CN103290034A - 一种参与豆科植物共生结瘤的泛素连接酶基因及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种参与豆科植物结瘤的泛素连接酶基因及应用。以百脉根共生受体激酶的膜外部分为诱饵，通过酵母双杂交的方法从百脉根AD-cDNA文库中筛选到该基因的部分序列，再根据两个与此部分重叠的表达序列标签Lj-G0027263与Lj-G0032470，通过基因拼接以及RT-PCR的方法扩增到全长序列。通过基因克隆及测序比对分析，证实本发明从百脉根基因组和cDNA中克隆出了此基因，并且通过序列分析以及体外泛素化活性实验证实了此基因为一种新型的泛素连接酶。该基因在豆科植物中的应用，通过RNAi以及超表达的方法研究了该基因在共生结瘤过程中的生物学功能。结果表明，与对照植株比较，超表达后，根瘤数目明显增多；而RNAi后，根瘤数目明显减少，在豆科植物共生固氮上具有应用前景。

Description

一种参与豆科植物共生结瘤的泛素连接酶基因及应用

技术领域

本发明属于新植物技术领域，更具体涉及一种参与豆科植物结瘤的泛素连接酶基因，同时还涉及一种参与豆科植物结瘤的泛素连接酶基因的制备方法，还涉及一种参与豆科植物结瘤的泛素连接酶基因在豆科植物中的应用。

背景技术

在各种形式的蛋白质翻译后修饰过程中，泛素化过程近年来引起了越来越广泛的关注，与蛋白质磷酸化信号转导作用相似，泛素化在细胞生命活动的过程中发挥着至关重要的作用。2004年诺贝尔化学奖授予了在“泛素介导的蛋白质降解过程研究”做出开创性贡献的科学家。泛素是一个由76个氨基酸残基组成的高度保守的多肽，因其广泛分布于各类细胞中而得名。被泛素标记的蛋白质大部分情况下将被特异的识别并被迅速降解。但是近期的研究发现表明泛素化修饰也有可能与蛋白的定位，转录调控活性等方面相关(Komander等，The emerging complexity of protein ubiquitina-tion.Biochem.Soc.Trans.37：937-953.2009)。

泛素化过程涉及几种关键的酶，泛素活化酶E1，泛素结合酶E2以及泛素连接酶E3。在植物中，泛素活化酶E1一般只有几个，泛素结合酶E2有几十个，但泛素连接酶相对来说比较多，由此是泛素化过程中决定反应特异性的关键的酶，它介导活化的泛素从结合酶E2转移到底物，不同的泛素连接酶作用于不同的蛋白底物，决定了泛素化修饰的特异性，根据结构与功能机制的不同，泛素连接酶分为HECT(homologous toE6AP C terminus)家族与RING-finger家族，前者含有HECT结构域，可直接与泛素连接再将其传替给底物。RING-finger家族的E3发现较晚，庞大且功能复杂，是近年来研究的热点，除了两类比较典型的C3HC4以及C3H2C3以外，一些新类型比如RING-V，RING-D，RING-S/T，RING-G以及RING-C2等相继被发现(stone等，FunctionalAnalysis of the RING-Type Ubiquitin Ligase Family of Arabidopsis.Plant Physiology，137：13-30，2005)。此家族均包含相似的E2结合结构域和特异的底物结合部分，作为桥梁将活化的泛素从E2直接转移到靶蛋白，其本身并不与泛素发生作用。

近年来的研究表明，泛素连接酶在豆科植物共生信号转导，根瘤菌侵染以及结瘤过程中发挥重要的调控作用。目前发现的参与根瘤菌侵染以及结瘤的泛素连接酶的种类与数量并不是很多，大多数都是在根瘤菌进入植物体内即侵染过程中发挥调控作用，比如，Shimomura等，LjnsRING，a Novel RING Finger Protein，is Required for SymbioticInteractions Between Mesorhizobium loti and Lotus japonicus.Plant Cell Physiol.47(11)：1572-1581，2006；Kiss等，LIN，a Novel Type of U-Box/WD40Protein，Controls EarlyInfection by Rhizobia in Legumes.Plant Physiology，151：1239-1249，2009；Mbengue等，The Medicago truncatula E3ubiquitin ligase PUB1 interacts with the LYK3symbioticreceptor and negatively regulates infection and nodulation.Plant Cell.22：3474-3488，2010)。也有参与根瘤发育的，比如，Nishimura等，Rieko A Lotus basic leucine zipperprotein with a RING-finger motif negatively regulates the developmental program ofnodulation.PNAS 23：15206-15210，2002。本发明通过酵母双杂交技术筛选到一个与共生受体激酶相互作用的潜在的新型的泛素连接酶SIE3。在豆科植物百脉根中超表达此基因后，结瘤数明显增多；RNAi后，结瘤数明显减少，从而正调控豆科植物的结瘤过程，进而在农业以及生态学上具有很重要的意义。

本发明在国内外未见报道，所在课题组也未公开发表涉及本发明内容的文章，本发明在国内外公众未知。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种参与调控豆科植物共生结瘤的泛素连接酶基因，该基因编码了一个组成型表达的新型的泛素连接酶，并且在接种根瘤菌6天后表达量明显升高。结果表明该基因编码的蛋白酶参与共生结瘤的过程。

本发明的另一个目的是在于提供了一种参与豆科植物共生结瘤的泛素连接酶基因的制备方法。该方法能简单快捷的扩增未知基因的全长以及基因的分类。通过酵母双杂交的方法分离到非全长的基因后，在NCBI以及日本百脉根基因组序列库里进行详细分析比对，然后通过序列拼接以及RT-PCR的方法得到基因的全长序列。以起始密码子为起点，终止密码子为终点设计特异性强的引物进行基因克隆，克隆的片段经过测序与比对分析以及体外泛素化活性实验验证，证实本发明成功的从百脉根基因组和cDNA中克隆出了该参与调控豆科植物共生结瘤的泛素连接酶基因。

本发明的再一个目的是在于提供了一种参与豆科植物共生结瘤的泛素连接酶基因在豆科植物(百脉根、紫云英、苜蓿、大豆和花生等)根瘤数目中的应用，申请人通过Real-Time PCR的方法研究了该基因在豆科植物中的表达情况，并利用RNAi以及超表达技术研究了该基因在豆科植物百脉根中共生结瘤过程中的功能。结果表明，与对照植株比较，超表达后，根瘤数目明显增多；而RNAi后，根瘤数目明显减少，在豆科植物共生固氮上具有应用前景。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种参与豆科植物共生结瘤的泛素连接酶基因的制备方法，其步骤是：

A、以豆科植物百脉根的共生受体激酶SymRK(Stracke et al.，A plant receptor-likekinase required for both fungal and bacterial symbiosis.Nature 417：959-962.2002)的膜外部分为诱饵，通过酵母双杂交的方法筛选百脉根AD-cDNA文库(Zhu et al.，A novelARID DNA-binding protein interacts with SymRK and is expressed during early noduledevelopment in Lotus japonicus.Plant Physiol.148：337-347.2008)，对在营养缺陷性的酵母培养基的平板上长出的菌落通过严谨的回转验证后，对阳性转化子提取质粒并进行测序分析，得到只含有C末端的663bp的cDNA，在NCBI以及日本百脉根网站(http://www.kazusa.or.jp/lotus/)中进行比对分析，找到了与之部分重叠的两个表达序列标签Lj-G0027263与Lj-G0032470，然后通过重叠区扩增基因拼接的方法(一种常规的基因工程技术)扩增得到该基因的全长。

B、根据拼接所获得的基因序列，设计引物从百脉根基因组中扩增此泛素连接酶基因已知的全长，包含编码区以及部分非编码区序列，扩增的片段经过测序比对分析后，它的DNA序列如序列为SEQ ID NO：1所示核苷酸序列。一种分离的泛素连接酶基因LjSIE3，其序列为SEQ NO：1所示的核苷酸序列。

C、同时设计特异的引物PF(5′-CGCGGATCCATGGAGCTTAGTACTAT-3′含BamHI酶切位点)，PR(5′-CCGCTCGAGGAAATATAGTTGCTTGC-3′含XhoI酶切位点)将其编码区从百脉根cDNA中扩增出来。

D、扩增的产物经过筛选阳性克隆并测序分析比对，获得所需的全长编码基因。将该候选基因命名为LjSIE3，它的cDNA序列为SEQ ID NO：1中所示的70-1231bp共1161bp。其编码的蛋白质，一种分离的泛素连接酶基因LjSIE3，其序列为SEQ ID NO：2所示氨基酸序列。

本发明从豆科植物百脉根中分离得到一种参与豆科植物共生结瘤的泛素连接酶基因它是下列核苷酸序列之一：

1)序列SEQ NO：1中第1-1279所示的DNA序列，或者基本相当于SEQ NO：1所示的高度同源的DNA序列；或

2)编码与1)编码的蛋白质相同的蛋白质的DNA序列，或者其功能相当于SEQNO：2所示序列的亚片段。

本发明的泛素连接酶基因LjSIE3的编码基因(SEQ ID NO：1)来源于豆科植物百脉根，由1279个碱基组成，其推测的蛋白质编码序列有1161个碱基，是序列1自5’端第70位碱基到1231位碱基，可编码387个氨基酸。可以采用PCR(polymerase chainreaction)技术，从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的LjSIE3基因以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。

通过上述的方法获得了一种分离的泛素连接酶基因LjSIE3，其序列为SEQ NO：1所示的核苷酸序列和一种分离的泛素连接酶基因LjSIE3，其序列为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

泛素连接酶E3是泛素化过程中的关键酶之一，介导活化的泛素从结合酶E2转移到底物，不同的泛素连接酶作用于不同的蛋白底物，决定了泛素化修饰的特异性。此类蛋白在细胞生命活动过程中发挥重要的作用，广泛的参与生物的各种生命活动。例如：DNA修复，细胞周期调控，细胞凋亡，抗原呈递，炎症反应等过程。本发明所获得的基因编码一个有功能的新型的泛素连接酶。该蛋白酶具有3个典型的结构域：第一个是目前功能没有研究得特别明确的CTLH(C-terminal LisH motif)结构域，其序列为SEQ ID NO：2所示的151-200位氨基酸序列，该结构域可能与蛋白二聚体的形成以及蛋白的正确折叠相关；第二个是RanBPM(Ran-Binding-Protein)类蛋白中典型的一个结构域RanBPM-CRA(Ran binding Protein in the microtubule-organsing centre)，其序列为SEQ ID NO：2所示的204-294位氨基酸序列，该结构域可能与蛋白质之间的相互作用相关；第三个结构域是RING类泛素连接酶通常含有的RING-Finger(ReallyInteresting New Gene-Finger)结构域，其序列为SEQ ID NO：2所示的329-372位氨基酸序列，由于含有这类结构域的大部分都是泛素连接酶基因，所以预测本发明的LjSIE3基因也具有泛素连接酶的活性。为了证实该蛋白的活性，本发明将该基因的表达载体，在大肠杆菌中表达纯化后，然后在泛素活化酶E1，泛素结合酶E2以及泛素存在的情况下进行体外泛素化实验，结果表明该蛋白是一个有功能的泛素连接酶。为了证明该基因在豆科植物中的表达情况，本发明通过Real-Time PCR分析LjSIE3基因在百脉根的根、茎、叶、瘤中的表达情况，结果表明LjSIE3基因为组成型表达基因，并且在接种根瘤菌6天后表达量明显升高，从而证明了LjSIE3受根瘤菌的诱导表达。

一种参与豆科植物共生结瘤的泛素连接酶基因在百脉根、紫云英、苜蓿、大豆和花生上中的应用，其步骤是：通过遗传转化来实现的。本发明根据预测的LjSIE3基因结构，构建超表达载体以及设计特异的RNAi(RNA干扰)片段，构建RNAi载体，将构建好的载体通过电转入农杆菌LBA1334中，然后通过毛根转化转入豆科植物百脉根中，通过GUS鉴定得到阳性植株后，将阳性植株种在沙和蛭石1∶1混合盆栽中，接种根瘤菌。结果表明超表达后，豆科植物百脉根结瘤数目明显提高，而RNAi后，结瘤数目明显降低。见表1与表2，这是首次在百脉根中找到并证实了一个正调控结瘤的泛素连接酶基因。

表1

表2

由以上可知，本发明的泛素连接酶基因LjSIE3能够参与并正调控百脉根结瘤。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

本发明利用酵母双杂交筛选及序列拼接等方法找到了一个新的蛋白，并且通过序列比对功能预测以及体外泛素化活性等方法证实了该新基因是一个有活性的泛素连接酶基因，并且是一种新亚类的泛素连接酶；利用Real-Time PCR检测不同时间不同组织该基因的表达，确定了该基因在豆科植物百脉根中组成型表达并且受根瘤菌的诱导；同时又通过超表达以及基因沉默等遗传转化的方法证实了该基因参与并正调控豆科植物的结瘤。这是首次在百脉根中找到并证实了一个泛素连接酶正调控根瘤菌共生结瘤。

豆科植物通过根瘤共生固氮来增加土壤的肥力，但是自然情况下豆科植物根中根瘤的数目有限，因此通过增加根瘤的数目，进而增加豆科植物的固氮能力来增加土壤的肥力，有效减少化肥等的使用，在农业以及生态学上都有着重大意义。本发明正是通过超表达以及RNAi沉默技术证实了该基因正调控结瘤，由此可以通过转基因的手段使该基因在豆科植物中超量表达，这样就可以大大增加根瘤的数目，从而加强固氮能力，这在豆科作物固氮机制研究以及农业生产上具有一定的应用前景。

附图说明

图1为一种利用DNAMAN软件(公开使用软件)将LjSIE3基因预测的蛋白序列与SIE3同源蛋白序列RING结构域序列比对示意图。

图2为一种利用Real-Time PCR检测LjSIE3基因在不同组织不同时间中的表达情况示意图。

图中：R-根，N-瘤，S-茎，L-叶，IR-接种的根

图3为一种体外表达纯化His-LjSIE3蛋白的示意图。

1，Mark；2，pET28a-SIE3上清；3，pET28a-SIE3沉淀；4，binding beats后上清；

5，binding后柱子；6，第一次洗脱后上清；7，第二次洗脱后上清；

8，第三次洗脱后上清；9，第四次洗脱后上清；10洗脱后柱子

图4为一种体外证实LjSIE3具有泛素连接酶活性的示意图。

图5为一种利用RealTime-PCR检测超表达以及RNAi转基因植株的超表达以及沉默效率的示意图。

A，B为超表达转基因植株基因表达情况；C，D为RNAi转基因植株基因抑制情况。

图6为一种在植物中超量表达载体pU1301载体结构示意图。

将LjSIE3的编码序列插入pU1301的PstI和BamHI酶切位点之间示意图。

图7为一种抑制表达载体pCAMBIA1301-35s-int-T7的结构示意图。

将LjSIE3的一段特异序列正反重组到抑制表达载体pCAMBIA1301-35s-int-T7上，5’UTR(含部分编码序列)正向序列连入SmaI和BamHI酶切位点，反向序列连入PstI和XbaI酶切位点。

具体实施方式

实施例1：

一种参与豆科植物共生结瘤的泛素连接酶基因的制备方法，其步骤是：

A、候选基因LjSIE3的克隆：

以豆科植物百脉根的共生受体激酶SymRK的膜外部分SymRK-EC与pGBKT7(一个公知公用的酵母蛋白表达载体)融合后为诱饵质粒，通过酵母双杂交的方法筛选百脉根AD-cDNA文库，对在SD/-Leu-Trp-Ade-His(营养缺陷性的酵母培养基)的平板上长出的菌落通过严谨的回转验证后，对阳性转化子提取质粒并进行测序分析，得到只含有C末端的663bp的cDNA，其序列为SEQ NO：1所示的598-1161核苷酸序列。具体实施步骤为：

(一)LiAc法制备酵母感受态细胞，酵母转化，筛选文库

(1)从-70摄氏度中将冰冻的酵母菌Y187(购自clontech公司)在YPDA平板上划线。倒置培养皿于30℃直到克隆子的出现，大约3d左右。

(2)在无菌条件下，用PA瓶装3mL 2YPDA液体培养基，接种一个直径为2-3mm的酵母菌，30℃，200r/min振荡培养8h；

(3)转接，将5μL的培养物转接到250mL的三角瓶中(三角瓶中有50mL的YPDA)。30℃230-250r/min培养16-20h，直到OD₆₀₀为0.15-0.3；

(4)室温(20-25℃，以下相同)离心，700g，5min；

(5)弃上清，用100mLYPDA重悬细胞；

(6)30℃230-250r/min培养3-5h，直到OD₆₀₀为0.5-0.6；

(7)室温离心，700g，5min；

(8)弃上清，用3mL 1.1×TE/LiAc重悬细胞；

(9)将重悬液分装于两个无菌的1.5mL的离心管(每管1.5mL)；

(10)高速离心15s；

(11)弃上清，各管用600μL 1.1×TE/LiAc重悬细胞。

(备注：制备好的细胞应立即用于转化，如果有需要可以在室温存放1-3个小时，而转化能力没有明显变化。)

(12)在一个预冷的1.5ml的EP管中按下列体系加样品并混匀：

备注：阳性对照质粒pGBKT7-53(购自clotech公司)以及阴性对照质粒pGBKT7-lam(购自clotech公司)。

(13)30℃培养30min，每10min摇动一次；

(14)每管加入20μL DMSO，混匀，将离心管置于42℃水浴15min，每5min摇动一次；

(15)高速离心15s，弃上清，用1mLYPDA重悬细胞；

(16)30℃培养90min；

(17)高速离心15s；

(18)弃上清，用1mLYPDA重悬细胞，混合均匀；

(19)按100μL的体积，涂SD/-Trp的平板；

(20)30℃倒置培养2-4d，直到克隆子出现；

(21)挑转化的克隆子于50ml SD/-Trp中于30摄氏度中培养20-24hrs，OD值达到0.8

(22)2500rpm离心5min，去上清，再用SD/-Trp(4-5ml)悬浮

(23)室温水裕解冻文库质粒，取1ml文库质粒与5ml诱饵菌株混合，再加45ml于2L三角瓶中，于30摄氏度轻悬(30-50rpm)培养20-24hr

(24)2500rpm离心10min，用10ml 0.5×YPDA重悬细胞

(25)大约取350ul图涂SD/-Leu-Trp-Ade-His平板，在30摄氏度培养3-8天。上述步骤的药品简介以及配方如下：

鲑鱼精(Salmon)DNA为Sigma产品。浓度2mg/mL：鲑鱼精DNA 20mg加入10mL灭菌TE buffer(10mmol/L Tris-HCl pH 8.0，1.0mmol/L EDTA)中，用Tip反复吹、吸分散，在磁力搅拌器上充分混合2～3h，直至完全溶解。如果条件允许，将混合液置4℃冰箱过夜。然后分装于1.5mL离心管，于-20℃贮存。使用前，取一管在水浴中煮沸5min，取出立即放于冰上。该管可使用3～4次，若转化效率降低，则需再煮沸1次，或使用新鲑鱼精DNA。

聚乙二醇3350(PEG 3350)为Sigma产品。浓度50％w/v：PEG 335050mg加入35mL灭菌ddH₂O中，在磁力搅拌器上充分搅拌至完全溶解，加入灭菌ddH₂O定容至100mL，用0.45μm滤膜过滤除菌，于密封性好的试剂瓶保存。其浓度波动会降低转化效率。

10×TE    0.1M Tris-HCl，10mM EDTA，pH7.5，高压灭菌

10×LiAc  1M LiAc，pH7.5，高压灭菌

1.1×TE/LiAc Solution(现配现用)：

10×TE    1.1mL

10×LiAc  1.1mL

加ddH₂O定容到10mL

PEG/LiAc溶液：

8mL  50％PEG 3350

1mL  10×TE

1mL  10×LiAc

加ddH₂O定容到10mL

YPDA培养基配方(100ml)：PH＝5.5-6.5

Peptone蛋白胨2.0g

酵母粉  1.0g

葡萄糖  2.0g

腺嘌呤  0.0003g

SD培养基配方(1L)：PH＝5.8-6.5

Yeast nitrogeo  1.7g

(NH₄)₂SO4       5.0g

葡糖糖          20g

氨基酸(-Trp)：L-Arg 200mg；L-Iso 300mg；L-lys 300mg；L-me⁺200mg；L-phe  500mg；L-Thr  2000mg；L-Tyr  300mg；L-Val  1500mg；L-Ura200mg；His 20mg；Leu 100mg；Ade 30mg

氨基酸(-Trp-Leu-His-Ade)：L-Arg 200mg；L-Iso 300mg；L-lys300mg；L-me⁺200mg；L-phe 500mg；L-Thr 2000mg；L-Tyr 300mg；L-Val 1500mg；L-Ura 200mg；

(二)序列拼接，基因克隆：

把从文库中获得的部分序列在NCBI以及日本百脉根网站(http://www.kazusa.or.jp/lotus/)中进行比对分析，找到了与此片段部分重叠的两个表达序列标签Lj-G0027263与Lj-G0032470，然后通过基因拼接的方法得到该基因的全长序列；设计引物PF  (5′-CTATCTCAACAACATAGATCTGTCCC-3′)和PR(5′-CCGCTCGAGGAAATATAGTTGCTTGC-3′含XhoI酶切位点)并通过RT-PCR的方法扩增得到全长LjSIE3。扩增的产物就是本发明的序列SEQ NO-1所示的核苷酸序列。具体实施步骤为：采用Trizol试剂(购自Invitrogen公司)从百脉根接种的早期的根或瘤中提取总RNA(提取方法根据上述Trizol试剂说明书)，利用反转录酶(购自TAKARA公司)将其反转录成cDNA第一条链。反应条件为：37℃15min(反转录反应)，85℃5sec(反转录酶失活反应)。将目的基因利用上述引物从反转录产物中扩增出来，反应条件为95℃5min，94℃45s，55℃50s，72℃1.5min，循环30次，72℃5min，12℃5min。将扩增获得的PCR产物连入pMD18-T(购自TAKARA公司)，筛选阳性克隆并测序，获得所需的全长基因。将该候选基因命名为LjSIE3，它的cDNA序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。一种分离的泛素连接酶基因LjSIE3，其序列为SEQ ID NO：2所示氨基酸序列，用DNAMAN软件(一种常规的公知公用的序列分析软件)对LjSIE3及不同物种的同源蛋白比对发现，LjSIE3及其同源蛋白具有一个与泛素连接酶E3相关的RING结构域，由此对下一步预测其性质与功能起着非常重要的作用。

B、His-SIE3融合蛋白的表达与纯化：

设计引物PF(5′-GGAATTCCATATGATGGAGCTTAGTAC-3′含NdeI酶切位点)，PR(5′-CCGGAATTCTCAGAAATATAGTTGC-3′含EcolI酶切位点)，把LjSIE3基因的编码序列从TA-LjSIE3克隆上扩增出来，与带His标签的蛋白表达载体pET28a(一个公知公用的带His标签的原核蛋白表达载体，购买于NEW England公司)构成重组载体，表达纯化融合蛋白。具体实施步骤为：

(1)取0.5ul构建好的重组表达质粒加入到50ul大肠杆菌表达菌株E.coliBL21-Codon plus(DE3)-RP(来自华中农业大学刘子铎教授实验室，见遗传资源表)里进行转化。涂Kan抗性平板，于37摄氏度温箱中培养12-16小时。

(2)挑取4个单菌落分别于2毫升含抗性的LB液体培养基中，于37摄氏度，200r/min摇床培养12到16小时。

(3)取50ul培养液于5毫升与上含相同抗性的液体培养基中；37摄氏度，200r/min摇床培养2小时40分钟左右。

(4)取出2.5毫升到一新PA瓶中，不加IPTG；剩下的2.5毫升中加入2.5ul 0.1mol/L的IPTG，并做好标记；28摄氏度，200r/min摇床培养4小时左右。

(5)12000转每分钟离心2分钟。

(6)对没加IPTG的样品，用1.5ml的离心管收集，去上清，加400ul ddH₂O悬浮，取出100ul，加入50ul 3倍的SDS loadingbuffer开水中煮5分钟；对加IPTG的样品，去上清，取出一管加400ul ddH2O悬浮，加入50ul 3倍的SDS loadingbuffer开水中煮5分钟，其余的加入PH8.0的PBS，超声波破碎1分钟(每次时间为10s，间隔时间为10s；在冰上进行)，4摄氏度下13000转每分离心15到20分钟，然后吸出上清400ul于一新离心管中，沉淀中加入400ul的PH8.0的PBS。取100ul上清与沉淀，加入50ul 3倍的SDS loadingbuffer开水中煮5分钟。

(7)待冷却后以15ul的量上样跑12％的(体系中聚丙烯酰胺所占的体积比)SDS-PAGE蛋白胶。

(8)电泳时的开始以80V的电压跑15到20分钟(即跑完积存胶)，然后以120V的电压跑，直至跑完。

(9)取出蛋白胶，去掉积存胶，放入专用盒中，加入染色液于摇床上20-30分钟

(10)倒掉染色液，用蒸馏水稍微洗一下，加入脱色液于摇床上脱色。第一次15分钟，第二，三次10分钟，然后观察结果。结果如图3泳道(2-5)所示。

(11)根据上述的条件大量表达His-LjSIE3融合蛋白，于-70摄氏度冰箱中储存备用。

(12)按每10ml菌加1ml PH8.0的PBS重悬破细胞，取上清于4摄氏度下13000转每分离心15到20分钟，然后加入到用PH8.0的PBS润洗过的nickel-beads中，于冰上孵育2小时，每5-10分钟混匀一下；4摄氏度，3000转/分离心1分钟；沉淀后轻轻吸去上清，加吸附缓冲液(含PH8.0的10mM/L咪唑的Tris-His)洗两次，每次洗5分钟；去上清，再用含PH8.0的250mM/L咪唑的Tris-His洗脱几次，每次取样，跑胶检测纯化效果，如图3泳道(6-10)所示。

上述步骤的缓冲液配方如下：

PBS缓冲液：

吸附缓冲液：

0.5M  Tris-Hcl

0.5M  NaCl

10mM  咪唑

洗脱缓冲液：

50mM     Tris-Hcl

50mM     NaCl

250mM    咪唑

C、体外泛素连接酶活性检测：

把纯化好的His-SIE3蛋白以及提取的泛素活化酶E1(GI：136632)，泛素结合酶E2(UBCh5b)以及纯化的泛素蛋白Arabidopsis ubiquitin(UBQ14)(Liu，L et.al.Anefficient system to detect protein ubiquitination by agroinfiltration in Nicotianabenthamiana.Plant J.61：893-903.2010)一起加入到体外泛素化反应体系中进行泛素连接酶活性检测，具体实施步骤为：

(1)按下列体系加好并混匀各样品，

同时做几组阴性对照：不加E1；不加E2；不加SIE3；只加SIE3。

(2)在控温摇床上30°，900rpm震荡1.5小时；

(3)加10ul 4×Protein Loading buffer，于沸水中煮5-10min；

(4)轻轻斡旋后然后离心，跑蛋白胶进行电泳；

(5)取下蛋白胶转膜，于PBS-T配制的5％脱脂奶粉中室温孵育1-2小时；

(6)用PBS-T洗5分钟；

(7)一抗杂交，按1/10000的比例加Ubq(北京微生物遗传所谢旗课题组，见遗传资源表)的抗体杂交1小时；

(8)用PBS-T洗两次，每次15分钟；

(9)二抗杂交，按1/5000的比例加商品化的二抗，杂交1小时；

(10)用PBS-T洗两次，每次15分钟；

(11)曝光自显影。

结果如图四所示。

上述步骤的缓冲液20×buffer配方如下(-20度保存)：

实施例2：

一种参与豆科植物共生结瘤的泛素连接酶基因在百脉根、紫云英、苜蓿、大豆和花生(豆科植物)根瘤数目中的应用，其步骤是：

A，检测LjSIE3在百脉根中的组织特异表达情况：

以百脉根亚种MG20为材料，收取不同时间内接种与未接种的百脉根的根，茎，叶与瘤，并提取不同组织不同时间的总RNA(Trizol试剂，购自Invitrogen公司)，然后利用荧光定量PCR技术检测其表达情况(如图5所示)。具体实施步骤为：将提取的总RNA反转录为cDNA，cDNA第一链的合成使用试剂盒PrimeScriptTM RTreagent Kit(Perfect RealTime)，20μl体系反转录500ng Total RNA，引物使用Oligo-dT，操作均按照使用说明进行。PCR反应体系(25μL)：12.5μL SYBR○RPremix Ex TaqTM II (2×)；1μmol/L PCR，Forward Primer；1μmol/L PCR ReversePrimer；2μL cDNA模板；加ddH₂O至25μL。PCR反应程序：95℃10s；95℃5s，60℃12s，72℃15s，40个循环；接着进行溶解曲线分析。定量方法采用相对定量ΔΔCt法。Real-Time PCR采用的引物：LiSIE3基因荧光定量PCR引物为：F(5′-AGAAGCAGGAATGGCAGACTATG-3′)与R(5′-GAGCCGTTCTTGGACATCTTCG-3′)。Ubiquitin作为内参，其引物序列为：F(5’-TTCACCTTGTGCTCCGTCTTC-3’)，和R(5’-AACAACAGCACA CACAGACAATC-3’)。

B，LjSIE3基因超表达及抑制表达载体的构建与遗传转化：

为了研究SIE3在豆科植物百脉根中的生物学功能，申请人通过两种比较常用的遗传转化的方法(超表达以及RNAi)的方法探索了SIE3的生物学功能。主要涉及到超表达以及RNAi载体的构建和遗传转化，具体实施步骤如下：

超表达融合载体的构建：如图7所示：将SIE3基因序列通过引物PF(5′-CGGGGTACCATGGAGCTTAGTACTAT-3′含KpnI  酶切位点)，PR(5′-CGGGATCCGAAATATAGTTGCTTGC-3′含BamHI酶切位点)以上述重组克隆TA-SIE3为模板扩增获得，其序列为SEQ ID NO：1所示的70-1231核苷酸序列；通过KpnI和BamHI将LjSIE3基因序列酶切后连接到国际上常用的植物超表达载体PU1301(来自华中农大王石平实验室，请见遗传资源表)中的Mazie-ubquitin报告基因下游。

抑制表达(RNAi)载体构建方法如下：本发明如图8所示：首先用RNAi引物：

5’非翻译区正向引物F  (5′-TCCCCCGGGTCAAGTGTACAAACTAT-3″含SmaI酶切位点)和R(5′-CGCGGATCCTTATGATCAAGCACAT-3′含BamHI酶切位点)从百脉根cDNA中扩增出LjSIE3基因片段(201bp)(含部分编码序列)。反应条件为：95℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃30s，循环30次，72℃5min。同样以5’非翻译区反向引物F(5′-AACTGCAGCCCTCCATTTCAAGTGT-3′含PstI酶切位点)和R(5′-GCTCTAGATTATGATCAAGCACATGGT-3′含XbaI酶切位点)从百脉根cDNA中扩增出LjSIE3基因的特异片段(210bp)，反应条件如上。扩增的片段分别插入载体pCAMBIA1301-35s-int-T7(来自上海中科院植物生理研究所罗达教授，请见遗传资源表)的SmaI-BamHI之间或PstI-SalI位点之间，产生一个正义和反义的SIE3片段串联在一段拟南芥(Arabidopsis)actin-11内含子两侧，这个含有内含子的发卡RNA结构(intron-containing hairpin RNA)位于CAMV 35S启动子下游。(如图8)。pCAMBIA1301-35s-int-T7是已经公开发表的专门用于RNAi载体构建的载体。

将构建好的超表达融合载体和RNAi载体分别电转化到发根农杆菌A.rhizogenesLBA1334(该菌株是国际上已公布的菌株，来自美国洪宗烈教授，请见遗传资源表)中用于百脉根的毛根转化。百脉根毛根转化方法主要参考Lotus japonicus Handbook。

具体实施步骤如下：

(1)植物材料培养：提前5天萌发百脉根MG20(一个公知公用的百脉根亚种)种子。用砂纸将种子磨毛(比一般萌发种子磨得轻些)，放在液氮中冷冻1分钟，75％(质量体积比)乙醇浸泡1分钟，5％(有效氯浓度)NaClO浸泡15分钟，无菌水冲洗5-6次，除去残留的NaClO。种子表面消毒完成后，留少许无菌水刚好淹没种子，黑暗条件下4℃春化处理1天，然后转到MS不加蔗糖的固体培养基上23℃暗培养2天，后置于光照培养箱(16h光照，8h黑暗)中23℃继续培养2天，待用。

(2)菌株和质粒准备：所用菌株为A.rhizogenes LBA1334(壮观霉素抗性)，将含目的基因的质粒通过电转化方法导入农杆菌A.rhizogenes LBA1334，鉴定后-70℃保存菌株备用。提前2天，取保存菌种划平板(含质粒抗性平板)活化。

(3)侵染转化：第一天：下午，挑单菌落接种于5ml LB培养基(含质粒抗性)，28-30℃振荡培养16-24小时。第二天：将前一天接种的小量菌扩大培养，1∶100比例接种，28-30℃振荡培养8小时左右。将大量培养的菌液以6000转/分钟离心10分钟，收集菌体，用无菌水重悬菌体，使其OD₆₀₀＝0.8左右。将幼苗的下胚轴基部切断，有子叶的部分用此重悬菌液浸泡30分钟，捞出外植体，用滤纸吸干，置于MS不加蔗糖培养基上共培养。

(4)共培养：先避光共培养3-5天。然后把外植体转入HRE和300μgmL^-1cefotaxime的培养基上继续培养10天，这期间毛根从下胚轴切口处长出。

(5)阳性转基因根鉴定：剪取根尖处约0.5em长的根段放入GUS染液中，37℃暗培养过夜，显蓝的根为阳性转基因根。

(6)炼苗和移栽：鉴定后，剪去非转化的根，把苗放在装有水的平皿中(不加盖)炼苗1天，然后移栽到花盆中于光照培养箱(16h光照，8h黑暗)23℃培养。花盆中事先加入蛭石(vermiculite)和沙(sand)按1∶1比例混合的基质。每3天浇一次无氮营养液。

(7)根瘤菌接种：百脉根根瘤菌MAFF303099(来源于中国科学院华南植物园吴国江教授实验室，见遗传资源表)在YMA平板上活化后，接入液体TY培养基中，28℃震荡培养24-36h；培养好的根瘤菌转入无菌的离心管中，4℃，7000r/min离心5min，收集菌体；以无菌Fahraeus无氮营养液洗涤并离心2次；加入无氮营养液重悬菌体，接种于百脉根幼苗根部。

上述的步骤主要是以本发明的基因在百脉根中的应用为例所阐述的，其中在苜蓿(Medicago truncatula)中：具体应用步骤(1)中植物材料培养分别为提前5天萌发苜蓿；具体应用步骤(7)中根瘤菌接种为别为苜蓿根瘤菌Sinorhizobium meliloti 1021(该菌株是国际上已公布的菌株，Juan等，Comparison of Developmental andStress-Induced Nodule Senescence in Medicago truncatula.Plant Physiol.152：1574-1584，2010)。其中在紫云英(Astragalus sinicus)中：具体应用步骤(7)中根瘤菌接种为为紫云英根瘤菌(Rhizobium huakuii)(该菌株是国际上已公布的菌株，Li等Anodule-specific plant cysteine proteinase，AsNODF32，is involved in nodule senescence andnitrogen fixation activity of the green manure legume Astragalus sinicus.New phytologist180：185-1922008)；在大豆与花生中的应用主要是(7)中根瘤菌接种为大豆根瘤菌Rhizobium fredii HN01lux(该菌株是国际上已公布的菌株，陈昌斌等，组成型nifA对大豆根瘤菌(Rhizobium fredii))HN01lux结瘤固氮效率的促进作用，科学通报，44(5)1999)和花生根瘤菌Spr(该菌株是国际上已公布的菌株，于景丽等，celB基因标记法研究酸性土花生接种及施钼效果，植物营养与肥料学报，12(2)：250-253，2006)。

所述的豆科(Leguminosae sp.)为双子叶植物乔木、灌木、亚灌木或草本，直立或攀援，常有能固氮的根瘤植物。模式属：Faba P.Miller。约650属，18000种，广布于全世界。中国有172属，1485种，13亚种，153变种，16变型；各省区均有分。该科具有重要的经济意义，它是人类食品中淀粉、蛋白质、油和蔬菜的重要来源之一。本发明所述的豆科植物具体为百脉根(Lotus japonicus)、苜蓿(Medicago truncatula)、紫云英(Astragalus sinicus)、大豆(Soybean)和花生(Peanut)等。

上述步骤的培养基及试剂配方如下：

1)MS培养基：MS basal salt mixture(Sigma)4.3g，MS vitamin powder 0.103g，0.7-0.8％(质量体积比)琼脂粉，ddH₂O定容至1000mL，调节至pH 5.8。

2)YMA培养基：10.0g甘露醇(或蔗糖)，0.4g Yeast Extract，0.5g K₂HPO₄，0.2gMgSO₄·7H₂O，0.1g CaCl₂·6H₂O，0.1gNaCl，4mLRh微量元素液，ddH₂O定容至1000mL，调节至pH 6.8-7.0，115℃灭菌20min。

3)Rh微量元素液：5.0g H₃BO₃，5.0g Na₂MoO₄，ddH₂O定容至1000mL。

4)Fahraeus无氮营养液：0.10g CaCl₂·2H₂O，0.12g MgSO₄·7H₂O，0.10g KH₂PO₄，0.15g Na₂HPO₄·12H₂O，1mL Gibson微量元素液，5mg柠檬酸铁，ddH2O定容至1000mL。

5)Gibson微量元素液：2.86g H₃BO₃，0.22g ZnSO₄·7H₂O，2.03g MnSO₄·4H₂O，0.13g Na₂MoO₄·2H₂O，0.08g CuSO₄·5H₂O，ddH₂O定容至1000mL。

6)GUS染液：100mM sodium phosphate buffer，pH 7.0，0.1％Triton X-100，0.1％N-laurylsarcosine，10mM Na₂EDTA，1mM铁氰化钾(K₃Fe(CN)₆)，1mM亚铁氰化钾(K₄Fe(CN)₆)和0.5mg/mL X-GluC。

7)HRE培养基：20X的SH-A盐，20X的UM-C维生素，10g蔗糖，3mL 1MMES，0.7-0.8％(质量体积比)琼脂粉，ddH₂O定容至1000mL，调节至pH 5.8。110℃灭菌30min。

20X的SH-A盐：

·KNO₃            50g

·MgSO₄.7H₂O      8g

·NH₄H₂PO₄        6g

·CaCl₂.2H₂O      4g

·MnSO₄.4H₂O      0.2g

·H₃BO₃           0.1g

·ZnSO₄.7H₂O      0.02g

·KI              0.02g

·CuSO₄.5H₂O      0.004g

·NaMoO₄.2H₂O     0.002g

·CoCl₂.6H₂O      0.002g

·FeSO₄.7H₂O      0.3g

·NaEDTA          0.4g

用100mL无菌水分别溶解FeSO₄.7H₂O和NaEDTA，其它盐溶于700mL无菌水中，然后混合定容至1000mL，分装为50mL每管，-20℃保存。

20X的UM-C维生素：

·肌醇                     2.0g

·烟碱酸                   0.1g

·盐酸吡哆醇(维生素B6)     0.2g

·硫胺素盐酸               0.2g

·甘氨酸                   0.04g

ddH₂O定容至1000mL，分装为50mL每管，-20℃保存。

MES(2-[N-Morpholino]ethane-sulfonic acid)，1M储存液：

称29.28g MES(Sigma)用ddH₂O定容至150mL，调节至pH 5.8，分装为6mL每管，-20℃保存。

Claims (7)

1.一种分离的泛素连接酶基因LjSIE3，其序列为SEQ NO：1所示的核苷酸序列。

2.一种分离的泛素连接酶基因LjSIE3，其序列为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

3.权利要求1所述的一种分离的泛素连接酶基因LjSIE3在百脉根控制根瘤数目中的应用。

4.权利要求1所述的一种分离的泛素连接酶基因LjSIE3在苜蓿控制根瘤数目中的应用。

5.权利要求1所述的一种分离的泛素连接酶基因LjSIE3在紫云英控制根瘤数目中的应用。

6.权利要求1所述的一种分离的泛素连接酶基因LjSIE3在大豆根瘤数目中的应用。

7.权利要求1所述的一种分离的泛素连接酶基因LjSIE3在花生根瘤数目中的应用。

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