CN112795580A

CN112795580A - 火龙果基因HuAAE3及其在调控植物抗高温胁迫中的应用

Info

Publication number: CN112795580A
Application number: CN202110209840.9A
Authority: CN
Inventors: 夏快飞; 张明永; 徐卫娟; 贾永霞; 曾璇; 陈建通
Original assignee: South China Botanical Garden of CAS
Current assignee: South China Botanical Garden of CAS
Priority date: 2021-02-24
Filing date: 2021-02-24
Publication date: 2021-05-14
Anticipated expiration: 2041-02-24
Also published as: CN112795580B

Abstract

本发明公开了一种火龙果基因HuAAE3及其在调控植物抗高温胁迫中的应用，所述火龙果基因HuAAE3的核酸序列如SEQIDNO.1所示，或为与SEQIDNO.1完全互补配对的序列，其编的码氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。通过研究发现，上述火龙果HuAAE3基因表达的植物的草酰辅酶A合成酶AAE3参与热胁迫应答，这对于全面理解植物中草酰辅酶A合成酶AAE3的生物学功能具有重要的意义。同时，发明人通过转基因的方法对HuAAE3基因进行过表达，伴随着HuAAE3基因的表达量提高，拟南芥对高温的抗性提高。因此可将火龙果HuAAE3基因和相应蛋白应用于农作物的基因工程遗传育种，培育耐高温的作物品种，降低高温对粮食作物带来的安全危害，并对其它作物的高温耐受性相关研究具有重要参考意义。

Description

火龙果基因HuAAE3及其在调控植物抗高温胁迫中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及火龙果基因HuAAE3及其在调控植物抗高温胁迫中的应用。

背景技术

火龙果(Hylocereus spp.)是仙人掌科、量天尺属或蛇鞭柱属植物，是一种热带，亚热带果树。火龙果原产于墨西哥及美洲大陆等地，后传入越南、泰国等东南亚国家和我国的台湾省，随后我国大陆的海南、广西、广东、福建等省区也进行了引种种植(许伟东等.火龙果引种初报[J].中国南方果树,2002,31(1):33-34.)。火龙果具有较高的经济价值，火龙果的花、茎、果实皆可食用和观赏，且果实具有丰富的营养价值，是集水果、花卉、蔬菜、保健于一体的特色植物，具有巨大的经济价值和广阔的发展前景(杨之湜等.火龙果的保健作用及发展前景[J].中国果业信息,2009,26(1):26-28.)。

温度作为影响植物生长发育的重要环境因子之一，温度发生变化会极大的影响植物的生长发育。全球温室效应造成全球温度升高，高温胁迫严重影响农作物的生长发育(Hasanuzzaman M.,et al.Physiological,biochemical,and molecular mechanisms ofheat stress tolerance in plants.Internationaljournal ofmolecular sciences,2013,14:9643-9684)，从而影响农作物的产量(Lesk C.,et al.Influence of extremeweather disasters on global crop production.Nature,2016,529:84-87)。因此，研究植物耐热机制和培育耐热品种具有重要的意义。火龙果作为一种热带水果，抗逆性强，具有较强的耐热和耐旱性，可以作为一种挖掘植物抗逆性基因的研究对象进行深入研究。

草酸是一种最简单的二元羧酸，广泛存在与动植物和微生物体中。草酸具有强酸性和螯合能力，在生物体中具有许多重要的功能，如能调节细胞内钙浓度，解铝毒，抗病虫害，参与光合作用等(Bo Libert and Vincent R.Franceschi.Absorption andtranslocation ofmetalaxyl in cabbage,red raspberry,and strawberry.JournalofAgricultural and Food Chemistry 198735(6),926-938)。草酰辅酶A连接酶能特异催化草酸转化成为草酰CoA，从而参与维持植物体内的草酸稳态(Foster J.,etal.Apreviously unknown oxalyl-CoA synthetase is important for oxalatecatabolism inArabidopsis.Plant Cell.2012Mar；24(3):1217-29.)。草酰辅酶A合成酶的生理功能主要有：参与草酸代谢、缓解铝毒(Lou HQ,et al.An Oxalyl-CoA Synthetase IsInvolved in Oxalate Degradation and Aluminum Tolerance.Plant Physiol.2016；172(3):1679-1690.)、抗虫抗病(Foster J,et al.An Oxalyl-CoA Dependent Pathway ofOxalate Catabolism Plays a Role in Regulating Calcium Oxalate CrystalAccumulation and Defending against Oxalate-Secreting Phytopathogens inMedicago truncatula.PLoS One.2016；11(2):e0149850.)、以及与种子贮存蛋白有关(Yang J,et al.Maize Oxalyl-CoA Decarboxylase1 Degrades Oxalate and Affectsthe Seed Metabolome and Nutritional Quality.Plant Cell.2018；30(10):2447-2462.)，在植物生长发育、适应生物和非生物胁迫响应起到了非常重要的作用。

发明内容

基于此，本发明的目的之一在于提供一种火龙果基因HuAAE3及其表达蛋白，所述火龙果基因HuAAE3能够改善植物耐热调控能力，有效调控植物抵抗高温胁迫，可用于提高植物的高温耐受性，培育耐高温的植物品种。

实现上述目的的技术方案如下：

一种火龙果基因HuAAE3，所述火龙果基因HuAAE3序列如SEQID NO.1所示，或为与SEQ ID NO.1完全互补配对的序列，或为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；或为编码氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的核酸序列。

一种火龙果基因HuAAE3的表达蛋白，所述火龙果基因HuAAE3的表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸，但蛋白活性相同。

本发明还提供了上述火龙果基因HuAAE3或上述火龙果基因HuAAE3的表达蛋白在调控植物抗高温胁迫中的应用。

本发明还提供了上述火龙果基因HuAAE3或上述火龙果基因HuAAE3的表达蛋白在植物育种中提高植物抵抗高温胁迫中的应用。

在其中一些实施例中，所述高温温度范围为40-50℃。

本发明还提供了一种火龙果基因HuAAE3重组表达载体。

具体技术方案为：

一种火龙果基因HuAAE3重组表达载体，所述重组表达载体上插入有上述火龙果HuAAE3基因，或所述重组表达载体上插入上述火龙果HuAAE3表达蛋白的基因。

上述重组表达载体在调控植物抗高温胁迫中的应用。

在其中一些实施例中，所述重组表达载体为pCAMBIA1302-HuAAE3。

上述重组表达载体在调控植物抗高温胁迫中的应用。

本发明还提供了一种调控植物抗高温胁迫的方法。

具体技术方案为：

一种调控植物抵抗高温胁迫的方法，该方法包括调控上述火龙果HuAAE3基因在植物中的表达。

在其中一些实施例中，所述高温温度范围为40-50℃。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的发明人发现一个火龙果HuAAE3基因和相应蛋白，该基因表达植物的草酰辅酶A合成酶AAE3参与热胁迫应答，这对于全面理解植物中草酰辅酶A合成酶AAE3的生物学功能具有重要的意义。同时，发明人通过转基因的方法对HuAAE3基因进行过表达，伴随着HuAAE3基因的表达量提高，拟南芥对高温的抗性提高。因此可将火龙果HuAAE3基因和相应蛋白应用于农作物的基因工程遗传育种，培育耐高温的作物品种，降低高温对粮食作物带来的安全危害，并对其它作物的高温耐受性相关研究具有重要参考意义。

附图说明

图1为实施例1中构建表达载体所用的pCAMBIA1302载体图谱。

图2为实施例1中基因HuAAE3过表达阳性转基因植株的检测，其中，1-24泳道为阳性转基因拟南芥植株HuAAE3-OX1—HuAAE3-OX24，25泳道为野生型拟南芥。

图3为实施例1中野生型和HuAAE3转基因拟南芥的定量检测，其中WT为：WildType，HuAAE3-OX7为：HuAAE3-Overexpress line 7，HuAAE3-OX16为：HuAAE3-Overexpressline 16，HuAAE3-OX18为：HuAAE3-Overexpress line 18。

图4为实施例2中高温45℃处理过表达拟南芥和野生型拟南芥比较，其中WT为：WildType，HuAAE3-OX7为：HuAAE3-Overexpress line 7，HuAAE3-OX16为：HuAAE3-Overexpress line 16，HuAAE3-OX18为：HuAAE3-Overexpress line 18。

图5为实施例2中高温45℃处理过表达拟南芥和野生型拟南芥比较，其中CK为：Control Check，即未经高温处理的阴性对照组，HS为：Heat Stress，即经高温处理的实验组。

图6为实施例3中火龙果在高温45℃处理下，HuAAE3基因在不同时间点的表达水平。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本发明所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

本发明的术语"包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或组分，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或组分。

在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

除非特别说明或另有定义，本发明所使用的“第一、第二…”仅仅是用于对名称的区分，不代表具体的数量或顺序。

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本发明所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

本发明所述火龙果HuAAE3基因的序列如SEQ ID NO.1所示，或为与SEQ ID NO.1完全互补配对的序列，或为编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的序列。

SEQ ID NO.1：

ATGGAGAGCTTGACTCTCACCGGCCTATTGAACGACGTCGCCGGAAAGTTCCATTCCCGGCGAGCCATATCTGCCGCCGGCAAGTACGACCTCACTCACTCTCGATTGAATGAACTGGTCGAACAGGCCGCTTCTCAACTCGTCGCCGCCGGCGTTCGTCCCGGCGATGTCGTCGCCCTCACCTACCCCAACACCGTCGAGTTTGTGATATTGTTCTTGGCGGTGGTGCGCGCCAGAGGGACGGCGGCGCCGCTAAATGCGGCGTATACGGCGGAGGAGTTCGAGTTCTACTTGTCTGACTCAGAGTCCAAACTCCTCGTTACTTCTATTGAAGGCAATAAGCAAGCAGAAGCCGCCGCTTCCAAGCTCAACATCCCCCATTCCACCGCCTTTCTTCCCTCCGGCGACTCGGACATCGTCCTCTCCCTGACTCAGGCCGAGTCAAACTCGCCCAGCTCGGTTGCCGGACTTGTCAATGAGCCATCTGACGTGGCCCTGTTCCTCCACACCTCCGGGACCACTTCCCGGCCCAAGGGGGTCCAACTGAGTCAGCTGAATTTGGTTTCCTCGGTACGGAATATTAAATCGGTGTACAGGCTCGCCGAGTCTGACTCGACGGTGATCGTTCTCCCGTTGTTCCACGTGCACGGGTTGATCGCCGGGTTGCTGAGTTCACTCGGTGCTGGCGCGGCGGTTACCTTGCCGGCCGCCGGGCGGTTCTCTGCTACGTCGTTTTGGTCGGATATGAAAAAGTATAACGCCACGTGGTATACGGCCGTCCCCACCATCCATCAGATCATCCTTGATAGGCACATCAACAAACCCGAGCCCGATTACCCGAACCTCCGGTTCATTCGGAGCTGCAGTGCATCGCTGGCTCCGGCTATACTGGAACGGTTGGAGGAGTCATTCGGAGCACCCGTTTTGGAGGCCTATGCGATGACAGAGGCGTCTCATTTGATGTGTTCCAACCCACTACCAGAAGATGGACCCCACAAGGCGGGTTCAGTGGGTCGACCCGTAGGCCAGGAGATGGCCATATTAGACGAGAATGGGGTCATCCAACCAAACGGGTCAAAGGGAGAAGTGTGTATTCGGGGTCCAAATGTGACCAAAGGGTATAAGAATAATCCAGAGGCAAATAAGGCGGCCTTCCAATTCGGGTGGTTCCACACAGGTGATGTTGGGTATCTTGATGAGGATGGGTATTTGCACTTGGTCGGCCGGATTAAAGAGCTCATCAACCGTGGAGGGGAAAAGATTTCACCAATTGAGGTGGATGCAGTGCTTTTATCTCACCCTGATATTGCCCAAGCTGTTGCTTTCGGGGTCCCAGATGACAAGTATGGTGAAGAGATAAATTGTGCAGTTATCCCGAGAGAAGGAGCAAAGATTGATGAGCATGAAGTAATAACCTTTTGCAAGAAAAATCTGGCAGCCTTCAAGGTCCCTAAGAAGGTTTTCATCACCGATTTTCTCCCTAAAACTGCGAGTGGGAAGATCCAGCGAAGGATCGTAGCAGAACACTTCCTTGCACAGATCTCTACTGCCAAAGTCCCCAAGTTCGGTGCT

应当理解，考虑到密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，对上述碱基序列进行修改，也属于本发明的保护范围。

本发明所述火龙果HuAAE3基因的表达蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.2

MESLTLTGLLNDVAGKFHSRRAISAAGKYDLTHSRLNELVEQAASQLVAAGVRPGDVVALTYPNTVEFVILFLAVVRARGTAAPLNAAYTAEEFEFYLSDSESKLLVTSIEGNKQAEAAASKLNIPHSTAFLPSGDSDIVLSLTQAESNSPSSVAGLVNEPSDVALFLHTSGTTSRPKGVQLSQLNLVSSVRNIKSVYRLAESDSTVIVLPLFHVHGLIAGLLSSLGAGAAVTLPAAGRFSATSFWSDMKKYNATWYTAVPTIHQIILDRHINKPEPDYPNLRFIRSCSASLAPAILERLEESFGAPVLEAYAMTEASHLMCSNPLPEDGPHKAGSVGRPVGQEMAILDENGVIQPNGSKGEVCIRGPNVTKGYKNNPEANKAAFQFGWFHTGDVGYLDEDGYLHLVGRIKELINRGGEKISPIEVDAVLLSHPDIAQAVAFGVPDDKYGEEINCAVIPREGAKIDEHEVITFCKKNLAAFKVPKKVFITDFLPKTASGKIQRRIVAEHFLAQISTAKVPKFGA。

本发明所述火龙果HuAAE3基因的cDNA阅读框序列如SEQ ID NO.3所示，包括翻译起始密码子和终止密码子。

SEQ ID NO.3：

ATGGAGAGCTTGACTCTCACCGGCCTATTGAACGACGTCGCCGGAAAGTTCCATTCCCGGCGAGCCATATCTGCCGCCGGCAAGTACGACCTCACTCACTCTCGATTGAATGAACTGGTCGAACAGGCCGCTTCTCAACTCGTCGCCGCCGGCGTTCGTCCCGGCGATGTCGTCGCCCTCACCTACCCCAACACCGTCGAGTTTGTGATATTGTTCTTGGCGGTGGTGCGCGCCAGAGGGACGGCGGCGCCGCTAAATGCGGCGTATACGGCGGAGGAGTTCGAGTTCTACTTGTCTGACTCAGAGTCCAAACTCCTCGTTACTTCTATTGAAGGCAATAAGCAAGCAGAAGCCGCCGCTTCCAAGCTCAACATCCCCCATTCCACCGCCTTTCTTCCCTCCGGCGACTCGGACATCGTCCTCTCCCTGACTCAGGCCGAGTCAAACTCGCCCAGCTCGGTTGCCGGACTTGTCAATGAGCCATCTGACGTGGCCCTGTTCCTCCACACCTCCGGGACCACTTCCCGGCCCAAGGGGGTCCAACTGAGTCAGCTGAATTTGGTTTCCTCGGTACGGAATATTAAATCGGTGTACAGGCTCGCCGAGTCTGACTCGACGGTGATCGTTCTCCCGTTGTTCCACGTGCACGGGTTGATCGCCGGGTTGCTGAGTTCACTCGGTGCTGGCGCGGCGGTTACCTTGCCGGCCGCCGGGCGGTTCTCTGCTACGTCGTTTTGGTCGGATATGAAAAAGTATAACGCCACGTGGTATACGGCCGTCCCCACCATCCATCAGATCATCCTTGATAGGCACATCAACAAACCCGAGCCCGATTACCCGAACCTCCGGTTCATTCGGAGCTGCAGTGCATCGCTGGCTCCGGCTATACTGGAACGGTTGGAGGAGTCATTCGGAGCACCCGTTTTGGAGGCCTATGCGATGACAGAGGCGTCTCATTTGATGTGTTCCAACCCACTACCAGAAGATGGACCCCACAAGGCGGGTTCAGTGGGTCGACCCGTAGGCCAGGAGATGGCCATATTAGACGAGAATGGGGTCATCCAACCAAACGGGTCAAAGGGAGAAGTGTGTATTCGGGGTCCAAATGTGACCAAAGGGTATAAGAATAATCCAGAGGCAAATAAGGCGGCCTTCCAATTCGGGTGGTTCCACACAGGTGATGTTGGGTATCTTGATGAGGATGGGTATTTGCACTTGGTCGGCCGGATTAAAGAGCTCATCAACCGTGGAGGGGAAAAGATTTCACCAATTGAGGTGGATGCAGTGCTTTTATCTCACCCTGATATTGCCCAAGCTGTTGCTTTCGGGGTCCCAGATGACAAGTATGGTGAAGAGATAAATTGTGCAGTTATCCCGAGAGAAGGAGCAAAGATTGATGAGCATGAAGTAATAACCTTTTGCAAGAAAAATCTGGCAGCCTTCAAGGTCCCTAAGAAGGTTTTCATCACCGATTTTCTCCCTAAAACTGCGAGTGGGAAGATCCAGCGAAGGATCGTAGCAGAACACTTCCTTGCACAGATCTCTACTGCCAAAGTCCCCAAGTTCGGTGCTTAA

实施例1HuAAE3基因的过表达载体的构建和转基因材料的获得

本发明构建的过表达载体为pCAMBIA1302-AAE3，其中pCAMBIA1302载体图谱如图1所示，该载体的构建和转基因材料获得的步骤如下：

(1)扩增目的基因：以含有HuAAE3基因火龙果cDNA模板，以上游引物:5’-TGACCATGGTAGATCTGATGGAGAGCTTGACTCTCA-3’(SEQ ID NO.4)和下游引物5’-CTTCTCCTTTACTAGTAGCACCGAACTTGGGGA-3’(SEQ ID NO.5)扩增1372bp目的片段。PCR反应体系为：2×

Max DNA Polymerase 12.5μL，10μM上游/下游引物各0.75μL，cDNA模板1μL，ddH₂O 10μL。各种成分混匀后置于PCR仪上进行反应。PCR反应程序如下：98℃5min；98℃10s，55℃15s，72℃20s，36个循环，72℃5min；电泳检测并回收条带大小正确的产物。

(2)线性化载体pCAMBIA1302:用BglⅡ和SpeⅠ同时酶切载体质粒pCAMBIA1302。20μL双酶切反应体系为：质粒模板5μL，10×FastDiest Buffer 2μL，BglⅡ1μL，SpeⅠ1μL，ddH₂O11μL。酶切反应条件：37℃酶切60min。反应结束后，以琼脂糖凝胶DNA试剂盒回收酶切产物。

(3)载体连接：用In-Fusion克隆(无缝克隆)方法将目的基因片段连接于酶切后线性化的pCAMBIA1302载体上。5μL连接体系为：5×In-Fusion HD Enzyme Premix 0.5μL，pCAMBIA1302 Vector 2.5μL，目的片段2μL。混匀后，置于50℃保温45min，进行连接。

(4)连接产物转化大肠杆菌：将步骤(3)获得的2μl连接产物转化大肠杆菌DH5α，混匀后冰浴30min；42℃水浴热激90s；置于冰上，冰浴2min；加700ml液体LB培养基，复苏40min，涂于含Kan(卡那霉素)的LB平板37℃过夜。挑取单克隆，于含有Kan的液体LB培养基中扩增培养，测序鉴定，并提取质粒。

(5)连接产物转化农杆菌：将步骤(4)获得的阳性克隆提取质粒转化农杆菌，挑选阳性农杆菌。

(6)采用根瘤农杆菌介导的遗传转化方法，将步骤(5)获得的阳性农杆菌浸染野生型拟南芥花序，同时以未转入HuAAE3基因的野生型拟南芥作为对照。

(7)转基因T0代的阳性植株的筛选及检测：将T0代种子进行表面消毒，平铺在含有kan抗性的MS固体培养基平板上。待萌发的幼苗长至2片叶大小时，转移至营养土进行培养。待其快开花时取其叶片提取DNA，使用hpt引物(Hpt F：CGGAGTCGTGGCGATCCTGC，SEQ IDNO.6；Hpt R：CTACAACCGGTCGCGGAGGC，SEQ ID NO.7)进行PCR检测，PCR反应体系为：2×TaqMix 5μL，10μM上游/下游引物各0.25μL，DNA模板0.5μL，ddH₂O4μL。各种成分混匀后置于PCR仪上进行反应。PCR反应程序如下：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，36个循环，72℃5min；电泳检测并回收条带大小正确的产物。结果如图2所示，1-24泳道为转基因拟南芥植株，25泳道为野生型拟南芥，1-24泳道全部具有500bp左右的条带，25泳道无条带。

(8)超表达HuAAE3转基因植株的表达量检测：通过qRT-PCR技术检测转基因拟南芥中HuAAE3基因的表达水平。分别提取野生型和超表达HuAAE3转基因植株HuAAE3-OX7、HuAAE3-OX16和HuAAE3-OX18叶片总RNA，经反转录后，使用荧光定量试剂盒Hieff^TM qPCR

Green Master Mix(No Rox)进行qRT-PCR，qRT-PCR反应体系为：2×SYBR GreenMasterMix 5μL，10μM正向/反向引物(AAE-Q-F：CGTCGCCCTCACCTACCCCA，SEQ ID NO.8；AAE-Q-R：CCGAGTCGCCGGAGGGAAGA，SEQ ID NO.9)各0.2μL，稀释后的cDNA 1μL，ddH₂O 3.6μL。qRT-PCR采用384孔，仪器为RoChe公司的Light Cycler480，采用如下程序为：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火及延伸30s，45个循环；95℃15s，60℃60s，95℃15s，1个循环进行溶解曲线的制作；最后，50℃降温30s。选取拟南芥Actin为内参基因进行定量分析。结果如图3所示，转基因拟南芥植株中HuAAE3表达远远高于野生型，说明HuAAE3基因在转基因拟南芥中超表达成功。

实施例2高温45℃处理过表达拟南芥和野生型拟南芥比较

将野生型拟南芥种子和T2代纯合体过表达拟南芥种子进行表面消毒，播种到MS培养基上，4℃放置三天进行春化，然后将其放到22℃、16h白光(50μmol/m²s)/8h黑暗循环的温室中，7天后进行高温处理45℃2h，结果如图4和5所示，表明过表达HuAAE3转基因拟南芥株系明显比野生型拟南芥存活率高，且通过实验结果可进一步发现，实验组中的三个HuAAE3-OX7，HuAAE3-OX16和HuAAE3-OX18转基因株系在高温处理后存活率仍存在一定差异，这可能与不同转基因株系内部HuAAE3基因的超表达倍数不同有关，具体影响HuAAE3基因的表达因素有待做进一步的研究。

实施例3高温45℃处理下火龙果中HuAAE3基因表达模式

为进一步研究火龙果中HuAAE3基因对高温胁迫响应的模式。通过qRT-PCR技术检测了火龙果中HuAAE3基因在高温胁迫下不同时间点的表达水平。分别取高温45℃处理24h、48h和72h下的火龙果叶片进行总RNA提取，经反转录后，使用荧光定量试剂盒Hieff^TM qPCR

Green Master Mix(No Rox)进行qRT-PCR，qRT-PCR反应体系为：2×SYBR GreenMaster Mix 5μL，10μM正向/反向引物(AAE-Q-F：CGTCGCCCTCACCTACCCCA，SEQ ID NO.8；AAE-Q-R：CCGAGTCGCCGGAGGGAAGA，SEQ ID NO.9)各0.2μL，稀释后的cDNA 1μL，ddH₂O 3.6μL。qRT-PCR采用384孔，仪器为RoChe公司的Light Cycler480，采用如下程序为：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火及延伸30s，45个循环；95℃15s，60℃60s，95℃15s，1个循环进行溶解曲线的制作；最后，50℃降温30s。选取火龙果中eEF为内参基因进行定量分析。结果如图6所示，火龙果受到热胁迫24h时HuAAE3基因表达上升，在72h时表达依旧上升但与24h相比有所回调，表明HuAAE3基因受热胁迫诱导表达。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

序列表

<110> 中国科学院华南植物园

<120> 火龙果基因HuAAE3及其在调控植物抗高温胁迫中的应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1572

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggagagct tgactctcac cggcctattg aacgacgtcg ccggaaagtt ccattcccgg 60

cgagccatat ctgccgccgg caagtacgac ctcactcact ctcgattgaa tgaactggtc 120

gaacaggccg cttctcaact cgtcgccgcc ggcgttcgtc ccggcgatgt cgtcgccctc 180

acctacccca acaccgtcga gtttgtgata ttgttcttgg cggtggtgcg cgccagaggg 240

acggcggcgc cgctaaatgc ggcgtatacg gcggaggagt tcgagttcta cttgtctgac 300

tcagagtcca aactcctcgt tacttctatt gaaggcaata agcaagcaga agccgccgct 360

tccaagctca acatccccca ttccaccgcc tttcttccct ccggcgactc ggacatcgtc 420

ctctccctga ctcaggccga gtcaaactcg cccagctcgg ttgccggact tgtcaatgag 480

ccatctgacg tggccctgtt cctccacacc tccgggacca cttcccggcc caagggggtc 540

caactgagtc agctgaattt ggtttcctcg gtacggaata ttaaatcggt gtacaggctc 600

gccgagtctg actcgacggt gatcgttctc ccgttgttcc acgtgcacgg gttgatcgcc 660

gggttgctga gttcactcgg tgctggcgcg gcggttacct tgccggccgc cgggcggttc 720

tctgctacgt cgttttggtc ggatatgaaa aagtataacg ccacgtggta tacggccgtc 780

cccaccatcc atcagatcat ccttgatagg cacatcaaca aacccgagcc cgattacccg 840

aacctccggt tcattcggag ctgcagtgca tcgctggctc cggctatact ggaacggttg 900

gaggagtcat tcggagcacc cgttttggag gcctatgcga tgacagaggc gtctcatttg 960

atgtgttcca acccactacc agaagatgga ccccacaagg cgggttcagt gggtcgaccc 1020

gtaggccagg agatggccat attagacgag aatggggtca tccaaccaaa cgggtcaaag 1080

ggagaagtgt gtattcgggg tccaaatgtg accaaagggt ataagaataa tccagaggca 1140

aataaggcgg ccttccaatt cgggtggttc cacacaggtg atgttgggta tcttgatgag 1200

gatgggtatt tgcacttggt cggccggatt aaagagctca tcaaccgtgg aggggaaaag 1260

atttcaccaa ttgaggtgga tgcagtgctt ttatctcacc ctgatattgc ccaagctgtt 1320

gctttcgggg tcccagatga caagtatggt gaagagataa attgtgcagt tatcccgaga 1380

gaaggagcaa agattgatga gcatgaagta ataacctttt gcaagaaaaa tctggcagcc 1440

ttcaaggtcc ctaagaaggt tttcatcacc gattttctcc ctaaaactgc gagtgggaag 1500

atccagcgaa ggatcgtagc agaacacttc cttgcacaga tctctactgc caaagtcccc 1560

aagttcggtg ct 1572

<210> 2

<211> 524

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Glu Ser Leu Thr Leu Thr Gly Leu Leu Asn Asp Val Ala Gly Lys

1 5 10 15

Phe His Ser Arg Arg Ala Ile Ser Ala Ala Gly Lys Tyr Asp Leu Thr

20 25 30

His Ser Arg Leu Asn Glu Leu Val Glu Gln Ala Ala Ser Gln Leu Val

35 40 45

Ala Ala Gly Val Arg Pro Gly Asp Val Val Ala Leu Thr Tyr Pro Asn

50 55 60

Thr Val Glu Phe Val Ile Leu Phe Leu Ala Val Val Arg Ala Arg Gly

65 70 75 80

Thr Ala Ala Pro Leu Asn Ala Ala Tyr Thr Ala Glu Glu Phe Glu Phe

85 90 95

Tyr Leu Ser Asp Ser Glu Ser Lys Leu Leu Val Thr Ser Ile Glu Gly

100 105 110

Asn Lys Gln Ala Glu Ala Ala Ala Ser Lys Leu Asn Ile Pro His Ser

115 120 125

Thr Ala Phe Leu Pro Ser Gly Asp Ser Asp Ile Val Leu Ser Leu Thr

130 135 140

Gln Ala Glu Ser Asn Ser Pro Ser Ser Val Ala Gly Leu Val Asn Glu

145 150 155 160

Pro Ser Asp Val Ala Leu Phe Leu His Thr Ser Gly Thr Thr Ser Arg

165 170 175

Pro Lys Gly Val Gln Leu Ser Gln Leu Asn Leu Val Ser Ser Val Arg

180 185 190

Asn Ile Lys Ser Val Tyr Arg Leu Ala Glu Ser Asp Ser Thr Val Ile

195 200 205

Val Leu Pro Leu Phe His Val His Gly Leu Ile Ala Gly Leu Leu Ser

210 215 220

Ser Leu Gly Ala Gly Ala Ala Val Thr Leu Pro Ala Ala Gly Arg Phe

225 230 235 240

Ser Ala Thr Ser Phe Trp Ser Asp Met Lys Lys Tyr Asn Ala Thr Trp

245 250 255

Tyr Thr Ala Val Pro Thr Ile His Gln Ile Ile Leu Asp Arg His Ile

260 265 270

Asn Lys Pro Glu Pro Asp Tyr Pro Asn Leu Arg Phe Ile Arg Ser Cys

275 280 285

Ser Ala Ser Leu Ala Pro Ala Ile Leu Glu Arg Leu Glu Glu Ser Phe

290 295 300

Gly Ala Pro Val Leu Glu Ala Tyr Ala Met Thr Glu Ala Ser His Leu

305 310 315 320

Met Cys Ser Asn Pro Leu Pro Glu Asp Gly Pro His Lys Ala Gly Ser

325 330 335

Val Gly Arg Pro Val Gly Gln Glu Met Ala Ile Leu Asp Glu Asn Gly

340 345 350

Val Ile Gln Pro Asn Gly Ser Lys Gly Glu Val Cys Ile Arg Gly Pro

355 360 365

Asn Val Thr Lys Gly Tyr Lys Asn Asn Pro Glu Ala Asn Lys Ala Ala

370 375 380

Phe Gln Phe Gly Trp Phe His Thr Gly Asp Val Gly Tyr Leu Asp Glu

385 390 395 400

Asp Gly Tyr Leu His Leu Val Gly Arg Ile Lys Glu Leu Ile Asn Arg

405 410 415

Gly Gly Glu Lys Ile Ser Pro Ile Glu Val Asp Ala Val Leu Leu Ser

420 425 430

His Pro Asp Ile Ala Gln Ala Val Ala Phe Gly Val Pro Asp Asp Lys

435 440 445

Tyr Gly Glu Glu Ile Asn Cys Ala Val Ile Pro Arg Glu Gly Ala Lys

450 455 460

Ile Asp Glu His Glu Val Ile Thr Phe Cys Lys Lys Asn Leu Ala Ala

465 470 475 480

Phe Lys Val Pro Lys Lys Val Phe Ile Thr Asp Phe Leu Pro Lys Thr

485 490 495

Ala Ser Gly Lys Ile Gln Arg Arg Ile Val Ala Glu His Phe Leu Ala

500 505 510

Gln Ile Ser Thr Ala Lys Val Pro Lys Phe Gly Ala

515 520

<210> 3

<211> 1575

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggagagct tgactctcac cggcctattg aacgacgtcg ccggaaagtt ccattcccgg 60

cgagccatat ctgccgccgg caagtacgac ctcactcact ctcgattgaa tgaactggtc 120

gaacaggccg cttctcaact cgtcgccgcc ggcgttcgtc ccggcgatgt cgtcgccctc 180

acctacccca acaccgtcga gtttgtgata ttgttcttgg cggtggtgcg cgccagaggg 240

acggcggcgc cgctaaatgc ggcgtatacg gcggaggagt tcgagttcta cttgtctgac 300

tcagagtcca aactcctcgt tacttctatt gaaggcaata agcaagcaga agccgccgct 360

tccaagctca acatccccca ttccaccgcc tttcttccct ccggcgactc ggacatcgtc 420

ctctccctga ctcaggccga gtcaaactcg cccagctcgg ttgccggact tgtcaatgag 480

ccatctgacg tggccctgtt cctccacacc tccgggacca cttcccggcc caagggggtc 540

caactgagtc agctgaattt ggtttcctcg gtacggaata ttaaatcggt gtacaggctc 600

gccgagtctg actcgacggt gatcgttctc ccgttgttcc acgtgcacgg gttgatcgcc 660

gggttgctga gttcactcgg tgctggcgcg gcggttacct tgccggccgc cgggcggttc 720

tctgctacgt cgttttggtc ggatatgaaa aagtataacg ccacgtggta tacggccgtc 780

cccaccatcc atcagatcat ccttgatagg cacatcaaca aacccgagcc cgattacccg 840

aacctccggt tcattcggag ctgcagtgca tcgctggctc cggctatact ggaacggttg 900

gaggagtcat tcggagcacc cgttttggag gcctatgcga tgacagaggc gtctcatttg 960

atgtgttcca acccactacc agaagatgga ccccacaagg cgggttcagt gggtcgaccc 1020

gtaggccagg agatggccat attagacgag aatggggtca tccaaccaaa cgggtcaaag 1080

ggagaagtgt gtattcgggg tccaaatgtg accaaagggt ataagaataa tccagaggca 1140

aataaggcgg ccttccaatt cgggtggttc cacacaggtg atgttgggta tcttgatgag 1200

gatgggtatt tgcacttggt cggccggatt aaagagctca tcaaccgtgg aggggaaaag 1260

atttcaccaa ttgaggtgga tgcagtgctt ttatctcacc ctgatattgc ccaagctgtt 1320

gctttcgggg tcccagatga caagtatggt gaagagataa attgtgcagt tatcccgaga 1380

gaaggagcaa agattgatga gcatgaagta ataacctttt gcaagaaaaa tctggcagcc 1440

ttcaaggtcc ctaagaaggt tttcatcacc gattttctcc ctaaaactgc gagtgggaag 1500

atccagcgaa ggatcgtagc agaacacttc cttgcacaga tctctactgc caaagtcccc 1560

aagttcggtg cttaa 1575

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgaccatggt agatctgatg gagagcttga ctctca 36

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cttctccttt actagtagca ccgaacttgg gga 33

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cggagtcgtg gcgatcctgc 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctacaaccgg tcgcggaggc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgtcgccctc acctacccca 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccgagtcgcc ggagggaaga 20

Claims

1.一种火龙果基因HuAAE3，所述火龙果基因HuAAE3序列如SEQ ID NO.1所示，或为与SEQ ID NO.1完全互补配对的序列，或为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；或为编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的核酸序列。

2.一种火龙果基因HuAAE3的表达蛋白，所述火龙果基因HuAAE3的表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸，但蛋白活性相同。

3.根据权利要求1所述火龙果基因HuAAE3或权利要求2所述火龙果基因HuAAE3的表达蛋白在调控植物抗高温胁迫中的应用。

4.根据权利要求1所述火龙果基因HuAAE3或权利要求2所述火龙果基因HuAAE3的表达蛋白在植物育种中提高植物抵抗高温胁迫中的应用。

5.根据权利要求3-4中任一项所述的应用，其特征在于，所述高温温度范围为40-50℃。

6.一种火龙果基因HuAAE3重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体上插入有如权利要求1所述的火龙果HuAAE3基因，或所述重组表达载体上插入可用于表达权利要求2所述火龙果HuAAE3表达蛋白的基因。

7.根据权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为pCAMBIA1302-HuAAE3。

8.权利要求6-7中任一项所述重组表达载体在调控植物抗高温胁迫中的应用。

9.一种调控植物抗高温胁迫的方法，其特征在于，该方法包括调控如权利要求1所述的火龙果HuAAE3基因在植物中的表达。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述高温温度范围为40-50℃。