CN102242145A - 转aoc基因提高青蒿中青蒿素含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种生物技术领域的转AOC基因提高青蒿中青蒿素含量的方法。本发明从青蒿中克隆丙二烯氧化环化酶AOC基因，构建含AOC基因的植物表达载体，用根癌农杆菌介导，将AOC基因转入青蒿并再生出植株，PCR检测外源目的基因AOC的整合情况，高效液相色谱法及蒸发光散射检测器测定转基因青蒿中青蒿素的含量，筛选获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。本发明获得的转基因青蒿中青蒿素的含量显著提高，在非转化普通青蒿含量为1.53mg/g DW时，同时期转AOC基因青蒿中青蒿素的含量最高达到10.17mg/g DW，其含量是非转化青蒿含量的6.65倍，从而提供了一种提高青蒿中青蒿素含量的方法，为利用转基因青蒿大规模生产青蒿素打下了基础。

Description

转AOC基因提高青蒿中青蒿素含量的方法

技术领域

本发明涉及的是一种生物技术领域的提高青蒿素含量的方法，特别是一种转AOC基因提高青蒿中青蒿素含量的方法。

背景技术

青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿属的一年生草本植物。青蒿素(artemisinin)是从其地上部分分离的一种含有过氧桥结构的倍半萜内酯化合物，是目前世界上公认的最有效的治疗疟疾的药物，特别是对于脑型疟疾和抗氯喹疟疾具有速效和低毒的特点。目前，世界卫生组织推荐的最有效的治疗疟疾的方法就是青蒿素联合疗法(ACTs)。另外，随着对青蒿素药理研究的逐步深入，科学家发现青蒿素及其衍生物还具有抗炎、抗血吸虫、抗肿瘤以及免疫调节的功能。可见青蒿素是一种极具潜力的天然药物。

目前青蒿素的主要来源是从青蒿植株的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低，使得这种药物的大规模商业化生产受到了限制。由于青蒿素结构复杂，人工合成难度大，产量低，成本高，不具有可行性。有人尝试用组织培养和细胞工程的方法来生产青蒿素，然而青蒿素在愈伤组织中含量低于于重的0.1％，在芽中最高也只有于重的0.16％，而大多数研究在根中没有检测到青蒿素。因此利用组织培养及细胞工程来生产青蒿素的可行性也不高。

经对现有技术文献检索发现，2010年，Lies Maes等在《New phytologist》(《新植物学家》)发表了题为“Dissection of the phytohormonal regulation of trichome formation andbiosynthesis of the antimalarial compound artemisinin in Artemisia annua plants”(“分析植物激素调节腺毛形成和青蒿中青蒿素的合成”)的论文，报道通过喷洒茉莉酸类物质，既可促进青蒿中的腺毛的形成，又可以提高青蒿素合成途径关键酶基因表达，进而提高青蒿素的含量。如果通过代谢工程提高青蒿植株中内源茉莉酸含量，那么所产生的茉莉酸类物质就应该可以调节腺毛的发育和青蒿素合成途径关键酶基因表达，从而大幅度据高青蒿中青蒿素的含量。

现有技术中丙二烯氧化环化酶(Allene oxide cyclase，AOC)是青蒿茉莉酸合成途径中的一个关键酶，采用基因工程手段，用关键酶基因AOC转化青蒿，将打破青蒿中茉莉酸生物合成的限速瓶颈，获得青蒿素高产的青蒿植株，为规模化生产青蒿素提供一条新途径。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种转AOC基因提高青蒿中青蒿素含量的方法。本发明建立了稳定提高青蒿中青蒿素含量的方法，为利用青蒿大规模生产青蒿素奠定坚实的基础。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明从青蒿中克隆丙二烯氧化环化酶AOC基因，构建含AOC基因的植物表达载体，用根癌农杆菌介导，将AOC基因导入青蒿并再生出植株；PCR检测外源目的基因AOC的整合情况，高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)测定青蒿中青蒿素含量，筛选获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。

本发明包括如下具体步骤：

(1)采用基因克隆方法获得青蒿关键酶基因AOC；

(2)把AOC基因可操作性地连接于表达调控序列，形成含AOC基因的植物表达载体；

(3)将含AOC基因的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得用于转化青蒿的含AOC基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株；

(4)利用所构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿，获得经PCR检测的转基因青蒿植株；

(5)对获得的转基因青蒿中青蒿素含量进行HPLC-ELSD测定，筛选获得青蒿素含量显著提高的转基因青蒿植株。

所述的经PCR检测的转基因青蒿植株是指，分别设计合成AOC基因的检测引物，进行DNA扩增，紫外线下观察到目的条带的阳性株系即为转基因青蒿植株。

所述的HPLC-ELSD测定青蒿中青蒿素含量，方法为：色谱柱C-18反相硅胶柱，流动相为甲醇∶水，甲醇∶水的体积比为70∶30，柱温30℃，流速1.0mL/min，进样量10μL，蒸发光散射检测器漂移管温度40℃，放大系数(gain)为7，载气压力5bar。

本发明的转AOC基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，采用基因工程方法，将关键酶基因AOC导入青蒿植株中，获得了青蒿素含量显著提高的转基因青蒿株系，在非转化普通青蒿含量为1.53mg/gDW时，转AOC基因青蒿中青蒿素的含量达到10.17mg/g DW，其含量是非转化青蒿含量的6.65倍，该发明对于为青蒿素的规模化生产提供高产、稳定新药源具有重要意义。

本发明涉及的根癌农杆菌是一种公开多年的生物材料，如：中国专利文献号：CN101665804，名称：培育根癌农杆菌介导的长春花转基因植株的方法；中国专利文献号：CN1778913，名称：根癌农杆菌介导的质粒对顶头孢霉的转化方法；等等。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

青蒿AOC基因的克隆

1.青蒿基因组总RNA的提取

取少量青蒿(采用产于重庆酉阳青蒿素含量较高的青蒿品种)幼嫩叶片，用液氮速冻后，迅速用研钵研碎，加入盛有1mL TRIzol(TRIzol Reagents，GIBCO BRL，USA)的1.5mL Eppendorf管中，充分振荡后，于室温下放置5min，加200μL氯仿，用力振荡15sec，室温放置2-3min后，于4℃、12,000g离心15min；将上清液(约600μL)吸入干净的1.5mL Eppendorf管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温下放置10min后，于4℃、12,000g离心10min；弃上清，加1mL 75％乙醇清洗，振荡后，于4℃、7,500g离心5min；室温干燥15-20min后溶于适量(30-50μL)RNAase-free水中；用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。

2.青蒿AOC基因的RACE克隆

根据拟南芥中相关基因所编码的氨基酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，采用RACE(RapidAmplification of cDNA Ends)方法(Clontech公司SMART^TM RACE试剂盒)进行cDNA全长克隆，分三个阶段进行：

①首链cDNA的合成

利用SMART^TM RACE试剂盒所提供的5’-CDS primer A和SMART II A oligo引物，以所提取的总RNA为模板，在PowerScript反转录酶的作用下合成5’-RACE-Ready cDNA；利用Clontech试剂盒所提供的3’-CDS primer A为引物，以所提取的总RNA为模板，在PowerScript反转录酶的作用下合成3’-RACE-Ready cDNA。

②3’-RACE

用Clontech试剂盒提供的通用引物序列(UPM)和利用拟南芥同源区设计的基因特异引物2(GSP2)(SEQ ID NO：1)进行3’-RACE PCR反应。用琼脂糖凝胶电泳进行检测并对产物进行胶回收，将胶回收的目的片段连接到pMD18-T载体上进行测序。

③5’-RACE

用Clontech试剂盒提供的通用引物序列(UPM)和利用拟南芥同源区设计的基因特异引物1(GSP1)(SEQ ID NO：2)进行5’-RACE PCR反应。用琼脂糖凝胶电泳进行检测并对产物进行胶回收，将胶回收的目的片段连接到pMD18-T载体上进行测序。将测序结果的重叠区拼接，得到该基因的完整编码区序列。BLAST分析结果证明从青蒿中得到的基因确为一个丙二烯氧化环化酶的相关基因。

通过上述步骤，获得了青蒿中的丙二烯氧化环化酶蛋白的全长编码序列(SEQ ID NO：3)，其中，起始密码子为ATG，终止密码子为TAG。

实施例2

含AOC基因的植物双元表达载体的构建

1.中间载体pCAMBIA2300::p35S-gus-nos的构建

选用pBI121和pCAMBIA2300为基本元件，构建双元植物表达载体pCAMBIA2300::p35S-gus-nos。具体地，HindIII和EcoRI双酶切pBI121和pCAMBIA2300质粒；回收pBI121的gus表达盒和pCAMBIA2300大片段；连接回收产物，转化筛选，抽质粒酶切验证。

2.植物表达载体pCAMBIA2300::p35S-AOC-nos的构建

以所述的pCAMBIA2300::p35S-gus-nos为表达载体，用实施例1中AOC基因替换其上的gus基因。具体地，BamHI/SacI双酶切pGEM T-easy+AOC和pCAMBIA2300::p35S-gus-nos，回收AOC和pCAMBIA2300::p35S-gus-nos大片段，连接转化，挑取单克隆，提取质粒做PCR检测和酶切验证。

本实施例将青蒿素生物合成途径关键酶基因AOC可操作性地连接于表达调控序列，形成含AOC基因的植物表达载体，该表达载体可用于通过代谢工程策略来提高青蒿中青蒿素的含量。

实施例3

根癌农杆菌介导AOC基因遗传转化青蒿获得转基因青蒿植株

1.含AOC基因双元植物表达载体根癌农杆菌工程菌的获得

将实施例2中含AOC基因的植物双元表达载体转入根癌农杆菌(如EHA105，为市场有公开出售的生物材料，可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambar 1)，并进行PCR验证。结果表明，含AOC基因植物双元表达载体已成功构建到根癌农杆菌菌株中。

2.根癌农杆菌介导AOC基因转化青蒿

2.1.外植体的预培养

青蒿种子用75％乙醇浸泡1min，再用20％NaClO浸泡20min，无菌水冲洗3-4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS(Murashige and Skoog，1962)固体培养基中，25℃、16h/Sh(light/dark)光照培养，即可获得青蒿无菌苗。待苗长至5cm左右后，剪取无菌苗叶片外植体用于转化。

2.2.农杆菌与外植体的共培养

将所述的叶片外植体，转到共培养培养基(1/2MS+AS 100μmol/L)中，滴加含活化好的所述含AOC基因植物双元表达载体的根癌农杆菌工程菌的1/2MS悬液，使外植体与菌液充分接触，28℃暗培养3d。以滴加在不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照。

2.3.抗性再生植株的筛选

将所述的共培养3d的青蒿外植体转入到发芽筛选培养基(MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L+Kan 50mg/L+Cb 500mg/L)上于25℃、16h/Sh光照培养，每两周继代培养一次，经过2-3次继代后即可获得Kan抗性丛生芽。将生长良好的抗性丛生芽剪下转入生根培养基(1/2MS+Cb 125mg/L)上培养至生根，从而获得Kan抗性再生青蒿植株。

3.转基因青蒿植株的PCR检测

根据目的基因所在表达盒p35s-AOC-nos序列p35s和AOC分别设计正向引物设计和反向引物对目的基因进行检测。结果表明，利用所设计的PCR特异引物，能扩增出1193bp的特异DNA片段。而以非转化青蒿基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段。

本实施例将所述的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得用于转化青蒿的含AOC基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株，利用所构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿，获得经PCR检测的转基因青蒿植株。转基因青蒿植株的获得为筛选获得较高青蒿素含量的青蒿株系提供了直接素材。

实施例4

利用HPLC-ELSD测定转基因青蒿中青蒿素含量

1.HPLC-ELSD条件及系统适用性以及标准溶液的配制

HPLC：采用water alliance 2695系统，色谱柱为C-18反相硅胶柱(SymmetryShieldTM C18，5μm，250×4.6m，Waters)，流动相为甲醇∶水，甲醇∶水的体积比为70∶30，柱温30℃，流速1.0mL/min，进样量10μL，灵敏度(AUFS＝1.0)，理论塔板数接青蒿素峰计算不低于2000。

ELSD：采用water alliance 2420系统，蒸发光散射检测器漂移管温度40℃，放大系数(gain)为7，载气压力5bar；

精密称取青蒿素标准品(Sigma公司)2.0mg用1mL甲醇完全溶解，得到2mg/mL青蒿素标准品溶液，保存于-20℃备用。

本发明中流动相为甲醇(methanol)∶水，比例为70％∶30％时，青蒿素的保留时间为5.1min，峰型良好。理论塔板数接青蒿素计算不低于2000。

2.标准曲线的制作

将所述对照品溶液在相应色谱条件下分别进样2μl，4μl，6μl，8μl，10μl记录图谱及色谱参数，分别以峰面积(Y)对标准品含量(X，μg)进行回归分析。通过研究，本发明中青蒿素在4-20μg范围内呈现良好的log-log线性关系。青蒿素对照品的log-log线性回归方程为：Y＝1.28e+000X+4.71e+000，R＝0.979546。

3.样品的制备和青蒿素含量的测定

在青蒿植株的上，中和下部共取2g新鲜的青蒿叶片，于45℃烘箱中烘至恒重。然后从烘干的棱条上敲下叶和花蕾，磨成粉末。称取约0.1g干粉于2mL Eppendorf管中，加入2mL乙醇，用40W超声波处理30min，5000rpm离心10min，取上清用0.22μm滤膜过滤，即可用于HPLC-ELSD测定青蒿素的含量。

采用HPLC-ELSD测定青蒿素含量，样品进样体积为20μl，根据峰面积代入线形回归方程计算出样品中的青蒿素含量(mg)，再除以样品的青蒿叶干重(g)，从而计算出青蒿植株中青蒿素的含量。

在本发明中转AOC基因显著提高青蒿中青蒿素含量。在非转化普通青蒿含量为1.53mg/g DW时，同时期转AOC基因青蒿中青蒿素的含量最高达到10.17mg/g DW，其含量是非转化青蒿含量的6.65倍

本实施例采用HPLC-ELSD法测定了转基因青蒿中青蒿素含量，采用转化AOC基因的代谢工程策略获得了青蒿素高产的青蒿植株，为规模化生产青蒿素提供了一种理想方法。

Claims (4)

1.一种转AOC基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，从青蒿中克隆丙二烯氧化环化酶AOC基因，构建含AOC基因的植物表达载体，用根癌农杆菌介导，将AOC基因导入青蒿并再生出植株；PCR检测外源目的基因AOC的整合情况，HPLC-ELSD测定青蒿中青蒿素含量，筛选获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。

2.根据权利要求1所述的转AOC基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，包括如下步骤：

(1)采用基因克隆方法获得青蒿关键酶基因AOC；

(2)把AOC基因可操作性地连接于表达调控序列，形成含AOC基因的植物表达载体；

(3)将含AOC基因的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得用于转化青蒿的含AOC基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株；

(4)利用所构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿，获得经PCR检测的转基因青蒿植株；

(5)对获得的转基因青蒿中青蒿素含量进行HPLC-ELSD测定，筛选获得青蒿素转基因青蒿植株。

3.根据权利要求2所述的转AOC基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，所述的经PCR检测的转基因青蒿植株是指，分别设计合成AOC基因的检测引物，进行DNA扩增，紫外线下观察到目的条带的阳性株系即为转基因青蒿植株。

4.根据权利要求2所述的转AOC基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，所述的HPLC-ELSD测定青蒿中青蒿素含量，其方法为：色谱柱C-18反相硅胶柱，流动相为甲醇∶水，甲醇∶水的体积比为70∶30，柱温30℃，流速1.0mL/min，进样量10μL，蒸发光散射检测器漂移管温度40℃，放大系数为7，载气压力5bar。