CN106011152A - 一种提高水稻耐盐性的转录因子tfsalt1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种提高水稻耐盐性的转录因子TFSALT1及其应用。本发明的转录因子TFSALT1来源于水稻。本发明还涉及该转录因子的编码蛋白在培育耐盐性水稻中的应用。本发明的转录因子TFSALT1可用于提高水稻对盐胁迫的抗性，培育高盐抗性增强的水稻。水稻盐胁迫相关基因TFSALT1的超量表达转基因植株株系T2代在200mmol/L高盐环境下的地上部分和地下部分长度均显著高于对照，表明超量表达该基因的转基因植株能够显著提高水稻对高盐环境的抗性。高盐抗性水稻的栽培，对有效利用盐碱土地、增加粮食产量等具有重要意义。该基因为培育高盐抗性增强的水稻提供了一条重要途径。

Description

一种提高水稻耐盐性的转录因子TFSALT1及其应用

技术领域

本发明涉及植物耐盐相关基因，特别涉及一个来源于水稻的与耐盐性相关的转录因子基因及其在培育耐盐性植物中的应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)源于淡水沼泽植物，因此对盐较为敏感。水稻作为中国第一大粮食作物，水稻品质的改良和产量的提高，一直是人们努力的目标。然而近年来，由于化肥的大量施用以及不合理灌溉等农业措施，导致我国耕地的盐渍化进一步加剧，盐害已成为影响我国水稻产量的主要限制因素之一。因此，研究、培育耐盐水稻品种，提高水稻产量已刻不容缓。

研究表明，水稻耐盐性是受多基因控制的复杂数量性状。因此，明确水稻耐盐的遗传机制，定位、克隆与利用水稻耐盐相关基因，是提高水稻耐盐性的关键。在盐胁迫条件下，盐胁迫相关的转录因子可以调控一个或多个耐盐基因的表达和信号的传递。增强一些关键转录因子的调节能力也许是提高植物耐盐能力的一种重要途径。目前，已有不少转录因子应用到水稻耐盐性提高的工程当中，如NAC、WRKY等。水稻的2个NAC转录因子家族成员OsNAC1和OsNAC2，是通过降低气孔的开度来提高水稻的耐盐性，利用OsNAC1培育转基因水稻显著提高了植株对高盐的耐受能力(Hu H,Dai M,Yao J,et al.Overexpressing a NAM,ATAF,and CUC(NAC)transcription factor enhances drought resistance and salttolerance in rice[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2006,103(35):12987-12992.)。过量表达OsbZIP23的转基因水稻植株的耐盐性和抗旱性显著提高，同时对ABA的敏感性增加(Xiang Y,Tang N,Du H,et al.Characterization ofOsbZIP23as a key player of the basic leucine zipper transcription factorfamily for conferring abscisic acid sensitivity and salinity and droughttolerance in rice.Plant Physiology,2008,148(4): 1938-1952.)。水稻OsGTγ亚家族OsGTγ-1突变体植株的耐盐性降低，而超表达OsGTγ-1能明显提高水稻在盐胁迫下的生长能力，因此说明OsGTγ-1是一个重要的盐响应因子。(Fang Y,Xie K,Hou X,Hu H,XiongL.Systematic analysis of GT factor family of rice reveals a novel subfamilyinvolved in stress responses.Molecular Genetics and Genomics,2010,283:157-169)。

近年来在水稻转录因子的基因克隆和功能研究方面取得了很大进展，目前已克隆的水稻耐盐相关转录因子有30多个，它们在调节水稻不同生育时期的耐盐性方面，发挥着重要作用。但这些转录因子的功能和作用机理大多不是很清楚，需要在今后研究中，充分利用不断发展和完善的分子生物学和基因工程技术，进一步了解它们在基因表达与调控中的地位和作用，实现其在转基因植物中高效稳定表达，为利用转录因子进行植物抗逆基因工程改良提供理论依据，最终实现其在农业生产中的应用。

发明内容

本发明的目的在于从水稻中分离一个包含该功能蛋白基因完整编码区段的DNA序列，利用这个基因提高水稻对高盐胁迫的耐受能力，实现该基因在水稻耐盐性遗传改良中的应用。经系统进化分析表明，该基因属于水稻GT转录因子家族成员，本文将其命名为TFSALT1基因。

本发明分离和应用一种具有提高水稻耐盐性功能的基因片段TFSALT1，该片段能够增强水稻在高盐的逆境条件下的耐受能力。其中，所述TFSALT1基因是下列核苷酸序列之一：

1)序列表SEQ ID NO.1所示的DNA序列；或

2)编码与1)编码的蛋白质相同的DNA序列；或

3)1)和2)所包含的亚片段。

本发明的第二目的在于提供水稻耐盐胁迫相关基因TFSALT1编码的蛋白，其具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

本发明的第三目的在于提供水稻耐盐胁迫相关基因TFSALT1在培育耐盐抗性增强的水稻中的应用。

所述培育耐盐抗性增强的水稻可采用如下方法：

构建水稻盐胁迫相关基因TFSALT1的超表达载体，并将其转化到水稻，筛选得到耐盐抗性增强的转基因水稻。

所述的超表达载体为Ti类质粒载体，优选为Super1300。

所述转化可采用农杆菌介导转化法、基因枪介导转化法，优选农杆菌介导转化方法。

在盐胁迫条件下，本发明中的水稻盐胁迫相关基因TFSLAT1的超量表达转基因植株株系的地上部分平均长度及地下部分平均长度显著高于对照，表明该基因的超量表达能够显著提高转基因水稻对盐胁迫的抗性。

可使用包括本发明的基因的表达载体来转化的宿主可以为包括水稻在内的多种植物，用于培养相应的耐盐性植物品种。

本发明基因是受逆境(尤其是高盐环境)诱导表达的，因此，可将本发明的基因与任何感兴趣的逆境诱导启动子结合后连入合适的表达载体，并转化植物宿主，在逆境条件下可诱导表达本发明的基因，提高植物对高盐胁迫的抗性。

本发明为培育耐盐抗性增强的水稻提供了一条重要途径。而生产上栽培耐盐抗性增强的水稻，对有效利用盐碱土地、增加粮食产量等具有重要意义。

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1，对本发明已构建好的TFSALT1过表达载体酶切验证的结果示意图。其中，对TFSALT1过表达载体进行XbaI和SalI双酶切，大片段表示的是线性化的Super1300载体，小片段为TFSALT1基因片段。

图2，PCR检测TFSALT1过表达的阳性植株。分别提取所获得42株TFSALT1过表达植株的DNA，用PCR法检测转基因植株中的潮霉素基因，约为827bp。图2显示了部分阳性植株的检测结果。

图3，RT-PCR检测部分T2代TFSALT1过表达植株中的TFSALT1基因表达量。分别提取部分阳性TFSALT1过表达植株的RNA，并反转录成cDNA。以野生型日本晴水稻中TFSALT1的表达量为1，检测TFSALT1过表达植株中TFSALT1的表达量。结果显示在TFSALT1过表达植株中的该基因表达量达到374～5413倍。

图4，水稻中超表达TFSALT1基因能提高植株耐盐胁迫能力。A：转基因株系和野生型日本晴对照在不含或含有200mM NaCl的1/2MS培养基上生长10天的表型观察。B：转基因株系和野生型日本晴对照在不含或含有200mM NaCl的1/2MS培养基上生长10天后地上和地下部分长度的统计。结果说明，超表达TFSALT1基因后，能提高水稻耐盐 胁迫能力。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

分离克隆TFSALT1基因

本申请的发明人发现了一个受盐诱导上调表达的基因TFSALT1。提取盐胁迫处理的水稻日本晴总RNA，并将其反转录成cDNA。根据NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中TFSLAT1基因序列设计引物，并在引物两端分别引入限制性内切酶XbaI和SalI识别位点及保护碱基。引物序列如下，其中TCTAGA碱基为限制性内切酶XbaI的识别位点及保护碱基；GTCGAC碱基为限制性内切酶SalI的识别位点及保护碱基。

FP：5’-TCTAGAATGTCTATCCTCCTTTGGCTAT-3’XbaI

RP：5’-GTCGACTGGATGATTAGCATTGCCCTTT-3’SalI

以反转录获得的cDNA为模板，采用KOD-plus高保真DNA聚合酶进行PCR扩增。PCR反应条件为：94℃预变性3min，94℃30sec,58℃30sec,72℃1min,35个循环；72℃延伸10min。将扩增获得的PCR产物连入T载体，转化大肠杆菌XL1-blue，放在37℃恒温培养箱培养16-18h，挑选菌落进行PCR并酶切验证，挑选正确的克隆送北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序分析，获得所需的基因全长cDNA。将该克隆命名为T-TFSALT1。

TFSALT1基因超表达载体构建

为了更好的分析TFSALT1的功能，申请人使其在水稻中超表达，从转基因植株的表现研究该基因的功能。

用限制性内切酶XbaI和SalI对含T-TFSALT1质粒和空载体Super1300质粒进行双酶切，分别回收目的片段和Super1300质粒的大片段进行连接。用Progema T4连接酶连接目的片段和Super1300载体大片段(10×T4ligase buffer 1μl，T4ligase 1μl， 目的片段2μl，Super1300质粒大片段6μl)，4℃冰箱过夜连接16-18h，将连接产物转化大肠杆菌。通过抗性培养基筛选(构建成功的载体只在Kana上生长，在Amp上不生长)、菌落PCR筛选重组子和酶切验证(结果如图1所示)正确的，送北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序，测序验证正确的克隆即为本发明所构建的TFSLAT1基因过表达载体，并提取其质粒用于转化农杆菌EHA105。挑取阳性克隆用甘油保存在-80℃，并用于水稻遗传转化。

农杆菌介导的水稻遗传转化及转基因植株的鉴定

(1)愈伤的获得：挑取选取不带病斑、胚发育良好的日本晴水稻种子去颖壳，消毒后的种子用无菌水在30℃黑暗条件下浸泡过夜，用解剖刀将胚剥下置于诱导培养基上。每皿均匀放置12个胚，在30℃黑暗条件下放置2～3周诱导愈伤组织，至长出淡黄色颗粒状愈伤。

(2)转基因植株的获得：利用农杆菌介导的遗传转化方法，将TFSALT1超表达载体转化至水稻愈伤中，具体转化过程参考了文献Duan等人在“An Efficient and High-throughput Protocol for Agrobacterium-mediated Transformation based onPhosphomannose Isomerase Positive Selection in Japonica Rice(Oryza sativaL.).Plant Cell Reports(2012)”中公开的方法。其中，使用到的筛选剂为潮霉素，为过表达载体中包含的潮霉素基因的编码产物。共获得TFSALT1过表达植株42株。

(3)以过表达植株的DNA为模板，用Phusion高保真DNA聚合酶(NEB公司生产)，PCR扩增潮霉素基因，共检测出潮霉素阳性植株35株，部分结果如图2所示。其中PCR扩增所用的引物为：

FP:5’-CGCCGATGGTTTCTACCAA-3’

RP:5’-GGCGTCGGTTTCCACTAT-3’

TFSALT1过表达T2代苗期植株耐盐性筛选

为了验证转基因植株的耐盐性是否增强及增强是否与转入的TFSALT1基因有关，本发明采用qRT-PCR对转基因水稻植株中的TFSALT1基因表达量进行检测。具体步骤为：T2代TFSLAT1过表达植株在含有50mg/L潮霉素的1/2MS培养基上发芽并生长10天，以野生型日本晴为对照。幼苗经液氮速冻后存于-80℃超低温冰箱用于提取RNA，并反转录成cDNA。qRT-PCR采用天根公司(北京)的SuperReal荧光定量预混液试剂盒(TIANGEN，SYBR Green，FP205)。以水稻ACTIN基因作为内参基因对所用RNA模板量进行定量。采用2^–ΔΔCT(ΔCT＝CT目标基因–CT内参基因；ΔΔCT＝ΔCT处理后–ΔCT 对照)对获得的信号和数据进行处理。每个基因做3次重复。本实验中用到的基因的定量引物为：

Actin-FP，5’-CCTGACGGAGCGTGGTTAC-3’；

Actin-RP，5’-CCAGGGCGATGTAGGAAAGC-3’

用于ACTIN的扩增；

TFSLAT1-FP，5’-TTGTCACCTCATGCTCGAATGA-3’；

TFSLAT1-RP，5’-GGAAAGGGTTTGTTGATATCCAAC-3’用于TFSLAT1基因的扩增。

以野生型日本晴中TFSALT1的表达量为1(CK)，结果显示，在TFSALT1过表达植株中的该基因表达量达到374～5413倍(图3)。

对本发明T2代植株的部分家系进行了耐盐性筛选。具体步骤为：T2代植株种子在含有50mg/L潮霉素的1/2MS培养基上发芽2天，日本晴水稻1/2MS培养基上发芽2天，挑选发芽一致的转基因幼苗和日本晴幼苗移栽在含有200mM NaCl的1/2MS培养基上进行生长以在不含NaCl的培养基上生长同样天数的水稻幼苗为对照。在生长10天后，我们分别测量了野生型日本晴和转基因植株的地上部分长度和地下部分长度。结果显示，转基因植株无论在地上部分长度，还是地下部分长度，都明显强于野生型对照(图4中的A和B)。说明TFSALT1基因的确与植株耐盐性相关，其超表达后能明显提高植株的耐盐性。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (9)

1.一种提高盐胁迫耐受能力的水稻TFSALT1基因，其特征在于，所述TFSALT1基因提取自水稻，所述TFSALT1基因用于提高水稻耐盐性。

2.如权利要求1所述的水稻TFSALT1基因，其特征在于，其核苷酸序列为下述中的至少一种：

1)、序列表中SEQ ID NO.1所示序列；

2)、编码与1)编码的蛋白质相同的DNA序列；或

3)、1)和2)中所包含的亚片段。

3.如权利要求1所述的TFSALT1基因，其特征在于，所述水稻TFSALT1基因的序列是序列表中SEQ ID NO.1所示序列的cDNA序列或基因组DNA序列，或者是与这些序列具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列。

4.一种能够提高盐胁迫耐受能力的TFSALT1基因在水稻耐盐性遗传改良中的应用，利用根据权利要求1所述的TFSLAT1基因编码下述氨基酸序列(i)或(ii)所示的蛋白质：

(i)序列表中的SEQ ID NO：2；

(ii)在(i)限定的氨基酸序列中经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加，且所衍生的蛋白质具有调控植物耐盐性的功能。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用包括：将所述水稻TFSALT1基因导入水稻细胞、组织或器官，再将导入了所述水稻TFSALT1基因的水稻细胞、组织或器官培育成植株，得到耐盐性提高的转基因水稻植株。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，将所述水稻TFSALT1基因通过植物表达载体导入植物细胞、组织或器官。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述植物表达载体是Super1300。

8.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用包括用所述水稻TFSALT1基因构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前加上一种组成型、组织特异型或诱导型启动子。

9.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用包括用所述水稻TFSALT1基因构建植物过表达载体时添加组成型启动子。