CN116103272A - 控制大豆共生固氮效率的蛋白质、基因及其载体和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及基因的新应用，特别是指控制大豆共生固氮效率的蛋白质、基因及其编辑载体和应用。本申请发现了大豆的2个基因GmNAS1、GmNAP1和1个转录因子GmNFYC10a，并通过反向遗传学手段获得三者的基因序列，利用大豆毛根瞬时转化体系、稳定转基因植株、PCR反应和基因测序成功地进行了分离、克隆和验证。大豆基因GmNAS1、GmNAP1和转录因子GmNFYC10a三者之间的相互作用控制了大豆共生固氮效率，揭示了GmNAS1、GmNAP1和GmNFYC10a通过调控PEP流动方向从而提高根瘤固氮效率的分子机制。

Description

控制大豆共生固氮效率的蛋白质、基因及其载体和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及基因的新应用，特别是指控制大豆共生固氮效率的蛋白质、基因及其载体和应用。
背景技术
栽培大豆 [ Glycine max (L.) Merr] 起源于我国，是世界上重要的粮食、饲料、油料和能源作物，同时也是人类摄取蛋白质的重要来源。从上世纪九十年代中期开始，我国就成为了大豆净进口国，并且进口量逐年递增，到2019年我国的大豆进口量已经达到了8851万吨，居世界首位，因此发展我国大豆生产，实现“大豆振兴”，对于保障国家粮食安全具有重要意义。
同时，随着我国经济的发展和人口激增对粮食需求的压力，我国在粮食生产中大量施用化肥，其中以氮肥最甚。根据世界粮农组织FAO的统计，我国2002年到2014年间每年的氮肥使用量不断上升；我国耕地面积虽仅占全世界的8%，但氮肥使用量却达到了全世界使用总量的35%（http://faostat.fao.org/）。氮肥的过度施用和养分流失，导致了严重的水体富营养化污染；同时也影响了土壤有机质组成，降低了生物活性，导致土壤板结。固氮微生物能够利用其自身合成的固氮酶将大气中的氮气还原成可被植物直接利用的氨，在全球生态系统中，豆科植物与根瘤菌通过共生固氮所固定的氮含量占生物固氮总量的60%-70%，豆科植物与根瘤菌共生固氮既减少了能源消耗，又有助于土壤的改良，是提高豆科作物氮效率的重要途径，而在农业系统中，大豆固氮量占据豆类共生固氮总量的86%以上，每年产氮量达1644万吨，所以提高大豆和根瘤菌共生固氮效率，对绿色可持续农业的发展具有重要意义。
与其它豆科植物一样，大豆可以与根瘤菌共生形成根瘤，从而将大气中的氮气同化为氨，为自身提供氮源，设计培育高效固氮的大豆品种有利于在提高大豆产量的同时减少化学氮肥的使用，从而保证农业的可持续发展。之前的研究表明，许多豆科植物根瘤的固氮能力极易受到环境变化的影响，干旱、高盐和低光等非生物胁迫会显著抑制根瘤的固氮能力，而大气中二氧化碳浓度的增加和土壤氮源的缺乏则可以提高根瘤的固氮能力，因此设计培育广适性的高效固氮大豆品种迫切需要我们对大豆根瘤固氮能力响应环境变化的调控机制进行更深入的研究。
作为宿主豆科植物与根瘤菌进行碳氮交换的场所，成熟根瘤在形成之后可以通过韧皮部接收地上部分光合作用合成的蔗糖，到达根瘤后的蔗糖会被蔗糖合成酶和碱反转酶分解成己糖再进入糖酵解途径生成磷酸烯醇丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP）。PEP可以经过磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC）和苹果酸脱氢酶（malate dehydrogenase，MDH）催化的两步反应生成苹果酸，苹果酸被运输进类菌体中进行三羧酸循环产生ATP为固氮反应提供能量，之后固氮生成的铵根离子在氨酰输出型豆科植物（amide-exporting legume）中会被同化为天冬酰胺和谷氨酰胺运送到地上部分，而在大豆为代表的酰脲输出型豆科植物（ureide-exporting legume）中铵根生成的谷氨酰胺会进入嘌呤从头合成（de novo purine biosynthesis）途径生成肌苷单磷酸（inosinemonophosphate，IMP），并最后转化为酰脲再运送到地上部分；此外，PEP也可以在丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）的催化下生成糖酵解的最终产物丙酮酸，然后丙酮酸进入线粒体的三羧酸循环产生ATP为根瘤中氮的同化提供能量。
虽然目前大豆根瘤的碳氮代谢途径已经研究得比较清楚，但是调控这些代谢途径从而提高根瘤固氮效率的基因及其调控机制目前仍未得到阐明，如何调控大豆根瘤固氮效率、以及如何利用这种调控机制来提高大豆固氮能力，进而提高大豆对氮元素的利用率是本课题组要解决的技术问题。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提出一种控制大豆共生固氮效率的蛋白质、基因及其编辑载体和应用。
本发明的技术方案是这样实现的：
控制大豆共生固氮效率的蛋白质，所述蛋白质具有一个氨基端的叶绿体转移肽，四个CBS功能域，一个PB1功能域和一个羧基端的跨膜结构域。
进一步，所述蛋白质定位于线粒体中并与转录因子GmNFYC10a互作。
优选的，所述蛋白质通过羧基端的跨膜结构域定位到线粒体中。
上述的控制大豆共生固氮效率的蛋白质，所述蛋白质为GmNAS1蛋白和GmNAP1蛋白，其中GmNAS1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示、GmNAP1蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示；转录因子GmNFYC10a的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
编码GmNAS1蛋白的 GmNAS1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码GmNAP1蛋白的 GmNAP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码转录因子GmNFYC10a的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
含有上述的 GmNAS1基因和/或 GmNAP1基因的过表达载体。
上述蛋白质或基因在改良植物共生固氮效率、增强植物环境适应能力以及提高植物产量中的应用。
上述的过表达载体在改良植物共生固氮效率、增强植物环境适应能力以及提高植物产量中的应用。
进一步，步骤为：将权利要求6所述的过表达载体，通过遗传转化方法转入待改良植物中，然后筛选转基因阳性植株进行培养，完成增强大豆共生固氮能力的应用。
优选的，所述植物为豆科植物。
本发明具有以下有益效果：
1、本申请发现了大豆的2个基因 GmNAS1、 GmNAP1和1个转录因子 GmNFYC10a，并通过反向遗传学手段获得三者的基因序列，利用大豆毛根瞬时转化体系、稳定转基因植株、PCR反应和基因测序成功地进行了分离、克隆和验证。大豆基因 GmNAS1、 GmNAP1和转录因子 GmNFYC10a三者之间的相互作用控制了大豆共生固氮效率，在根瘤碳源供应增加时，GmNAS1可以感受根瘤能量状态上升导致的AMP含量下降，从而促进更多GmNAS1和GmNAP1蛋白形成同源二聚体，GmNAS1和GmNAP1的同源二聚体与转录因子GmNFYC10a结合在线粒体上，减少了GmNFYC10a的细胞核含量，从而降低了丙酮酸激酶基因的表达，减少了PEP向丙酮酸的转化，使更多PEP形成了草酰乙酸和苹果酸，增加了根瘤中类菌体的碳源供应，从而增强了根瘤的固氮能力，本研究揭示了 GmNAS1、 GmNAP1和 GmNFYC10a通过调控PEP流动方向从而提高根瘤固氮效率的分子机制。
2、本申请的2个大豆基因 GmNAS1、 GmNAP1和1个转录因子 GmNFYC10a在大豆碳源供应增加时控制了根瘤固氮效率的上升，通过在大豆中超量表达相关基因，将会进一步增强相关信号通路的运作，增加根瘤中类菌体的碳源供应，从而进一步增强大豆根瘤的固氮效率。
3、大豆的一对胱硫醚β合成酶（Cystathionine βsynthase，CBS）家族同源基因 GmNAS1和 GmNAP1GmNAS1和 GmNAP1在大豆中的过量表达将会在碳源供应充足时进一步提高根瘤的固氮能力，具体是通过减少一个转录因子GmNFYC10a的细胞核积累来重新分配根瘤中碳源的流动方向，从而增强大豆根瘤的固氮能力，进而提高植株地上部分生物量以及最终产量，发明人的研究将为包括大豆在内的豆科植物的氮高效和分子育种提供基因资源，为高效固氮大豆品种的分子设计提供理论依据，从而促进环境友好型的绿色可持续农业的发展。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为 GmNAS1和 GmNAP1基因在公开转录组数据库中的表达模式。
图2为 pGmNAS1:GUS和 pGmNAP1:GUS转基因毛根根瘤的GUS染色。
图3为GmNAS1和GmNAP1的蛋白功能域。
图4 为cTP-GFP-GmNAS1和GmNAP1-GFP-TMR融合蛋白在小叶烟草表皮细胞中的定位。
图5 为cTP-GFP-GmNAS1和GmNAP1-GFP-TMR融合蛋白在根瘤细胞中的定位。
图6为GmNAS1和GmNAP1蛋白在不同细胞组分中的免疫印迹检测。
图7为GmNAS1-CFP和GmNAP1-CFP融合蛋白在小叶烟草表皮细胞中的定位
图8为等温滴定量热法检测GmNAS1与AMP/ADP/ATP/cAMP的结合。
图9为等温滴定量热法检测GmNAP1与AMP/ADP/ATP/cAMP的结合。
图10为等温滴定量热法检测缺少CBS功能域的GmNAS1蛋白与AMP的结合。
图11为 Ri-GmNAS1/NAP1转基因毛根的结瘤表型分析。
图12为 cr-nas1， cr-nap1， cr-nas1nap1-1和 cr-nas1nap1-2转基因植株的结瘤表型分析，其中（A） cr-nas1， cr-nap1， cr-nas1nap1-1和 cr-nas1nap1-2突变体的基因编辑位点图示。（B） cr-nas1， cr-nap1， cr-nas1nap1-1和 cr-nas1nap1-2突变体中GmNAS1和GmNAP1的蛋白含量检测。（C-E） cr-nas1， cr-nap1， cr-nas1nap1-1和 cr-nas1nap1-2突变体的结瘤表型分析。
图13为GmNAS1/GmNAP1与GmNFYC10a互作于线粒体，其中（A）GmNAP1的免疫共沉淀质谱检测。（B）BiFC检测GmNAS1/GmNAP1和GmNFYC10a的相互作用。（C）Pull-down检测GmNAS1/GmNAP1和GmNFYC10a的相互作用。
图14为大豆根瘤能量状态调控了GmNFYC10a的细胞核定位，其中（A）GmNFYC10a-GFP在烟草表皮细胞中的荧光定位。（B）Oligomycin或AMP处理诱导了根瘤细胞中GmNFYC10a蛋白入核。（C）GmNFYC10a-GFP荧光定位的统计学分析。
图15为 GmNAS1/GmNAP1影响了大豆根瘤的糖酵解途径，其中（A-B） Ri-EV和 Ri- GmNAS1/NAP1转基因毛根根瘤中的差异表达基因。（C） Ri-GmNAS1/NAP1根瘤中下调基因的KEGG富集分析。（D） Ri-GmNAS1/NAP1根瘤中被下调的糖酵解基因。
图16为GmNFYC10a激活了大豆根瘤的糖酵解途径，其中（A）10个糖酵解基因启动子的调控基序分析。（B）GmNFYC10a与 PK1a/GAPC1/PK2a启动子的ChIP-qPCR分析。（C）GmNFYC10a与 PK1a/GAPC1/PK2a启动子的转录激活分析。
图17为GmNAS1/GmNAP1和GmNFYC10a调控了大豆根瘤中PEP的分配，其中（A）蔗糖处理前后根瘤细胞核中GmNFYC10a蛋白含量检测。（B）蔗糖处理前后根瘤中糖酵解基因的表达水平检测。（C）蔗糖处理后W82、 cr-nas1、 cr-nap1和 cr-nas1nap1-1根瘤中糖酵解基因的表达水平检测。（D-F）蔗糖处理后W82、 cr-nas1、 cr-nap1和 cr-nas1nap1-1根瘤中丙酮酸、草酰乙酸和苹果酸的含量，以及丙酮酸和草酰乙酸的含量比。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本申请通过在网上公开发布的大豆基因转录组数据库中搜索大豆CBS家族基因的表达，鉴定到了一对在大豆根瘤中高表达的同源基因 GmNAS1和 GmNAP1（图1）；
GmNAS1的基因序列利用下述方法得到：
反应体系的总体积为50μl，模板为大豆品系W82基因组DNA 1μL (约50ng)、10×KOD酶反应缓冲液5μl、25mM MgCL2 2μl、5mM dNTP 5μl、5 uM引物 5μl（引物NAS1-F和NAS1-R，每条引物均为2.5μl）、1μl KOD酶，加ddH2O（无菌去离子水）至50μl。
反应程序为：94℃变性5min，94℃ 30s、55℃ 1min、68℃ 4 min 35cycles，68℃延伸 10min。
所述引物为：
NAS1-F: ATGAGCACCACTCAAGCTTC；
NAS1-R: TTACTGTCTAGAGCGCTTTA；
最终获得包含有SEQ ID NO.1所述核苷酸的基因序列，该基因编码的蛋白质为SEQID NO.4所示。
本发明的保护内容还包括SEQ ID NO.4所示氨基酸序列对应的核苷酸序列，还包括SEQ ID NO.4所示序列经过改造修饰的具有相同功能的蛋白。
GmNAP1的基因序列利用下述方法得到：
反应体系的总体积为50μl，模板为大豆品系W82基因组DNA 1μL (约50ng)、10×KOD酶反应缓冲液5μl、25mM MgCL2 2μl、5mM dNTP 5μl、5 uM引物 5μl（引物NAP1-F和NAP1-R，每条引物均为2.5μl）、1μl KOD酶，加ddH2O（无菌去离子水）至50μl。
反应程序为：94℃变性5min，94℃ 30s、55℃ 1min、68℃ 3.5 min 35cycles，68℃延伸 10min。
所述引物为：
NAP1-F: ATGAGCAGCACTGAAACTTC；
NAP1-R: TTACTGTCTAGAGCGCTTTA；
最终获得包含有SEQ ID NO.2所述核苷酸的基因序列，该基因编码的蛋白质为SEQID NO.5所示。
本发明的保护内容还包括SEQ ID NO.5所示氨基酸序列对应的核苷酸序列，还包括SEQ ID NO.5所示序列经过改造修饰的具有相同功能的蛋白。
GmNFYC10a的基因序列利用下述方法得到：
反应体系的总体积为50μl，模板为大豆品系W82基因组DNA 1μL (约50ng)、10×KOD酶反应缓冲液5μl、25mM MgCL2 2μl、5mM dNTP 5μl、5 uM引物 5μl（引物NFYC10a-F和NFYC10a-R，每条引物均为2.5μl）、1μl KOD酶，加ddH2O（无菌去离子水）至50μl。
反应程序为：94℃变性5min，94℃ 30s、55℃ 1min、68℃ 2 min 35cycles，68℃延伸 10min。
所述引物为：
NFYC10a-F: ATGGCTTCCTCCAACACTCC；
NFYC10a-R: TTAACTTCCTCCTTTTCCTG；
最终获得包含有SEQ ID NO.3所述核苷酸的基因序列，该基因编码的蛋白质为SEQID NO.6所示。
本发明的保护内容还包括SEQ ID NO.6所示氨基酸序列对应的核苷酸序列，还包括SEQ ID NO.6所示序列经过改造修饰的具有相同功能的蛋白。
实施例2
通过构建 GmNAS1和 GmNAP1基因启动子（启动子的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示）驱动报告基因GUS表达的载体 pGmNAS1:GUS和 pGmNAS1:GUS并转化大豆毛状根，对获得的阳性根和根瘤进行GUS染色，发现 GmNAS1和 GmNAP1在根和根瘤发育早期都未表达，但 GmNAS1在成熟根瘤的所有区域都有表达， GmNAP1只在成熟根瘤的侵染区有高表达（图2）。
GmNAS1和GmNAP1蛋白预测具有一个氨基端的叶绿体转移肽（chloroplasttransit peptide，cTP），四个CBS功能域，一个PB1（Phox and Bem1）功能域和一个羧基端的跨膜结构域（transmembrane region，TMR）（图3）。
构建 p35S:cTP-GFP-GmNAS1和 p35S:GmNAP1-GFP-TMR载体并转化根癌农杆菌GV3101，将转化成功的根癌农杆菌GV3101注射进小叶烟草叶片中，利用激光共聚焦显微镜观察叶片表皮细胞中的GFP荧光，发现荧光都定位于线粒体中（图4）。构建 pGmNAS1:cTP- GFP-GmNAS1和 pGmNAP1:GmNAP1-GFP-TMR载体并转化发根农杆菌K599，利用转化成功的发根农杆菌K599侵染大豆根部愈伤组织，获得大豆毛状根，大豆毛状根接种慢生型根瘤菌USDA110之后25天，对毛状根上的根瘤进行切片，利用激光共聚焦显微镜观察根瘤切片细胞中的GFP荧光，发现荧光都定位于线粒体中（图5）。收获大豆根瘤，利用密度梯度离心技术分离根瘤细胞的线粒体、细胞质和细胞核组分，之后提取各组分的蛋白质，检测其中GmNAS1和GmNAP1的蛋白量，发现GmNAS1和GmNAP1只在线粒体组分中被检测到（图6）。构建 p35S: GmNAS1-CFP和 p35S:GmNAP1-CFP载体并转化根癌农杆菌GV3101，将转化成功的根癌农杆菌GV3101注射进小叶烟草叶片中，利用激光共聚焦显微镜观察叶片表皮细胞中的CFP荧光，发现荧光定位于细胞核和细胞质中，表明GmNAS1和GmNAP1的线粒体定位需要借助于羧基端的跨膜结构域（图7）。
利用大肠杆菌原核表达系统表达纯化GmNAS1和GmNAP1蛋白，之后利用等温滴定量热法检测GmNAS1/GmNAP1与AMP、ADP、ATP和cAMP的结合能力，发现GmNAS1可以结合AMP和ADP，并且解离常数分别为3.94 μM和40.32 μM，GmNAS1不与ATP和cAMP结合（图8）；GmNAP1与AMP、ADP、ATP和cAMP都不结合（图9），缺失任何一个CBS功能域的GmNAS1蛋白也不能结合AMP（图10）。
实施例3
GmNAS1和GmNAP1基因干扰载体的构建及应用：
将大豆品系W82中的 GmNAS1和 GmNAP1基因在毛根转化系统中进行RNAi，所获得的转基因毛根接种USDA110后，在第25天对形成的根瘤进行表型统计，发现 Ri-GmNAS1/NAP1转基因毛根根瘤的数目和重量都无变化，但根瘤的固氮酶活性显著降低（图11）。
（1）植物表达载体 Ri-GmNAS1/NAP1的构建
从W82中扩增出 GmNAS1和 GmNAP1基因编码区高同源性的411bp片段，利用AscI/SwaI和AvrII/BamHI酶切位点进行酶切，并将其连接到RNAi载体 pG2RNAi2上，构建 Ri- GmNAS1/NAP1重组载体。
所用引物如下：
Ri-GmNAS1/NAP1-F: ACTCCTAGGGGCGCGCCCAAGCTTCCTCCAACAACAAG
Ri-GmNAS1/NAP1-R: ACTGGATCCATTTAAATCACAACAGGGAGGTGTCTAAATC
（2）发根农杆菌K599介导的大豆毛根转化
1）大豆种子灭菌及萌发
①种子灭菌。挑取无破损、无病斑的大豆用氯气灭菌（量取100 ml次氯酸钠置入250ml烧杯中，沿杯壁缓缓加入5ml浓盐酸，密封灭菌16小时）。
②种子萌发。将灭过菌的大豆种播种于灭过菌的石英砂中，放置于在大豆人工气候室中培养 4~5 天，生长至子叶竖起，与下胚轴约成直角状态。
2）带有目标重组载体的发根农杆菌的准备
将重组质粒导入到发根农杆菌K599，得到工程菌；将工程菌在液体培养基中活化，取500 μl工程菌菌液涂板，28℃培养约2~3 天，生成“菌膜”。
）侵染
①萌发第5天（即暗培养3天，光培养2天后），取出大豆，在下胚轴“绿白交界处”沿45°斜切。
②用大豆下胚轴切口在工程菌菌板上蘸取工程菌；将侵染后的大豆放入无氮固体培养基中暗处共培养2天培养。
③将植株转入有氮培养基的方皿，下胚轴遮光培养6天。
）毛根培养
将植株取出，去除切面愈伤组织处长出的根后，将植株放入到有氮液体培养基中培养9~10天。
）转基因阳性根鉴定和筛选
取出植株，吸水纸吸干其根上的水，在体式荧光显微镜下检测阳性根，具有GFP绿色荧光的为阳性根；仅留下最粗壮的单一阳性根，其余剪除；将具有单一阳性根的植株继续放入有氮FM培养基中培养4~5天，然后移至土壤中进行培养接菌。
（3）转基因植株毛根 GmNAS1和 GmNAP1表达量鉴定和表型分析。
接种根瘤菌USDA110后25天后，对转基因植株毛根的根瘤数量、根瘤重量和根瘤固氮酶活性进行测定，同时利用Real Time qRT-PCR的方法对根瘤中的 GmNAS1和 GmNAP1的基因表达量进行分析。
GmNAS1-qF: CTGCCGTCAGCTATGCTAGG；
GmNAS1-qR: CCAGAACGGAGACGCAATGTA；
GmNAP1-qF: CATCCCCGACGGAACCAC；
GmNAP1-qR: GCCCCTCTGTGACGACTCTA
利用转化成功的发根农杆菌K599侵染大豆根部愈伤组织，获得大豆毛状根，大豆毛状根接种慢生型根瘤菌USDA110之后25天，对 Ri-GmNAS1/NAP1转基因毛根上的根瘤进行表型统计，发现 GmNAS1和 GmNAP1的表达下调并未影响根瘤的数目和重量，但显著降低了根瘤的固氮能力（图11）。
实施例4
GmNAS1和GmNAP1基因编辑载体的构建及应用：
（1）植物表达载体 CR-GmNAS1/NAP1的构建
首先选择5’-CGGTGTCGAAAGTAATGACG-3’和5’-CTACTAGAGTCGTCGCCGAG-3’作为 GmNAS1和 GmNAP1的sgRNA靶序列，将扩增得到的sgRNA片段连入 pBluescript-GmU6-tRNA获得tRNA-gRNA中间载体，之后用PstI和KpnI酶切将中间载体的GmU6-tRNA-gRNA片段下来，连入 pCambia1300-35S-Cas9载体获得植物表达载体 CR-GmNAS1/NAP1，转入W82植株中。
其中 pBluescript-GmU6-tRNA载体的获得：将大豆基因U6的启动子序列（如SEQ IDNO.10所示）连上tRNA（如SEQ ID NO.11所示）序列，然后一起插入商业化载体 pBluescript上获得 pBluescript-GmU6-tRNA载体。
所用引物如下：
CR-GmNAS1/NAP1-F: ttcccggctggtgcacggtgtcgaaagtaatgacggttttagagctagaaatagc；
CR-GmNAS1/NAP1-R: gctatttctagctctaaaacctcggcgacgactctagtagtgcaccagccgggaa；
（2）大豆遗传转化
本研究中大豆转化均采用农杆菌EHA105介导的大豆子叶节转化法，主要参考前人报道的转化方法(Luth et al 2015)，并在此基础上作了改进。
）大豆种子灭菌及萌发
①种子灭菌。挑取无破损、无病斑的大豆用氯气灭菌（量取100 ml次氯酸钠置入250ml烧杯中，沿杯壁缓缓加入5ml浓盐酸，密封灭菌16小时）。
②种子萌发。将灭过菌的大豆种放置于萌发培养基中，放置于22℃培养箱中暗培养16~24小时使其萌发。
）农杆菌的活化和侵染液的制备
取250μl冻存的菌液涂布于相应抗生素的LB平板上，28℃培养过夜。用一次性接种环刮取菌膜，垂悬于液体共培养基里，用分光光度计测定菌液浓度，使终浓度OD600 = 0.5~0.6。
）外植体准备和侵染
保留3~5mm长的下胚轴，分离两片子叶，去除种皮，切除初生芽后，用刀片在子叶节部位划几刀，得到用于转化的子叶节外植体。将其置于侵染液中，于水平旋转仪上振荡（转速50~80r/min）侵染30min。
）共培养
倒掉菌液，将外植体转移至铺有一层无菌滤纸的固体共培养基上，每皿15~20个，22℃培养箱中暗培养3~5天。
）筛选培养和植株再生
①芽诱导培养：共培养3~5天之后，将外植体转移至芽诱导培养基中，每皿放5个外植体，光周期16/8小时（光照/黑暗）、25℃条件下培养，每2周继代一次，继代2次。
②芽伸长培养：除去死芽，切掉子叶部分，将外植体转移至芽伸长培养基中，每皿放5个外植体，光周期16/8 小时（光照/黑暗）、25℃条件下培养，每3周继代一次，继代2~4次。
③生根诱导：当伸长苗长至3cm长之后，切下转移至根诱导培养基中，光周期16/8小时（光照/黑暗）、25℃条件下培养。
）炼苗及移栽培养
①当再生植株生根并长出两片以上复叶后，取出植株，洗净根部的培养基，栽入盛有灭菌蛭石的小花盆中，在人工智能培养箱（温度25℃，光周期16/8小时，相对湿度85%RH，光照强度90 μM/m2/s）炼苗5~7天。
②待壮苗之后将其移栽到大花盆（营养土：蛭石=1:1）中，移至培养室（温度28±2℃，光周期13.5/10.5h，相对湿度40%~60%RH，光照强度90μM/m2/s）中生长至成熟。
（3）转基因植株 CR-GmNAS1/NAP1编辑位点鉴定和表型分析。
根据sgRNA在 GmNAS1和 GmNAP1上的靶序列设计编辑位点鉴定引物，扩增出相应片段后送去进行测序，分析测序结果得到 cr-nas1、 cr-nap1、 cr-nas1nap1-1和 cr-nas1nap1-2四个功能缺失突变体，对这些突变体植株接种根瘤菌USDA110后第25天的根瘤数量、根瘤重量和根瘤固氮酶活性进行测定。
所用引物如下：
GmNAS1-JD-F: CATTCACATTCAGAAGAATGAGCAC
GmNAS1-JD-R: CTAGACGTGTTTTTTTTAGACACCG
GmNAP1-JD-F: TCATTCATCGAAACACAGAGAGAAG
GmNAP1-JD-R: TTGAAAAATGCTTTCCTCCAAACAG
利用基因编辑技术我们获得了 GmNAS1的功能敲除突变体 cr-nas1， GmNAP1的功能敲除突变体 cr-nap1，以及 GmNAS1和 GmNAP1的双敲除突变体 cr-nas1nap1-1和 cr-nas1nap1- 2，对这四个大豆突变体接种USDA110之后25天的根瘤进行表型测定，发现在正常生长条件下这些突变体的根瘤数目、重量和固氮酶活性与野生型W82植株相比没有明显差异，但是在施加3% (w/v)蔗糖溶液处理三天之后，我们发现野生型植株的固氮酶活性相比未施加蔗糖明显提高，但 cr-nas1， cr-nap1， cr-nas1nap1-1和 cr-nas1nap1-2突变体的固氮酶活性与未施加蔗糖植株类似，表明 GmNAS1和 GmNAP1控制了蔗糖对大豆根瘤固氮能力的提升（图12）。
实施例5
本申请还利用免疫共沉淀偶连质谱分析技术寻找与GmNAP1结合的候选蛋白，在质谱结果中发现了一个转录因子GmNFYC10a，pull-down方法证明GmNFYC10a可以与GmNAS1/GmNAP1相互作用，并且发现AMP与GmNAS1的结合会显著抑制GmNAS1和GmNFYC10a的相互作用，双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation，BiFC）技术进一步表明GmNFYC10a与GmNAS1/GmNAP1互作于线粒体上（图13）。GmNFYC10a-GFP融合蛋白注射小叶烟草之后，我们发现GmNFYC10a定位于细胞核中，表明GmNFYC10a可能通过与GmNAS1/GmNAP1互作而定位于线粒体上，而细胞中AMP浓度的高低可能会影响GmNFYC10a的细胞核定位，为了验证这一猜测，我们首先获得了GmNFYC10a-GFP转基因毛状根，对接种根瘤菌25天后的成熟根瘤进行震动切片，发现荧光主要定位于线粒体，而在对切片用oligomycin或AMP处理2小时之后，细胞核中的荧光显著增加，表明根瘤细胞能量状态降低导致的AMP含量增加会通过减弱GmNFYC10a和GmNAS1在线粒体的互作来增加细胞核中GmNFYC10a的含量（图14）。
对 Ri-GmNAS1/NAP1转基因毛根上的根瘤进行转录组测序分析，我们发现 GmNAS1/ GmNAP1表达下调影响了许多生物学过程，包括糖酵解和糖原异生途径，其中糖酵解途径中有10个基因的表达被显著下调，并且这10个基因中包括了5个丙酮酸激酶基因（图15）。对这10个糖酵解基因的启动子进行分析鉴定到了一个核因子Y（Nuclear Factor Y，NF-Y）转录复合物的结合基序，表明NF-Y复合物的亚基GmNFYC10a可能调控了这些糖酵解基因的表达，染色质免疫共沉淀偶连定量PCR（chromatin immunoprecipitation qPCR，ChIP-qPCR）结果表明GmNFYC10a的确结合在 PK1a/GAPC1/PK2a基因的启动子区域，进一步的双荧光素酶激活分析（dual-luciferase assays，dual-LUC）证明GmNFYC10a的确可以激活糖酵解基因 PK1a/ GAPC1/PK2a的表达（图16）。
实施例6
之前的实验结果表明根瘤能量状态下降会增加GmNFYC10a的细胞核含量，而蔗糖处理可以提高根瘤能量状态，因此我们分离了蔗糖处理前后大豆根瘤细胞的细胞核，并检测了其中GmNFYC10a的蛋白水平，发现蔗糖处理后细胞核中GmNFYC10a的蛋白含量显著下降，糖酵解相关基因的表达也显著下调，而蔗糖处理后 GmNAS1/GmNAP1突变体 cr-nas1、 cr- nap1和 cr-nas1nap1-1中糖酵解相关基因的表达明显高于野生型W82，表明GmNAS1/GmNAP1调控的GmNFYC10a细胞核含量下降控制了蔗糖处理下糖酵解基因表达的抑制（图17）。由于这些受调控的糖酵解基因有一半编码了丙酮酸激酶（催化了PEP向丙酮酸的转化），我们检测了蔗糖处理下W82、 cr-nas1、 cr-nap1和 cr-nas1nap1-1根瘤中的丙酮酸含量，发现 cr- nas1、 cr-nap1和 cr-nas1nap1-1根瘤中的丙酮酸含量显著高于野生型，而PEP转化为的草酰乙酸和苹果酸的含量显著低于野生型，表明 GmNAS1和 GmNAP1的功能缺失影响了大豆根瘤中PEP的分配（图17）。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.控制大豆共生固氮效率的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质具有一个氨基端的叶绿体转移肽，四个CBS功能域，一个PB1功能域和一个羧基端的跨膜结构域。
2.根据权利要求1所述的控制大豆共生固氮效率的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质定位于线粒体中并与转录因子GmNFYC10a互作。
3.根据权利要求2所述的控制大豆共生固氮效率的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质通过羧基端的跨膜结构域定位到线粒体中。
4. 根据权利要求1-3任一项所述的控制大豆共生固氮效率的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质为GmNAS1蛋白和GmNAP1蛋白，其中GmNAS1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示、GmNAP1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；转录因子GmNFYC10a的氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示。
5. 编码权利要求4所述的蛋白质的基因，其特征在于：编码GmNAS1蛋白的GmNAS1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码GmNAP1蛋白的GmNAP1基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，编码转录因子GmNFYC10a的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
6.含有权利要求5所述的GmNAS1基因和/或GmNAP1基因的过表达载体。
7.权利要求4所述蛋白质或权利要求5所述的基因在改良植物共生固氮效率、增强植物环境适应能力以及提高植物产量中的应用。
8.权利要求6所述的过表达载体在改良植物共生固氮效率、增强植物环境适应能力以及提高植物产量中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤为：将权利要求6所述的过表达载体，通过遗传转化方法转入待改良植物中，然后筛选转基因阳性植株进行培养，完成增强大豆共生固氮能力的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述改良植物为豆科植物。
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CN115043917B (zh) * 2022-03-10 2024-06-14 华中农业大学 大豆GmNAC039或GmNAC018在调控植物根瘤固氮和/或调控产量中的应用

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