CN106754913B - 水稻miRNA-miR874基因及前体基因和在提高水稻对重金属胁迫耐受性中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及水稻转基因领域，尤其涉及水稻miRNA‑miR874基因及其前体基因和其在提高水稻对重金属镉胁迫耐受性中的应用。本发明利用荧光定量PCR及生物信息学等方法，在水稻幼苗根中筛选得到一种新的miRNA—miR874。miR874基因上游的启动子区通过预测发现存在重金属响应元件（TGCRCNC）。实时定量PCR实验显示，miR874在镉胁迫下表达受到显著上调。本发明进而通过包含所述水稻miRNA的前体基因连接到载体上，通过农杆菌介导转化到水稻愈伤组织，筛选培养，获得纯合的水稻转基因株系。通过转基因手段发现该miRNA具有显著提高水稻对镉耐受性的作用。

Description

水稻miRNA-miR874基因及前体基因和在提高水稻对重金属胁 迫耐受性中的应用
技术领域
本发明涉及水稻转基因领域，尤其涉及水稻miRNA-miR874基因及其前体基因和其在提高水稻对重金属镉胁迫耐受性中的应用。
背景技术
近年来，随着我国工业化和城市化进程的不断发展，重金属(镉、铅、汞等)引起的土壤污染形势日趋严峻，对生态环境、食品安全和农业的可持续发展构成严重威胁。据报道我国受重金属污染的耕地近3亿亩，约占全国农田总数的1/6；全国每年因重金属污染粮食达1200万吨，造成的直接经济损失超过200亿元(韩少华等，2011)。浙江省受三废污染的耕地面积达33.33万公顷，占全省耕地总面积的20％以上，富阳郊区及富春江沿岸某些地段因采矿和冶炼活动引起的农田污染面积达数千亩，绍兴、诸暨、天台、黄岩、温州、建德等地也存在铅锌矿污染土壤。而且，由于重金属在土壤中的存留时间短则数十年(如镉)，长则数万年(如铅)，要彻底解决现有问题并非易事。因此，如何在轻度重金属污染的土壤中进行农作物的安全生产，如何利用植物进行大规模污染土壤的修复，这对保障农产品安全、生态安全和人民健康，促进农业生产的可持续发展意义重大。
目前对植物重金属转运和解毒机制的研究主要集中在植物螯合肽(Phytochelatin，PC)、金属硫蛋白(MT)、阳离子/H+转运蛋白CAX2等。但这些基因的表达调控机制并不清楚。MicroRNA(miRNA)是一类单链、长度约为20-24nt的内源性RNA，对特定基因转录后水平的表达具有重要调控作用。植物中，miRNA调节植物的生长发育，并参与多种生物(病原微生物)和非生物胁迫(盐胁迫、冷胁迫、干旱及重金属等)应答。近年来的研究表明，miRNA在植物重金属胁迫响应过程中扮演着重要角色。甘蓝型油菜中，miR156、miR171、miR393以及miR396a的表达受镉的抑制(Xie,F.L.,Huang,S.Q.,Guo,K.,Xiang,A.L.,Zhu,Y.Y.,Nie,L.,Yang,Z.M.Computational identification of novel microRNAs andtargets in Brassica napus.FEBS Lett,2007,581:1464–1474.)。蒺藜苜蓿中，部分miRNA的表达可受镉、汞、铝的诱导与调节(Zhao,S.Z.,Si,Q.H.,Zhi,M.Y.Bioinformaticidentification and expression analysis of new microRNAs from Medicago truncatula.Biochem.Biophys.Res.Commun,2008,374:538–542.)。Huang等(2009)构建镉胁迫下水稻幼苗的small RNA文库，克隆了19个新的miRNA，并发现其中多数miRNA在镉胁迫下表达发生变化。如水稻幼苗根中miR604在镉处理下表达下调，其靶基因脂转移蛋白表达上升。而脂转移蛋白参与植物多种抗逆性反应并介导植物激素信号转导等过程(Huang,S.Q.,Peng,J.,Qiu,C.X.,Yang,Z.M.Heavy metal-regulated new microRNAs fromrice.J.Inorg.Biochem,2009,103:282e287.)。Zhou等(2012)利用Solexa高通量测序技术发现了苜蓿中52个新的汞胁迫相关的miRNA(Zhou,Z.S.,Zeng,H.Q.,Liu,Z.P.,Yang,Z.M.Genome ‐wide identification of Medicago truncatula microRNAs and theirtargets reveals their differential regulation by heavy metal.Plant CellEnviron,2012,35:86-99)。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明的一个目的是提供水稻miRNA-miR874基因及其前体基因。本发明的另外一个目的是提供该两个基因在在提高水稻对重金属镉胁迫耐受性中的应用。
为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：
水稻miRNA-miR874基因，miR874基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
水稻miRNA-miR874基因的前体基因，前体基因的基因序列如SEQ ID NO.2所示。
为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：
上述的水稻miRNA-miR874基因或水稻miRNA-miR874基因的前体基因在提高水稻对重金属镉胁迫耐受性中的应用。
一种转化载体，该转化载体含所述的水稻miRNA-miR874基因或含所述的水稻miRNA-miR874基因的前体基因。
一种感受态细胞，其特征在于该感受态细胞含所述的水稻miRNA-miR874基因或含所述的水稻miRNA-miR874基因的前体基因。
一种抗重金属镉水稻的培育方法，该方法包括以下的步骤：
1)以野生型水稻幼苗DNA为模板，利用PCR方法扩增到前体基因的序列；水稻miRNA-miR874基因，碱基序列如SEQ ID NO.1所示；该基因的前体基因的基因序列如SEQ IDNO.2所示；
2)将前体基因DNA与pMD19-T载体进行连接反应，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，通过Amp筛选，挑取阳性克隆，经PCR反应验证及测序鉴定正确后，选取正确的菌液提取质粒pMD19-miR874；
3)将提取的质粒pMD19-miR874和DNA双元质粒载体pCAMBIA1301同时都用TakaRa公司生产的KpnI和PstI进行双酶切；将DNA双元质粒载体pCAMBIA1301和克隆质粒pMD19-miR874酶切后，割胶回收DNA片段；接着用T4连接酶连接；然后将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，进行菌液PCR，并提取质粒进行酶切鉴定；将正确的植物表达载体p1301-miR874导入农杆菌感受态细胞EHA105；摇菌，提取农杆菌质粒DNA重新转入大肠杆菌DH5α中，再提取质粒进行酶切鉴定；
4)经鉴定正确的阳性质粒p1301-miR874，通过农杆菌介导法转化到水稻愈伤；然后将愈伤组织进行选择培养，直到颗粒性的抗性愈伤组织长出；选择生长旺盛的抗性愈伤组织转移到含有潮霉素的分化培养基上进行培养，待再生小苗长成将其移到生根培养基上壮苗，最后将转基因苗挑出进行炼苗、移栽，挑选生长正常的植株，进行潮霉素PCR筛选和GUS染色，获得阳性T0代植株；收获T1代种子繁种并鉴定至T2代，获得纯合的转基因株系。
作为优选，所述的步骤1)前体基因的制备方法如下：
1)提取野生型水稻中花11七天龄幼苗DNA；
2)根据前体序列，分别在前体发夹结构两端约100bp处设计引物，所设引物如下：
miR874-F，5’-CGGGGTACCTGATCCAAGAACTCTGACT-3’
miR874-R，5'-AACTGCAGATACGTTTTTTGTACACAT-3'；
3)接着以DNA为摸板，利用所设引物扩增前体基因；PCR反应体系为50μl，依次加入DNA模板1μl、10×PCR buffer 5μl、10mM dNTPs 4μl、10μM正向引物miR874-F0.8μl、10μM反向引物miR874-R0.8μl、TaKaRa Taq 5U/μl聚合酶0.5μl，最后加ddH2O补至50μl；PCR反应条件：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃30s，30个循环，最后延伸72℃10min，4℃保存。
作为优选，所述的步骤2)前体基因DNA产物，利用天根生化科技(北京)有限公司生产的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收，操作如下：将DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入1.5ml的Eppendorf管中，称取重量；加入6倍体积溶胶液PN，50℃水浴放置30min；将溶胶液加入吸附柱CA2中，室温放置2min，12000rpm离心60s，倒掉收集管中的废液；加入600μl漂洗液PW，12000rpm离心60s，倒掉收集管中的废液；12000rpm离心2min，室温放置数分钟彻底晾干；将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，加入40μl洗脱缓冲液EB，12000rpm离心2min收集DNA溶液。
作为优选，所述的步骤2)提取质粒pMD19-miR874，利用天根公司生产的普通质粒小提试剂盒提取质粒操作如下：取3ml菌液加入离心管中，12000rpm离心1min，尽量吸出上清液；向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl的溶液P1，溶液P1含RNaseA，彻底悬浮细菌沉淀；加入250μl溶液P2，温和的上下翻转6-8次使菌体充分裂解；加入350μl溶液P3，立即温和的上下翻转6-8次，充分混匀，12000rpm离心10min；收集上清液，转移到吸附柱CP3中，12000rpm离心60s，倒掉废液；加入600μl已加入无水乙醇的漂洗液PW，12000rpm离心60s，倒掉废液并漂洗两次；将吸附柱CP3放入收集管，12000rpm离心2min，置于室温彻底晾干；加入55μl洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm离心1min，将质粒溶液收集到离心管中。
作为优选，所述的步骤4)农杆菌介导法转化到水稻愈伤的步骤如下：
1)首先活化农杆菌，在含50mg/L卡那霉素和40mg/L利福平的YM培养基上划线，28℃暗培养；收集农杆菌菌体，将其悬浮于含有200μM已酰丁香酮的AAM液体悬浮培养基中；调整菌体浓度至OD600为0.8～1.0，倒入含继代培养1周的水稻愈伤组织的无菌三角瓶，侵染10min，并不时晃动；
2)然后将愈伤组织置于无菌的滤纸上沥干30min后，置于铺有一层无菌滤纸的固体共培养培养基上，25℃暗培养3天；将共培养后的愈伤组织用无菌水清洗5-6次，再用含500mg/L头孢拉定的无菌水清洗1～2遍，置于无菌滤纸上沥干1小时；将晾干的愈伤转入含500mg/L头孢拉定和50mg/L潮霉素的选择培养基上进行第一轮选择，28℃，暗培养14天；
3)然后将长有抗性愈伤的初始愈伤转到新的含500mg/L头孢拉定和50mg/L潮霉素的培养基上进行第二轮选择，28℃，光照培养，直到颗粒性的抗性愈伤组织长出。
本发明利用荧光定量PCR及生物信息学等方法，在水稻幼苗根中筛选得到一种新的miRNA—miR874。miR874基因上游的启动子区通过预测发现存在重金属响应元件(TGCRCNC)。实时定量PCR实验显示，miR874在镉胁迫下表达受到显著上调。
本发明进而通过包含所述水稻miRNA的前体基因连接到载体上，通过农杆菌介导转化到水稻愈伤组织，筛选培养，获得纯合的水稻转基因株系。通过转基因手段发现该miRNA具有显著提高水稻对镉耐受性的作用。
附图说明
图1为7天龄水稻幼苗60μM CdCl2处理6h miR874的荧光定量PCR图(CK对照；Cd处理样品)。
图2为miR874过表达载体构建的过程凝胶图谱。a.miR874前体PCR扩增凝胶图谱；b.pMD19-T-miR874质粒酶切鉴定图；c.p1301-miR874重组质粒菌液PCR扩增凝胶图谱；d.p1301-miR874重组质粒酶切鉴定图。
图3为miR874过表达水稻植株的鉴定图。a.潮霉素PCR筛选；b.GUS染色。
图4为miR874过表达水稻植株在CdCl2处理下14d后表型，(WT对照；35S:MIR874转基因水稻，#1#2代表2个株系)。
图5为miR874过表达水稻植株在CdCl2处理下14d后的MDA和H2O2含量(WT对照；35S:MIR874转基因水稻，#1#2代表2个株系)。
具体实施方式
实施例1基因的获得
利用Lindow等(2007)预测的2100条miRNA序列以及水稻miRNA数据库(miRBaseRelease11.0，http://microrna.sanger.ac.uk)中的miRNA序列，选取miR874进行序列查询，发现水稻miR874位于6号染色体，来源于基因间区域。成熟序列如SEQ ID NO.1所示，前体序列如SEQ ID NO.2所示。
成熟序列TACTACTGCTGGTGGTGGCGGCG
前体序列
TAGTCTACTACTGCTGGTGGTGGCGGCGGCGGCGCTACTACTGCTGCTGCTACTACTGCTAGCGCGCTGCTGCTGCTACTACTACAGCAGTAGTACTACTA(101bp)
miR874基因上游的启动子区通过预测发现存在重金属响应元件(TGCRCNC)。
并且采用荧光定量PCR检测miR874在镉胁迫6h下的表达，发现镉胁迫显著提高了miR874的表达(图1)。
具体操作如下：
以野生型水稻(中花11)七天苗龄幼苗为材料，取60uM CdCl2处理6h和对照组(未处理)的根采用Trizol法提取RNA，并用RNase-free DNase I(TaKara)消化以去除DNA污染。用反转录试剂盒PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara)逆转录成cDNA。反应体系为20μl，分别为2μg RNA，1μl Oligo dT Primer(50μM)，1μl dNTP Mixture(10mM)和RNase free H2O至10μl，65℃5min，冰上急冷，然后依次加入4μl 5×PrimeScriptBuffer，0.5μl RNase Inhibitor(40U/μl)，1μl PrimeScript RTase(200U/μl)和4.5μlRNase free dH2O，轻微混合均匀，42℃60min，70℃15min，最后-20℃保存。然后以第一链cDNA为摸板扩增miR874，PCR反应程序：预变性，95℃1min；PCR反应，第一步：94℃变性10s；第二步：55℃退火延伸15s；第三步：72℃15s。同时在退火过程中检测荧光信号变化，共进行45个循环。采用2-△△Ct相对定量法计算基因的相对表达量。以β-actin作为内参，β-actin的正向引物序列：5’-GCCGTCCTCTCTCTGTATGC-3’，反向引物序列：5’-GGGGACAGTGTGGCTGAC-3’。使用的PCR扩增引物如下：
miR874-F，5‘-ACGATTTTACAGGATTT-3’；
miR874-R，5‘-CTCTTCTTTAGGAGGGA-3’。
实施例2基因克隆与转化
以野生型水稻中花11七天苗龄幼苗DNA为模板，利用PCR方法扩增到miR874前体基因的序列。具体操作如下：首先，提取野生型水稻中花11七天龄幼苗DNA。取约0.2g水稻叶片用液氮研磨成粉末，转移粉末到加有500μl提取液(100mM Tris-HCl，pH 8.0；20mM EDTA；500mM NaCl)的离心管中，轻轻混匀。向管中加入100μl 10％SDS溶液，混匀，65℃保温20min。然后加氯仿/异戊醇/乙醇(20:1:4)混合液600μl，室温静止10min。4℃，12000rpm离心10min，转移上清至另一离心管中。加入1ml预冷的无水乙醇充分混匀，-20℃沉淀DNA20min。4℃，12000rpm离心10min，弃上清，加70％乙醇500μl进行洗涤。4℃，12000rpm离心10min，弃上清。轻微离心，用移液器将残留液体吸干。吹干DNA沉淀后，溶于100μl含RNase酶(10μg/ml)TE中，37℃水浴30min，-20℃保存。根据miR874前体序列，在database中查阅其所在基因组位点的两端的序列，分别在前体发夹结构两端约100bp处设计引物，所设引物如下：
miR874-F，5’-CGGGGTACCTGATCCAAGAACTCTGACT-3’
miR874-R，5'-AACTGCAGATACGTTTTTTGTACACAT-3'。
接着以DNA为摸板，利用所设引物扩增miR874前体基因。PCR反应体系为50μl，依次加入DNA模板1μl、10×PCR buffer 5μl、10mM dNTPs 4μl、10μM正向引物(miR874-F)0.8μl、10μM反向引物(miR874-R)0.8μl、TaKaRa Taq(5U/μl)聚合酶0.5μl，最后加ddH2O补至50μl。PCR反应条件：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃30s，30个循环，最后延伸72℃10min，4℃保存。PCR产物凝胶图谱如图2.a所示。
扩增后将miR874前体基因DNA产物，利用天根生化科技(北京)有限公司生产的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收，操作如下：将DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入1.5ml的Eppendorf管中，称取重量。加入6倍体积溶胶液PN，50℃水浴放置30min。将溶胶液加入吸附柱CA2中，室温放置2min，12000rpm离心60s，倒掉收集管中的废液。加入600μl漂洗液PW，12000rpm离心60s，倒掉收集管中的废液。12000rpm离心2min，室温放置数分钟彻底晾干。将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，加入40μl洗脱缓冲液EB，12000rpm离心2min收集DNA溶液。
将回收的miR874前体基因DNA与pMD19-T载体(TakaRa)进行连接反应，连接体系10μl，分别加入0.5μl pMD19-T载体、4.5μl纯化的miR874前体的DNA、5μl Solution I。16℃下连接3h后将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。通过Amp筛选，挑取阳性克隆，经PCR反应验证及测序鉴定正确后，选取正确的菌液提取质粒pMD19-miR874。利用天根公司生产的普通质粒小提试剂盒提取质粒操作如下：
取3ml菌液加入离心管中，12000rpm离心1min，尽量吸出上清液。向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl的溶液P1(含RNaseA)，彻底悬浮细菌沉淀。加入250μl溶液P2，温和的上下翻转6-8次使菌体充分裂解。加入350μl溶液P3，立即温和的上下翻转6-8次，充分混匀，12000rpm离心10min。收集上清液，转移到吸附柱CP3中，12000rpm离心60s，倒掉废液。加入600μl已加入无水乙醇的漂洗液PW，12000rpm离心60s，倒掉废液并漂洗两次。将吸附柱CP3放入收集管，12000rpm离心2min，置于室温彻底晾干。加入55μl洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm离心1min，将质粒溶液收集到离心管中。
将提取的质粒pMD19-miR874和DNA双元质粒载体pCAMBIA1301同时都用TakaRa公司生产的KpnI和PstI进行双酶切。酶切体系50μl，包括5μl 10×M buffer、28μlpMD19-miR874质粒(或pCAMBIA1301质粒)、1μl KpnI、1μl PstI和15μl ddH2O，37℃水浴过夜。pMD19-miR874质粒酶切结果如图2.b所示。将DNA双元质粒载体pCAMBIA1301和克隆质粒pMD19-miR874酶切后，割胶回收DNA片段。接着用T4连接酶连接，连接体系10μl，包括1μlpCAMBIA1301载体、7.5μl miR874DNA、1μl 10×T4连接酶buffer和0.5μl T4连接酶，16℃连接过夜。然后将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，进行菌液PCR，并提取质粒进行酶切鉴定，结果如图2.c和图2.d所示。将正确的植物表达载体p1301-miR874导入农杆菌感受态细胞EHA105，操作如下：取200μl农杆菌感受态细胞，加入1μg p1301-miR874质粒，混匀，冰浴5min，液氮中速冻5min，37℃水浴5min，然后加入1ml YM培养基28℃恢复培养4h。10000g离心30s，弃上清，吸200μl菌液涂布于含有50mg/L卡那霉素和40μg/l利福平的YM平板，28℃培养，约48h后长出农杆菌单菌落。摇菌，提取农杆菌质粒DNA重新转入大肠杆菌DH5α中，再提取质粒进行酶切鉴定。
经鉴定正确的阳性质粒p1301-miR874，通过农杆菌介导法转化到水稻愈伤。操作如下：首先活化农杆菌，在含50mg/L卡那霉素和40mg/L利福平的YM培养基上划线，28℃暗培养。收集农杆菌菌体，将其悬浮于含有200μM已酰丁香酮(As)的AAM液体悬浮培养基中。调整菌体浓度至OD600为0.8～1.0，倒入含继代培养1周的水稻愈伤组织的无菌三角瓶，侵染10min，并不时晃动。然后将愈伤组织置于无菌的滤纸上沥干30min后，置于铺有一层无菌滤纸的固体共培养培养基上，25℃暗培养3天。将共培养后的愈伤组织用无菌水清洗5-6次，再用含500mg/L头孢拉定的无菌水清洗1～2遍，置于无菌滤纸上沥干1小时。将晾干的愈伤转入含500mg/L头孢拉定和50mg/L潮霉素的选择培养基上进行第一轮选择，28℃，暗培养14天。然后将长有抗性愈伤的初始愈伤转到新的含500mg/L头孢拉定和50mg/L潮霉素的培养基上进行第二轮选择，28℃，光照培养，直到颗粒性的抗性愈伤组织长出。选择生长旺盛的抗性愈伤组织转移到含有潮霉素的分化培养基上，于25℃，12h光照/12h黑暗条件下培养。待再生小苗长成约1cm高时，将其移到生根培养基上壮苗，25℃，12h光照/12h黑暗条件下培养。最后将转基因苗挑出，加入适量蒸馏水炼苗3天至一周左右，洗去琼脂，培养箱水培1周，移栽到温室的土钵中生长。挑选生长正常的植株，进行潮霉素PCR筛选和GUS染色，获得阳性T0代植株，共3个株系(图3)。收获T1代种子繁种并鉴定至T2代，获得纯合的转基因株系。
实施例3 miRNA镉胁迫应答的调控功能鉴定
取T2代转基因株系种子和中花11野生型的种子，1％稀HNO3破休眠处理16h。倒去稀HNO3，10％NaClO(有效氯约1～1.2％)消毒20min后用蒸馏水冲洗。将种子浸泡在水中，37℃暗处催芽约两天，再在铺有湿润滤纸的培养皿中培养一天至露白。挑选生长一致的露白的转基因株系和野生型的种子播于网格上，放入盛有水稻营养液(按国际水稻所标准营养液配方进行配制)的桶中，置于水稻培养箱中(白天/黑夜：26℃/22℃，13h/11h；Rh 80％)培养，营养液每5天换一次。将转基因株系和野生型水稻在正常的营养液中培养五周后，挑选生长一致的水稻植株用150uM CdCl2处理，观察转基因株系与野生型大苗在镉胁迫下的表型。如图4所示，结果发现在150uM CdCl2处理14天后，miR874过表达的转基因苗相比野生型苗，苗更加健壮，叶片仍保持绿色，说明miR874超量表达株系对镉毒害具有一定的耐受作用。
我们进而测定转基因和野生型水稻株系在镉胁迫下的部分生理指标。MDA和H2O2是常用的膜脂过氧化指标，其含量的多少表示膜受胁迫的程度。在镉不处理下，转基因和野生型水稻植株的MDA和H2O2含量均没有显著差异。镉处理二周14d之后，与不处理相比，这些水稻的MDA和H2O2含量均有不同程度的上升(图5)。但miR874过表达的转基因植株的MDA和H2O2的上升量和总含量均小于WT，表明在镉胁迫下，miR874过表达的转基因水稻膜受胁迫的程度较小。换言之，miR874过表达可在一定程度上提高水稻植株对镉胁迫的耐受性。
<110>中国计量大学
<120>水稻miRNA-miR874基因及其前体基因和其在提高水稻对重金属镉胁迫耐受性中的应用
<160>2
<210>1
<211>23
<212>DNA
<213>水稻miR874
<400>1
TACTACTGCT GGTGGTGGCG GCG 23
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>水稻miR874
<400>2
TAGTCTACTA CTGCTGGTGG TGGCGGCGGC GGCGCTACTA CTGCTGCTGC TACTACTGCT 60
AGCGCGCTGC TGCTGCTACT ACTACAGCAG TAGTACTACT A 101

Claims (10)

1.水稻miRNA-miR874基因，其特征在于：miR874基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的水稻miRNA-miR874基因的前体基因，其特征在于：前体基因的基因序列如SEQ ID NO.2所示。
3.权利要求1所述的水稻miRNA-miR874基因或权利要求2所述的水稻miRNA-miR874基因的前体基因在提高水稻对重金属镉胁迫耐受性中的应用。
4.一种转化载体，其特征在于该转化载体含权利要求1所述的水稻miRNA-miR874基因或含权利要求2所述的水稻miRNA-miR874基因的前体基因。
5.一种感受态细胞，其特征在于该感受态细胞含权利要求1所述的水稻miRNA-miR874基因或含权利要求2所述的水稻miRNA-miR874基因的前体基因。
6.一种抗重金属镉水稻的培育方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：
1)以野生型水稻幼苗DNA为模板，利用PCR方法扩增到前体基因的序列；水稻miRNA-miR874基因，碱基序列如SEQ ID NO.1所示；前体基因的基因序列如SEQ ID NO.2所示；
2)将前体基因DNA与pMD19-T载体进行连接反应，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，通过Amp筛选，挑取阳性克隆，经PCR反应验证及测序鉴定正确后，选取正确的菌液提取质粒pMD19-miR874；
3)将提取的质粒pMD19-miR874和DNA双元质粒载体pCAMBIA1301同时都用TakaRa公司生产的KpnI和PstI进行双酶切；将DNA双元质粒载体pCAMBIA1301和克隆质粒pMD19-miR874酶切后，割胶回收DNA片段；接着用T4连接酶连接；然后将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，进行菌液PCR，并提取质粒进行酶切鉴定；将正确的植物表达载体p1301-miR874导入农杆菌感受态细胞EHA105；摇菌，提取农杆菌质粒DNA重新转入大肠杆菌DH5α中，再提取质粒进行酶切鉴定；
4)经鉴定正确的阳性质粒p1301-miR874，通过农杆菌介导法转化到水稻愈伤；然后将愈伤组织进行选择培养，直到颗粒性的抗性愈伤组织长出；选择生长旺盛的抗性愈伤组织转移到含有潮霉素的分化培养基上进行培养，待再生小苗长成将其移到生根培养基上壮苗，最后将转基因苗挑出进行炼苗、移栽，挑选生长正常的植株，进行潮霉素PCR筛选和GUS染色，获得阳性T0代植株；收获T1代种子繁种并鉴定至T2代，获得纯合的转基因株系。
7.根据权利要求6所述的一种抗重金属镉水稻的培育方法，其特征在于步骤1)前体基因的制备方法如下：
1)提取野生型水稻中花11七天龄幼苗DNA；
2)根据前体序列，分别在前体发夹结构两端约100bp处设计引物，所设引物如下：
miR874-F，5’-CGGGGTACCTGATCCAAGAACTCTGACT-3’
miR874-R，5'-AACTGCAGATACGTTTTTTGTACACAT-3'；
3)接着以DNA为摸板，利用所设引物扩增前体基因；PCR反应体系为50μl，依次加入DNA模板1μl、10×PCR buffer 5μl、10mM dNTPs 4μl、10μM正向引物miR874-F0.8μl、10μM反向引物miR874-R0.8μl、TaKaRa Taq 5 U/μl聚合酶0.5μl，最后加ddH2O补至50μl；PCR反应条件：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃30s，30个循环，最后延伸72℃10min，4℃保存。
8.根据权利要求6所述的一种抗重金属镉水稻的培育方法，其特征在于步骤2)前体基因DNA产物，利用天根生化科技(北京)有限公司生产的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收，操作如下：将DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入1.5ml的Eppendorf管中，称取重量；加入6倍体积溶胶液PN，50℃水浴放置30min；将溶胶液加入吸附柱CA2中，室温放置2min，12000rpm离心60s，倒掉收集管中的废液；加入600μl漂洗液PW，12000rpm离心60s，倒掉收集管中的废液；12000rpm离心2min，室温放置数分钟彻底晾干；将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，加入40μl洗脱缓冲液EB，12000rpm离心2min收集DNA溶液。
9.根据权利要求6所述的一种抗重金属镉水稻的培育方法，其特征在于步骤2)提取质粒pMD19-miR874，利用天根公司生产的普通质粒小提试剂盒提取质粒操作如下：取3ml菌液加入离心管中，12000rpm离心1min，尽量吸出上清液；向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl的溶液P1，溶液P1含RNaseA，彻底悬浮细菌沉淀；加入250μl溶液P2，温和的上下翻转6-8次使菌体充分裂解；加入350μl溶液P3，立即温和的上下翻转6-8次，充分混匀，12000rpm离心10min；收集上清液，转移到吸附柱CP3中，12000rpm离心60s，倒掉废液；加入600μl已加入无水乙醇的漂洗液PW，12000rpm离心60s，倒掉废液并漂洗两次；将吸附柱CP3放入收集管，12000rpm离心2min，置于室温彻底晾干；加入55μl洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm离心1min，将质粒溶液收集到离心管中。
10.根据权利要求6所述的一种抗重金属镉水稻的培育方法，其特征在于步骤4)农杆菌介导法转化到水稻愈伤的步骤如下：
1)首先活化农杆菌，在含50mg/L卡那霉素和40mg/L利福平的YM培养基上划线，28℃暗培养；收集农杆菌菌体，将其悬浮于含有200μM已酰丁香酮的AAM液体悬浮培养基中；调整菌体浓度至OD600为0.8～1.0，倒入含继代培养1周的水稻愈伤组织的无菌三角瓶，侵染10min，并不时晃动；
2)然后将愈伤组织置于无菌的滤纸上沥干30min后，置于铺有一层无菌滤纸的固体共培养培养基上，25℃暗培养3天；将共培养后的愈伤组织用无菌水清洗5-6次，再用含500mg/L头孢拉定的无菌水清洗1～2遍，置于无菌滤纸上沥干1小时；将晾干的愈伤转入含500mg/L头孢拉定和50mg/L潮霉素的选择培养基上进行第一轮选择，28℃，暗培养14天；
3)然后将长有抗性愈伤的初始愈伤转到新的含500mg/L头孢拉定和50mg/L潮霉素的培养基上进行第二轮选择，28℃，光照培养，直到颗粒性的抗性愈伤组织长出。
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