CN107699576B - 一种调控丹参酮生物合成的SmAP2/ERF82转录因子的筛选、鉴定及应用 - Google Patents

一种调控丹参酮生物合成的SmAP2/ERF82转录因子的筛选、鉴定及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107699576B
CN107699576B CN201710849664.9A CN201710849664A CN107699576B CN 107699576 B CN107699576 B CN 107699576B CN 201710849664 A CN201710849664 A CN 201710849664A CN 107699576 B CN107699576 B CN 107699576B
Authority
CN
China
Prior art keywords
smap2
erf82
tanshinone
erf
regulating
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201710849664.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107699576A (zh
Inventor
罗红梅
张建红
吕海舟
宋经元
季爱加
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Medicinal Plant Development of CAMS and PUMC
Original Assignee
Institute of Medicinal Plant Development of CAMS and PUMC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Medicinal Plant Development of CAMS and PUMC filed Critical Institute of Medicinal Plant Development of CAMS and PUMC
Priority to CN201710849664.9A priority Critical patent/CN107699576B/zh
Publication of CN107699576A publication Critical patent/CN107699576A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107699576B publication Critical patent/CN107699576B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一条调控丹参酮合成的AP2/ERF转录因子SmAP2/ERF82的编码基因序列；本发明所提供的SmAP2/ERF82基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述基因编码蛋白质具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。本发明构建了SmAP2/ERF82‑RNAi载体及SmAP2/ERF82‑过表达载体，通过遗传转化方法转化丹参，获得转基因毛状根，与对照株系相比，SmAP2/ERF82‑RNAi株系中二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮II A的含量显著降低，SmAP2/ERF82‑过表达株系中二氢丹参酮I、隐丹参酮的含量显著上升。本发明提供的SmAP2/ERF82具有正调控丹参酮类化合物生物合成的功能，该类化合物具有治疗心血管疾病的显著疗效。本发明创新了丹参酮合成调控分子机制的研究思路，为丹参酮的合成生物学研究奠定基础。

Description

一种调控丹参酮生物合成的SmAP2/ERF82转录因子的筛选、鉴 定及应用
技术领域
本发明属于植物分子生物学及基因工程领域，具体涉及一种调控丹参酮生物合成的SmAP2/ERF82转录因子的筛选、鉴定及应用。
背景技术
丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)，为唇形科鼠尾草属多年生双子叶植物，根及根茎入药。丹参味苦，微辛，性微寒，归心、肝经，具有活血祛瘀，凉血消痈，通经止痛，清心除烦等作用。丹参酮是丹参中具有重要药理活性的脂溶性二萜化合物，包括丹参酮IIA、丹参酮I、隐丹参酮、二氢丹参酮I等10余种化合物，具有抗肿瘤、抗菌消炎等作用，对心脑血管疾病有很好的疗效。目前丹参酮的生物合成途径已得到较为深入的解析，但调控机制的研究却较为匮乏。
转录因子能够识别并结合基因启动子区域中的顺式作用元件，从而激活或抑制目标基因的转录，可分为Myb、bHLH、WRKY和AP2/ERF转录因子等不同的家族。AP2/ERF转录因子家族已报道调控多种植物中次生代谢产物的生物合成，如长春花中的长春碱和长春新碱、黄花蒿中的青蒿素、红豆杉中的紫杉醇等。而AP2/ERF转录因子是否可以调控丹参中丹参酮类化合物的生物合成尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种调控丹参酮生物合成的AP2/ERF转录因子基因及其编码的蛋白质。
本发明的另一个目的在于验证AP2/ERF转录因子家族成员的功能。
本发明提供的SmAP2/ERF82基因，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。
本发明提供的SmAP2/ERF82基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：基于丹参全基因组及不同丹参器官/组织转录组差异表达分析筛选出可能调控丹参酮合成的AP2/ERF基因家族成员SmAP2/ERF82编码基因。
构建一种含有SmAP2/ERF82基因特异性片段的正向和反向序列的植物RNAi双元表达载体。
构建一种含有SmAP2/ERF82基因全长序列的植物过表达双元表达载体。
本发明通过发根农杆菌侵染丹参叶片，获得SmAP2/ERF82-RNAi阳性毛状根及SmAP2/ERF82-过表达阳性毛状根。
本发明采用HPLC技术鉴定到SmAP2/ERF82-RNAi转基因毛状根中二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA的含量显著降低，SmAP2/ERF82-过表达株系中二氢丹参酮I、隐丹参酮的含量显著上升。本发明提供的SmAP2/ERF82可促进丹参酮的生物合成，这为解析调控丹参酮生物合成的分子机制奠定基础。
附图说明
图1所示为发根农杆菌ACCC10060介导的SmAP2/ERF82-RNAi/过表达遗传转化的丹参毛状根。
图2所示为SmAP2/ERF82在SmAP2/ERF82-RNAi转基因毛状根中表达量降低(A)及在SmAP2/ERF82-过表达转基因毛状根中表达量上升(B)。
图3所示为HPLC分析SmAP2/ERF82-RNAi转基因毛状根(A)及SmAP2/ERF82-过表达转基因毛状根(B)中丹参酮类化合物的含量。
图4所示为丹参酮类化合物的含量在SmAP2/ERF8-RNAi转基因毛状根中降低(A-D)及在SmAP2/ERF8-过表达转基因毛状根中上升(E、F)。
具体实施方式
以下结合实例详细说明本发明。实施是为更好的理解本发明，但不限定于本发明。以下实施方法中的实验方法均为常规方法，所涉及的实验试剂均为常规生化试剂。
实施例1在丹参全基因组中筛选并鉴定AP2/ERF基因家族的成员
利用Pfam数据库隐马尔科夫模型HMM：PF00847搜索丹参基因组进行注释。在丹参基因组中共预测到170个AP2/ERF转录因子基因，命名为Sm001-Sm170，蛋白长度范围在79aa到595aa之间。其中，Sm082在本发明中命名为SmAP2/ERF82。
实施例2丹参SmAP2/ERF82基因的克隆
根据SmAP2/ERF82序列的开放阅读框设计全长引物，以丹参的eDNA为模板，PCR扩增得到SmAP2/ERF82基因的核苷酸序列，长度为582bp，如SEQ ID No.1。将核苷酸序列翻译后推导出SmAP2/ERF82的氨基酸序列，包含193个氨基酸残基，如SEQ ID No.2。
实施例3丹参SmAP2/ERF82基因的功能验证
1)RNAi引物设计及PCR扩增。挑选SmAP2/ERF82基因中一段长为185bp的特异性片段作为RNAi目标区域(位于基因的96-280bp)，对目标区域设计两端引物，根据Gateway使用原理，在引物5′端添加attB序列，其中F引物添加attB1序列：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT，R引物添加attB2序列：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT。引物序列如下：
F-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGATCGCCGCCGTTGTCGGC
R-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTGTCGAATGTGCCGAGCCA
2)过表达引物设计及PCR扩增。在SmAP2/ERF82基因的全长引物5′端添加attB序列。引物序列如下：
F-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGTTGAGAAACGACTCTTT
R-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTAATACTCCACCAAACCAC3)构建SmAP2/ERF82-RNAi载体。BP反应：在PCR反应管中加入25ng attB-PCR回收产物，75ng pDONR221入门载体，1μL BP clonase II enzyme，补充ddH2O至5μL；轻轻混匀后，于25℃孵育1小时以上；再加入0.5μL的蛋白激酶K，混匀后37℃孵育10min；转入DH5α感受态细胞，用含50mg/LKan(卡那霉素)抗性的LB固体培养基筛选培养，再对克隆利用PCR进行检测。LR反应：在PCR反应管中加入75ng pDONR221-RNAi回收产物，75ng pK7GWIWG2D(II)受体载体，1μL LR clonase IIenzyme，补充ddH2O至5μL；轻轻混匀后于25℃温育1小时以上；再加入0.5μL的蛋白激酶K，混匀后37℃孵育10min；转入DH5α感受态细胞，用含50mg/L Spec(壮观霉素)抗性的LB固体培养基筛选培养，经PCR检测后将阳性克隆送测；测序正确的克隆提取重组质粒pK7GWIWG2D(II)-SmAP2/ERF82，转入发根农杆菌ACCC10060中。
4)构建SmAP2/ERF82-过表达载体。BP反应同3)。LR反应：在PCR反应管中加入75ngpDONR221-过表达回收产物，75ng pK7WG2D受体载体，1μLLR clonase II enzyme，补充ddH2O至5μL；轻轻混匀后于25℃温育1小时以上；再加入0.5μL的蛋白激酶K，混匀后37℃孵育10min；转入DH5α感受态细胞，用含50mg/L Spec(壮观霉素)抗性的LB固体培养基筛选培养，经PCR检测后将阳性克隆送测；测序正确的克隆提取重组质粒pK7WG2D-SmAP2/ERF82，转入发根农杆菌ACCC10060中。
5)农杆菌ACCC10060侵染丹参叶片。用转入pK7GWIWG2D(II)/pK7WG2D载体的发根农杆菌作为对照，同步侵染丹参叶片；选取生长旺盛的丹参组培苗，取幼嫩叶片，剪成0.5cm2的叶盘，置于空白MS培养基平板上25℃预培养2-3天；用50mg/L Spec+50mg/L Rif的液体YEB培养基分别培养含重组质粒和空载体的发根农杆菌，28℃摇培至OD600达到0.4-0.6；将菌液离心，富集菌体后用等体积的MS液体培养基重悬菌体(MS-plasmid)，将预培养的叶盘置于MS-plasmid中，浸泡10min后用无菌滤纸吸去多余菌液，置于空白MS平板上，25℃黑暗条件下共培养48-72h；将共培养的叶盘于600mg/L Car(羧苄青霉素)的无菌水中浸泡10min，吸去多余水分后置于含500mg/L Car+50mg/L Kan的MS平板上，25℃黑暗条件下筛选培养，每10天更换一次培养基；选择长势快的阳性毛状根，待其长至2.0-3.0cm后切下，置于含15mg/L Kan的6，7-V平板上，长出较多侧根后，利用荧光显微镜检测GFP的表达情况判断转基因的毛状根是否为阳性株系，如图3所示。将阳性株系移至6，7-V液体培养基中，150rpm，25℃黑暗条件下扩大培养。利用实时定量PCR方法检测转基因阳性株系中，基因表达受到抑制/过表达程度，如图4所示。
实施例4 丹参酮类化合物含量检测
本发明采用HPLC技术对转基因的毛状根进行化学成分检测，步骤如下：1)将丹参毛状根烘干后称重，使用球磨仪打粉，每100mg毛状根用0.5ml甲醇提取，提取物超声处理30min，3,000g离心10min，用0.22μm尼龙过滤器将上清过滤至棕色液相小瓶中，待进样；2)HPLC条件：采用Waters XBridge C18色谱柱，检测波长，270nm；柱温，25℃；流速，1ml/min；进样量，10μL，流动相：乙腈(A)-0.1％磷酸溶液(B)；梯度洗脱条件为0～5min，25％～60％A；5～35min；60％～100％A。
本发明首次基于丹参全基因组筛选并克隆SmAP2/ERF82基因，验证发现SmAP2/ERF82具有正调控丹参酮生物合成的功能，为开展丹参酮合成生物学及优良种质培育的研究奠定基础。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出对于技术领域普通人员来说在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些也应视为在本发明的保护范围。
Figure ISB0000170035470000011
Figure ISB0000170035470000021

Claims (5)

1. 一种调控丹参酮生物合成途径的AP2/ERF转录因子SmAP2/ERF82的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.权利要求1所述基因SmAP2/ERF82编码的蛋白质，其特征在于，其氨基酸残基序列如SEQ ID No.2所示。
3.一种植物RNAi双元表达载体，其特征在于，所述RNAi载体含有SmAP2/ERF82特异性片段的正向和反向序列；所述SmAP2/ERF82特异性片段的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的96-280bp。
4.一种植物过表达的双元表达载体，其特征在于，所述过表达载体含有SmAP2/ERF82的全长序列；所述SmAP2/ERF82的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
5.权利要求1所述编码基因在丹参中调控丹参酮类化合物的生物合成中的应用。
CN201710849664.9A 2017-09-20 2017-09-20 一种调控丹参酮生物合成的SmAP2/ERF82转录因子的筛选、鉴定及应用 Active CN107699576B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710849664.9A CN107699576B (zh) 2017-09-20 2017-09-20 一种调控丹参酮生物合成的SmAP2/ERF82转录因子的筛选、鉴定及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710849664.9A CN107699576B (zh) 2017-09-20 2017-09-20 一种调控丹参酮生物合成的SmAP2/ERF82转录因子的筛选、鉴定及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107699576A CN107699576A (zh) 2018-02-16
CN107699576B true CN107699576B (zh) 2021-08-31

Family

ID=61173096

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710849664.9A Active CN107699576B (zh) 2017-09-20 2017-09-20 一种调控丹参酮生物合成的SmAP2/ERF82转录因子的筛选、鉴定及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107699576B (zh)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108342396B (zh) * 2018-04-13 2020-12-08 华中农业大学 玉米基因ZmEREB180在植物耐渍中的应用
CN110616224A (zh) * 2019-08-16 2019-12-27 广州中医药大学(广州中医药研究院) 一种丹参转录因子SmNAC36基因及其应用
CN112522220B (zh) * 2019-08-27 2022-08-09 中国医学科学院药用植物研究所 一种参与丹参酮生物合成的丹参cyp71be37的基因克隆引物、功能及应用
CN112626075B (zh) * 2019-10-08 2022-08-09 中国医学科学院药用植物研究所 一种调控丹参酮合成的SmAP2/ERF152基因的克隆引物、功能及应用
CN111548401B (zh) * 2020-06-04 2022-08-02 中国中医科学院中药研究所 丹参ERF-Ⅶ转录因子SmERF73及其应用
CN114380898B (zh) * 2022-01-25 2023-07-28 山西中医药大学 一种植物产丹参酮类化合物相关基因及其应用
CN114891810B (zh) * 2022-04-27 2023-01-10 山东中医药大学 丹参SmSnRK2.7基因在提高丹参酮含量中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007032111A1 (ja) * 2005-09-16 2007-03-22 Incorporated Administrative Agency Japan International Research Center For Agricultural Sciences トウモロコシ由来のストレス誘導性転写因子
CN102747091A (zh) * 2012-07-31 2012-10-24 福建农林大学 一种白菜ap2/erf转录因子基因及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007032111A1 (ja) * 2005-09-16 2007-03-22 Incorporated Administrative Agency Japan International Research Center For Agricultural Sciences トウモロコシ由来のストレス誘導性転写因子
CN102747091A (zh) * 2012-07-31 2012-10-24 福建农林大学 一种白菜ap2/erf转录因子基因及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Genome-Wide Identification of the AP2/ERF Gene Family Involved in Active Constituent Biosynthesis in Salvia miltiorrhiza;A. J. Ji 等;《Plant Genome》;20160731;第9卷(第2期);全文 *
基于丹参全基因组鉴定活性成分合成相关AP2/ERF转录因;季爱加;<第一届《药学学报》药学前沿论坛暨2 0 1 5 年中国药学会中药与天然药物专业委员会会议>;20151231;全文 *
干涉丹参SmORA1 对植物抗病和丹参酮类次生代谢的影响;化文平 等;《中国农业科学》;20161231;第49卷(第3期);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN107699576A (zh) 2018-02-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107699576B (zh) 一种调控丹参酮生物合成的SmAP2/ERF82转录因子的筛选、鉴定及应用
CN104894143B (zh) 一种提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法
CN114645061B (zh) SmMYB76基因及其在提高丹参中丹酚酸含量中的应用
CN106148357B (zh) 一种青蒿wrky类转录因子编码序列及应用
CN105087600B (zh) 一种珠子参转录因子基因PjbHLH1的应用
CN108517323B (zh) 一种丹参AP2转录因子SmERF128编码序列及克隆方法与应用
CN112522220B (zh) 一种参与丹参酮生物合成的丹参cyp71be37的基因克隆引物、功能及应用
CN106148355B (zh) 菘蓝IiAP2/ERF049基因在调控木脂素类化合物合成中的应用
CN112626075B (zh) 一种调控丹参酮合成的SmAP2/ERF152基因的克隆引物、功能及应用
CN107699577A (zh) 一种调控丹酚酸生物合成的SmAP2/ERF8转录因子的筛选、鉴定及应用
CN106086039B (zh) 一种青蒿wrky类转录因子编码序列及应用
CN112143734A (zh) SmbHLH92基因克隆引物、表达载体、调控丹酚酸生物合成的功能及应用
CN102776212A (zh) 高青蒿素含量转基因青蒿植株的生产方法
CN102558325B (zh) 青蒿AaORA蛋白及编码基因、转基因青蒿植株的获得方法
CN101654678A (zh) 一种丹参异戊烯焦磷酸异构酶(SmIPPI)基因的分析及应用
CN113186205B (zh) 丹参CYP76AK5v2的基因克隆引物、表达载体、催化功能及应用
CN108070596B (zh) 青蒿腺毛优势表达AaTCP14基因启动子及其获得方法与应用
CN110819643A (zh) 人参PgCYP309基因及其应用
CN113388621B (zh) 一种地黄WRKY转录因子RgWRKY37基因及其应用
CN105713921A (zh) 转chi基因提高青蒿中青蒿素含量的方法
CN105695507B (zh) 转ics1基因提高青蒿中青蒿素含量的方法
CN112143742B (zh) 丹参细胞色素p450基因cyp72a395的基因克隆引物、表达载体、催化功能及应用
CN106755060B (zh) 共转fps和dbr2基因提高青蒿素含量的方法及制备的青蒿
CN114149993B (zh) 一种调控植物可溶性糖含量的lncRNA及其应用
CN118027166B (zh) 广金钱草转录因子GsNSP1及其编码基因的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant