CN101597620B - 利用pts基因和RNA干扰ads基因提高青蒿广藿香醇含量的方法 - Google Patents
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Abstract
一种生物技术领域的利用pts基因和RNA干扰ads基因提高青蒿广藿香醇含量的方法，具体步骤为：获得基因ads部分序列和基因pts全部阅读框序列以及拟南芥中质体定位信号肽的tp片段；将构建成发夹结构的ads基因部分序列和质体定位的pts基因分别连于表达调控序列上，形成含adsi和质体定位的pts基因的植物表达载体；利用构建的植物表达载体转化根癌农杆菌；利用所构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿外植体；HPLC-ELSD测定转基因青蒿中广藿香醇的含量。本发明建立了一种提高广藿香醇含量的方法，为利用转基因青蒿大规模生产广藿香醇以及除青蒿素外的其他萜类等次生代谢物奠定坚实的基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物技术领域的提高青蒿广藿香醇含量的方法，具体是一种利用pts(patchoulol synthase，广藿香醇合成酶)基因和RNA干扰ads(Amorpha-4，11-dienesynthase，紫穗槐二烯合成酶)基因提高青蒿广藿香醇含量的方法。
背景技术
青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿属的一年生草本植物。青蒿素是从青蒿地上部分分离出的一种含有过氧桥结构的倍半萜内酯化合物，是目前世界上公认的治疗疟疾最有效的药物，尤其对于脑型疟疾和抗氯喹疟疾具有更好的效果。ads是青蒿素合成途径中的一个关键酶，是青蒿素代谢工程的重要靶点。采用基因工程手段，用反义RNA的方法抑制ads基因，将使得植株不产青蒿素或少产青蒿素，并且将代谢流分流到其他萜类等次生代谢产物的合成上，从而得到产生其他次生代谢产物的青蒿植株。
广藿香醇，英文名Patchouli Alcohol；俗称：百秋李醇；分子量：222；分子式：C15H26O；熔点：55℃-59℃；溶解度：不溶于水，易溶于乙醇、丙酮、石油醚等有机溶剂。广藿香醇是从广藿香中提取出来的一种具有特殊芳香气味的天然单体化合物，用于香精或香水行业，是法国标准化委员会确定的香精香料中的标志性成分，可用于治疗真菌性皮肤病，还可用于其它化合物合成的基础原料，提高广藿香醇具有重大的商业价值和广阔的市场前景。pts是广藿香中广藿香醇合成途径中的一个关键酶，是广藿香醇代谢工程的重要靶点。采用基因工程手段，用关键酶基因pts质体定位地转化青蒿，将打破广藿香醇生物合成的限速瓶颈，获得广藿香醇高产的青蒿植株，为规模化生产广藿香醇提供一条新途径。
Joe Chappell等在《Nature Biotechnology》(自然生物技术)2006年24期1441-1447页发表了题为“Redirection of cytosolic or plastidic isoprenoid precursorselevates terpene production in plants”(在植物中通过异戊二烯前体的质体或胞质分流提高萜类化合物的产量)的论文，文中评述，通过在转基因烟草中过量表达广藿香醇合成酶可以使原来不产生广藿香醇的烟草产生广藿香醇，每克湿重物质中广藿香醇含量达到0.5微克，可见通过代谢调控广藿香醇合成途径关键步骤可以使原来不产生广藿香醇的植物合成广藿香醇。
经对现有技术的文献检索发现，目前尚未发现与利用pts基因和RNA干扰的ads基因提高广藿香醇含量有关的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种利用pts基因和RNA干扰ads基因提高青蒿广藿香醇含量的方法。本发明建立了一种稳定提高青蒿中广藿香醇含量的方法，为利用转基因青蒿大规模生产广藿香醇以及除青蒿素外的其他萜类等次生代谢物奠定坚实的基础。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括步骤如下：
步骤一，获得青蒿素生物合成途径关键酶基因ads部分序列，广藿香醇生物合成途径关键酶基因pts全部阅读框序列和拟南芥中质体定位信号肽的tp片段；
步骤二，将获得的ads基因部分序列构建成发夹结构，然后将发夹结构和质体定位的pts基因分别连于表达调控序列上，得到含adsi和质体定位的pts基因的植物表达载体；
步骤三，用含adsi和质体定位的pts基因的植物表达载体转化根癌农杆菌；
步骤四，利用所构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿外植体，PCR检测，获得转基因青蒿植株；
步骤五，对获得的转基因青蒿中广藿香醇含量进行测定。
步骤二中，所述质体定位的pts基因由P35S或cyp71av1基因启动子启动。
步骤四中，所述PCR检测具体为，分别设计合成检测adsi和检测质体定位的pts基因的引物，进行DNA扩增，紫外线下观察到目的条带为阳性的植株即为转基因青蒿植株。
步骤五中，所述测定具体为：HPLC-ELSD法检测，色谱柱C-18反相硅胶柱，流动相为甲醇与水，柱温30℃，流速1.0mL/min，进样量10μL，蒸发光散射检测器漂移管温度40℃，放大系数为7，载气压力5bar。
所述流动相中甲醇与水的体积比为70∶30。
本发明从广藿香中克隆广藿香醇合成酶基因的完整阅读框pts序列，构建质体定位的pts基因的植物表达载体，用根癌农杆菌介导；从青蒿中克隆紫穗槐二烯合成酶基因ads部分序列，构建含adsi结构的植物表达载体，发夹结构的RNA干扰，简称为“adsi”或“hairpin ads”；将质体定位的pts和adsi基因同时导入植物并再生出植株；PCR检测外源目的基因质体定位的pts和adsi的整合情况，利用HPLC-ELSD法测定植物中广藿香醇含量。
本发明具有如下的有益效果：本发明将青蒿素合成途径的关键酶adsi基因和质体定位的广藿香醇合成途径关键酶基因pts导入青蒿植株中，获得了广藿香醇含量显著提高的转基因青蒿植株。转基因青蒿植株中广藿香醇的含量达到湿重的1.02％，是非转化普通青蒿的1020倍，本发明对于广藿香醇的规模化生产以及利用转基因青蒿大规模生产除青蒿素外的其他萜类等次生代谢产物具有重要意义。
本发明涉及的根癌农杆菌EHA105已在《黄亚丽，蒋细良，田云龙，郭萍，朱昌雄；根癌农杆菌介导的哈茨木霉菌遗传转化的研究，中国生物工程杂志，2008，28(3)：38-43》文献中公开。根癌农杆菌EHA105可通过公开市售的商业渠道取得，如可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambar1。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解为：这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册见New York Cold Spring HarborLaboratory出版社1989年版中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
步骤一，青蒿adsi基因、pts基因、tp基因的克隆
①青蒿基因组总RNA的提取
取少量青蒿幼嫩叶片，用液氮速冻后，迅速用研钵研碎，加入盛有1mL由美国GIBCOBRL公司生产的TRIzol Reagents于1.5mL Eppendorf管中，充分振荡后，于室温下放置5min，加200μL氯仿，用力振荡15sec，室温放置2min-3min后，于4℃、12,000g离心15min；将约600μL上清液吸入干净的1.5mL Eppendorf管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温下放置10min后，于4℃、12,000g离心10min；弃上清，加1mL 75％(v/v)乙醇清洗，振荡后，于4℃、7,500g离心5min；室温干燥15min-20min后溶于30μL-50μL RNAase-free水中；用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。
②广藿香基因组总RNA的提取
取少量广藿香幼嫩叶片，用液氮速冻后，迅速用研钵研碎，加入盛有1mL由美国GIBCO BRL公司生产的TRIzol Reagents于1.5mL Eppendorf管中，充分振荡后，于室温下放置5min，加200μL氯仿，用力振荡15sec，室温放置2min-3min后，于4℃、12,000g离心15min；将约600μL上清液吸入干净的1.5mL Eppendorf管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温下放置10min后，于4℃、12,000g离心10min；弃上清，加1mL75％(v/v)乙醇清洗，振荡后，于4℃、7,500g离心5min；室温干燥15min-20min后溶于30μL-50μL RNAase-free水中；用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。
③拟南芥基因组总RNA的提取
取少量拟南芥幼嫩叶片，用液氮速冻后，迅速用研钵研碎，加入盛有1mL由美国GIBCO BRL公司生产的TRIzol Reagents于1.5mL Eppendorf管中，充分振荡后，于室温下放置5min，加200μL氯仿，用力振荡15sec，室温放置2min-3min后，于4℃、12,000g离心15min；将约600μL上清液吸入干净的1.5mL Eppendorf管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温下放置10min后，于4℃、12,000g离心10min；弃上清，加1mL 75％(v/v)乙醇清洗，振荡后，于4℃、7,500g离心5min；室温干燥15min-20min后溶于30μL-50μL RNAase-free水中；用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。
④青蒿ads基因的克隆
将所获的青蒿基因组总RNA通过反转录酶XL(AMV)反转录获得第一链cDNA，根据青蒿ads基因的编码序列(SEQ ID NO.1)，设计扩增出含有部分ads编码序列(SEQ IDNO.1中1054bp到1427bp)的上下游引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点Xbal/Xhol以及KpnI/HindIII，以便构建表达载体。以第一链cDNA为模板，经PCR扩增后进行测序。DNA序列测定由上海英骏生物技术服务有限公司采用3730自动测序仪完成。测序结果表明，所克隆的部分序列与GenBank中所报道的青蒿ads基因的编码序列(SEQ ID NO.1中1054bp到1427bp)一致。
⑤广藿香pts基因的克隆
将广藿香基因组总RNA通过反转录酶XL(AMV)反转录获得第一链cDNA，根据广藿香pts基因的编码序列(SEQ ID NO.2)，设计扩增出完整编码框的上下游引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点NcoI和SacI，以便构建表达载体。以第一链cDNA为模板，经PCR扩增后进行测序。DNA序列测定由上海英骏生物技术服务有限公司采用3730自动测序仪完成。测序结果表明，所克隆的序列与GenBank中所报道的广藿香pts基因的编码序列(SEQ ID NO.2)一致。
⑥拟南芥tp基因的克隆
将拟南芥基因组总RNA通过反转录酶XL(AMV)反转录获得第一链cDNA，根据所述拟南芥tp基因的编码序列(SEQ ID NO.3)，设计扩增出完整功能的上下游引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点SacI和BamHI，以便构建表达载体。以第一链cDNA为模板，经PCR扩增后进行测序。DNA序列测定由上海英骏生物技术服务有限公司采用3730自动测序仪完成。测序结果表明，所克隆的序列与GenBank中所报道的拟南芥tp基因的编码序列(SEQ ID NO.3)一致。
步骤二，含质体定位的pts和adsi基因的植物双元表达载体的构建
①中间载体pHANNBAL::p35S-hairpin ads-nos的构建
选用pHANNBAL为基本元件，构建具有发夹结构的中间载体pHANNBAL::p35S-hairpin ads-no。具体地，Xhol/HindIII以及KpnI/Xbal分别进行双酶切pGEMT-easy+ads和pCAMBIA2300::p35S-pdk-nos，其中pdk是pyruvate orthophosphatedikinase的简称，是一种内含子，回收ads部分片段和pHANNBAL大片段，连接转化，挑取单克隆，提取质粒做PCR检测和酶切验证。
②中间载体pCAMBIA2300::p35S-gus-nos的构建
选用pBI121和pCAMBIA2300为基本元件，构建双元植物表达载体pCAMBIA2300::p35S-gus-nos。利用HindIII和EcoRI双酶切pBI121和pCAMBIA2300质粒；回收pBI121的GUS表达盒和pCAMBIA2300大片段；连接回收产物，转化筛选，抽质粒酶切验证。
③植物表达载体pCAMBIA2300::p35S-hairpin ads-nos的构建
以pCAMBIA2300::p35S-gus-nos为表达载体，用hairpin ads基因替换其上gus基因。利用BamHI/SacI双酶切pGEM T-easy+hairpin ads和pCAMBIA2300::p35S-gus-nos，回收hairpin ads和pCAMBIA2300::p35S-gus-nos大片段，连接转化，挑取单克隆，提取质粒做PCR检测和酶切验证。
④植物表达载体pCAMBIA2300::p35S-tp-pts-nos的构建
以pCAMBIA2300::p35S-gus-nos为表达载体，用tp-pts基因替换其上gus基因。利用BamHI/SacI双酶切pGEM T-easy+tp-pts和pCAMBIA2300::p35S-gus-nos，回收tp-pts和pCAMBIA2300::p35S-gus-nos大片段，连接转化，挑取单克隆，提取质粒做PCR检测和酶切验证。
步骤三，将含adsi和质体定位的pts基因的植物表达载体转化根癌农杆菌
将步骤二中含adsi和质体定位的pts基因的植物双元表达载体转入根癌农杆菌，如EHA105。取1μg左右的质粒DNA加入到200ml EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min，-70℃放置10min。再在37℃水浴5min或42℃水浴1min，接着冰浴2min，加入800ml LB液体培养基28℃，175rpm摇培3hr后涂在含50μg/ml Kanamycin的LB平板上。28℃培养到形成单菌落。
步骤四，根癌农杆菌介导adsi和P35S启动子启动的质体定位pts基因转化青蒿
①外植体的预培养
青蒿种子用75％(v/v)乙醇浸泡1min；再用20％(v/v)NaCIO浸泡20min；无菌水冲洗3-4次；用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS固体培养基中，MS由Murashige和Skoog在1962年发明，可以通过公开的商业渠道取得；25℃、16小时白天和8小时的黑夜培养，培养3天即可获得青蒿无菌苗。待苗长至5cm时，剪取无菌苗叶片外植体用于转化。
②农杆菌与外植体的共培养
将所述的叶片外植体，转到1/2MS和100μmol/L AS组成的共培养培养基中，滴加含活化好的所述含antisense ads和pts基因植物双元表达载体的根癌农杆菌工程菌的1/2MS悬液，使外植体与菌液充分接触，28℃暗培养3d，以滴加在不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照。
③抗性再生植株的筛选
将所述的共培养3d的青蒿外植体转入到MS、0.5mg/L 6-BA、0.05mg/L NAA、50mg/L Kan和500mg/L Cb组成的发芽筛选培养基上于25℃、16h/8h光照培养，每两周继代培养一次，经过2次-3次继代后即可获得Kan抗性丛生芽。将生长良好的抗性丛生芽剪下转入1/2MSO和125mg/L Cb组成生根培养基上培养至生根，从而获得Kan抗性再生青蒿植株。
④转基因青蒿植株的PCR检测
根据目的基因所在表达盒p35s-adsi-nos序列p35s和adsi分别设计正向引物设计和反向引物对目的基因进行检测。结果表明，利用所设计的PCR特异引物，能扩增出958bp的特异DNA片段。而以非转化青蒿基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段。
根据目的基因所在表达盒p35s-tp-pts-nos序列p35s和tp-pts分别设计正向引物设计和反向引物对目的基因进行检测。结果表明，利用所设计的PCR特异引物，能扩增出2966bp的特异DNA片段。而以非转化青蒿基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段。
步骤五，对获得的转基因青蒿中广藿香醇含量进行HPLC-ELSD测定
①HPLC-ELSD条件及系统适用性以及标准溶液的配制
HPLC：采用water alliance 2695系统，色谱柱为C-18反相硅胶柱，此硅胶柱是由Waters公司生产SymmetryShieldTM C18，具体规格为：膜厚5μm，长度×内径250mm×4.6mm；流动相为甲醇与水，其中甲醇与水的体积比为70∶30，此比例下广藿香醇的保留时间为5.1min，峰型良好；柱温30℃；流速1.0mL/min；进样量10μL；灵敏度AUFS＝1.0；理论塔板数按广藿香醇峰计算不低于2000。
ELSD：采用water alliance 2420系统，蒸发光散射检测器漂移管温度40℃，放大系数为7，载气压力5bar；
称取2.0mg Sigma公司生产的广藿香醇标准品用1mL甲醇完全溶解，得到2mg/mL广藿香醇标准品溶液，保存于-20℃备用。
②标准曲线的制作
将对照品溶液在相应色谱条件下分别进样2μl、4μl、6μl、8μl、10μl，记录图谱及色谱参数，分别以峰面积(Y)对标准品含量(X，μg)进行回归分析。结果标明，广藿香醇在4μg-20μg范围内呈现良好的log-log线性关系，广藿香醇对照品的log-log线性回归方程为：Y＝1.28e+000X+4.71e+000，R＝0.979546。
③样品的制备和广藿香醇含量的测定
广藿香醇的提取过程基于《Journal of Chromatography A》(色谱杂志A)2006年6月23日第1118卷第2期180-187页由Van Nieuwerburgh等人报道的方法：取1g-2g鲜重的青蒿叶片，于50ml试管中将其浸没在10ml氯仿中摇荡1分钟，将浸出液倒入新的试管中使氯仿挥发完全，取3ml无水乙醇充分溶解提取物，用于HPLC检测。
采用HPLC-ELSD测定广藿香醇含量，样品进样体积为20μl，根据峰面积代入线形回归方程计算出样品中的广藿香醇含量(mg)，再除以样品的青蒿叶湿重(g)，从而计算出青蒿植株中广藿香醇的含量。结果表明，本实施例青蒿中广藿香醇的含量达到湿重的1％，是非转化普通青蒿的1000倍。
实施例2
本实施例中步骤一、步骤三及步骤五均同实施例1，本实施例与实施例1所不同之处在于：步骤二中①、②和③均同实施例1，不同之处在于，
④中间载体pCAMBIA2300::cyp71av1 promoter-gus-nos的构建
以pCAMBIA2300::p35S-gus-nos为表达载体，用cyp71av1 promoter基因替换其上P35S基因。利用PstI/BamHI双酶切pGEM T-easy+cyp71av1 promoter和pCAMBIA2300::p35S-gus-nos，回收cyp71av1 promoter和pCAMBIA2300::p35S-gus-nos大片段，连接转化，挑取单克隆，提取质粒做PCR检测和酶切验证。
⑤植物表达载体pCAMBIA2300::cyp71av1 promoter-tp-pts-nos的构建
以pCAMBIA2300::cyp71av1 promoter-gus-nos为表达载体，用tp-pts基因替换其上gus基因。利用BamHI/SacI双酶切pGEM T-easy+tp-pts和pCAMBIA2300::cyp71av1promoter-gus-nos，回收tp-pts和pCAMBIA2300::cyp71av1 promoter-gus-nos大片段，连接转化，挑取单克隆，提取质粒做PCR检测和酶切验证。
步骤四中①、②和③均同实施例1，不同之处在于，
④转基因青蒿植株的PCR检测
根据目的基因所在表达盒cyp71av1 promoter-hairpin ads-nos序列cyp71av1promoter和hairpin ads分别设计正向引物设计和反向引物对目的基因进行检测。结果表明，利用所设计的PCR特异引物，能扩增出990bp的特异DNA片段，而以非转化青蒿基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段。
根据目的基因所在表达盒cyp71av1 promoter-tp-pts-nos序列cyp71av1 promoter和tp-pts分别设计正向引物设计和反向引物对目的基因进行检测。结果表明，利用所设计的PCR特异引物，能扩增出2998bp的特异DNA片段，而以非转化青蒿基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段。
结果表明，本实施例青蒿中广藿香醇的含量达到湿重的1.02％，是非转化普通青蒿的1020倍。
序列表
<110>上海交通大学
<120>利用pts基因和RNA干扰ads基因提高青蒿广藿香醇含量的方法
<160>3
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1641
<212>DNA
<213>青蒿(Artemisia annua L.)
<400>1
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ggagatcagt ttctcatcta tgaaaagcaa gtagagcaag gggtggaaca gatagtgaat 120
gatttaaaaa aagaagtgcg gcaactacta aaagaagctt tggatattcc tatgaaacat 180
gccaatttat tgaagctgat tgatgaaatc caacgccttg gaataccgta tcactttgaa 240
cgggagattg atcatgcatt gcaatgtatt tatgaaacat atggtgataa ctggaatggt 300
gaccgctctt ccttatggtt ccgtcttatg cgaaagcaag gatattatgt tacatgtgat 360
gttttcaata actataaaga caaaaatgga gcgttcaagc aatcgttagc taatgatgtt 420
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<110>上海交通大学
<120>利用pts基因和RNA干扰ads基因提高青蒿广藿香醇含量的方法
<160>3
<170>PatentIn version 3.1
<210>2
<211>1689
<212>DNA
<213>广藿香(Pogostemon cablin)
<400>2
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ggtgctgctt ctcgtcctct tgcgaatttt catccatgtg tgtggggaga caaattcatt 120
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ggtacttttg aggaattaca aatgttcaca gatgcaatcg aaaggtggga tgcttcatgt 1020
ttagataaac ttccagatta catgaaaata gtatacaagg cccttttgga tgtgtttgag 1080
gaagttgacg aggagttgat caagctaggc gcaccatatc gagcctacta tggaaaagaa 1140
gccatgaaat acgccgcgag agcttacatg gaagaggccc aatggaggga gcaaaagcac 1200
aaacccacaa ccaaggagta tatgaagctg gcaaccaaga catgtggcta cataactcta 1260
ataatattat catgtcttgg agtggaagag ggcattgtga ccaaagaagc cttcgattgg 1320
gtgttctccc gacctccttt catcgaggct acattaatca ttgccaggct cgtcaatgat 1380
attacaggac acgagtttga gaaaaaacga gagcacgttc gcactgcagt agaatgctac 1440
atggaagagc acaaagtggg gaagcaagag gtggtgtctg aattctacaa ccaaatggag 1500
tcagcatgga aggacattaa tgaggggttc ctcagaccag ttgaatttcc aatccctcta 1560
ctttatctta ttctcaattc agtccgaaca cttgaggtta tttacaaaga gggcgattcg 1620
tatacacacg tgggtcctgc aatgcaaaac atcatcaagc agttgtacct tcaccctgtt 1680
ccatattaa 1689
<110>上海交通大学
<120>利用pts基因和RNA干扰ads基因提高青蒿广藿香醇含量的方法
<160>3
<170>PatentIn version 3.1
<210>3
<211>177
<212>DNA
<213>拟南芥(Aribdopsis)
<400>3
atggcttcct ctatgctctc ctccgccgct gtggttacat ccccggctca ggccaccatg 60
gtcgctccat tcaccggctt gaagtcatcc gctgcattcc cggtcacccg caagaccaac 120
aaggacatca cttccatcgc aagcaacggg ggaagatcta gctgcatgaa ggagctc 177
Claims (5)
1.一种利用pts基因和RNA干扰ads基因提高青蒿广藿香醇含量的方法，其特征在于，包括步骤为：
步骤一，获得青蒿素生物合成途径关键酶基因ads部分序列，广藿香醇生物合成途径关键酶基因pts全部阅读框序列和拟南芥中质体定位信号肽的tp片段；
所述的ads部分序列如SEQ ID NO.1中1054bp到1427bp所示；
步骤二，将获得的ads基因部分序列构建成发夹结构，然后将发夹结构和质体定位的pts基因分别连于表达调控序列上，得到含adsi和质体定位的pts基因的植物表达载体；
步骤三，用含adsi和质体定位的pts基因的植物表达载体转化根癌农杆菌；
步骤四，利用所构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿外植体，PCR检测，获得转基因青蒿植株；
步骤五，对获得的转基因青蒿中广藿香醇含量进行测定。
2.根据权利要求1所述的利用pts基因和RNA干扰ads基因提高青蒿广藿香醇含量的方法，其特征是，步骤二中，所述质体定位的pts基因由P35S或cyp71av1基因启动子启动。
3.根据权利要求1所述的利用pts基因和RNA干扰ads基因提高青蒿广藿香醇含量的方法，其特征是，步骤四中，所述PCR检测具体为，分别设计合成检测adsi和检测质体定位的pts基因的引物，进行DNA扩增，紫外线下观察到目的条带为阳性的植株即为转基因青蒿植株。
4.根据权利要求1所述的利用pts基因和RNA干扰ads基因提高青蒿广藿香醇含量的方法，其特征是，步骤五中，所述测定具体为：HPLC-ELSD法检测，色谱柱C-18反相硅胶柱，流动相为甲醇与水，柱温30℃，流速1.0mL/min，进样量10μL，蒸发光散射检测器漂移管温度40℃，放大系数为7，载气压力5bar。
5.根据权利要求4所述的利用pts基因和RNA干扰ads基因提高青蒿广藿香醇含量的方法，其特征是，所述的流动相中甲醇与水的体积比为70∶30。
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