CN102250903A - 水稻miR166在提高植物干旱胁迫耐受性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻miR166在提高植物干旱胁迫耐受性中的应用，所述水稻miR166的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过将该水稻miR166转化到水稻愈伤组织，将获得的T2代水稻培养在水稻培养液(PEG 6000浓度为12％)中，发现该miRNA可以提高对干旱胁迫的耐受性，缓解干旱胁迫对它的毒害。

Description

水稻miR166在提高植物干旱胁迫耐受性中的应用

技术领域

本发明涉及功能基因组学领域，尤其涉及一种水稻miRNA166在提高植物干旱胁迫耐受性中的应用。

背景技术

干旱是全球作物生产的主要限制因素，而且干旱面积分布极不均匀。据统计，世界上干旱半干旱地区约占土地面积的36％，占耕地面积的42.9％。我国干旱、半干旱和亚湿润干旱区面积达331.7万平方米，占国土总面积的34.6％。干旱作为常见的严重影响植物生长的胁迫因素，对农作物造成的损失在所有的环境胁迫中占首位，仅次于生物胁迫病虫害造成的损失。干旱胁迫首先导致植物细胞膜透性的改变、引发膜脂的过氧化作用，并打破细胞内活性氧(ROS)的产生和清除之间的动态平衡，诱导氧化胁迫等。干旱胁迫下，植物基因表达发生变化，关闭一些正常表达的基因，启动干旱胁迫应答基因，产生大量的特异蛋白，独立或协同调节植物的耐旱性。目前，植物干旱胁迫响应基因已被大量挖掘，这些基因大致可分为两类：一类编码调控蛋白因子，比如锌指蛋白、SOS2类似蛋白激酶PKS5、转录因子bHLH、DREB1A、DREB2A、HD-Zip以及生长因子类似蛋白RAP2等；另一类编码功能蛋白，如LEA蛋白、脱毒酶、渗透保护合成酶等。这些胁迫诱导基因及相关转录因子，协同或各自独立地组成植物的基因调控网络，调节植物生理生化以及代谢的变化，从而适应外部逆境，提高植物对干旱的耐受性。

随着拟南芥、水稻等植物基因组测序的完成，植物基因的研究已经进入了功能基因组时代，干旱胁迫响应基因表达调控网络的研究日益成为分子生物学和作物抗旱基因工程研究的前沿。并且随着众多内源小RNA的不断发现及其功能的研究，人们逐渐认识到基因转录后水平的调节在植物干旱等逆境胁迫响应过程中也起着非常重要的作用，尤其是内源小RNA对基因转录后水平的调节。微RNA(microRNA，或miRNA)就是一类在转录后水平调控基因表达的内源小RNA分子。miRNA广泛存在于植物基因组中，长度约为22个核苷酸，它自从被发现以来就成为生命科学领域的研究热点。miRNA作为新型的调控基因表达的小分子RNA，主要在转录后水平上通过介导靶mRNA分子的切割或翻译抑制来调节植物基因的表达，从而调控植物器官的形态建成、生长发育、激素分泌与信号转导以及植物对外界环境胁迫因素的应答等过程。

近年来，人们通过构建小RNA文库、表达序列标签(EST)分析、miRNA基因芯片、高通量测序、miRNA过表达等方法，发现miRNA可受干旱胁迫诱导产生，并在植物抗干旱胁迫中发挥着重要的作用。Sunkar和Zhu(2004)通过构建拟南芥幼苗的干旱、盐、冷害、ABA胁迫的小RNA文库，新发现了26种miRNA，它们受到胁迫调控表达：Northern杂交结果显示拟南芥幼苗(2周)在干旱胁迫和ABA处理后，miR393、miR397b和miR402的表达升高，miR389a.1表达下降(Sunkar R and Zhu JK.Noveland stress-regulated microRNAs and other small RNAs from Arabidopsis.Plant Cell，2004，16：001-2019)。miRNA芯片结果表明，拟南芥和水稻中均有多个miRNA受到干旱调控(Liu HH，Tian X，Li YJ，Wu CAand ZhengCC.Microarray-based analysis of stress-regulated microRNAs in Arabidopsisthaliana.RNA，2008，14：836-843；Zhou LG，Liu YH，Liu ZC，Kong DY，Duan M and Luo LJ.Genome-wide identification and analysis ofdrought-responsive microRNAs in Oryza sativa.Journal of ExperimentalBotany，2010，61：4157-4168)。如拟南芥中的miR393和miR396在干旱诱导下表达上调。miR393的靶基因是是生长素受体TIR，推测它通过影响生长素效应发挥干旱耐受作用；miR396的靶基因是生长调控因子GFL，它通过影响叶片发育、减少叶片及气孔密度，从而发挥耐干旱作用。金由辛课题组在2007年研究发现水稻中的miR169g可受干旱诱导，且水稻根部的miR169g比茎部的miR169g表达量更高，合成更迅速，显示miR169g在水稻根的抗干旱胁迫反应中具有重要作用(Zhao B，Liang R，Ge L，Li W，Xiao H，Lin H，Ruan K，Jin Y.Identification of drought-induced microRNAs inrice Biochemical and Biophysical Research Communications，2007，354：585-590)。另外，朱健康课题组在2008年研究发现拟南芥miR169被干旱胁迫抑制表达，它的靶基因是核转录因子Y亚基(NFYA5)。干旱胁迫下拟南芥通过ABA途径下调miR169水平，引起靶基因NYF5转录因子表达量的上调，进而影响下游干旱胁迫相关基因的表达。miR169过表达以及nfya5敲除突变体植株，较野生植物都表现出叶易失水和抗干旱能力减弱的特点，相反，NFY5过量表达的转基因拟南芥通过减少叶片水分丧失而表现出更强的干旱抗性(Li WX，Oono Y，Zhu J，He XJ，Wu JM，Iida K，Lu XY，Cui X，Jin H，Zhu JK.2008.The Arabidopsis NFYA5 transcriptionfactor is regulated transcriptionally and posttranscriptionally to promotedrought resistance.The Plant Cell 20，2238-2251)。这些结果表明，miRNA对干旱胁迫耐受性的功能研究，并通过小RNA的遗传操作改良禾本科作物的抗逆性，将为解决作物的耐旱性问题提供新思路，并具有重要的应用前景。利用小RNA技术改良植物对生物与非生物胁迫的耐性成为了一个重要的技术手段。目前，国内外还没有利用基因工程手段将干旱胁迫相关的miRNA导入水稻、玉米、草莓、烟草等作物获得干旱胁迫耐受作物株系，但通过小分子RNA的遗传操作改良作物的抗逆性的前景很光明。

miR166是一种广泛存在于单子叶植物和双子叶植物中的miRNA。在植物众多miRNA中，研究表明miR166通过调节其靶基因：同源异型域一亮氨酸拉链蛋白(homeodomain-leucine zipper protein，HD-Zip)，从而调控拟南芥和水稻的叶、花、根的生长发育，并且在植物对逆境胁迫的响应过程中发挥着重要作用。过量表达miR166会造成拟南芥植株生长受抑，花器官簇生，顶端分生组织发育异常等表型。蒺藜苜蓿中过量表达miR166会造成植株根瘤和侧根数目减少，维管系统发育异常。受干旱诱导表达的miR166通过影响根的数量和维管组织，从而来调节植物的抗干旱能力。在缺水胁迫下蒺藜苜蓿根中miR166表达上调，且野生型蒺藜苜蓿在缺水胁迫下的表型与过表达miR166的转基因的植株表型相似。干旱胁迫下野生二粒小麦和大麦根中的miR166均表达下调，可能存在其他的未鉴定的靶基因。盐胁迫下玉米的miR166表达下调。水稻miR166还与冷胁迫和赤霉素处理有关。以上研究结果表明，miR166不仅可以调节叶、花、根的发育，并且在植物应答多种环境胁迫中发挥作用。

发明内容

本发明提供了一种水稻miR166在提高植物干旱胁迫耐受性中的应用。

一种水稻miR166在提高植物干旱胁迫耐受性中的应用，所述水稻miR166的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，所述植物为水稻。

具体方法为：将包含所述水稻miR166的前体基因连接到载体上，通过农杆菌介导转化到水稻愈伤组织，筛选培养，获得水稻转基因株系。

由于miR166本身序列很短，只有20几个bp，而前体序列相对较长，连接到载体上，有利于转化实现，优选的，所述前体基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明通过将水稻miR166转化到水稻愈伤组织，将获得的T2代水稻培养在水稻培养液(PEG 6000浓度为12％)中，发现该miRNA可以提高对干旱胁迫的耐受性，缓解干旱胁迫对它的毒害。

附图说明

图1为7天龄水稻幼苗60uM Cd胁迫6h根的miRNA芯片图谱，(Cy3对照；Cy5处理样品)；

图2为7天龄水稻幼苗60uM Cd处理3，6，12，24h后，miR166m及其靶基因HD-Zip的表达分析；

图3为miR166m过表达载体构建的过程凝胶图谱。a.miR166m前体PCR扩增凝胶图谱；b.pMD19-T-miR166m质粒酶切鉴定图；c.p1301-miR166m重组质粒菌液PCR扩增凝胶图谱；d.p1301-miR166m重组质粒酶切鉴定图；

图4为生长五周的miR166m过表达水稻经12％PEG6000处理7d和19d后的表型(WT对照；35S：MIR166m转基因水稻)。

具体实施方式

实施例1 基因的获得

以野生型水稻(中花11)七天苗龄幼苗为材料，取60uM CdCl₂处理6h和对照组(未处理)的根0.1g，用液氮研磨并加入1ml Trizol(Invitrogen生产)继续研磨至匀浆，转入1.5ml离心管中，12000×g离心10min，收集上清至新离心管中。室温放置5min，加入0.2ml氯仿用力震荡15s，使溶液充分混匀。室温放置5min，12000×g离心15min，收集上清。加两倍上清体积的异丙醇，-20℃过夜沉淀。12000×g离心10min，去上清，加1mL预冷的75％乙醇(DEPC-H₂O配制)洗沉淀。12000×g离心10min，倒尽液体，室温干燥5min，沉淀重溶于50μL DEPC(焦碳酸二乙酯)水。取2μg Total RNA进行电泳检测，并稀释样品测OD 260/280，OD 260/230及浓度。利用2-5μg总RNA样品，通过YM-100(Millipore)微离心过滤柱得到片段小于300nt的小RNA。Poly(A)聚合酶在分离到的小RNA 3′端加上poly(A)尾巴，再将一个寡聚核苷酸标记与这个poly(A)尾巴连接，(ligation)用于后续的荧光标记。用两个不同的标记物Cy3和Cy5来标记处理组和对照组的两个RNA样品。

利用 Version    11.0 microRNA    数据库，(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)制作μParafloTM微流体芯片探针。杂交反应通过利用μParafloTM微流体芯片，检测在60uM CdCl₂胁迫下水稻根中miRNA的表达差异，如图1所示，结果发现miR166m在Cd处理6h后表达量比对照(未处理)下降2倍以上。

根据Sanger microRNA数据库(miRBase)和TIGR数据库，发现miR166m是水稻miR166家族成员之一，位于8号染色体，来源于基因间区域。成熟序列如SEQ ID NO.1所示，前体序列如SEQ ID NO.2所示。

根据miRU靶基因预测软件发现，miR166m的靶基因是同源异型域一亮氨酸拉链蛋白(homeodomain-leucine zipper protein，HD-Zip)。根据NCBI和TIGR数据库查询，HD-Zip基因号为Os03g43930，mRNA长度为3081bp，CSD为2589bp，基因编码产物大小166个氨基酸。

以野生型水稻(中花11)七天苗龄幼苗为材料，用60uM CdCl₂处理0，3，6，12，24h，用Trizol法分别提取RNA，并用DNase I消化以去除DNA污染。采用PrimeScriptTM RT reagent kit(Takara，Japan)合成cDNA。miR166m利用具有茎环结构的RT引物进行反转录(RT引物序列：5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACAGGGAA3-’)；HD-Zip利用oligo-d(T)进行反转录。采用SYBRPremix Ex TaqTM(Takara，Japan)，在LightCycler480(Roche，Shanghai，China)荧光定量PCR仪上扩增miR166m和HD-Zip，PCR反应条件为95℃1min，变性95℃10s，退火58℃15s，延伸72℃15s，45个循环。PCR引物如下：

miR166m-F，5’-GTCGGACCAGGCTTCA-3’

miR166m-R，5’-TGCGTGTCGTGGAGTC-3′

HD-Zip-F，5’-ATGTCAAGAACCTCCCCAG-3’

HD-Zip-R，5’-CACACGCAAAAATCACTCA-3’

如图2所示，实时定量PCR实验结果验证了miR166m对HD-Zip的负调控。

实施例2 基因克隆与转化

以野生型水稻中花11七天苗龄幼苗DNA为模板，利用PCR方法扩增到miR166m前体基因的序列。具体操作如下：首先，提取野生型水稻中花11七天龄幼苗DNA。取约0.2g水稻叶片用液氮研磨成粉末，转移粉末到加有500μl提取液(100mM Tris-HCl，pH 8.0；20mM EDTA；500mM NaCl)的离心管中，轻轻混匀。向管中加入100μl 10％SDS溶液，混匀，65℃保温20min。然后加氯仿/异戊醇/乙醇(20∶1∶4)混合液600μl，室温静止10min。4℃，12000rpm离心10min，转移上清至另一离心管中。加入1ml预冷的无水乙醇充分混匀，-20℃沉淀DNA 20min。4℃，12000rpm离心10min，弃上清，加70％乙醇500μl进行洗涤。4℃，12000rpm离心10min，弃上清。轻微离心，用移液器将残留液体吸干。吹干DNA沉淀后，溶于100μl含RNase酶(10μg/ml)TE中，37℃水浴30min，-20℃保存。根据已知的miR166m  前体序列(http://www.mirbase.org/cgi-bin/get_seq.pl)，在database中查阅其所在基因组位点的两端的序列，分别在前体发夹结构两端约50bp处设计引物，所设引物如下：

miR166m-F，5’-CGGGGTACCCTTTCTCTGCTTTGGTGGTT-3’

miR166m-R，5′-AACTGCAGTTCCGATGGATTTCCTGGAC-3′

接着以DNA为摸板，利用所设引物扩增miR166m前体基因。PCR反应体系为20μl，依次加入DNA模板1μl、10×PCR buffer 2μl、10mMdNTPs 2μl、10μM正向引物(miR166m-F)0.5μl、10μM反向引物(miR166m-R)0.5μl、TaKaRa Taq(5U/μl)聚合酶0.2μl，最后加ddH₂O补至20μl。PCR反应条件：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火58℃30s，延伸72℃30s，30个循环，最后延伸72℃10min，4℃保存。PCR产物凝胶图谱如图3.a所示。

扩增后将miR166m前体基因DNA产物，利用天根生化科技(北京)有限公司生产的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收，操作如下：将DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入1.5ml的Eppendorf管中，称取重量。加入6倍体积溶胶液PN，50℃水浴放置30min。将溶胶液加入吸附柱CA2中，室温放置2min，12000rpm离心60s，倒掉收集管中的废液。加入600μl漂洗液PW，12000rpm离心60s，倒掉收集管中的废液。12000rpm离心2min，室温放置数分钟彻底晾干。将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，加入40μl洗脱缓冲液EB，12000rpm离心2min收集DNA溶液。

将回收的miR166m前体基因DNA与pMD19-T载体(TakaRa)进行连接反应，连接体系10μl，分别加入0.5μl pMD19-T载体、4.5μl纯化的miR166m前体的DNA、5μl Solution I。16℃下连接3h后将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。通过Amp筛选，挑取阳性克隆，经PCR反应验证及测序鉴定正确后，选取正确的菌液提取质粒pMD19-miR166m。利用天根公司生产的普通质粒小提试剂盒提取质粒操作如下：

取3ml菌液加入离心管中，12000rpm离心1min，尽量吸出上清液。向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl的溶液P1(含RNaseA)，彻底悬浮细菌沉淀。加入250μl溶液P2，温和的上下翻转使菌体充分裂解。加入350μl溶液P3，立即温和的上下翻转充分混匀，12000rpm离心10min。收集上清液，转移到吸附柱CP3中，12000rpm离心60s，倒掉废液。加入600μl已加入无水乙醇的漂洗液PW，12000rpm离心60s，倒掉废液并漂洗两次。将吸附柱CP3放入收集管，12000rpm离心2min，置于室温彻底晾干。加入55μl洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm离心1min，将质粒溶液收集到离心管中。

将提取的质粒pMD19-miR166m和DNA双元质粒载体pCAMBIA1301同时都用TakaRa公司生产的KpnI和PstI进行双酶切。酶切体系50μl，包括5μl 10×M buffer、30μl pMD19-miR166m质粒(或pCAMBIA1301质粒)、1μl KpnI、1μl PstI和13μl ddH₂O，37℃水浴过夜。pMD19-miR166m质粒酶切结果如图3.b所示。将DNA双元质粒载体pCAMBIA1301和克隆质粒pMD19-miR166m酶切后，割胶回收DNA片段。接着用T4连接酶连接，连接体系10μl，包括1μl pCAMBIA1301载体、7.5μl miR166m DNA、1μl 10×T4连接酶buffer和0.5μl T4连接酶，16℃连接过夜。然后将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，进行菌液PCR，并提取质粒进行酶切鉴定，结果如图3.c和图3.d所示。将正确的植物表达载体p1301-miR166m导入农杆菌感受态细胞EHA105，操作如下：取200μl农杆菌感受态细胞，加入1μg p1301-miR166m质粒，混匀，冰浴5min，液氮中速冻5min，37℃水浴5min，然后加入1ml YM培养基28℃恢复培养4h。10000g离心30s，弃上清，吸200μl菌液涂布于含有50mg/L卡那霉素和40μg/l利福平的YM平板，28℃培养，约48h后长出农杆菌单菌落。摇菌，提取农杆菌质粒DNA重新转入大肠杆菌DH5α中，再提取质粒进行酶切鉴定。

经鉴定正确的阳性质粒p1301-miR166m，通过农杆菌介导法转化到水稻愈伤。操作如下：首先活化农杆菌，在含50mg/L卡那霉素和40mg/L利福平的YM培养基上划线，28℃暗培养。收集农杆菌菌体，将其悬浮于含有200μM已酰丁香酮(As)的AAM液体悬浮培养基中。调整菌体浓度至OD600为0.8～1.0，倒入含继代培养1周的水稻愈伤组织的无菌三角瓶，侵染10min，并不时晃动。然后将愈伤组织置于无菌的滤纸上沥干30min后，置于铺有一层无菌滤纸的固体共培养培养基上，25℃暗培养3天。将共培养后的愈伤组织用无菌水清洗5-6次，再用含500mg/L头孢拉定的无菌水清洗1～2遍，置于无菌滤纸上沥干1小时。将晾干的愈伤转入含500mg/L头孢拉定和50mg/L潮霉素的选择培养基上进行第一轮选择，28℃，暗培养14天。然后将长有抗性愈伤的初始愈伤转到新的含500mg/L头孢拉定和50mg/L潮霉素的培养基上进行第二轮选择，28℃，光照培养，直到颗粒性的抗性愈伤组织长出。选择生长旺盛的抗性愈伤组织转移到含有潮霉素的分化培养基上，于25℃，12h光照/12h黑暗条件下培养。待再生小苗长成约1cm高时，将其移到生根培养基上壮苗，25℃，12h光照/12h黑暗条件下培养。最后将转基因苗挑出，加入适量蒸馏水炼苗3天至一周左右，洗去琼脂，培养箱水培1周，移栽到温室的土钵中生长。挑选生长正常的植株，进行潮霉素PCR筛选和GUS染色，获得阳性T0代植株，共16个株系。收获T1代种子繁种并鉴定至T2代，获得纯合的转基因株系。

实施例3 miRNA干旱胁迫耐性功能鉴定

取T2代转基因株系种子和中花11野生型的种子，1％稀HNO₃破休眠处理16h。倒去稀HNO₃，10％NaClO(有效氯约1～1.2％)消毒20min后用蒸馏水冲洗。将种子浸泡在水中，37℃暗处催芽约两天，再在铺有湿润滤纸的培养皿中培养一天。挑选生长一致的露白的转基因株系和野生型的种子播于网格上，放入盛有水稻营养液(按国际水稻所标准营养液配方进行配制)的桶中，置于水稻培养箱中(白天/黑夜：26℃/22℃，13h/11h；Rh 80％)培养，营养液每5天换一次。将转基因株系和野生型水稻在正常的营养液中培养五周后，挑选生长一致的水稻植株置于水稻营养液(PEG6000浓度为12％)，处理7d和19d后，观察转基因株系与野生型大苗在干旱胁迫下的表型。如图4所示，结果发现在PEG 600012％模拟的干旱胁迫后7d和19d下，miR166m过表达的转基因幼苗相比野生型幼苗，苗更加健壮，叶片的萎蔫程度更低，说明miR166m超量表达株系对干旱胁迫具有一定的耐受作用。

Claims (4)

1.一种水稻miR166在提高植物干旱胁迫耐受性中的应用，所述水稻miR166的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物为水稻。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括：将包含所述水稻miR166的前体基因连接到载体上，通过农杆菌介导转化到水稻愈伤组织，筛选，培养，获得水稻转基因株系。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述前体基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

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