CN115896161A - 一种利用基因过表达增强水稻镉抗性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用基因过表达增强水稻镉抗性的方法，属于基因工程领域。本发明通过用25μM CdCl₂胁迫下水稻根部进行RNA‑seq分析，筛选出1380条相关的lncRNA，发现51个lncRNA在镉胁迫下表达差异显著，其中35个受镉诱导，16个受镉抑制。通过对筛选出的与Cd毒害相关基因的GO和KEGG分析，筛选到一个镉诱导的基因间型LncRNA16555，镉胁迫下水稻根中LncRNA16555表达量显著上调，通过荧光定量PCR进行验证，其实为镉诱导表达基因。因此，本发明筛选得到一个能够增强水稻镉抗性的基因，并且通过过表达该基因，可以提高水稻镉抗性以及培育镉抗性增强的水稻。

Description

一种利用基因过表达增强水稻镉抗性的方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种利用基因过表达增强水稻镉抗性的方法。

背景技术

镉(Cadmium，Cd)是我国农田和稻米污染较为严重且普遍的主要重金属元素，极易被水稻根系吸收。长链非编码RNA(LncRNA，long non-coding RNA)是一种长度大于200个核苷酸的非编码RNA，已有研究表明它不仅参与植物的生长发育过程，还参与植物响应逆境的调控等多个环节。但是目前关于镉与水稻抗逆性调控相关报道极少，关于长链编码RNA调控水稻抗性的机理也不清楚，因此，深入研究镉与长链非编码RNA调控水稻抗逆性非常关键，并且减少农田和水稻中镉污染也是迫切需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用基因过表达增强水稻镉抗性的方法，以解决上述现有技术存在的问题，通过在水稻中过表达LncRNA16555基因，可以增强水稻镉抗性。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供LncRNA16555基因在增强水稻镉抗性中的应用。

优选的是，所述LncRNA16555基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，或者包含如SEQ ID NO：1所示序列的基因片段。

优选的是，过表达所述LncRNA16555基因，增强水稻镉抗性。

本发明还提供由所述的LncRNA16555基因表达的蛋白在增强水稻镉抗性中的应用。

本发明还提供转入所述的LncRNA16555基因的重组载体在增强水稻镉抗性中的应用。

本发明还提供包含所述的重组载体的宿主菌在增强水稻镉抗性中的应用。

本发明还提供一种利用基因过表达增强水稻的镉抗性的方法，通过构建LncRNA16555基因的重组表达载体，将所述重组表达载体转入水稻使得所述LncRNA16555基因在水稻中过表达，以增强水稻镉抗性。

本发明还提供一种培育镉抗性增强水稻的方法，通过构建LncRNA16555基因的重组表达载体，将所述重组表达载体转入水稻使得所述LncRNA16555基因在水稻中过表达，得到镉抗性增强水稻。

优选的是，所述LncRNA16555基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，或者包含如SEQ ID NO：1所示序列的基因片段。

本发明公开了以下技术效果：

本发明用Cd胁迫水稻根部，通过筛选得到一个Cd诱导的基因间型LncRNA(LncRNA16555，chr4：27175885-27177495)，Cd胁迫下水稻根中LncRNA16555表达量显著上调，通过荧光定量PCR进行验证，其实为Cd诱导表达基因。在此基础上，通过构建该基因的过表达载体和干扰载体，验证了在水稻中过表达LncRNA16555可以显著提高水稻的镉抗性，这对于培育Cd抗性水稻具有重要意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为靶基因染色体定位图(A)和25μM CdCl₂处理2天后水稻幼苗根部的差异LncRNAs(B)；

图2为水稻中Cd胁迫相关LncRNA参与的生物过程；

图3为水稻中Cd胁迫相关基因的GO富集分析结果；

图4为水稻中Cd胁迫相关基因的KEGG富集分析结果；

图5为LncRNA16555二级结构预测图；

图6为两周苗龄水稻根中LncRNA16555在25μM CdCl₂胁迫下和未处理条件下的表达情况；

图7为1300UR-sGFP过表达载体图谱；

图8为pFGC1008质粒结构示意图；

图9为LncRNA16555序列内部酶切位点图；

图10为LncRNA16555过表达片段PCR扩增电泳图；M：2000DNA Maker；泳道1、2、3、4：LncRNA16555(Kpn I/Spe I)过表达片段PCR扩增电泳结果；

图11为1300UR-sGFP质粒双酶切验证图；

图12为LncRNA16555-1300UR-sGFP重组载体测序结果(a)及测序峰图(b)；

图13为LncRNA16555干扰片段酶切位点；

图14为LncRNA16555干扰片段正义链PCR扩增电泳图；M：2000DNA Maker；泳道1、2、3、4：LncRNA16555正义链(Asc I/Swa I)PCR扩增电泳结果；

图15为LncRNA16555干扰片段反义链PCR扩增电泳图；M：2000DNA Maker；泳道1、2、3、4：LncRNA16555反义链(BamHⅠ/SpeⅠ)PCR扩增电泳结果；

图16为LncRNA16555干扰载体构建正义链测序结果(a)及峰图(b)；

图17为LncRNA16555干扰载体构建反义链测序结果(a)及峰图(b)；

图18为LncRNA16555过表达植株鉴定PCR扩增电泳图；M：2000DNA Maker；1-32泳道：LncRNA16555过表达植株；WT泳道：日本晴野生型；

图19为LncRNA16555 RNAi植株鉴定PCR扩增电泳图；M：2000DNA Maker；1-32泳道：LncRNA16555 RNAi植株；WT泳道：日本晴野生型；

图20为LncRNA16555-GFP在水稻根尖的表达情况；

图21为T0代LncRNA16555过表达和LncRNA16555 RNAi水稻植株表达量；

图22为Cd胁迫下LncRNA16555过表达植株根长(A)和株高(B)的相对抑制率；

图23为4周龄野生型和LncRNA16555过表达植株根(A)、茎(B)、叶(C)和地上部分(D)Cd含量。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

以下实施例中所用水稻为日本晴水稻(Oryza satIva L.NIpponbare，粳稻)。

实施例1与水稻抗性相关的长链非编码RNA的筛选和鉴定

1、培养水稻时，用25μM CdCl₂胁迫下水稻根部，提取水稻根部RNA，并利用RNA-seq分析，筛选出1380条相关的lncRNA，发现51个lncRNA在Cd胁迫下表达差异显著，其中35个受Cd诱导，16个受Cd抑制。通过对筛选出的与Cd毒害相关基因的GO和KEGG分析，发现主要参与细胞壁形成、过氧化物清除、GSH代谢、GST活性、离子转运、次生代谢和胁迫响应等相关，在GSH代谢、ABC转运体、植物病原体互作和苯丙酸合成等途径富集较高(图1B、图2-图4)。并且筛选到一个Cd诱导的基因间型LncRNA(LncRNA16555，chr4：27175885-27177495)，Cd胁迫下水稻根中LncRNA16555表达量显著上调，通过荧光定量PCR进行验证，其实为Cd诱导表达基因。

2、LncRNA16555序列与靶基因结构分析

LncRNA16555测序结果如下SEQ ID NO：1所示：

生物信息学分析发现LncRNA16555具有典型的茎环结构，见图5。

3、LncRNA16555靶基因

生物信息学预测分析，LncRNA16555顺式调控的靶基因有11个，有参与植物抗病的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶基因(LOC_Os04g45920.1)，鞘脂代谢相关的同源盒关联亮氨酸拉链基因(LOC_Os04g45800)、两个碳代谢相关的转座子蛋白基因及其它7个未知的基因；它们的染色体定位关系如图1A所示。

实施例2Cd胁迫水稻根部对于LncRNA16555基因表达量的影响

1、水稻培养与处理

挑选饱满的日本晴水稻种子，用0.1％的稀硝酸浸泡过夜约14h左右，起到破休眠催萌发的作用；第二天早上用0.5％次氯酸钠浸泡20min进行消毒处理；无菌水漂洗3次，随后在30℃恒温培养箱暗条件下浸种48h，每12h换一次水；植物光照生长箱中，将露白的种子挑选播于漂浮在水盆的纱网格上，培养7天；后改换1/2浓度水稻营养液培养3天，接下来挑选长势一致的水稻苗移栽到装有全营养液的桶中培养。植物光照生长箱的培养条件为：白天28℃/13h；夜间23℃/11h，空气相对湿度为60％-80％(RH)。水稻培养液母液按照表1木村B营养液配方进行配制，pH调至5.5。

表1木村B营养液

2、水稻Cd处理与样品采集

待水稻生长至第14天进行Cd胁迫处理。对全营养液中加入25μM CdCl₂处理。在Cd处理的不同时间：0h、3h、6h、9h、12h、24h和48h，取水稻植株的地下部分，每个采样点3个重复，迅速液氮冷冻装入封口袋中，放在-80℃超低温冰箱保存。在选取处理的水稻时，应选取长势相同的植株。植物光照生长箱的培养条件为：白天28℃/13h；夜间23℃/11h，空气相对湿度为60％-80％(RH)。

3、水稻总RNA的提取及逆转录

在植物RNA提取实验室，应带好口罩，手套，全过程样品需在冰上操作。

具体步骤为：

(1)取新鲜的植物组织在液氮中充分研磨，每30-50mg组织加入1ml TRIzonReagent，混匀。

(2)样品中加入TRIzon Reagent后反复吹打几次，使样本充分裂解，室温放置5分钟，目的为了使蛋白核酸复合物完全分离。

(3)以每1ml TRIzon Reagent加入200μL氯仿的比例加入氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15秒，室温2分钟。

(4)4℃12000rpm离心10分钟，分为三层：红色有机相，中间层和上层无色水相，RNA主要在上层水相中，将上层水相移到一个新的RNase-Free离心管中。

(5)在得到的水相溶液中加入等体积的70％乙醇(约400μL)无RNase水配制，颠倒混匀。

(6)将步骤(5)得到的溶液加入到吸附柱中，12000rpm离心20秒，倒掉废液。

(7)向吸附柱中加入700μL Buffer RW1,12000rpm离心20秒,倒掉废液。

(8)向吸附柱中加入500μLBuffer RW2，12000rpm离心20秒，弃废液。

(9)重复一次8步骤。

(10)空转12000rpm离心2分钟，弃废液，室温晾干。

(11)取新的无RNase离心管，向吸附柱中加入30-50μL RNase-Free Water，室温1分钟，12000rpm离心1分钟。收集RNA溶液，-80℃保存，防止降解。

测定RNA浓度和纯度后利用逆转录试剂盒(TAKARA)进行逆转录：

按表2加入试剂。于PCR仪上反应条件为37℃，15min，85℃，5s。-20℃保存cDNA样品。用于qPCR的cDNA需稀释3倍。

表2逆转录反应体系

注：RT-U6:5'-ATTTGGACCATTTCTCGATTTGT-3'；RT-miR390:5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGGCGCT-3'；RT Primer Mix是试剂盒自带的。

4、实时荧光定量PCR

qPCR检测基因的表达量，需要对每个cDNA样品做3次重复实验，选用72孔板加样。PCR体系如表3，反应程序如表4。内参为β-actin和U6基因，引物如表5。定量数据采用2^-ΔΔCt方法进行分析。

表3荧光定量PCR反应体系

表4荧光定量PCR反应程序

表5荧光定量PCR引物

结果如图6所示，通过荧光定量PCR方法，检测LncRNA16555在Cd处理不同时间3h，6h，9h，12h，24h，48h下的表达。LncRNA16555在前6h表达量升高；且6h时表达量达峰值，此后的时间逐渐恢复。同时，LncRNA16555在Cd处理下的表达量均大于对照组。

实施例3

1、LncRNA16555过表达载体的构建方法

(1)以Cd胁迫下水稻根cDNA为模板，做PCR产物扩增(引物设计)，按表6配制PCR反应液。

表6PCR反应液体系

PCR反应程序如表7所示：

表7PCR反应程序

PCR扩增引物设计如表8：

表8LncRNA16555过表达载体构建引物设计

(2)PCR产物电泳验证及其DNA纯化。PCR扩增产物利用1.2％浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离，回收目的条带后再用TIANquick Midi Purification Kit进行DNA产物回收纯化，具体操作过程参考试剂盒说明书，获得纯化的PCR产物片段。

(3)1300UR-sGFP过表达载体(酶切位点如图7所示)双酶切和产物回收。质粒载体双酶切体系如表9，酶切结束后将双酶切产物做进行琼脂糖凝胶电泳分离，回收目的条带，用TIANgel Midi Purification Kit试剂盒做琼脂糖凝胶DNA回收，具体流程参照试剂盒说明书。获得纯净的1300UR-sGFP过表达酶切载体备用。

表9质粒双酶切体系

(4)纯化的PCR产物片段双酶切与产物回收。PCR扩增的目的片段双酶切体系如表10，酶切结束后将酶切后的产物使用TIANquick Midi Purification Kit做DNA产物纯化，详细操作见说明书。此步骤获得酶切的目的片段。

表10目的片段双酶切体系

(5)目的片段和1300UR-sGFP酶切载体的连接(重组反应)。连接体系如表11。

表11T4连接体系

(6)转化。向15μL连接产物中加入50μL大肠杆菌DH5α感受态细胞，混匀，放置冰上30min；然后42℃热激60s，立即放在冰上2min；转移至1.5mL EP管中，加入600μL无菌LB液体培养基，混匀；37℃，摇床220rpm/min，1h；用移液枪取100μL菌液，稀释涂布平板法将其涂在卡那霉素(50ng/mL)选择性固体培养基上，待菌液被培养基吸收后，37℃倒置培养12-16h。

(7)挑取单克隆，摇菌鉴定。挑取单克隆菌落，在1mL加入卡那霉素(50ng/mL)的LB液体培养基中37℃摇床2h；而后做菌液PCR鉴定，PCR反应体系如表12，PCR反应程序同表7，而后做琼脂糖凝胶电泳跑胶。

表12菌液PCR体系

(8)菌液测序验证。选取PCR验证阳性单克隆菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司测序后，比对序列结果，将正确的单克隆菌液扩大培养10mL，用TIANprep MiniPlasmid Kit进行质粒提取，具体操作流程见说明书。取15μL LncRNA16555-1300UR-sGFP重组过表达质粒做农杆菌转化实验，培育转基因水稻。

2、LncRNA16555干扰表达载体的构建方法

(1)以Cd胁迫下水稻根cDNA为模板，PCR扩增两个目的片段，按表12配制PCR反应液，按照表13为PCR反应条件程序，引物设计如表13：

表13LncRNA16555干扰载体引物设计

(2)PCR产物电泳验证及其DNA纯化。PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，单一条带，则使用TIANquick Midi Purification Kit进行DNA产物纯化，具体操作过程参考试剂盒说明书。纯化后获得纯净的两个目的基因片段。

(3)对pFGC1008载体(Asc I/Swa I，如图8所示)和目的片段(Asc I/Swa I)分别双酶切。双酶切体系如表14：

表14干扰载体构建双酶切体系

(4)对双酶切后的pFGC1008干扰载体(Asc I/Swa I)和目的片段(Asc I/Swa I)纯化。使用TIANquick Midi Purification Kit做DNA产物纯化，详细操作见说明书。将1008干扰载体(Asc I/Swa I)和目的片段(Asc I/Swa I)使用T4连接酶进行连接实验。连接体系如表15：

表15干扰载体T4连接体系

(5)转化。向15μL连接产物中加入50μL大肠杆菌DH5α感受态细胞，混匀，放置冰上30min；然后42℃热激60s，立即放在冰上2min；加入600μL无菌LB液体培养基，混匀；37℃，摇床220rpm/min，1h；用移液枪取100μL菌液，稀释涂布平板法将其涂在氯霉素选择性固体培养基上，待菌液被培养基吸收后，37℃倒置培养12-16h

(6)挑取单克隆，摇菌鉴定。挑取单克隆菌落，在1mL加入氯霉素的LB液体培养基中37℃摇床2h；而后做菌液PCR鉴定，PCR反应体系同表12，PCR反应程序同表11，琼脂糖凝胶电泳跑胶。

(7)挑取阳性单克隆菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司测序后，比对序列结果，将正确的单克隆菌液扩大培养10mL，用TIANprep Mini Plasmid Kit进行质粒提取，具体操作流程见说明书。获得连接好正义链目的片段(Asc I/Swa I)的pFGC1008干扰载体。

(8)对上面获得的pFGC1008干扰载体和反义链目的片段用Asc I/Swa I双酶切，酶切体系同表14。

(9)将酶切产物纯化，进行连接。

(10)连接产物转化，重复步骤(6)、(7)和(8)。

(11)取15μL重组1008干扰载体做农杆菌转化实验，培育转基因水稻。

3、结果与分析

3.1LncRNA16555过表达载体构建

LncRNA16555序列全长496bp，内部所含酶切位点如图9所示，构建过程中LncRNA16555全长的电泳如图10所示。以SpeⅠ和KpnⅠ为酶切位点，对表达载体进行双酶切，获得线性化载体并将所得LncRNA16555基因过表达片段插入其中。质粒酶切鉴定结果如图11所示。LncRNA16555-1300UR-sGFP重组载体测序结果及测序峰图如图12所示，说明LncRNA16555过表达载体构建成功。

3.2LncRNA16555干扰表达载体构建

LncRNA16555干扰序列全长202bp，内部所含酶切位点如图13所示。通过PCR获得两个干扰片段，如图14-15所示。干扰片段以AscⅠ和SwaⅠ为正义链酶切位点，以BamHⅠ和SpeⅠ为反义链酶切位点，进行连接实验。质粒测序结果如图16和图17所示证明两个目的片段都已连接到了载体上。

实施例4水稻LncRNA16555过表达和干扰表植株的鉴定

1、水稻DNA提取(CTAB法)

(1)用剪刀剪取约1-2cm长的水稻叶片放入2mL离心管中，往离心管中加3颗5mm钢珠、400μL CTAB溶液，放在研磨机上以60Hz进行磨样(2次，每次1min)。

(2)在65℃恒温水浴锅中水浴30-45min，每15min取出上下颠倒几次。

(3)取200μL氯仿-异戊醇匀浆液(24:1)，加入到离心管中，上下颠倒充分混匀，12000rpm的速度离心10min。

(4)取300μL离心管中的上清液，往其中加入300μL异丙醇，在4℃中以12000rpm的速度离心10min。

(5)弃掉上清液，贴着离心管壁加入1mL 70％乙醇，12000rpm离心5min。

(6)弃掉上清液，放置于超净台中吹干30min以上。

(7)加入20μL ddH₂O溶解。

(8)用Nanodrop检测DNA的浓度。

2、转基因植物的鉴定

获得T0代转基因植株后，提取转基因植株的DNA，然后利用设计的引物如表8，表13进行PCR扩增，1％凝胶电泳检测是否有条带，有条带且大小正确的即为阳性植株。

3、激光共聚焦显微镜观察LncRNA16555过表达植株荧光强弱

在LncRNA16555过表达植株T0代苗期时，用剪刀剪下主根根尖，置于载玻片上，在载玻片上滴加1-2滴ddH₂O，置于NiKon/C2激光共聚焦显微镜下，在波长488nm下观察荧光信号，通过荧光信号的强弱初步判断T0代植株的过表达情况。

4、q-RTPCR方法检测过表达和干扰表达植株情况

提取T0代LncRNA16555过表达和干扰表达植株的RNA，逆转录为cDNA，设计荧光定量引物如表5，然后按照表3配制qRT-PCR反应体系，q-RTPCR反应程序参照表4，内参为水稻β-actin基因，数据处理采用2^-ΔΔCt方法进行分析。

5、结果与分析

5.1LncRNA16555过表达植株和LncRNA16555 RNAi植株的鉴定

如图18和图19所示，通过荧光定量PCR检测，鉴定了多个LncRNA16555过表达转基因水稻株系(共29株)和LncRNA16555 RNAi转基因水稻株系(共32株)。

5.2LncRNA16555过表达植株的进一步筛选

如图20所示，通过观察过表达转基因水稻根系的绿色荧光情况，进一步明确前面鉴定的多个LncRNA416555过表达转基因水稻株系的准确性。

5.3LncRNA16555过表达和干扰表达植株的再进一步筛选

如图21所示，通过进一步进行荧光定量PCR检测若干阳性的过表达和干扰表达植株，发现其过表达和干扰表达的程度存在一定的差异，但均已经达到过表达或干扰表达的效果。

5.4LncRNA16555过表达和干扰表达水稻转基因株系响应Cd胁迫的表型分析

从图22中可以看出，Cd胁迫后LncRNA16555过表达的株高相对抑制率显著降低，根长也有所下降但无显著差异，说明LncRNA16555过表达可增加水稻的Cd抗性。

从图23中可知，与野生型相比，LncRNA16555过表达植株的其中在叶、茎和地上部分的Cd含量均显著性增加。说明LncRNA16555的过表达会影响水稻植株Cd的吸收，LncRNA16555在调控Cd吸收中可能发挥一定的作用。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (9)

1.LncRNA16555基因在增强水稻镉抗性中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述LncRNA16555基因的核苷酸序列如SEQID NO：1所示，或者包含如SEQ ID NO：1所示序列的基因片段。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，过表达所述LncRNA16555基因，增强水稻镉抗性。

4.由权利要求1-3中任一项所述的LncRNA16555基因表达的蛋白在增强水稻镉抗性中的应用。

5.转入如权利要求1-3中任一项所述的LncRNA16555基因的重组载体在增强水稻镉抗性中的应用。

6.包含权利要求5所述的重组载体的宿主菌在增强水稻镉抗性中的应用。

7.一种利用基因过表达增强水稻镉抗性的方法，其特征在于，通过构建LncRNA16555基因的重组表达载体，将所述重组表达载体转入水稻使得所述LncRNA16555基因在水稻中过表达，以增强水稻镉抗性。

8.一种培育镉抗性增强水稻的方法，其特征在于，通过构建LncRNA16555基因的重组表达载体，将所述重组表达载体转入水稻使得所述LncRNA16555基因在水稻中过表达，得到镉抗性增强水稻。

9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述LncRNA16555基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，或者包含如SEQ ID NO：1所示序列的基因片段。

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