CN113637679A - 一种抗逆植物基因及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物遗传工程技术领域，提出了一种抗逆植物基因及应用，从高粱中克隆得到SbANR01基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，SbANR01基因的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，高粱中的SbANR01基因为提高植物抗逆能力提供了一种新的调控基因资源，可用于抗逆植物材料的培育和改良，通过上述技术方案，解决了相关技术中对于非生物抗逆性的分子机制了解不透彻的问题，所克隆SbANR01基因在抗逆调控中发挥功能，可用于增强植物抗逆性。
Description
技术领域
本发明涉及植物遗传工程技术领域，具体的，涉及一种抗逆植物基因及应用。
背景技术
高粱是世界五大作物之一，具有较强的耐盐、耐旱性，广泛种植于干旱、半干旱地区。甜高粱是普通谷物高粱的变种，是一种具有广泛适应性的糖作物，并具有生产生物能源的潜力。与普通高粱和玉米相比，甜高粱相对地更能适应边际生产条件，如盐胁迫、碱胁迫、水胁迫以及其他环境胁迫。我国高粱种植面积近200万hm2，种质资源非常丰富，运用高粱独特的耐盐能力开发利用盐碱地，是增加我国粮食产量和提高地区经济收入的有效措施。
盐碱胁迫是农作物生产的主要限制因子之一。盐碱胁迫影响了全世界超过800公顷的土地，盐碱胁迫是影响农业的一个主要环境威胁。盐碱胁迫涉及渗透胁迫、离子失衡等复杂过程，并引发次生胁迫，如植物体内毒素积累、营养失衡、氧化胁迫，最终导致植物生长发育减缓。植物对盐渍化条件的防御依赖于参与胁迫感知、信号转导的分子网络级联的激活，以及与胁迫相关的特殊基因和代谢物的表达。因此，了解非生物抗逆性的分子机制对于未来发展抗逆性作物和利用盐碱地有重要意义。
盐碱胁迫诱导或抑制许多基因表达，对基因表达调控的研究成为近些年来的热点。高粱基因组序列的公布和测序技术的发展为研究环境胁迫和高粱基因响应的相互作用机制提供了良好的参考。
发明内容
本发明提出一种抗逆植物基因及应用，解决了相关技术中对于非生物抗逆性的分子机制了解不透彻，导致盐碱地利用率低的问题。
本发明的技术方案如下：
一种抗逆植物基因，从高粱中克隆得到SbANR01基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
作为进一步的技术方案，所述SbANR01基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
一种SbANR01基因在提高植物抗逆性的应用。
作为进一步的技术方案，包括以下步骤：
A、对不同抗盐能力品种的高粱进行RNA提取，进行高通量转录组深度测序，获得转录本序列，将转录本序列与数据库进行比对，进行转录本序列的编码区序列及其对应氨基酸序列的预测，通过数据库比对，获得转录本序列的注释信息，进而得到所述SbANR01基因的数据；
B、提取高粱RNA，RT-PCR，设计PCR引物SbANR01F和SbANR01R，PCR扩增克隆获得SbANR01基因；
C、PCR扩增产物与载体连接，连接产物与大肠杆菌感受态细胞混匀，大肠杆菌再进行菌落PCR鉴定，对菌落PCR鉴定的重组载体，命名为pGreen-SbANR01，进行测序；
D、在测序正确的大肠杆菌的菌液中提取pGreen0029质粒，所述pGreen0029质粒加入农杆菌菌株GV3101感受态细胞，再对农杆菌菌液进行菌落PCR鉴定；
E、制备已成功转化所述pGreen0029质粒的所述农杆菌菌液，喷洒到拟南芥植株上，使得所述SbANR01基因在所述拟南芥中表达，得到阳性拟南芥植株。
作为进一步的技术方案，步骤A中所述高粱具体河农16和高粱蔗。
作为进一步的技术方案，步骤E包括如下步骤：
E1、制备已转化所述pGreen0029质粒的所述农杆菌菌液10ml，在转化的前一天晚上，转入大瓶培养过夜，使所述农杆菌菌液OD600＝1.2-1.6；
E2、室温5000rpm离心15min；
E3、弃上清，将农杆菌沉淀悬浮于相等体积的渗透培养基中，使OD600＝0.8；
E4、将农杆菌悬浮液直接喷洒至整个植株，盖上盖子，避光过夜，第二天后正常培养；
E5.、一周后再喷洒一次；
E6、拟南芥纯系筛选，拟南芥收获的种子进行4度纯化一周，种植于穴盘，7天后喷洒basta除草剂，存活的即为阳性苗。
作为进一步的技术方案，阳性植株的检测包括如下步骤：在1/2MS固体培养基上播撒消毒后的种子，并在培养基中添加basta除草剂，生长14d后，移栽根长且叶绿的幼苗到营养土里，提取DNA，经PCR鉴定正确后，即获得转基因阳性植株，再经后续纯化得到纯合体种子。
F、将收获的拟南芥纯系种子进行4度春化一周，种植于穴盘，7天后喷洒basta除草剂，于21日龄时进行盐胁迫处理，用0.8％的氯化钠溶液透灌，每24h透灌一次，3-5d检验转基因和野生型拟南芥植株的耐盐性。
G、为了验证转SbANR01拟南芥的耐盐功能，以Actin(LOC110436378)为内参基因(ActinF：ggtcctcttccagccatcctt；Actin R：atttccttgcctcatcctgtca)，测定SbANR01基因的表达，采用qRT-PCR验证该基因功能。利用0.8％NaCl溶液对野生型、转空载体、转SbANR01基因拟南芥生长21d的幼苗进行盐胁迫一周处理，选取0、24h、48h、72h NaCl胁迫的植株提取RNA进行qRT-PCR分析。在每个反应中设置对照，使用2-ΔΔCt法计算相对表达水平，qRT-PCR结果是3个技术重复的平均值。
本发明的工作原理及有益效果为：
本发明的高粱基因SbANR01为提高植物抗逆能力提供了一种新的调控基因资源，可用于抗逆植物材料的培育和改良，解决了相关技术中对于非生物抗逆性的分子机制了解不透彻的问题，所克隆SbANR01基因在抗逆调控中发挥功能，可用于增强植物抗逆性。
本发明中，从高粱中进行SbANR01基因的克隆，根据对不同抗盐能力的高粱的高通量转录组深度测序对进行数据组装，高粱品种可以选择三种，筛选到与抗盐相关基因SbANR01基因，然后利用引物设计软件Primer Premier 5设计PCR引物，从高粱叶片中提取总RNA，反转录PCR，克隆获得SbANR01基因。进一步可以通过基因表达定量分析验证出，SbANR01在抗盐性不同高粱植株表达量不同，并在盐碱胁迫后表达水平显著升高。将SbANR01转入拟南芥种，当在拟南芥中表达基因时，可以引发细胞超敏反应，并使抗逆相关基因表达水平明显增高，表明有SbANR01基因可以提高植物的抗逆性，盐胁迫下转基因拟南芥抗逆性好于野生型。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1为本发明中克隆高粱中SbANR01基因琼脂糖凝胶电泳图；
图2为本发明河农16和高粱蔗两种高粱种子核苷酸序列比对结果；
图3为本发明河农16和高粱蔗两种高粱种子氨基酸序列比对结果；
图4为本发明中拟南芥阳性苗DNA电泳图；
图5为本发明转SbANR01基因、转空载体、野生型拟南芥幼苗胁迫后生长情况；
图6为本发明盐胁迫处理后转SbANR01基因、转空载体、野生型拟南芥实时定量结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都涉及本发明保护的范围。
实施例1:一种SbANR01基因在提高植物抗逆性的应用包括如下步骤
A、高粱高通量转录组测序
为了获得功能基因转录本序列，利用高粱栽培品种组织样品，通过分别提取2个品种的叶片、根系混合样品，2个品种为：河农16(HN16)和高粱蔗，将共6份样品进行高通量转录组序列测定。
A1、试剂
植物RNA提取试剂Trizol购于Invitrogen公司，DNA酶I(Dnase I)购于TaKaRa公司，RNA文库制备试剂盒(RNA Library Prep Kit)来自北京百迈客生物科技有限公司，其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。
A2、植物材料：河北农业大学提供高粱品种种子。河农16，高粱蔗，通过前期预实验得知，其抗盐性高粱蔗较强，河农16对盐较为敏感。
A3、方法
A3.1RNA提取
1)使用液氮研磨法破碎100mg高粱组织，移至1.5mL离心管中，加入1ml Trizol，剧烈震荡，室温放置5min；
2)离心管中加入200μL氯仿，振荡30s混匀，室温放置5min；
3)4℃，12000rpm离心15min；
4)将上清液700μL移至1.5mL离心管中，下层有机相和中间层有蛋白质和其他杂质，避免触及吸取；
5)在上清液中加入等体积异丙醇，混匀，室温放置10min；
6)4℃，12000rpm离心15min，弃上清；
7)加入1mL 70％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；
8)4℃，12000rpm离心5min，弃上清；
9)室温干燥5～10min；
10)加入50μL无RNA酶水(RNase-free H2O)，溶解RNA；
11)根据RNA溶液浓度取RNA 50μg，加入5μL 10X缓冲液(400mM Tris-HCL,pH 7.5,80mM MgCl2,50mM DTT)、5μL Dnase I、2μL RNA酶抑制剂，37℃反应30min；
12)加入2.5μL 0.5M EDTA，80℃，2min失活Dnase I；
13)加入10μL 3M醋酸钠和250μL预冷的乙醇，-80℃放置20min；
14)4℃，12000rpm离心10min，弃上清；
15)加入1mL 70％乙醇清洗RNA；
16)4℃，12000rpm离心5min，弃上清；
17)室温干燥5～10min；
18)加入50μL无RNA酶水，溶解RNA；
19)检测RNA样品的纯度、浓度。
A3.2转录组测序组装与注释
转录组测序利用RNA Library Prep Kit，通过Illumina HiSeq高通量测序平台，按以下步骤进行：
1)用带有Oligo(dt)的磁珠富集真核生物RNA，将mRNA进行随机打断；
2)以mRNA为模版，用六碱基随机引物合成第一条cDNA链，然后加入dNTPs、RNA酶H和DNA聚合酶I合成第二条cDNA链，利用微珠(beads)纯化cDNA；
3)纯化的双链cDNA再进行末端修复，并连接测序接头，然后用微珠进行片段大小选择，通过PCR富集得到cDNA文库；
4)对文库的浓度和插入片段大小进行检测；
5)利用Illumina HiSeq高通量测序平台对cDNA文库进行测序，测序读长为PE125；
6)将测序片段(reads)截除测序接头、引物序列，过滤低质量值数据后，获得高质量的测序数据；
7)利用Trinity组装软件将高质量测序read延伸成较长的片段(contig)，并利用这些片段之间的重叠，得到片段集合(component)，最后利用De Bruijn做图的方法获得转录本序列(unigene)；
8)使用BLAST软件将转录本序列与NR(NCBI非冗余数据库)、Swiss-Prot(欧洲生物信息学研究所维护数据库)、GO(Gene Ontology)、COG(Clusters of OrthologousGroups)、KOG(euKaryotic Orthologous Groups)、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes)数据库比对；
9)利用TransDecoder软件进行unigene的编码区序列及其对应氨基酸序列的预测，使用HMMER软件与Pfam(Protein family)数据库比对，获得转录本序列(unigene)的注释信息。
A4、结果
对高粱进行高通量转录组深度测序，然后对测序序列进行组装和基因功能的预测，对转录因子基因的组装注释和分析，得到SbANR01基因数据。
B、SbANR01基因克隆
根据步骤A中得到高粱SbANR01基因的数据，利用引物设计软件P rimer Premier5.0设计PCR引物，从高粱植株中提取总RNA，反转录PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR)，PCR克隆获得SbANR01基因。
B1、试剂
植物RNA提取试剂Trizol购于Invitrogen公司，DNA酶I(Dnase I)购于TaKaRa公司，反转录酶、dNTP、高保真DNA聚合酶购于北京全式金生物技术有限公司，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。
B2、载体与菌株
克隆载体pGreen0029购自华越洋生物，大肠杆菌感受态(Escherichia Coli)DH5α感受态购于北京全式金生物技术有限公司，GV3101农杆菌感受态细胞购于昂羽生物。质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购于天根生化科技有限公司，高保真DNA聚合酶购于宝日医(北京)生物技术有限公司(Code No：R045A)，限制性内切酶QuickCutTM SmaⅠ、QuickCutTMEcoRⅠ购于宝生物公司(Code No：1629)，无缝克隆试剂盒购于US Everbright公司(CodeNo：M2026)，其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。
B3、培养基与试剂
LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。用NaOH调pH至7.0，高压灭菌。
LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，琼脂粉10g/L。用NaOH调pH至7.0，高压灭菌。
1000×盐酸四环素：100mg/mL，溶于灭菌去离子水，-20℃保存。
1000×卡那霉素：100mg/mL，溶于灭菌去离子水，-20℃保存。
1000×利福平：100mg/mL，溶于灭菌去离子水，-20℃保存。
B4、方法
B4.1高粱叶片组织RNA提取：如步骤A3.1所述操作步骤进行。
B4.2RT-PCR
B4.2.1RT
1)取1μg总RNA与1μL polyT18(10μM)引物混合，用RNase-free ddH2O补足到12.75μL，轻轻混匀；
2)65℃保温5min，立即转移至冰浴中，放置2min；
3)加入5×反应缓冲液4μL、10mM dNTP 2μL、RNA抑制剂0.25μL(40U/μL)、反转录酶1μL(100U/μL)，42℃1h，合成第一链cDNA；
4)95℃加热5min，失活反转录酶，终止反应。
B4.2.2PCR
根据步骤A4所获得的Sobic 3基因推测序列，利用Primer Premier 5.0软件设计引物序列如下
Sobic 3F:5’AAGCTTGATATCGAATTCATGTCAGAGGGCGGCAGGAA 3’
Sobic 3R:5’ACTAGTGGATCCCCCGGGTCAGTTGGGCAGAACCCCCA 3’
将B4.2.1所获高粱叶片组织的cDNA，进行SbANR01基因的克隆。
将200μL EP管放置于冰上，加入试剂
2×Es Taq MasterMix(Dye)25μL；Forward Primer(10μM)2μL；Reverse Primer(10μM)2μL；Template DNA 0.5μg，RNase-free ddH2O补足到50μL，轻轻混匀；
按以下程序进行扩增：94℃2min(预变性)；94℃30s(变性)，56℃30s(复性)，72℃30s(延伸)，所述变性-复性-延伸30个循环；72℃2min(总延伸)。
通过上述操作，获得了Sobic 3基因的PCR扩增产物。
琼脂糖凝胶电泳，电泳照片见图1；
图1中从左至右，第6、13泳道为marker-DL2000,第1、2、4、5、7、8、10、11泳道为高粱中克隆SbANR01基因电泳图。
B5胶纯化
将B4.2获得的PCR片段进行胶回收，实验步骤按试剂盒使用说明所述进行。
1)向胶回收吸附柱CA2中加入500μL平衡液BL，12000rpm离心1min，弃去柱底部废液；
2)在紫外切胶仪器上回收电泳分离DNA片段，将切下的凝胶块放入EP管中；
3)根据胶的质量按照1:1体积加入溶胶液PN。将EP管放入50℃的加热器上，溶解10～15min，至胶完全溶解为止；
4)溶胶完全后，待其冷至室温，将溶解液体转入胶回收吸附柱CA2中，静置3min，使溶胶液和吸附膜充分接触；
5)12000rpm离心1min，弃去柱底部废液。向吸附管中加入600μL的PW，静置3min；
6)12000rpm离心1min，弃去柱底部废液。完成后重复上一步过程；
7)将空的吸附柱放入离心机中12000rpm离心3min，放置15min，待酒精全部挥发干净；
8)向吸附柱CA2中正中心吸附膜上加入30μL洗脱剂EB，静置3min，12000rpm离心3min，获得胶回收产物。
C、PCR扩增产物与载体连接、大肠杆菌转化、测序
C1、载体双酶切片段化：
利用QuickCutTM SmaⅠ、QuickCutTM EcoRⅠ对载体进行双酶切：1μg质粒，QuickCutTM SmaⅠ、QuickCutTM EcoRⅠ各1μL，10×QuickCut Buffer 5μL，RNase-freeddH2O补足到50μL，30℃5min；
Super Fusion Cloning Mix(2×)5μL，线粒化载体100ng，目的DNA片段100ng，RNase-free ddH2O补足到100μL，50℃45min；
C2、大肠杆菌转化
1)取出冻存的大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α感受态细胞冰浴解冻；
2)将PCR扩增产物与载体的连接产物与大肠杆菌感受态细胞轻轻混匀，冰浴30min；
3)42℃热冲击90s，立即冰浴1～2min；
4)加入0.8mL LB，混匀，37℃温和振荡培养1h；
5)室温13000rpm离心1min，倒掉一部分上清液，留约200μL的上清液，用吸头将上清液与细胞混匀，涂布于含有卡那霉素和盐酸四环素(100μg/mL)的LB平板，37℃培养12h。
C3、菌落PCR鉴定
1)将C2得到的大肠杆菌再进行菌落PCR鉴定，以确定插入片段是目标片段，反应体系如下：将200μL EP管放置于冰上，加入试剂
2×Es Taq MasterMix(Dye)25μL；Forward Primer(10μM)2μL；Reverse Primer(10μM)2μL；菌液1μL，RNase-free ddH2O补足到50μL，轻轻混匀；
按以下程序进行扩增：94℃2min(预变性)；94℃30s(变性)，56℃30s(复性)，72℃30s(延伸)，所述变性-复性-延伸30个循环；72℃2min(总延伸)。
C4、测序
对菌落PCR鉴定的重组载体，命名为pGreen-SbANR01，对高粱蔗品种进行测序。测序结果表明，获得了连接于pGreen克隆载体的SbANR01基因全长序列。其中SbANR01基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：
ATGTCAGAGGGCGGCAGGAAGCAGAAGACGGCGTGCGTGACCGGAGGTAACGGGTACATCGCCTCGGTGCTCATCAAGAT
GCTGCTCGAGAATGGCTACGCCGTGAAGACGACGGTCAGGAACCCCGATGACATGGCCAAGAATTCCCACCTCAAGGACA
TGCAGGCGGTCGGCCCCCTGACAGTCCTCCGCGCCGACCTGCTAGAAGAAGGCAGCTTCGACGAGGCCGTCGCCGGCTGC
GACTACGCCTTCCTCATCGCCGCTCCGGTGAACCTCCATTCGAAGAATCCTGAGAAAGAACTGATCGAGCCTGCTGTCCG
AGGAATCCTGAACGTCATGAGGTCGTGTGCCAAGGCAGGGACAGTGAAGCGCGTGATTCTGACCTCGTCGGCGGCTGCAG
TCGCCGGCAGGCCGTTGCAAGGCGGCGGCCACGTTCTGGACGAGGAGTCCTGGACCGACGTCGAGTACCTCACTGCCAAA
AAGTCCAGTCACTGGGGGTACGGGGTCTCCAAGGTGCTCGCGGAGAAGGAGGCGTGCAGGTTTGCGAAGGAGCACGGCAT
CAACTTCGTCAGCGTCTGCCCCGTCCTCACCGTCGGCGCAGCACCTGCCACAAAGATGGACACGAGCCTCCACGCTAGCC
TCTCCTGCTTTGCAGGCGACGAAGCAGCGTTCCGGGTGCTGAGAGGAATCGAGATGGCCACGGGCTGCATGCCGCTGGTT
CACGCCGCTGACCTGTGCCGTGCGCAGATGTTCGTCGCCGAGGAGGACGCGGCCGCCGGGAGGTACATCTGCTGCAGCGT
CAACACCACCATCGTCGAGCTCGCCCATTTCCTGGCGGACAAGTACCCGCAGTACACCGTGAAGACACATCTGCTCTCCT
CCGGGGTCCTTGAAAAGCCGAGAGTGAGCCTGTCGTCGGCGAGGCTGCTCGGCGAAGGGTTCAAGTTCAAGTACGAGACG
CTGGACGAGATCTACGACGACGTGGTGGCGCAGGGCAAGGCCCTGGGGGTTCTGCCCAACTGA
SbANR01基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体如下：
MSEGGRKQKTACVTGGNGYIASVLIKMLLENGYAVKTTVRNPDDMAKNSHLKDMQAVGPLTVLRADLLEEGSFDEAVAGC
DYAFLIAAPVNLHSKNPEKELIEPAVRGILNVMRSCAKAGTVKRVILTSSAAAVAGRPLQGGGHVLDEESWTDVEYLTAK
KSSHWGYGVSKVLAEKEACRFAKEHGINFVSVCPVLTVGAAPATKMDTSLHASLSCFAGDEAAFRVLRGIEMATGCMPLV
HAADLCRAQMFVAEEDAAAGRYICCSVNTTIVELAHFLADKYPQYTVKTHLLSSGVLEKPRVSLSSARLLGEGFKFKYET
LDEIYDDVVAQGKALGVLPN
其他两个品种河农16和高粱蔗的DNA序列与TX623B对比，
核苷酸对比见图2，
氨基酸对比见图3，
发现：在河农16中有15个碱基发生了突变，高粱蔗没有变化。见表1。
表1基因在河农16中的突变碱基
通过氨基酸序列比对，在三个品种中，河农16的氨基酸序列在6个位置发生了变化。见表2。
表2基因在河农16中的氨基酸序列变化
| 氨基酸位置 | 155 | 216 | 217 | 218 | 255 | 276 |
| 河农16 | D-天冬氨酸 | I-异亮氨酸 | I-异亮氨酸 | S-丝氨酸 | K-赖氨酸 | D-天冬氨酸 |
| 高粱蔗 | E-谷氨酸 | C-半胱氨酸 | E-谷氨酸 | A-丙氨酸 | E-谷氨酸 | H-组氨酸 |
D、SbANR01基因表达载体构建
将测序正确的大肠杆菌菌液，质粒小提
D1、试剂与B1中相同；
D2、载体与菌株与B2中相同；
D3、培养基与试剂与B3中相同；
D4、方法
D4.1质粒提取
1)柱平衡：向吸附柱中加入500μL平衡液BL，12000rpm，离心1min，弃废液；
2)12000rpm，离心1min，收集菌沉淀，弃尽上清；加入250μL P1(已加RNase A)，吹吸混匀至菌沉淀彻底悬浮；
3)加入250μL P2，温和上下翻转8次离心管，使菌体充分裂解；
4)加入350μL P3，温和上下翻转8次离心管，12000rpm，离心10min；
5)吸出上清至新的离心管中，12000rpm，离心5min；
6)小心转移上清至吸附柱中，12000rpm，离心1min，弃废液；
7)加入500μL PD，12000rpm，离心1min，弃废液；
8)加入600μL PW(已加无水乙醇)，12000rpm，离心1min，弃废液，重复操作一次；
9)12000rpm，离心2min，除尽残留的PW；
10)将吸附柱转移至新离心管中，在柱中央加入50μL无菌去离子水，室温放置2min，12000rpm，离心2min，洗脱DNA；
E、农杆菌转化以及SbANR01基因在拟南芥中表达
农杆菌转化
1)按D4.1步骤提取pGreen0029质粒；
2)将所提取质粒pGreen0029加入50μL农杆菌菌株GV3101感受态细胞中，轻轻混匀，在冰上冰浴30min；
3)放置于液氮中冷激1min；
4)将EP管移置于37℃恒温加热器上，加热5min；
5)加入SOC培养液800μL，放置于摇床中28℃，200rpm培养4～5h；
6)菌液于4000rpm离心5min；
7)在超净台中吸取上清，剩余约100μL，将菌体轻轻吹打悬浮混匀；
8)以灭菌玻璃球将菌液均匀涂布于LB+Rif+Kan+Met固体培养基，于28℃恒温培养箱培养48h；
9)按C3相同方法步骤进行菌落PCR鉴定，并将鉴定转入重组质粒的阳性农杆菌-80℃保存。
SbANR01基因在拟南芥中表达
将SbANR01基因通过农杆菌介导方法在拟南芥中稳定表达，对SbANR01基因表达情况进行检测，
1、试剂
RNA提取、反转录试剂如前面所述；实时定量PCR试剂如前面所述；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。
2、植物材料
拟南芥(Arabidopsis thaliana)(哥伦比亚野生型)为本实验室保存，种植于人工气候培养室。
3、培养基与试剂
渗透培养基：1/2MS，5％蔗糖；0.5g MES；用KOH调pH至5.7；再加入10μL 1mg/ml的6-BA；200μL Siwet L-77；
3转化步骤：
E1.制备已转化相应质粒的农杆菌液10ml，在转化的前一天晚上，转入大瓶培养过夜，使农杆菌液OD600＝1.2-1.6
E2.室温5000rpm离心15min
E3.弃上清，将农杆菌沉淀悬浮于相等体积的渗透培养基中，使OD600＝0.8左右
E4.将农杆菌悬浮液直接喷洒至整个植株，盖上盖子，避光过夜，第二天开干正常培养
E5.一周后再喷洒一次
4拟南芥纯系筛选，
将拟南芥收获的种子进行4度纯化一周，种植于穴盘，7天后喷洒basta除草剂，存活的即为阳性苗。
F、阳性植株检测
在1/2MS固体培养基上播撒消毒后的种子，并在培养基中添加basta除草剂。生长14d后，移栽根长且叶绿的幼苗到营养土里，提取DNA，经PCR鉴定正确后，即获得转基因阳性植株，再经后续纯化得到纯合体种子。阳性苗DNA电泳照片见图4。图4中从左至右，第一泳道为marker-DL2000，第2-11泳道为拟南芥阳性苗中SbANR01基因电泳图。
G、转基因拟南芥耐盐试验
将收获的拟南芥纯系种子进行4度纯化一周，种植于穴盘，7天后喷洒basta除草剂，于21日龄时进行盐胁迫处理，用0.9％的氯化钠溶液透灌，每24h透灌一次，分别于处理0h，24h，48h，72h，取叶片，液氮速冻后于-80摄氏度保存，并拍照留存。
实施例2SbANR01基因在拟南芥中表达情况
试剂及仪器：植物RNA提取试剂Trizol购于Invitrogen公司，RT-qPCR Kit购自康为世纪，RT-qPCR仪采用BIO-BAD7706
植物材料培养：转SbANR01基因拟南芥、转空载体拟南芥，野生型拟南芥，由河北农业大学提供
材料培养：不同类型拟南芥种子经70％乙醇消毒1min后，蒸馏水冲洗，浸种催芽24小时，发芽温度为25℃±1℃。将出芽整齐的种子播于消毒后的石英砂中，光照室中常规育苗，21d进行盐处理。利用0.8％NaCl溶液浇灌幼苗，每24h更新盐溶液，于0h，24h，48h，72h，取样，取样部位为全株。液氮中冷冻并储存在-80℃下，每次处理重复三次。
RNA提取：同实施例1中A3.1RNA提取
RT-PCR：
1)取1μg总RNA与10×gDNA Remover Mix混合，用RNase-free ddH2O补足到10μL，轻轻混匀；
2)42℃孵育2min，反应结束后，短暂离心，至于冰上冷却。
3)加入5×HiFiScript RTMaster Mix 10μL、RNase-free ddH2O 6μL，37℃15min，85℃5s,合成第一链cDNA；
RT-qPCR：
设计引物，引物设计由primer设计完成，合成引物由上海生工完成，引物：F：TTTCCTGGCGGACAAGTACC，R：AGGCTCACTCTCGGCTTTTC
实验方法：采用康为世纪UltraSYBR One Step RT-qPCR Kit。
1.将RNA模板、引物、2×UltraSYBR One Step Buffer、UltraSYBR One StepEnzymeMix和RNase-Free Water溶解并置于冰上备用。
2.PCR反应体系：
反应程序：
35个循环实验结果：盐胁迫下，转SbANR01基因拟南芥幼苗生长情况良好，转空载体和野生型拟南芥幼苗出现萎蔫。实验结果见图5，图5中左1为转基因拟南芥，左2为转入空载体拟南芥，左3为野生型拟南芥。
实时定量结果表明转SbANR01基因拟南芥表达量在72h增加显著(图6)，基因表达量上升幅度大于转空载体和野生型拟南芥，表明转SbANR01基因拟南芥耐盐性优于野生型和转入空载体拟南芥。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种抗逆植物基因，其特征在于，从高粱中克隆得到SbANR01基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种抗逆植物基因，其特征在于，所述SbANR01基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种SbANR01基因在提高植物抗逆性的应用。
4.根据权利要求3所述的一种SbANR01基因在提高植物抗逆性的应用，包括以下步骤：
A、对不同抗盐能力的高粱进行RNA提取，进行高通量转录组深度测序，获得转录本序列，将转录本序列与数据库进行比对，进行转录本序列的编码区序列及其对应氨基酸序列的预测，通过数据库比对，获得转录本序列的注释信息，进而得到高粱所述SbANR01基因的数据；
B、提取高粱RNA，RT-PCR，设计PCR引物SbANR01F和SbANR01R，PCR扩增克隆获得SbANR01基因；
C、PCR扩增产物与载体连接，连接产物与大肠杆菌感受态细胞混匀，大肠杆菌再进行菌落PCR鉴定，对菌落PCR鉴定的重组载体，命名为pGreen-SbANR01，进行测序；
D、在测序正确的大肠杆菌的菌液中提取pGreen0029质粒，所述pGreen0029质粒加入农杆菌菌株GV3101感受态细胞，再对农杆菌菌液进行菌落PCR鉴定；
E、制备已成功转化所述pGreen0029质粒的所述农杆菌菌液，喷洒到拟南芥植株上，使得所述SbANR01基因在所述拟南芥中表达，得到阳性拟南芥植株。
5.根据权利要求4所述的一种SbANR01基因在提高植物抗逆性的应用，其特征在于，步骤A中所述高粱具体为河农16和高粱蔗。
6.根据权利要求4所述的一种SbANR01基因在提高植物抗逆性的应用，其特征在于，步骤E包括如下步骤：
E1、制备已转化所述pGreen0029质粒的所述农杆菌菌液10ml，先转入大瓶培养过夜，使所述农杆菌菌液OD600＝1.2-1.6；
E2、室温5000rpm离心15min；
E3、弃上清，将农杆菌沉淀悬浮于相等体积的渗透培养基中，使OD600＝0.8；
E4、将农杆菌悬浮液直接喷洒至整个植株，盖上盖子，避光过夜；
E5、7～10天后再喷洒一次；
E6、拟南芥纯系筛选，拟南芥收获的种子进行4度纯化一周，种植于穴盘，7～10天后喷洒basta除草剂，存活的即为阳性苗。
7.根据权利要求6所述的一种SbANR01基因在提高植物抗逆性的应用，其特征在于，阳性植株的检测包括如下步骤：在1/2 MS固体培养基上播撒消毒后的种子，并在培养基中添加basta除草剂，生长14d后，移栽根长且叶绿的幼苗到营养土里，提取DNA，经PCR鉴定正确后，即获得转基因阳性植株，再经后续纯化得到纯合体种子。
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| 董明等: "高粱苗期耐盐性转录组分析和基因挖掘", 中国农业科学, vol. 52, no. 22, pages 3987 - 4001 * |
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