CN110616224A - 一种丹参转录因子SmNAC36基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种丹参转录因子SmNAC36基因，所述SmNAC36基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；还提供了一种丹参转录因子SmNAC36蛋白，所述SmNAC36蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明公开了SmNAC36转录因子克隆及功能验证的一整套完善体系，SmNAC36能够通过结合丹参酮合成途径关键酶基因，进一步促进丹参酮的合成。对阐明丹参酮生物合成的调控机制提供分子基础，同时具有重大的应用价值，可通过基因工程技术手段促进丹参酮产量的提高。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种丹参转录因子SmNAC36基 因及其应用。
背景技术
药用植物作为中药和世界传统药物的主要来源，面临着资源稀缺和活性成 分含量低等问题，因此，开发新的药物来源途径是迫切需要解决的问题。通过 代谢工程技术和合成生物学手段提高和合成次生代谢产物是药物生产和开发的 新途径。但是大多数药用植物存在遗传背景不清楚，基因组信息缺乏的难题， 限制了药用植物活性成分的开发与利用。丹参是我国常用大宗药材，其基因组 学、活性成分的生物合成研究在国际上处于领先地位，被提出作为中药研究的 模式物种。脂溶性丹参酮类成分是丹参主要的药效成分之一，用于治疗冠心病 等多种疾病。目前以丹参酮为主要组成的药品种类较多，如复方丹参滴丸、丹 参酮IIA磺酸钠注射液、丹参酮片、丹参舒心胶囊等，据报道，复方丹参滴丸在 国内已连续10几年问鼎中成药单品年销量冠军，2016年销售量1.36亿盒。以 丹参活性成分为组成的药品市场需求量逐年增加，通过代谢工程和生物合成调 控手段提高丹参活性成分含量成为研究热点。
转录因子是一类通过识别并结合在目标基因上游的启动子区域来调控靶基 因转录表达的蛋白，常常参与植物的生长发育、胁迫响应和活性成分合成等生 理过程。NAC转录因子家族是植物最大转录因子家族之一，在植物生长发育、 非生物胁迫、生物胁迫响应的功能研究很深入，但是在次生代谢物合成的调控 方面研究尚浅。目前只有三个NAC转录因子被报道参与次生代谢物的合成，其 中，奇异果中AaNAC2转录因子参与单萜类化合物的合成，拟南芥ANAC042 转录因子能够调控camalexin的生物合成。此外，AaNAC1能够提高青蒿中青蒿 素的含量。但还未发现有参与调控丹参酮和丹酚酸生物合成的NAC家族转录因 子。
发明内容
本发明首先在丹参基因组数据中获得一个NAC转录因子基因SmNAC36， 经过qRT-PCR分析之后发现SmNAC36在根皮中表达最高，与丹参酮的积累规 律一致(图2)。在此基础上克隆SmNAC36基因，利用过表达与沉默技术下研 究SmNAC36对丹参酮合成的调控作用，并通过酵母单杂交技术和转录激活实 验来揭示其调控机制。本发明证明SmNAC36能够正向调控丹参酮的生物合成， 增加丹参酮活性成分的含量，为通过基因工程手段提高丹参酮活性成分含量提 供基因资源。
本发明的第一个目的在于提供一个丹参NAC转录因子SmNAC36基因，该 基因具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，或在如SEQ ID NO.1所示的核 苷酸序列的基础上经替换、缺失或添加一个或多个碱基而得到的具有SmNAC36 功能的核苷酸序列。
本发明的第二个目的在于提供一个丹参NAC转录因子SmNAC36基因编码 的蛋白，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，或在如SEQ ID NO.2所 示的氨基酸序列的基础上经替换、缺失或添加一个或多个碱基而得到的具有 SmNAC36功能的氨基酸序列。
本发明的第三个目的在于提供一种提高丹参毛根中丹参酮含量的方法，包 括以下步骤：
(1)根据丹参的全基因组序列筛选出SmNAC36转录因子基因，并检测其 在丹参的各个组织器官的表达量；所述SmNAC36转录因子基因序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)采用基因克隆方法获得丹参SmNAC36转录因子基因，并将其插入植 物表达载体获得SmNAC36基因的过表达载体；
(3)构建亚细胞定位载体，瞬时转化拟南芥叶片，分析丹参SmNAC36转 录因子在细胞中的定位；
(4)构建真核表达载体转化酵母，检测丹参SmNAC36转录因子与 CYPNAC2启动子的结合能力，所述SmNAC36转录因子通过特异性结合到 NAC元件上，激活下游目的基因的表达；
(5)将步骤(2)中的植物过表达载体转入农杆菌获得转染重组农杆菌， 并瞬时转化浸染丹参外植体，筛选获得具有阳性转化丹参毛状根；
(6)通过检测转化的阳性毛状根中丹参酮的含量，筛选出丹参酮产量提高 的株系。
优选地，所述步骤(2)中基因克隆方法采用的引物序列为如SEQ ID NO.3 所示和如SEQ ID NO.4所示。
优选地，所述步骤(2)中构建的植物表达载体为pK7WG2D-SmNAC36。
优选地，所述步骤(3)中构建的亚细胞定位载体为35S: PBI221-GFP-SmNAC36。
优选地，所述步骤(4)中构建的真核表达载体为PB42AD-SmNAC36和 pLacZ-2u-CYPNAC2。
本发明的第四个目的在于提供丹参转录因子SmNAC36基因在提高丹参酮含 量的方法中的应用。
本发明的有益效果：本发明公开了SmNAC36转录因子克隆及功能验证的 一整套完善体系，SmNAC36能够通过结合丹参酮合成途径关键酶基因，进一 步促进丹参酮的合成。对阐明丹参酮生物合成的调控机制提供分子基础，同时 具有重大的应用价值，可通过基因工程技术手段促进丹参酮产量的提高。
附图说明
图1为本发明的技术路线图。
图2为SmNAC36转录因子在各个器官组织中的表达量分析(其中R表示 根；S表示茎；L表示叶；F表示花；R1表示周皮；R2表示木质部；R3表示韧 皮部)。
图3为SmNAC36基因扩增产物电泳检测图；
图4为转基因毛根提取液(A)和毛根表型(B)示意图；
图5为过表达SmNAC36株系与对照株系中关键酶基因表达量差异示意图；
图6为过表达SmNAC36株系与对照株系中丹参酮类化合物含量差异示意 图；
图7为SmNAC36亚细胞定位结果图(A为对照；B为含有SmNAC36转录 因子的细胞)；
图8为SmNAC36转录激活结果示意图(1表示阳性；2表示 pGBKT7-SmNAC36；3表示阴性)；
图9为本发明中SmNAC36酵母单杂交结果示意图(A表示阴性；B表示 阴性；C表示阳性；D表示PB42AD-NAC36pLacZ-2u-CYPNAC2)。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体 实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。
实施例1丹参SmNAC36基因的克隆
1.1实验方法
1.1.1PCR扩增
以丹参cDNA为模板采用诺唯赞高保真酶phantomax-super Fidelity DNApolymerase聚合酶进行扩增，扩增体系见表1，扩增程序见表2，扩增引物序列 为：
”
F：5-ATGGAAGTGGAAAACATGAGC-3
”
R：5-TTAATAACGATTAGAATAGAAGG-3
表1：扩增体系
表2：扩增程序
1.1.2目的基因电泳检测和胶回收
①1％的琼脂糖凝胶电泳检测。
②从琼脂糖凝胶中切下含目标片段的胶块，称重。
③加入胶块重进3倍的Buffer B2，50℃水浴5-10分钟溶胶(300μL/mg)。
④(选做)对于<500bp的片段，加入1/3Buffer B2体积的异丙醇。
⑤将溶胶液移入吸附柱中，8,000g离心30秒。倒掉收集管中液体。
⑥加入500μL Wash Solution，9,000g离心30秒，倒掉收集管中液体。
⑦重复步骤6一次。
⑧空吸附柱于9,000g离心1分钟。
⑨将吸附柱放入一个干净的1.5mL离心管中，在吸附膜中央加入15-40μL ElutionBuffer室温静置1分钟后，离心1分钟。保存管中DNA溶液。
⑩收集到的DNA溶液进行琼脂糖凝胶电泳，检测其浓度。
1.1.3目的基因连接克隆载体PLB
将纯化PCR产物与PLB克隆载体进行连接反应，连接体系与条件见表3。
表3：PLB-T载体连接体系与条件
1.1.4连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，转化步骤为：
①在冰上解冻感受态细胞，不要过度摇晃；
②取50μL细胞于EP管中，轻弹摇匀，冰上静置30min(打开水浴锅加热至42℃)；
③42℃水浴90s后，立即取出冰上冷却2min；
④加入没有抗生素的LB培养基700μL，37℃摇菌200rmp,40min-1h；
⑤平板提前放37℃培养箱预热；
⑥4500rpm离心5min，弃上清液，将剩余菌液重悬，引至抗性平板培养基上 加入石英玻璃珠子，水平摇晃至菌液分散，晾干；
⑦放入37℃培养箱过夜。
1.1.5 PCR鉴定阳性克隆及测序验证
转化后12-16h挑取平板上单克隆于1.5mL离心管，加入含相应抗生素的LB 液体培养基，37℃摇床震荡培养至菌液浑浊，而后进行阳性鉴定。试剂采用2 ×Tap(Vazyme)，PCR程序见表2，反应体系见表4。获得阳性克隆后，将阳性 克隆送至擎科公司测序，测序正确的菌液用30％甘油保菌于-80℃冰箱。
表4：反应体系
1.1.6质粒提取
测序正确后，将携带阳性重组质粒的大肠杆菌扩繁并提取质粒。将质粒-20℃ 保存，重组质粒命名为PLB-SmNAC36。
1.2结果与分析
由凝胶电泳检测得到约807大小的片段，如图3所示。将测序结果与基因 组数据库得到的序列进行比对，结果一致，该基因长度为807bp，编码269个氨 基酸的蛋白，该蛋白的分子量为31kDa，将该基因命名为SmNAC36，核苷酸序 列为SEQ ID No.1所示，其氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。
实施例2转基因SmNAC36毛根株系构建
2.1实验方法
2.1.1过表达载体构建
以PLB-SmNAC36重组质粒为模板，采用诺唯赞高保真酶进行扩增，扩增 体系见表1，扩增程序见表2，扩增引物序列为：
F:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGGAAGTGGAAAACAT GAGCAG
R:GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTAATAACGATTAGAATA GAAGG
扩增片段回收、转化、及阳性克隆检测及送样测序等步骤的方法参照实施例 1中的方法，植物表达载体采用pK7WG2D质粒，连接方法采用Gateway系统， 连接体系和反应条件见表5和表6，构建的植物表达载体命名为 pK7WG2D-SmNAC36。
表5：Gateway系统BP反应连接体系和反应条件
表6：Gateway系统LR反应连接体系和反应条件
2.1.2 pK7WG2D-SmNAC36转化农杆菌ACC10060
制备农杆菌ACC10060感受态细胞，利用电击法将重组质粒转化农杆菌 ACC10060，并保存菌种。步骤如下：
(1)将-80℃冰箱中保存的农杆菌菌种ACC10060在LB+Rif固体培养基上 划线，于28℃培温箱中培养36h。
(2)待单克隆长出后，挑取接种于750μL LB+Rif液体培养基中，28℃，200 rpm培养36h。
(3)取200μL菌液培养于200mL LB+Rif液体培养基中，28℃200rpm培养 OD600值至0.5-1.0之间，冰浴30min。
(4)用两个50mL离心管集菌，集菌两次。
(5)4℃4000rpm离心10min，弃上清。
(6)用25mL冰浴的10％甘油悬浮菌体，4℃4000rpm离心10min，收集菌 体，弃上清。
(7)用4mL冰浴的10％甘油悬浮菌体，将两个管的菌液合并，4℃4000rpm 离心10min，收集菌体，弃上清。
(8)用4mL冰浴的10％甘油悬浮菌体，4℃4000rpm离心10min，收集菌 体，弃上清。
(9)用2.5mL冰浴的10％甘油悬浮菌体，之后分装到1.5mL离心管中，每 管100μL经液氮速冻后于-80℃保存备用。
(10)用1％的盐酸溶液浸泡电击杯内部10min，再用蒸馏水冲洗，之后用 75％乙醇浸泡5min，置于空气中晾干。
(11)将电击杯冰浴后，向100μL农杆菌感受态细胞ACC10060中加入5μL pK7WG2D-SmNAC36质粒，轻轻吹吸2-3次，再转入电击杯中，盖上杯盖。
(12)选择细菌模式下“AGR”条件，迅速加入750μL LB液体培养基，28℃ 200rpm摇床中培养2-3h。
(13)取100μL培养好的菌液涂布于LB+Rif+Spec固体培养基上，倒置培养 于28℃恒温箱中36h。
(14)待单菌落长出后，挑取接种于LB+Rif+Spec液体培养基中，28℃200rpm 摇床培养36h。
(15)取上述菌液2μL作为PCR检测反应的模板，剩余保存于-20℃冰箱内。 超表达载体的检测使用pK7WG2D-SmNAC36R/F引物，PCR配制体系见表4， 程序见表2。
2.1.3农杆菌介导的丹参遗传转化
(1)外植体预培养：选取10天的丹参无菌苗，将叶片剪成0.5×0.5cm2的小块， 并用刀片将叶片表面划伤，以背面向上的方式将叶片置于MS固体培养基上， 于25℃左右光照16h/黑暗8h的条件下预培养2天。
(2)农杆菌的活化：
①吸取100μL-20℃冻存的农杆菌菌液加到5mL含有50mg/L Rif和50mg/L Spec的LB培养液上，28℃培养活化24h直至菌液浑浊；
②吸取上步100μL菌液加入5mL含50mg/L Rif和50mg/L Spec的LB的液 体培养基中，于28℃振荡培养过夜；
③次日早上吸取上步4mL菌液加入40mL含50mg/L Rif和50mg/L Spec的 LB的液体培养基中，于28℃振荡培养至OD260 0.5左右(220rpm约2-6h，取 决于吸取菌液的浓度)，将菌液倒入无菌离心管中，6000rpm离心10min，弃上 清夜，用15-20mL的MS液体培养基重悬沉淀菌体，用于浸染。
(3)浸染及共培养：将预培养材料放入MS重悬液中，浸染10min，取出外植 体，用无菌滤纸吸去菌液，放入新的MS固体培养基上，黑暗中共培养48-72h。
(4)选择培养：
①将共培养的外植体用无菌水清洗3次，可选步骤。
②400mg/L carb(羧苄青霉素)水浸泡5min左右，(无菌水清洗1次，可选)， 吸干水分而后移入含50mg/L Kana(母液为50μg/μL)和400mg/L carb(母液为 400μg/μL)的MS固体培养基上，于黑暗中进行筛选培养，每7天更换一次培 养基。
③选择生长迅速长至2.0cm～3.0cm的抗性毛状根，将其切下，单独标号转 入50mg/L Kana和400mg/L carb和0.1mg/L IAA (母液为0.1mg/ml)的MS固 体培养基上，IAA可以刺激毛状根长愈伤组织，培养一周左右后，将阳性根转 入含15mg/L Kana和200mg/Lcarb的MS培养基上恢复培养，此时毛根会长出 许多侧根，有益于加快生长。
(5)液体培养：经过一次筛选的阳性毛状根在长至5cm后，移入6-7V液体 培养基中，于25℃黑暗中110rpm振荡进行扩大培养，几周后后取一部分提RNA， 一部分冻存用于后续化学检测；剩余毛状根转入新的6-7V液体培养基中继代， 留存备用。RNA用于检测目的基因及关键酶基因的表达。
2.2结果与分析
过表达载体上携带eGFP增强型荧光蛋白报告基因，阳性毛状根在蓝光下发 出绿光，证明成功转化丹参毛状根。
实施例3SmNAC36转基因株系关键酶基因表达和丹参酮含量变化情况
3.1实验方法
3.1.1关键酶基因表达量变化检测
取液体培养一个月的毛根用于提RNA，方法如下：
(1)每次微量提取一般需要50-100mg丹参毛根，采用液氮研磨法将植物在液 氮中迅速研磨成粉末，用离心管估算装取50-100mg样品后加入1000μL细胞裂 解液A，放置于涡旋振荡器振30s其充分裂解。
(2)将上步所得混合物中的液体成分取1mL转移至净的1.5mL离心管
(3)在离心管中加入300μL的去蛋白液B和200μL WB溶液(如试剂盒中没 有该成分请用氯仿替代)，置于涡旋振荡器振30s其充分混匀，此时溶液呈均匀 的乳浊状。振荡器振荡时必须使管底溶液震荡起来，震荡后室温静置2min。
(4)室温12000rpm离心8分钟，将上清液(不超过700μL)转移到另一个干 净的1.5mL塑料离心管中，下层有机相和中间层含有DNA、蛋白质和其他杂质， 避免触及或吸取，容易造成污染。最好留下100μL上清液不取。
(5)加入等体积的漂洗液C，充分颠倒混匀(此时如有沉淀，属于正常现象， 不能丢弃沉淀，务必将沉淀混合物一起上柱)再将所得混合物分两次(每次体 积不超过700μL)加入同一个离心吸附柱中，每次加入吸附柱后都12000rpm室 温离心1分钟，倒掉收集管中的废液。
(6)向吸附柱加500μL洗柱液D，12000rpm室温离心1分钟，倒掉收集管中 的废液。再向吸附柱加入500μL洗柱液D，重复一遍。再室温12000rpm离心1 分钟以便去除残留的液体(此步非常重要)。
(7)膜上消化DNA
①将5μL的RNase-freeDNase I加入到45uLDNasebuffer中混匀(务必在离心 管中混匀)配成DNA消化液，预热消化液37℃，1分钟，加入到离心吸附柱中 室温(20-30℃)放置5分钟。
②直接在离心级附柱中加500μL的去酶液E，盖上盖后颠倒混匀数次。室温12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液。加入新的500μL去酶液E重复此 步骤一次。
③室温12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中废液，将吸附柱于室温两分钟， 以彻底晾干吸附柱中的无水乙醇，防止残留乙醇影响后续类似酶切，PCR等反 应。
(8)RNA洗脱：将离心吸附柱转移到RNase-free l.5ml离心收集管中，加入 50μLRNA洗脱液，室温放置5分钟。12000rpm室温离心1分钟，离心管中溶液 即为RNA。
接下来用TaKaRA PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(PerfectReal Time)反转录试剂盒进行反转录，体系以及程序如表7
表7：反转录体系以及程序
配好以上体系后42℃2min反应
配好以上体系后37℃15min反应，接着85℃5S反应，保存于-20℃供 qRT-PCR实验使用。
以上述反转录的cDNA为模板，进行qRT-PCR荧光定量实验，体系如表8， 程序如表9。
表8：qRT-PCR体系
表9：qRT-PCR程序
3.1.2丹参酮含量变化检测
取培养4个月的毛根用于化合物检测，步骤如下：
样品处理及上样：取丹参毛状根40℃烘干后称重，使用研钵磨粉，取10mg 毛状根用1mL(色谱级甲醇加内标(伞形内酯0.005mg/mL))提取，提取物超 声处理(功率140W，频率42kHz)30min，放冷，12000g离心10min，将上清 过滤至进样瓶中；上样时分别精密吸取混合液后的标准品溶液与样品溶液各 10μL，注入液相色谱仪，测定。
以上所得样品分别进样，LC-MS；流动相：乙腈(A)，0.1％乙酸溶液(B)： 梯度洗脱条件为0min，95％A，1min，95％A，8min，0％A，10min，0％A，10.5min，95％A；柱温：25℃；流速每分钟0.4mL；正离子模式；进样体积2μL。
3.2结果与分析
结果见图5，发明人发现过表达SmNAC36株系(36oe4，36oe5，36oe6)， 跟对照株系(pkoe3，pkoe4，pkoe5)相比，关键酶基因表达量有提高，提示可 能通过SmNAC36结合这些关键酶基因(CYP76AH1、CYP76AH3、KSL1、CPS1、 CYP76AK1、GGPPS1、IDI、HDR1)来调节丹参酮含量变化。进一步检测丹参 酮类化合物含量(图4和6)可知，转基因毛根(36oe)与对照(pkoe)相比， 毛根表型和毛根提取液明显更红，丹参酮IIB，丹参新酮，柳杉酚三种化合物含 量有一定提高，证明该基因对丹参酮类化合物合成起到正向调控作用。
实施例4SmNAC36转录因子亚细胞定位分析
4.1实验方法
构建35S:PBI221-GFP-SmNAC36载体，将35S:PBI221-GFP-SmNAC36与 对照35S:PBI221-GFP分别瞬时转化到拟南芥的叶片下表皮细胞，步骤如下：
(1)选择生长三周左右，叶片舒展，没有抽苔的拟南芥制备原生质体
(2)配制酶解液，胶带剥离叶片下表皮，剥离面朝下浸入酶解液中。(5mL 一个培养皿，酶解大概20片叶片，以覆盖培养皿为准，大概可以做15个200μL 体系的转染)。(将上述溶液放置在55℃烘箱约5-10min溶解的酶解液为透明淡 棕色。拿出烘箱恢复至室温后，加入两种成分1M CaCl2，10％BSA)
(3)置于摇床平台上避光低速(40rpm)摇40-80min。
(4)用剪过的1mL枪头将酶解液吸入圆底离心管中，100-200g离心3min(室 温)底部会有深绿色沉淀，轻轻倒去上清。
(5)沿着管壁加入10-20mL的W5溶液，轻轻摇晃将沉淀悬起来，100-200g 离心3min，轻轻倒去上清，再重复一次。
(6)加入5-10mL的W5，冰浴30min以上。
(7)用移液枪将W5吸出来，加入1mL mmg溶液，轻轻混匀去显微镜下观 察细胞状态。
(8)在2mL离心管中加入20-30ug质粒，体积约为20μL(单转10μL).
(9)用剪过的枪头加入200μL(单转100μL)的原生质体溶液，再加入220μL (单转110μL)的PEG4000(不要贴着管壁加)，轻轻晃匀，然后避光静置10min。
(10)加入880μLW5溶液(单转990μL)，100-200g离心2min，吸取上清。
(11)加入1mL的W5溶液(贴着管壁加)，100-200g离心2min，吸取上清。
(12)加入1mL的W5溶液(贴着管壁加)，轻轻晃匀，横至于26℃培养箱 培养16h-(从孵育时间开始算，到孵育完在显微镜下观察到定位位子不能超过 72h。)
注：MES PH＝5.7(用KOH调节PH值，不能调至碱性再用酸调回，只能慢 慢加KOH，开始可以直接加KOH固体调节)
4.2结果与分析
结果见图7，激光共聚焦观察发现对照组(图7A)的荧光充满整个表皮细 胞，包括细胞质、细胞核，而转化35S:PBI221-GFP-SmNAC36(图7B中为35S: NAC36-GFP)的荧光只集中在细胞核内。此外，在明场下观察到细胞中叶绿体 的分布区域，叶绿体和荧光视角整合后，SmNAC36荧光与叶绿体未重合，说 明SmNAC36是一个核定位蛋白。
实施例5转录激活分析实验
5.1实验方法
为了验证SmNAC36是否具有转录活性，我们将该基因全长构建到pGBKT7 载体上，转化酵母菌株AH109。以空载pGBKT7作为阴性对照，以 pGBKT7-ANAC096重组载体作为阳性对照。转化以及显色具体步骤如下：
(1)将-80℃保存的酵母菌AH109菌种在YPDA固体培养基上划线，30℃培 养至生长出单菌落。
(2)挑取单菌落接种于10mL的YPDA液体培养基中，30℃250rpm过夜 摇菌；
(3)次日早上检测OD600值，当其达到1.6-1.8之间时，按1:50的比例转接 于100mLYPDA液体培养基中，30℃250rpm摇菌3-5h。
(4)当菌液OD600达到1.0-1.1之间时，3,000rpm离心5min收集菌体，弃 上清，用1/2体积(25mL)无菌ddH2O悬浮。
(5)3,000rpm离心5min，弃上清，用无菌ddH2O悬浮(体积＝100μL×要 转化质粒的个数)；
AH109酵母感受态细胞的转化,步骤如下
①100μL分装到1.5mL管中，然后按以下顺序及体积加入表10中的溶液：
表10：溶液
②加完之后，混匀，30℃金属浴30min，而后42℃热激25min，再在冰上 放置5min，7,000g离心15s，收集菌体，弃上清，加入200μL ddH2O重悬菌 体。涂布SD/-Trp-His二缺固体培养基，每板100μL，最后置于30℃培养箱中 生长2d。
③酵母克隆滤纸显色分析
将在SD/-Trp-His二缺培养基上生长的酵母菌在新的二缺平板上划线，每个 克隆划三道，30℃培养3-4d。准备显色液(Z-缓冲液，X-gal溶液β-巯基乙醇)， 取2mL显色液加入灭菌的培养皿中，放入无菌滤纸浸润，取另一张滤纸覆盖与 二缺培养基上生长的酵母克隆，用涂布器小心赶出气泡，使滤纸尽可能地与酵 母接触。用一根针在滤纸上刺个小孔以标记菌落位置，轻轻取出滤纸，置于液 氮中10s，夹出滤纸，室温解冻，克隆朝上放置于预先浸润的滤纸上，轻按使滤 纸之间不要有气泡。30℃生长箱中放置，观察显色情况，根据之前所做的标记 确定显色菌落。
5.2结果与分析
结果见图8，区域1是阳性对照的结果，区域2是pGBKT7-SmNAC36/AH109 的显色结果，区域3是阴性对照结果；只有pGBKT7-SmNAC36酵母转化子和 阳性对照能在二缺培养基SD-Trp/His正常生长，且在加有X-Gal的二缺培养基 上被染上蓝色，说明SmNAC36具有转录激活活性。
实施例6酵母单杂交验证SmNAC36与启动子CYPNAC2位点的结合
6.1材料与方法
为验证SmNAC36与靶基因启动子的结合，把该基因全长构建到酵母单杂 交表达载体PB42AD上，得到重组载体PB42AD-SmNAC36；分析CYPNAC2 启动子发现在其ATG上游有一个NAC结合元件，将含有该元件的CYPNAC2 启动子片段构建到酵母单杂载体pLacZ-2u上，形成重组载体 pLacZ-2u-CYPNAC2，两个重组载体共同转入酵母感受态细胞EGY48中，如果SmNAC36能够结合CYPNAC2元件，则酵母转化子显蓝色。具体步骤如下：
(1)将EYG480.4酵母菌种在YPDA平板上划出单菌落；
(2)接种单菌落于YPDA液体培养基中小摇过夜，第二天按1:50转接后摇至 OD600为0.4左右，700g，室温离心5min，去离子水重悬细胞；
(3)700g，室温离心5min，加适量1.1×TE/LiAC，转移至1.5mL离心管；
(4)高速离心15sec(6000rpm 1min)，去上清后加1.1×TE/LiAC，每个质粒 100μL；
(5)质粒各加5μL混合，加入5μL鲑鱼精DNA(提前100度煮沸10min， 迅速放冰上5min)；
(6)然后加入感受态细胞，轻轻混匀；
(7)每管加500μL PEG/LiAC，轻轻混匀；
(8)30℃，30min，每10min轻摇一次；
(9)加20μL DMSO，42℃15min，每5min摇匀一次；
(10)高速离心15sec(6000rpm 1min)，去上清，加YPDA液体，30o C， 100rpm 1h，高速离心15sec(6000rpm 1min)，去上清，加0.9％NaCl 1mL重 悬菌体。高速离心15sec(6000rpm 1min)，用100μL 0.9％NaCl再重悬菌体， 涂布于二缺平板上；
(11)挑单菌落置于二缺液体培养基中，摇菌12h左右，取50μL在二缺板上 划线，PCR鉴定；
(12)挑菌落到显色板上(显色板需再涂一层X-gal)，过夜显色。
其中用到的试剂配方如表11：
表11：酵母单杂交实验中试剂配方
5.2结果与分析
结果见图9，在SD-Ura/Trp培养基上，各个转化子都能正常生长，但是两 个阴性对照(PB42AD-pLacZ-2u-CYPNAC2和PB42AD-NAC36-pLacZ-2u)没有显 蓝斑，而同时转入了带有基因和启动子的酵母显色蓝斑(PB42AD-NAC36 pLacZ-2u-CYPNAC2)说明SmNAC36能够特异的结合到NAC元件上，并激活 下游报告基因的表达。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细， 但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的 普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改 进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权 利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州中医药大学中药学院
<120> 一种丹参转录因子SmNAC36基因及其应用
<130> 7.20
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atggaagtgg aaaacatgag c 21
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人共序列
<400> 2
ttaataacga ttagaataga agg 23
Claims (8)
1.一种丹参转录因子SmNAC36基因，其特征在于，所述SmNAC36基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示；或在如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的基础上经替换、缺失或添加一个或多个碱基而得到的具有SmNAC36功能的核苷酸序列。
2.一种丹参转录因子SmNAC36蛋白，其特征在于，所述SmNAC36蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.2所示；或在如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的基础上经替换、缺失或添加一个或多个碱基而得到的具有SmNAC36功能的氨基酸序列。
3.一种提高丹参毛根中丹参酮含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)根据丹参的全基因组序列筛选出SmNAC36转录因子基因，并检测其在丹参的各个组织器官的表达量；所述SmNAC36转录因子基因序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)采用基因克隆方法获得丹参SmNAC36转录因子基因，并将其插入植物表达载体获得SmNAC36基因的过表达载体；
(3)构建亚细胞定位载体，瞬时转化拟南芥叶片，分析丹参SmNAC36转录因子在细胞中的定位；
(4)构建真核表达载体转化酵母，检测丹参SmNAC36转录因子与CYPNAC2启动子的结合能力，所述SmNAC36转录因子通过特异性结合到NAC元件上，激活下游目的基因的表达；
(5)将步骤(2)中的植物过表达载体转入农杆菌获得转染重组农杆菌，并瞬时转化浸染丹参外植体，筛选获得具有阳性转化丹参毛状根；
(6)通过检测转化的阳性毛状根中丹参酮的含量，筛选出丹参酮产量提高的株系。
4.如权利要求3所述的提高丹参毛根中丹参酮含量的方法，其特征在于，所述步骤(2)中基因克隆方法采用的引物序列为如SEQ ID NO.3所示和如SEQ ID NO.4所示。
5.如权利要求3所述的提高丹参毛根中丹参酮含量的方法，其特征在于，所述步骤(2)中构建的植物表达载体为pK7WG2D-SmNAC36。
6.如权利要求3所述的提高丹参毛根中丹参酮含量的方法，其特征在于，所述步骤(3)中构建的亚细胞定位载体为35S:PBI221-GFP-SmNAC36。
7.如权利要求3所述的提高丹参毛根中丹参酮含量的方法，其特征在于，所述步骤(4)中构建的真核表达载体为PB42AD-SmNAC36和pLacZ-2u-CYPNAC2。
8.丹参转录因子SmNAC36基因在提高丹参酮含量的方法中的应用。
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