CN102250901B - 水稻miR192在增加植物镉胁迫敏感性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻miR192在增加植物镉胁迫敏感性中的应用，所述miR192的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过将水稻miR192转化到水稻愈伤组织，获得的T2代种子播种在含镉培养液中，发现miR192超量表达增加了对镉的敏感性。

Description

水稻miR192在增加植物镉胁迫敏感性中的应用

技术领域

本发明涉及功能基因组学领域，尤其涉及一种水稻miR192在增加植物镉胁迫敏感性中的应用。

背景技术

近年来，我国重金属(镉、砷、汞等)引起的土壤污染形势已相当严峻。2006年全国受重金属污染的耕地约有1.5亿亩；全国每年受重金属污染的粮食达1200万吨，造成的直接经济损失超过200亿元；在未来的中国农产品安全问题中，重金属污染将取代农药，成为主要的公共卫生问题。水稻是世界上最重要的农作物，全球一半以上的人口以稻米为主食，我国是世界上第一种稻大国，目前我国稻米中重金属超标现象已引起了国家各部委的高度重视。重金属一旦进入土壤-水稻系统中就很难排除。过量的重金属在水稻的根、茎、叶以及籽粒中积累，不仅影响水稻的产量和农田生态系统，并可通过食物链进入人体，引发各种疾病，最终危害人体健康。因此，探明水稻对重金属吸收、转运规律及重金属耐性的生理和分子机理，在轻度重金属污染的土壤中进行农作物的安全生产，并利用植物进行大规模污染土壤的修复，将对保障农产品安全和生态安全，促进农业生产的可持续发展意义重大。

植物重金属毒害是多方面的，其对重金属的抗性机制也十分复杂，包括植物限制重金属离子吸收，重金属与体外分泌物结合，重金属的外排，根系富集，细胞壁束缚，跨质膜、液泡膜转运，抗氧化响应等。其中，有机酸、氨基酸、含氮化合物，植物螯合肽(Phytochelatin，PC)和金属硫蛋白(MT)等在植物对重金属的解毒作用中发挥了重要功能。一些与植物重金属耐性相关的基因也得到了鉴定与功能的描述，它们基本为直接参与代谢与生理变化的效应基因，通过控制代谢小分子或蛋白的表达参与抗逆过程。一般认为植物的重金属胁迫应答机理可能是由多基因控制的，植物的重金属毒害及其耐受性是多种生理过程的综合反应，但迄今为止其中何为关键因子并不清楚。

微RNA(microRNA，或miRNA)是一种新型的调控基因表达的小分子RNA，主要在转录后水平负调控靶基因的表达。植物中miRNA通过调控其靶基因的表达，广泛参与植物的生长发育、细胞代谢、器官形态建成、激素分泌、信号转导、胁迫应答等过程。近年来的研究表明，miRNA在植物重金属胁迫响应过程中扮演着重要角色。在豆科的模式植物蒺藜苜蓿中，部分miRNA的表达可受重金属镉、汞、铝的诱导与调节(Zhao，S.Z.，Si，Q.H.，Zhi，M.Y.Bioinformatic identification and expression analysis ofnew microRNAs from Medicago truncatula.Biochem.Biophys.Res.Commun，2008，374：538-542.)。在甘蓝型油菜中，miR156、miR171、miR393以及miR396a的表达受到镉的抑制(Xie，F.L.，Huang，S.Q.，Guo，K.，Xiang，A.L.，Zhu，Y.Y.，Nie，L.，Yang，Z.M.Computational identification of novelmicroRNAs and targets in Brassica napus.FEBS Lett，2007，581：1464-1474.)。Huang等(2009)构建镉胁迫下水稻幼苗的small RNA文库，克隆了19个新的miRNA，并发现其中多数miRNA在镉胁迫下表达发生变化。水稻幼苗根中miR604在镉处理下表达下调，其靶基因脂转移蛋白表达上升。而脂转移蛋白参与植物多种抗逆性反应并介导植物激素信号转导等过程(Huang，S.Q.，Peng，J.，Qiu，C.X.，Yang，Z.M.Heavymetal-regulated new microRNAs from rice.J.Inorg.Biochem，2009，103：282e287.)。Kong等(2010)在拟南芥中克隆得到8个与缺铁胁迫相关的miRNA，它们在缺铁条件下均表达上调，并且其中5个MIRNA基因上游的启动子区经预测存在缺铁诱导表达调控元件(IDE1/IDE2)(Kong，W.，Yang，Z.M.Identification of iron-deficiency responsive microRNA genes andcis-elements in Arabidopsis.Plant Physiol.Biochem，2010，48：153e159.)。Sunkar等(2006)研究发现miR398在拟南芥抵抗强光、重金属Cu、Fe等氧化胁迫中发挥作用：在氧化胁迫条件下，miR398的表达量被诱导降低，miR398调控的Cu/Zn超氧化物歧化酶(CSDs)mRNA的表达量升高，Cu/Zn超氧化物歧化酶可快速地将超氧化物转变成过氧化物和分子氧，组成了抵抗高毒性超氧化物的第一道防线，导致拟南芥对重金属胁迫的耐受性也大大增加(Sunkar，R.，Kapoor，A.，Zhu，J.K.Posttranscriptional inductionof two Cu/Zn superoxide dismutase genes in Arab idopsis is mediated bydownregulation of miR398 and important for oxidative stress tolerance.PlantCell，2006，18：2051-2065.)。因此，深入研究植物miRNA在重金属胁迫应答中的功能及其作用机制，将有助于阐明植物对重金属吸收、转运规律及其生理和分子机理，也可为通过小分子RNA的遗传操作改良作物的抗逆性，培育优良重金属可食部分低积累型或者优良重金属超积累型植物，为土壤重金属污染的植物修复技术提供材料。

Lindow等(2007)利用miRNA与靶基因的互补性等特征，预测水稻中可能存在2100条成熟miRNA序列(Lindow M，Jacobsen A，Nygaard S，Mang Y，Krogh A：Intragenomic matching reveals a huge potential formiRNA-mediated regulation in plants.PLoS Comput Biol 2007，3：2379-2390.)。这些miRNA的靶基因及其具体的生物学功能以及是否在水稻重金属胁迫应答中发挥作用并不清楚。因此，对于水稻miRNA的深入研究将有助于我们解答重金属耐性的分子调节机制，提出避免植物重金属毒害和提高植物抗重金属胁迫能力的有效措施。

发明内容

本发明提供了一种水稻miR192在增加植物镉胁迫敏感性中的应用。

一种水稻miR192在增加植物镉胁迫敏感性中的应用，所述miR192的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，所述植物为水稻。

具体方法为：将包含所述水稻miRNA的前体基因连接到载体上，通过农杆菌介导转化到水稻愈伤组织，筛选，培养，获得转基因株系。

由于miRNA本身序列很短，只有20几个bp，而前体序列相对较长，连接到载体上，有利于转化实现，优选的，所述前体基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明通过将水稻miR192转化到水稻愈伤组织，获得的T2代种子播种在含镉培养基中，发现过表达miR192的水稻植株对镉敏感。

附图说明

图1为7天龄水稻幼苗60uM Cd胁迫6h根的miRNA芯片图谱，(Cy3对照；Cy5处理样品)；

图2为7天龄水稻幼苗60μM Cd胁迫下6h根中miR192的RT-PCR图(Control对照；Cd处理样品；tubulin作为内参)；

图3为miR192过表达载体构建的过程凝胶图谱。a.miR192前体PCR扩增凝胶图谱；b.pMD19-T-miR192质粒酶切鉴定图；c.p1301-miR192重组质粒菌液PCR扩增凝胶图谱；d.p1301-miR192重组质粒酶切鉴定图；

图4为miR192过表达水稻种子在60uM Cd处理下萌发7d后表型，(WT对照；35S：MIR192转基因水稻)；

具体实施方式

实施例1  基因的获得

以野生型水稻(中花11)七天苗龄幼苗为材料，取60uM CdCl₂处理6h和对照组(未处理)的根0.1g，用液氮研磨并加入1ml Trizol(Invitrogen生产)继续研磨至匀浆，转入1.5ml离心管中，12000×g离心10min，收集上清至新离心管中。室温放置5min，加入0.2ml氯仿用力震荡15s，使溶液充分混匀。室温放置5min，12000×g离心15min，收集上清。加两倍上清体积的异丙醇，-20℃过夜沉淀。12000×g离心10min，去上清，加1mL预冷的75％乙醇(DEPC-H₂O配制)洗沉淀。12000×g离心10min，倒尽液体，室温干燥5min，沉淀重溶于50μL DEPC(焦碳酸二乙酯)水。取2μg Total RNA进行电泳检测，并稀释样品测OD 260/280，OD 260/230及浓度。利用2-5μg总RNA样品，通过YM-100(Millipore)微离心过滤柱得到片段小于300nt的小RNA。Poly(A)聚合酶在分离到的小RNA 3′端加上poly(A)尾巴，再将一个寡聚核苷酸标记与这个poly(A)尾巴连接，(ligation)用于后续的荧光标记。用两个不同的标记物Cy3和Cy5来标记处理组和对照组的两个RNA样品。

利用Lindow等(2007)预测的2100条miRNA序列以及水稻miRNA数据库(miRBase Release 11.0，http://microrna.sanger.ac.uk)中的miRNA序列，原位合成miRNA芯片，检测生长第七天的水稻在重金属镉胁迫6h根组织中miRNA的表达情况。经60μM镉处理6h后的7天龄水稻幼苗的根，采用Trizol法提取总RNA，提纯miRNA后，荧光标记，与miRNA芯片杂交，经芯片扫描，数据采集分析，寻找表达水平上调或者下调较显著的miRNA。芯片结果显示(图1)，一个来自于Lindow等(2007)预测的miRNA序列(Lindow M，Jacobsen A，Nygaard S，Mang Y，Krogh A：Intragenomic matching reveals a huge potential for miRNA-mediatedregulation in plants.PLoS Comput Biol 2007，3：2379-2390.)，即miR192在Cd处理6h后表达量比对照(未处理)下降2倍以上。

根据TIGR数据库，发现水稻miR192位于1号染色体，来源于基因间区域。成熟序列如SEQ ID NO.1所示，前体序列如SEQ ID NO.2所示。

根据miRU靶基因预测软件发现miR192靶向ATP结合(ABC)转运蛋白。文献报道ATP结合(ABC)转运蛋白是重要的重金属转运体，对重金属耐性发挥重要作用(Clemens，S.Molecular mechanisms of plant metaltolerance and homeostasis.Planta，2001，212：475-486.)。

我们并且采用RT-PCR方法初步验证芯片分离得到的miR192，具体操作如下：

以野生型水稻(中花11)七天苗龄幼苗为材料，取60uM CdCl₂处理6h和对照组(未处理)的根采用Trizol法提取RNA，并用RNase-free DNaseI(TaKara)消化以去除DNA污染。用反转录试剂盒PrimeScript^TM 1^st StrandcDNA Synthesis Kit(Takara)逆转录成cDNA。反应体系为20μl，分别为2μgRNA，1μl Oligo dT Primer(50μM)，1μl dNTP Mixture(10mM)和RNase freeH₂O至10μl，65℃5min，冰上急冷，然后依次加入4μl 5×PrimeScriptBuffer，0.5μl RNase Inhibitor(40U/μl)，1μl PrimeScript RTase(200U/μl)和4.5μl RNase free dH₂O，轻微混合均匀，42℃60min，70℃15min，最后-20℃保存。然后以第一链cDNA为摸板扩增目的基因miR192，所用扩增配对引物：

miR192-F，5’-AGAGACCGTGTCGTTGT-3’，

miR192-R，5’-GGTTTGGATCTTTGGAT-3’，

RT-CPR结果如图2所示，该结果验证了芯片结果，表明miR192在镉胁迫下表达下调。

实施例2  基因克隆与转化

以野生型水稻中花11七天苗龄幼苗DNA为模板，利用PCR方法扩增到miR192前体基因的序列。具体操作如下：首先，提取野生型水稻中花11七天龄幼苗DNA。取约0.2g水稻叶片用液氮研磨成粉末，转移粉末到加有500μl提取液(100mM Tris-HCl，pH 8.0；20mM EDTA；500mMNaCl)的离心管中，轻轻混匀。向管中加入100μl 10％SDS溶液，混匀，65℃保温20min。然后加氯仿/异戊醇/乙醇(20∶1∶4)混合液600μl，室温静止10min。4℃，12000rpm离心10min，转移上清至另一离心管中。加入1ml预冷的无水乙醇充分混匀，-20℃沉淀DNA20min。4℃，12000rpm离心10min，弃上清，加70％乙醇500μl进行洗涤。4℃，12000rpm离心10min，弃上清。轻微离心，用移液器将残留液体吸干。吹干DNA沉淀后，溶于100μl含RNase酶(10μg/ml)TE中，37℃水浴30min，-20℃保存。根据miR192前体序列，在database中查阅其所在基因组位点的两端的序列，分别在前体发夹结构两端约50bp处设计引物，所设引物如下：

miR192-F，5’-CGGGGTACCGGGAGTAAGAGATAAAAGAT-3’

miR192-R，5′-AACTGCAGGCTAATACAAAAGTAGAATT-3′

接着以DNA为摸板，利用所设引物扩增miR192前体基因。PCR反应体系为50μl，依次加入DNA模板1μl、10×PCR buffer 5μl、10mMdNTPs 4μl、10μM正向引物(miR192-F)0.8μl、10μM反向引物(miR192-R)0.8μl、TaKaRa Taq(5U/μl)聚合酶0.5μl，最后加ddH₂O补至50μl。PCR反应条件：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火59℃30s，延伸72℃30s，30个循环，最后延伸72℃10min，4℃保存。PCR产物凝胶图谱如图3.a所示。

扩增后将miR192前体基因DNA产物，利用天根生化科技(北京)有限公司生产的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收，操作如下：将DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入1.5ml的Eppendorf管中，称取重量。加入6倍体积溶胶液PN，50℃水浴放置30min。将溶胶液加入吸附柱CA2中，室温放置2min，12000rpm离心60s，倒掉收集管中的废液。加入600μl漂洗液PW，12000rpm离心60s，倒掉收集管中的废液。12000rpm离心2min，室温放置数分钟彻底晾干。将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，加入40μl洗脱缓冲液EB，12000rpm离心2min收集DNA溶液。

将回收的miR192前体基因DNA与pMD19-T载体(TakaRa)进行连接反应，连接体系10μl，分别加入0.5μl pMD19-T载体、4.5μl纯化的miR192前体的DNA、5μl Solution I。16℃下连接3h后将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。通过Amp筛选，挑取阳性克隆，经PCR反应验证及测序鉴定正确后，选取正确的菌液提取质粒pMD19-miR192。利用天根公司生产的普通质粒小提试剂盒提取质粒操作如下：

取3ml菌液加入离心管中，12000rpm离心1min，尽量吸出上清液。向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl的溶液P1(含RNaseA)，彻底悬浮细菌沉淀。加入250μl溶液P2，温和的上下翻转6-8次使菌体充分裂解。加入350μl溶液P3，立即温和的上下翻转6-8次，充分混匀，12000rpm离心10min。收集上清液，转移到吸附柱CP3中，12000rpm离心60s，倒掉废液。加入600μl已加入无水乙醇的漂洗液PW，12000rpm离心60s，倒掉废液并漂洗两次。将吸附柱CP3放入收集管，12000rpm离心2min，置于室温彻底晾干。加入55μl洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm离心1min，将质粒溶液收集到离心管中。

将提取的质粒pMD19-miR192和DNA双元质粒载体pCAMBIA1301同时都用TakaRa公司生产的KpnI和PstI进行双酶切。酶切体系50μl，包括5μl 10×M buffer、28μl pMD19-miR192质粒(或pCAMBIA1301质粒)、1μl KpnI、1μl PstI和15μl ddH₂O，37℃水浴过夜。pMD19-miR192质粒酶切结果如图3.b所示。将DNA双元质粒载体pCAMBIA1301和克隆质粒pMD19-miR192酶切后，割胶回收DNA片段。接着用T4连接酶连接，连接体系10μl，包括1μl pCAMBIA1301载体、7.5μl miR192DNA、1μl 10×T4连接酶buffer和0.5μl T4连接酶，16℃连接过夜。然后将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，进行菌液PCR，并提取质粒进行酶切鉴定，结果如图3.c和图3.d所示。将正确的植物表达载体p1301-miR192导入农杆菌感受态细胞EHA105，操作如下：取200μl农杆菌感受态细胞，加入1μgp1301-miR192质粒，混匀，冰浴5min，液氮中速冻5min，37℃水浴5min，然后加入1ml YM培养基28℃恢复培养4h。10000g离心30s，弃上清，吸200μl菌液涂布于含有50mg/L卡那霉素和40μg/l利福平的YM平板，28℃培养，约48h后长出农杆菌单菌落。摇菌，提取农杆菌质粒DNA重新转入大肠杆菌DH5α中，再提取质粒进行酶切鉴定。

经鉴定正确的阳性质粒p1301-miR192，通过农杆菌介导法转化到水稻愈伤。操作如下：首先活化农杆菌，在含50mg/L卡那霉素和40mg/L利福平的YM培养基上划线，28℃暗培养。收集农杆菌菌体，将其悬浮于含有200μM己酰丁香酮(As)的AAM液体悬浮培养基中。调整菌体浓度至OD600为0.8～1.0，倒入含继代培养1周的水稻愈伤组织的无菌三角瓶，侵染10min，并不时晃动。然后将愈伤组织置于无菌的滤纸上沥干30min后，置于铺有一层无菌滤纸的固体共培养培养基上，25℃暗培养3天。将共培养后的愈伤组织用无菌水清洗5-6次，再用含500mg/L头孢拉定的无菌水清洗1～2遍，置于无菌滤纸上沥干1h。将晾干的愈伤转入含500mg/L头孢拉定和50mg/L潮霉素的选择培养基上进行第一轮选择，28℃，暗培养14天。然后将长有抗性愈伤的初始愈伤转到新的含500mg/L头孢拉定和50mg/L潮霉素的培养基上进行第二轮选择，28℃，光照培养，直到颗粒性的抗性愈伤组织长出。选择生长旺盛的抗性愈伤组织转移到含有潮霉素的分化培养基上，于25℃，12h光照/12h黑暗条件下培养。待再生小苗长成约1cm高时，将其移到生根培养基上壮苗，25℃，12h光照/12h黑暗条件下培养。最后将转基因苗挑出，加入适量蒸馏水炼苗3天至一周左右，洗去琼脂，培养箱水培1周，移栽到温室的土钵中生长。挑选生长正常的植株，进行潮霉素PCR筛选和GUS染色，获得阳性T0代植株，共10个株系。收获T1代种子繁种并鉴定至T2代，获得水稻转基因株系。

实施例3  miRNA镉胁迫应答的调控功能鉴定

取T2代转基因株系种子和中花11野生型的种子，1％稀HNO₃破休眠处理16h。倒去稀HNO₃，10％NaClO(有效氯约1～1.2％)消毒20min后用蒸馏水冲洗。将种子浸泡在水中，37℃暗处催芽约两天，再在铺有湿润滤纸的培养皿中培养一天至露白。挑选生长一致的露白的转基因株系和野生型的种子，同时转移入0uM、100uM CdCl₂的琼脂培养基上，置于光照培养箱中(白天/黑夜：26℃/22℃，13h/11h)。培养7天后，观察转基因株系与野生型幼苗在镉胁迫下的表型。如图4所示，结果发现在100uM CdCl₂处理下，miR192过表达的转基因幼苗相比野生型幼苗，生物量、叶长度、根的数目及和长度都显著降低，说明miR192超量表达增加了对镉胁迫的敏感性。

Claims (1)

1.一种SEQ ID NO.1所示的miRNA在增加水稻镉胁迫敏感性中的应用。

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