CN102776212A - 高青蒿素含量转基因青蒿植株的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生物技术领域的高青蒿素含量转基因青蒿植株的生产方法，包括如下步骤：从青蒿中克隆ADS，CYP71AV1和CPR三个基因，构建含ADS，CYP71AV1和CPR三基因的植物表达载体，用根癌农杆菌介导，将ADS，CYP71AV1和CPR三基因转入青蒿并再生出植株，筛选，获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。在非转化普通青蒿含量为6.43mg/g DW时，本发明得到的转基因青蒿株系中青蒿素的含量最高达到15.09mg/g DW，其含量是非转化青蒿含量的2.35倍，本发明的方法对于为青蒿素的规模化生产提供高产、稳定新药源具有重要意义。

Description

高青蒿素含量转基因青蒿植株的生产方法

技术领域

本发明涉及的是一种生物技术领域的提高青蒿素含量的方法，特别是涉及一种高青蒿素含量转基因青蒿植株的生产方法。

背景技术

青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿属的一年生草本植物。青蒿素(artemisinin)是从其地上部分分离的一种含有过氧桥结构的倍半萜内酯化合物，是目前世界上公认的最有效的治疗疟疾的药物，特别是对于脑型疟疾和抗氯喹疟疾具有速效和低毒的特点。目前，世界卫生组织推荐的最有效的治疗疟疾的方法就是青蒿素联合疗法(ACTs)。另外，随着对青蒿素药理研究的逐步深入，科学家发现青蒿素及其衍生物还具有抗炎、抗血吸虫、抗肿瘤以及免疫调节的功能，可见青蒿素是一种极具潜力的天然药物。

目前青蒿素的主要来源是从青蒿植株的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低，使得这种药物的大规模商业化生产受到了限制。由于青蒿素结构复杂，人工合成难度大，产量低，成本高，不具有可行性。有人尝试用组织培养和细胞工程的方法来生产青蒿素，然而青蒿素在愈伤组织中含量低于干重的0.1％，在芽中最高也只有干重的0.16％，而大多数研究在根中没有检测到青蒿素。因此利用组织培养及细胞工程来生产青蒿素的可行性也不高。

经对现有技术文献检索发现，Pravej Alam等在2011年的《Plant Cell Rep》(《植物细胞报道》)发表了题为“Over-expression of HMG-CoA reductase andamorpha-4，11-dienesynthase genes in Artemisia annua L.and its influence onartemisinin content”(“在青蒿中过表达HMGR和ADS基因对青蒿素含量的影响”)的论文，报道通过共同转化青蒿素合成途径关键酶基因HMGR和ADS，得到的转基因植株青蒿素含量得到明显提高的转基因株系。通过基因工程方法提高青蒿植株中青蒿素的含量为规模化生产青蒿素提供一条新途径。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种高青蒿素含量转基因青蒿植株的生产方法。在非转化普通青蒿含量为6.43mg/g DW时，本发明得到的转基因青蒿株系中青蒿素的含量最高达到15.09mg/g DW，其含量是非转化青蒿含量的2.35倍，本发明的方法对于为青蒿素的规模化生产提供高产、稳定新药源具有重要意义。

本发明是通过以下的技术方案实现的，本发明涉及一种高青蒿素含量转基因青蒿植株的生产方法，包括如下步骤：从青蒿中克隆ADS，CYP71AV1和CPR三个基因，构建含ADS，CYP71AV1和CPR三基因的植物表达载体，用根癌农杆菌介导，将ADS，CYP71AV1和CPR三基因转入青蒿并再生出植株，筛选，获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。

优选地，所述筛选包括如下步骤：PCR检测外源目的基因ADS，CYP71AV1和CPR基因的整合情况，高效液相色谱法及蒸发光散射检测器测定转基因青蒿中青蒿素的含量。

优选地，所述PCR检测为：设计合成35S和ADS，CYP71AV1和CPR基因的引物，进行DNA扩增，紫外线下观察到目的条带的株系即为转基因青蒿植株。

优选地，所述高效液相色谱法及蒸发光散射检测器测定青蒿植株中青蒿素含量，测定条件为：色谱柱C-18反相硅胶柱，流动相为甲醇∶水，甲醇∶水的体积比为70∶30，柱温30℃，流速1.0mL/min，进样量10μL，蒸发光散射检测器漂移管温度40℃，放大系数为7，载气压力5bar。

本发明具有如下的有益效果：本发明的共转ADS，CYP71AV1和CPR三基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，采用基因工程方法，将关键酶基因ADS，CYP71AV1和CPR三基因导入青蒿植株中，获得了青蒿素含量显著提高的转基因青蒿株系，在非转化普通青蒿含量为6.43mg/g DW时，共转ADS，CYP71AV1和CPR三基因青蒿中青蒿素的含量最高达到15.09mg/g DW，其含量是非转化青蒿含量的2.35倍，该发明对于为青蒿素的规模化生产提供高产、稳定新药源具有重要意义。

附图说明

图1为植物双元表达载体pCAMBIA2300-cyp71av1-cpr-ads的构建示意图；

图2为实施例中转基因青蒿植株的PCR检测结果图；

图3为实施例中青蒿植株中青蒿素的含量检测结果图。

具体实施方式

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

对本发明的过程概述如下：

(1)采用基因克隆方法获得青蒿关键酶基因ADS，CYP71AV1和CPR；

(2)把ADS，CYP71AV1和CPR三基因可操作性地连接于表达调控序列，形成含ADS，CYP71AV1和CPR三基因的植物表达载体；

(3)将含ADS，CYP71AV1和CPR三基因的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得用于转化青蒿的含ADS，CYP71AV1和CPR三基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株；

(4)利用所构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿，获得经PCR检测的转基因青蒿植株；

(5)对获得的转基因青蒿中青蒿素含量进行HPLC-ELSD测定，筛选获得青蒿素含量显著提高的转基因青蒿植株。

实施例1、青蒿ADS，CYP71AV1和CPR三基因的克隆

1.1青蒿基因组总RNA的提取

取青蒿叶片组织，置于液氮中研碎，加入盛有裂解液的1.5mL Eppendorf(EP)离心管中，充分振荡后，按照TIANGEN试剂盒的说明书抽提总RNA。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。

1.2青蒿ADS，CYP71AV1和CPR三基因的克隆

将所获的青蒿基因组总RNA通过反转录酶XL(AMV)反转录获得第一链cDNA，根据所述青蒿ADS，CYP71AV1和CPR三基因的编码序列(分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示)，设计扩增出完整编码框的上下游引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点，以便构建表达载体。以所述的第一链cDNA为模板，经PCR扩增后进行测序。DNA序列测定由上海英骏生物技术服务有限公司采用3730自动测序仪完成。测序结果表明，所克隆的序列与GenBank中所报道的青蒿ADS，CYP71AV1和CPR三基因的编码序列一致。

本实施例采用基因克隆方法从青蒿中获得序列正确的青蒿素生物合成关键酶基因ADS，CYP71AV1和CPR，为通过共转ADS，CYP71AV1和CPR三基因提高青蒿中青蒿素含量提供了重要的关键酶基因。

实施例2、含ADS，CYP71AV1和CPR三基因的植物双元表达载体的构建

2.1中间载体pMD18-p35S-gfp-gus-nos的构建

选用pMD18-T和pCAMBIA1304为基本元件，构建中间载体pMD18-p35S-gfp-gus-nos。具体地，根据pCAMBIA1304上p35S-gfp-gus-nos的序列设计一对引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点，以便构建表达载体。以pCAMBIA1304质粒为模版，PCR扩增gfp-gus融合基因的表达盒，连接到pMD18-T载体，转化筛选，挑取单克隆测序确认无误。

2.2中间载体的构建

构建pMD18-p35S-ads-nos，pMD18-p35S-cyp71av1-nos，pMD18-p35S-cpr-nos，以所述的pMD18-p35S-gfp-gus-nos为基础，用重组载体pMD18-ads pMD18-cyp71av1和pMD18-cpr中的ADS，CYP71AV1和CPR三基因分别替换其上的gfp-gus融合基因。具体步骤为：用SpeI和BstEII双酶切pMD18-ads pMD18-cyp71av1，pMD18-cpr和pMD18-p35S-gfp-gus-nos，回收ADS，CYP71AV1，CPR三基因片段和pMD18-p35S-gfp-gus-nos大片段，ADS，CYP71AV1，CPR三基因片段分别与大片段连接，转化大肠杆菌，挑取单克隆，提取质粒做PCR检测和酶切验证。

2.3植物双元表达载体pCAMBIA2300-cyp71av1的构建

以所述的pMD18-p35S-cyp71av1-nos为基础，将含有cyp71av1融合基因的表达盒置于植物双元表达载体pCAMBIA2300中，构建成植物双元表达载体pCAMBIA2300-cyp71av1。具体操作如下：用SmaI和PstI双酶切pCAMBIA2300，回收大片段，用SwaI和PstI双酶切pMD18-p35S-cyp71av1-nos，回收cyp71av1的表达盒。将cyp71av1表达盒与pCAMBIA2300大片段连接，转化大肠杆菌，挑取单克隆，提取质粒做PCR检测和酶切验证。

2.4植物双元表达载体pCAMBIA2300-cyp71av1-cpr的构建

以所述的pMD18-p35S-cpr-nos为基础，将含有cpr基因的表达盒插入植物双元表达载体pCAMBIA2300-cyp71av1中，构建成植物双元表达载体pCAMBIA2300-cyp71av1-cpr。具体操作如下：用SmaI和PstI双酶切pCAMBIA2300-cyp71av1，回收大片段，用SwaI和PstI双酶切pMD18-p35S-cpr-nos，回收CPR基因的表达盒。将CPR基因的表达盒与pCAMBIA2300-cyp71av1大片段连接，转化大肠杆菌，挑取单克隆，提取质粒做PCR检测和酶切验证，获得含有CYP71AV1基因和CPR基因的植物双元表达载体pCAMBIA2300-cyp71av1-cpr。

2.5植物双元表达载体pCAMBIA2300-cyp71av1-cpr-ads的构建(图1)

以所述的pMD18-p35S-ads-nos为基础，将含有ads基因的表达盒插入植物双元表达载体pCAMBIA2300-cyp71av1-cpr中，构建成植物双元表达载体pCAMBIA2300-cyp71av1-cpr-ads。具体操作如下：用SmaI和PstI双酶切pCAMBIA2300-cyp71av1-cpr，回收大片段，用SwaI和PstI双酶切pMD18-p35S-ads-nos，回收ADS基因的表达盒。将ADS基因的表达盒与pCAMBIA2300-cyp71av1-cpr大片段连接，转化大肠杆菌，挑取单克隆，提取质粒做PCR检测和酶切验证，获得含有CYP71AV1基因，CPR基因和ADS基因的植物双元表达载体pCAMBIA2300-cyp71av1-cpr-ads。

本实施例将青蒿素生物合成途径关键酶基因ADS，CYP71AV1和CPR三基因可操作性地连接于表达调控序列，形成含ADS，CYP71AV1和CPR三基因的植物表达载体，该表达载体可用于通过代谢工程策略来提高青蒿中青蒿素的含量。

实施例3、根癌农杆菌介导ADS，CYP71AV1和CPR三基因遗传转化青蒿获得转基因 青蒿植株

3.1含ADS，CYP71AV1和CPR三基因双元植物表达载体根癌农杆菌工程菌的获得

将实施例2中含ADS，CYP71AV1和CPR三基因的植物双元表达载体转入根癌农杆菌(如EHA105，为市场有公开出售的生物材料，可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambar 1)，并进行PCR验证。结果表明，含ADS，CYP71AV1和CPR三基因植物双元表达载体已成功构建到根癌农杆菌菌株中。

3.2根癌农杆菌介导ADS，CYP71AV1和CPR三基因载体转化青蒿

(1)外植体的预培养

青蒿种子用75％乙醇浸泡1min，再用20％NaClO浸泡20min，无菌水冲洗3-4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS(Murashige and Skoog，1962)固体培养基中，25℃、16h/8h(light/dark)光照培养，即可获得青蒿无菌苗。待苗长至5cm左右后，剪取无菌苗叶片外植体用于转化。

(2)农杆菌与外植体的共培养

将所述的叶片外植体，转到共培养培养基(1/2MS+AS 100μmol/L)中，滴加含活化好的所述含ADS，CYP71AV1和CPR三基因植物双元表达载体的根癌农杆菌工程菌的1/2MS悬液，使外植体与菌液充分接触，28℃暗培养3d。以滴加在不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照。

(3)抗性再生植株的筛选

将所述的共培养3d的青蒿外植体转入到发芽筛选培养基(MS+6-BA 0.5mg/L+NAA0.05mg/L+Kan 50mg/L+Cb 500mg/L)上于25℃、16h/8h光照培养，每两周继代培养一次，经过2-3次继代后即可获得Kan抗性丛生芽。将生长良好的抗性丛生芽剪下转入生根培养基(1/2MS+Cb 125mg/L)上培养至生根，从而获得Kan抗性再生青蒿植株。

3.3转基因青蒿植株的PCR检测

根据35s启动子序列设计正向引物p35S(SEQ ID NO.4)，根据目的基因所在表达盒p35s-ADS-nos序列，p35s-CYP71AV1-nos序列，p35s-Cpr-nos序列，分别设计ADSR，CYP71AV1R和CPRR的反向引物(分别如SEQ ID NO.6、7、8所示)，对目的基因进行检测。结果表明，利用所设计的PCR特异引物，分别能扩增出1027bp，580bp和634bp的特异DNA片段(图2)。而以非转化青蒿基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段。

本实施例将所述的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得用于转化青蒿的含ADS，CYP71AV1和CPR三基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株，利用所构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿，获得经PCR检测的转基因青蒿植株。转基因青蒿植株的获得为筛选获得较高青蒿素含量的青蒿株系提供了直接素材。

实施例4、利用HPLC-ELSD测定转基因青蒿中青蒿素含量

4.1HPLC-ELSD条件及系统适用性以及标准溶液的配制

HPLC：采用water alliance 2695系统，色谱柱为C-18反相硅胶柱(SymmetryShieldTM C18，5μm，250×4.6mm，Waters)，流动相为甲醇∶水，甲醇∶水的体积比为70∶30，柱温30℃，流速1.0mL/min，进样量10μL，灵敏度(AUFS＝1.0)，理论塔板数按青蒿素峰计算不低于2000。

ELSD：采用water alliance 2420系统，蒸发光散射检测器漂移管温度40℃，放大系数(gain)为7，载气压力5bar；

精密称取青蒿素标准品(Sigma公司)2.0mg用1mL甲醇完全溶解，得到2mg/mL青蒿素标准品溶液，保存于-20℃备用。

本发明中流动相为甲醇(methanol)∶水，比例为70％∶30％时，青蒿素的保留时间为5.1min，峰型良好。理论塔板数按青蒿素计算不低于2000。

4.2标准曲线的制作

将所述对照品溶液在相应色谱条件下分别进样2μl，4μl，6μl，8μl，10μl记录图谱及色谱参数，分别以峰面积(Y)对标准品含量(X，μg)进行回归分析。通过研究，本发明中青蒿素在4-20μg范围内呈现良好的log-log线性关系。青蒿素对照品的log-log线性回归方程为：Y＝1.28e+000X+4.71e+000，R＝0.979546。

4.3样品的制备和青蒿素含量的测定

在青蒿植株的上，中和下部共取2g新鲜的青蒿叶片，于45℃烘箱中烘至恒重。然后从烘干的枝条上敲下叶和花蕾，磨成粉末。称取约0.1g干粉于2mL Eppendorf管中，加入2mL乙醇，用40W超声波处理30min，5000rpm离心10min，取上清用0.22μm滤膜过滤，即可用于HPLC-ELSD测定青蒿素的含量。

采用HPLC-ELSD测定青蒿素含量，样品进样体积为20μl，根据峰面积代入线形回归方程计算出样品中的青蒿素含量(mg)，再除以样品的青蒿叶干重(g)，从而计算出青蒿植株中青蒿素的含量。

本实施例共转ADS，CYP71AV1和CPR三基因显著提高了青蒿中青蒿素含量，在非转化普通青蒿含量为6.43mg/g DW时，共转ADS，CYP71AV1和CPR三基因青蒿中青蒿素的含量最高达到15.09mg/g DW，其含量是非转化青蒿含量的2.35倍(图3)。本实施例采用HPLC-ELSD法测定了转基因青蒿中青蒿素含量，采用共转化ADS，CYP71AV1和CPR三基因的代谢工程策略获得了青蒿素高产的青蒿植株，为规模化生产青蒿素提供了一种理想方法。

Claims (4)

1.一种高青蒿素含量转基因青蒿植株的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：从青蒿中克隆ADS，CYP71AV1和CPR三个基因，构建含ADS，CYP71AV1和CPR三基因的植物表达载体，用根癌农杆菌介导，将ADS，CYP71AV1和CPR三基因转入青蒿并再生出植株，筛选，获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。

2.如权利要求1所述的高青蒿素含量转基因青蒿植株的生产方法，其特征在于，所述筛选包括如下步骤：PCR检测外源目的基因ADS，CYP71AV1和CPR三基因的整合情况，高效液相色谱法及蒸发光散射检测器测定转基因青蒿中青蒿素的含量。

3.如权利要求2所述的高青蒿素含量转基因青蒿植株的生产方法，其特征在于，所述PCR检测为：设计合成35S和ADS，CYP71AV1和CPR基因的引物，进行DNA扩增，紫外线下观察到目的条带的株系即为转基因青蒿植株。

4.如权利要求2所述的高青蒿素含量转基因青蒿植株的生产方法，其特征在于，所述高效液相色谱法及蒸发光散射检测器测定青蒿植株中青蒿素含量，测定条件为：色谱柱C-18反相硅胶柱，流动相为甲醇∶水，甲醇∶水的体积比为70∶30，柱温为30℃，流速1.0mL/min，进样量10μL，蒸发光散射检测器漂移管温度40℃，放大系数为7，载气压力5bar。

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