混匀后37℃孵育10min；转入DH5α感受态细胞，用含50mg/L Kan(卡那霉素)抗性的LB固体培养基筛选培养，再对克隆利用PCR进行检测。LR反应：在PCR反应管中加入75ng pDONR221-RNAi/oe回收产物，75ng pK7GWIWG2D(II)/pK7WG2D受体载体(pDONR221-RNAi回收产物连接pK7GWIWG2D(II)载体，pDONR221-oe回收产物连接pK7WG2D载体)，1μL LRclonase II enzyme，补充ddH₂O至5μL；轻轻混匀后，于25℃温育1小时以上；再加入0.5μL的蛋白激酶K，混匀后37℃孵育10min；转入DH5α感受态细胞，用含50mg/L Spec(壮观霉素)抗性的LB固体培养基筛选培养，经PCR检测后将阳性克隆送测；测序正确的克隆提取重组质粒pK7GWIWG2D(II)/pK7WG2D-SmAP2/ERF152，转入发根农杆菌ACCC10060中。

5.3发根农杆菌ACCC10060侵染丹参叶片

用转入pK7GWIWG2D(II)/pK7WG2D载体的发根农杆菌作为对照菌株，同时侵染丹参叶片。选取生长旺盛的丹参组培苗，取其幼嫩叶片，剪成0.5cm²的叶盘，置于MS培养基平板上25℃预培养2-3天；用50mg/L Spec+50mg/L Rif的液体YEB培养基分别培养含重组质粒(pK7GWIWG2D(II)/pK7WG2D-SmAP2/ERF152)和空载体(pK7GWIWG2D(II)/pK7WG2D)的发根农杆菌ACCC10060菌株，28℃摇培至OD₆₀₀达到0.4-0.6；将菌液离心，富集菌体后用等体积的MS液体培养基重悬菌体(MS-plasmid)，将预培养的叶盘置于MS-plasmid中，浸泡10min后用无菌滤纸吸去多余菌液，置于MS平板上，25℃黑暗条件下共培养48-72h；将共培养的叶盘分别用无菌水和含500mg/L Car(羧苄青霉素)的无菌水中浸泡10min，用滤纸吸去多余水分后置于含500mg/L Car+50mg/L Kan的MS平板上，25℃黑暗条件下筛选培养，每10天更换一次培养基。选择长势良好的毛状根，待其长至2.0-3.0cm后切下，置于含200mg/L Car+15mg/LKan+0.1mg/L IAA的6，7-V平板上刺激一周后转入不含IAA的平板上，长出较多侧根后，利用荧光显微镜检测GFP的表达情况判断转基因的毛状根是否为阳性株系。将阳性株系移至6，7-V液体培养基中，120rpm，25℃黑暗条件下扩大培养。

5.4检测转基因毛状根的基因表达量

毛状根液体摇床培养1个月后，提取RNA，利用实时荧光定量PCR方法检测SmAP2/ERF152-RNAi(152i-2、152i-3、152i-5和152i-10)和SmAP2/ERF152-oe(152oe-1、152oe-2、152oe-3和152oe-4)转基因阳性株系中基因表达量，如图4所示。与RNAi对照株系(pki)相比，株系152i-2、152i-3、152i-5和152i-10中基因的抑制率分别为0.34、0.14、0.27和0.14；与过表达对照株系(pkoe)相比，株系152oe-1、152oe-2、152oe-3和152oe-4中基因的过表达倍数分别为51.87、31.11、27.85和69.40。

实施例6 UPLC检测转基因毛状根中丹参酮类化合物含量

6.1样品前处理

将摇床培养4个月后的SmAP2/ERF152转基因毛状根在液体培养基中取出后拍照，如图5所示。将毛状根烘干后称重，使用球磨仪打粉，每100mg毛状根用0.5ml甲醇提取，提取物超声处理30min，8,000g离心10min，用0.22μm尼龙过滤器将上清过滤至棕色液相小瓶中，待进样。

6.2 UPLC检测丹参酮类化合物的含量

采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1×100mm，1.7μm；Waters)；检测波长：255nm；柱温：25℃；流速：0.25mL/min；进样量：2μL；流动相：甲醇(A)-水(B)；梯度洗脱条件为20-60％A(0-5min)，60-70％A(5-20min)，70-80％A(20-25min)，80-100％A(25-26min)，100％A(26-30min)；记录隐丹参酮和丹参酮IIA组分的峰面积，代入线性回归方程后，计算即得样品丹参酮的含量。结果显示，SmAP2/ERF152-RNAi转基因毛状根中隐丹参酮和丹参酮IIA的含量降低，SmAP2/ERF152-oe转基因毛状根中隐丹参酮和丹参酮IIA的含量显著升高(图6)。

实施例7转基因毛状根中丹参酮生物合成途径关键酶基因的表达量检测

设计丹参酮生物合成途径中的关键酶基因CPS1、KSL1、DXS2、CYP76AH1、CYP76AH3、CYP76AK1和IPI1的特异性片段扩增引物，利用实时荧光定量PCR方法，检测这些基因在转基因毛状根株系和对照株系中的相对表达量，以丹参管家基因Actin作为内参基因，采用2^-ΔΔCt方法计算基因的相对表达量。丹参酮生物合成途径中的关键酶基因的引物如下：

本发明首次基于丹参全基因组筛选并克隆SmAP2/ERF152基因，验证发现SmAP2/ERF152参与调控丹参酮的生物合成，为提高丹参酮产量和利用合成生物学等方法解决丹参资源紧张问题奠定基础。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出对于技术领域普通人员来说在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些也应视为在本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种参与调控丹参酮生物合成的AP2/ERF转录因子SmAP2/ERF152的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种参与调控丹参酮生物合成的AP2/ERF转录因子SmAP2/ERF152的编码基因，所述SmAP2/ERF152的编码基因编码蛋白质的氨基酸残基序列如SEQ IDNo.2所示。

3.一种植物RNAi双元表达载体，其特征在于所述RNAi载体含有SmAP2/ERF152特异性片段的正向和反向序列以及特异性片段的引物序列；所述SmAP2/ERF152特异性片段为SEQ IDNo.1的59-234bp；所述特异性片段的引物序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。

4.一种植物过表达的双元表达载体，其特征在于所述过表达载体含有SmAP2/ERF152的核苷酸序列；所述SmAP2/ERF152的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

5.权利要求1所述的参与调控丹参酮生物合成的AP2/ERF转录因子SmAP2/ERF152的编码基因在植物基因工程中的应用，其特征在于SmAP2/ERF152的编码基因在丹参毛状根中通过基因工程手段调控丹参酮类化合物的生物合成；所述SmAP2/ERF152的编码基因如SEQ IDNo.1所示。

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