CN102558325A - 青蒿AaORA蛋白及编码基因、转基因青蒿植株的获得方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种青蒿AaORA蛋白及编码基因、转基因青蒿植株的获得方法；所述青蒿AaORA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；同时，本发明还涉及编码青蒿AaORA蛋白的核酸序列、植物干扰表达载体、根癌农杆菌菌株以及一种转基因青蒿植株的获得方法。本发明从青蒿中克隆AaORA基因，构建含AaORA基因的植物干扰表达载体，用根癌农杆菌EH105介导，将AaORA基因干扰表达载体转化青蒿；PCR检测外源目的基因AaORA的整合情况，高效液相色谱-蒸发光散射检测器测定青蒿中青蒿素含量，筛选获得青蒿素含量明显降低的转基因青蒿植株。

Description

青蒿AaORA蛋白及编码基因、转基因青蒿植株的获得方法

技术领域

本发明涉及的是一种基因工程技术领域的蛋白，具体涉及一种青蒿AaORA蛋白及编码基因、转基因青蒿植株的获得方法。

背景技术

植物新陈代谢分为初生代谢和次生代谢，初生代谢产物(如糖类、脂类和核酸)存在于所有植物中，是维持细胞生命活动所必需的，而植物次生代谢产物是指植物中一大类并非植物生长发育所必需的小分子有机化合物，其产生和分布具有种属、组织器官和生长发育特异性。近年来，随着对中草药成分研究的逐步深入，发现很多中草药的有效成分均为植物的次生代谢产物，如青蒿中的青蒿素，紫草中的紫草素等，具有重要的药用价值。

天然植株中次生代谢产物含量极低，而使用化学合成的方法，工艺流程复杂、成本高。因此，人们开始探索其他的提高植物次生代谢产物含量的方法，在诸多方法之中，植物代谢工程和代谢调控是提高植物次生代谢产物含量的最有效方法之一。植物代谢途径大多是由多种酶参与的多步反应，受发育、环境等因素的影响，对单个基因进行修饰有时难以奏效。而转录调控因子可调控多个参与代谢途径基因的表达，其在植物发育、适应、进化中的作用研究已取得了不少进展。转录因子通常指由核基因编码的一类蛋白质，它们主要以同源或异源二聚体的形式同顺式作用因子发生特异性的结合，通过和某些辅助调控子发生作用而影响转录复合体的形成，从而调节植物基因的特异性表达。改变转录因子的表达往往可导致植物中该转录因子所控制性状的较大改变，因此，利用基因工程的方法调控转录因子是颇具应用价值的植物遗传操作手段。

荷兰Memelink实验室在长春花中所做的研究取得重要进展，他们所发现的ORCA2和ORCA3转录因子是目前所知在植物次生代谢调控中具有重要作用的转录因子，且都属于AP2/ERF家族，是植物特有的一类转录因子。该家族转录因子参与植物多种基因的表达，能调节植物对病原、低温、干旱及高盐等分子的应答反应，提高植物对逆境胁迫的耐受作用。ORCA3应答于MeJA的诱导，可以增强TIAs生物合成代谢途径上多个基因，包括dxs、as、tdc、str、d4h的表达。ORCA3不影响催化开联番木鳖甙生物合成第一步的酶--香叶醇单加氧酶(G10H)，尽管G10H也受甲基茉莉酸调控。在仅过表达ORCA3的转基因细胞系中生物碱含量并没有增加。如果在细胞培养介质中加入一定量的开联番木鳖甙的前体马钱苷后，转ORCA3基因的细胞系生物碱合成比非转基因对照细胞系高3倍。如果通过RACE等技术在青蒿中克隆并得到类似长春花中的ORCA2和ORCA3转录因子，那么就可以利用其对次生代谢的重要调控作用，使用代谢工程手段提高青蒿植株中重要次生代谢产物青蒿素的含量。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种青蒿AaORA蛋白及编码基因、转基因青蒿植株的获得方法。该基因编码一个乙烯相应的AP2-ERF类转录因子(AaORA)，它参与调控青蒿素的合成代谢途径；利用转基因技术将青蒿AaORA转录因子干扰载体转化青蒿可以有效调控青蒿中青蒿素的含量。

本发明是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明涉及一种青蒿AaORA蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

第二方面，本发明还涉及编码青蒿AaORA蛋白的核酸序列。

优选地，所述核酸序列的碱基序列为：

如(a)SEQ ID NO：5中第1～1101位所示，

或者是(b)SEQ ID NO：5序列中第1～1101位所示的核苷酸中一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子取代后产生的序列。

第三方面，本发明还涉及一种植物干扰表达载体，包含第二方面所述的核酸序列。

第四方面，本发明还涉及一种根癌农杆菌菌株，包含第三方面所述的植物干扰表达载体。

第五方面，本发明还涉及一种转基因青蒿植株的获得方法，包括如下步骤：

(a)克隆第二方面所述的核酸序列；

(b)把所述核酸序列可操作性地连接于表达调控序列，得到植物干扰表达载体；

(c)将植物干扰表达载体转化根癌农杆菌EH105；

(d)利用构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿植株，经卡那霉素筛选得到抗性苗，再经PCR检测为阳性的植株，即转基因青蒿植株。

所述的经PCR检测为阳性的植株是指，分别设计合成AaORA基因的检测引物，进行DNA扩增，紫外线下观察到目的条带的阳性株系即为转基因青蒿植株。

本发明具有如下的有益效果：

本发明从青蒿中克隆AaORA基因，构建含AaORA基因的植物干扰表达载体，用根癌农杆菌EH105介导，将AaORA基因干扰表达载体转化青蒿；PCR检测外源目的基因AaORA的整合情况，高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)测定青蒿中青蒿素含量，筛选获得青蒿素含量明显降低的转基因青蒿植株。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的青蒿AaORA蛋白多肽时，可以将青蒿AaORA蛋白编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成青蒿AaORA蛋白表达载体。

“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一股，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

以下实施例中涉及的农杆菌为根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EH105，该菌株可以从市场上公开购买(来源于澳大利亚CAMBIA公司，菌株编号为Gambar 1)。

实施例1、青蒿AaORA基因的克隆

1.1、青蒿基因组总RNA的提取

取青蒿叶片组织，置于液氮中研碎，加入盛有裂解液的1.5mL Eppendorf(EP)离心管中，充分振荡后，按照TIANGEN试剂盒的说明书抽提总RNA。

用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。

1.2、青蒿AaORA基因的RACE克隆

根据拟南芥中相关基因所编码的氨基酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，采用RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)方法(Clontech公司SMART^TM RACE试剂盒)进行cDNA全长克隆，分三个阶段进行：

1.2.1、首链cDNA的合成

利用SMART^TM RACE试剂盒所提供的5’-CDS primer A和SMART II A oligo引物，以所提取的总RNA为模板，在PowerScript反转录酶的作用下合成5’-RACE-Ready cDNA；利用Clontech试剂盒所提供的3’-CDS primer A为引物，以所提取的总RNA为模板，在PowerScript反转录酶的作用下合成3’-RACE-Ready cDNA。

1.2.2、3’-RACE

用Clontech试剂盒提供的通用引物序列(UPM)和利用青蒿中与orca3同源性最高的保守片段(EY074653)设计的基因特异引物3-GSP1(SEQ ID NO：1)，3-GSP2(SEQ ID NO：2)；进行3’-RACE PCR反应。用琼脂糖凝胶电泳进行检测并对产物进行胶回收，将胶回收的目的片段连接到pMD18-Tsimple载体上进行测序。

1.2.3、5’-RACE

用Clontech试剂盒提供的通用引物序列(UPM)和利用青蒿保守片段设计的基因特异引物5-GSP1(SEQ ID NO：3)，5-GSP2(SEQ ID NO：4)；进行5’-RACE PCR反应。用琼脂糖凝胶电泳进行检测并对产物进行胶回收，将胶回收的目的片段连接到pMD18-Tsimple载体上进行测序。将测序结果的重叠区拼接，得到该基因的完整编码区序列(SEQ IDNO：5)。

BLAST分析结果证明从青蒿中得到的基因为AP2-ERF类转录因子。

通过上述步骤，获得了青蒿中该转录因子的全长编码序列并推导出其蛋白编码序列(SEQ ID NO：6)，其中，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。

实施例2、含AaORA基因的植物双元干扰表达载体的构建

2.1、中间载体pBlucescript::AaORA的构建

选用pBlucescriptSK+和gus基因片段为基本元件，构建干扰表达盒pBlucescriptSK+::gus。具体地，SmaI单酶切pBlucescriptSK+和含gus基因的质粒；回收gus片段和pBlucescriptSK+大片段；连接回收产物，转化筛选，抽质粒pBlucescriptSK+::gus酶切验证。

将AaORA特异性片段正反向分别插入到pBlucescriptSK+::gus载体中。具体地，XhoI/HindIII双酶切pGEM T-easy+AaORA和pBlucescriptSK+::gus，回收AaORA和pBlucescriptSK+::gus大片段，连接转化，挑取单克隆，提取质粒pBlucescriptSK+::FAaORA，并做PCR检测和酶切验证。用BamHI/XbaI双酶切pGEMT-easy+AaORA和pBlucescriptSK+::FAaORA，回收AaORA和pBlucescriptSK+::FAaORA大片段，连接转化，挑取单克隆，提取质粒pBlucescriptSK+::AaORAi，并做PCR检测和酶切验证。

2.2、植物表达干扰载体pCAMBIA2300::p35S-AaORAi-nos的构建

使用pCAMBIA2300::p35S-AaORAi-nos为表达载体，用中间载体pBlucescriptSK+::AaORAi中AaORA基因发卡结构，插入到pCAMBIA2300载体中。具体地，BamHI/SacI双酶切pBlucescriptSK+::AaORAi和pCAMBIA2300::p35S-gus-nos，回收AaORA发卡结构和pCAMBIA2300::p35S-gus-nos大片段，连接转化，挑取单克隆，提取质粒做PCR检测和酶切验证。

本实施例将青蒿AP2-ERF类转录因子AaORA可操作性地连接于表达调控序列，形成含AaORA发卡结构的植物表达干扰载体，该载体可用于通过代谢工程策略来调控青蒿中青蒿素的含量。

实施例3、根癌农杆菌介导的AaORA干扰载体遗传转化青蒿获得转基因青蒿植株

3.1、含AaORA干扰表达载体的根癌农杆菌工程菌的获得

将实施例2中含AaORA的植物双元干扰表达载体采用冻融法转入根癌农杆菌(EHA105，为市场有公开出售的生物材料，可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambar 1)，并进行PCR验证。结果表明，含AaORA的植物双元干扰表达载体已成功构建到根癌农杆菌菌株中。

3.2、根癌农杆菌介导AaORA基因转化青蒿

3.2.1、外植体的预培养

青蒿种子用75％乙醇浸泡1min，再用20％NaClO浸泡20min，无菌水冲洗3-4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS(Murashige and Skoog，1962)固体培养基中，25℃、16h/8h(light/dark)光照培养，即可获得青蒿无菌苗。待苗长至5cm左右后，剪取无菌苗叶片外植体用于转化。

3.2.2、农杆菌与外植体的共培养

将所述的叶片外植体，转到共培养培养基(1/2MS+AS 100μmol/L)中，滴加含活化好的所述含AaORA植物双元干扰表达载体的根癌农杆菌工程菌的1/2MS悬液，使外植体与菌液充分接触，28℃暗培养3d。以滴加在不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照。

3.2.3、抗性再生植株的筛选

将所述的共培养3d的青蒿外植体转入到发芽筛选培养基(MS+6-BA 0.5mg/L+NAA0.05mg/L+Kan 50mg/L+Cb 500mg/L)上于25℃、16h/8h光照培养，每两周继代培养一次，经过2-3次继代后即可获得Kan抗性丛生芽。将生长良好的抗性丛生芽剪下转入生根培养基(1/2MS+Cb 125mg/L)上培养至生根，从而获得Kan抗性再生青蒿植株。

3.2.4、转基因青蒿植株的PCR检测

根据目的基因所在表达盒p35s-AaORAi-nos序列p35s和AaORA分别设计正向引物设计和反向引物对目的基因进行检测。结果表明，利用所设计的PCR特异引物，能扩增出927bp的特异DNA片段。而以非转化青蒿基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段。

本实施例将所述的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得用于转化青蒿的含AaORA植物双元干扰表达载体的根癌农杆菌菌株，利用所构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿，获得经PCR检测的转基因青蒿植株。转基因青蒿植株的获得为筛选获得较高青蒿素含量的青蒿株系提供了直接素材。

实施例4、利用HPLC-ELSD测定转基因青蒿中青蒿素含量

4.1、HPLC-ELSD条件及系统适用性以及标准溶液的配制

HPLC：采用water alliance 2695系统，色谱柱为C-18反相硅胶柱(SymmetryShieldTM C18，5μm，250×4.6mm，Waters)，流动相为甲醇∶水，甲醇∶水的体积比为70∶30，柱温30℃，流速1.0mL/min，进样量10μL，灵敏度(AUFS＝1.0)，理论塔板数按青蒿素峰计算不低于2000。

ELSD：采用water alliance 2420系统，蒸发光散射检测器漂移管温度40℃，放大系数(gain)为7，载气压力5bar；

精密称取青蒿素标准品(Sigma公司)2.0mg用1mL甲醇完全溶解，得到2mg/mL青蒿素标准品溶液，保存于-20℃备用。

本发明中流动相为甲醇(methanol)∶水，比例为70％∶30％时，青蒿素的保留时间为5.1min，峰型良好。理论塔板数按青蒿素计算不低于2000。

4.2、标准曲线的制作

将所述对照品溶液在相应色谱条件下分别进样2μl，4μl，6μl，8μl，10μl记录图谱及色谱参数，分别以峰面积(Y)对标准品含量(X，μg)进行回归分析。通过研究，本发明中青蒿素在4-20μg范围内呈现良好的log-log线性关系。青蒿素对照品的log-log线性回归方程为：Y＝1.28e+000X+4.71e+000，R＝0.979546。

4.3、样品的制备和青蒿素含量的测定

在青蒿植株的上，中和下部共取2g新鲜的青蒿叶片，于45℃烘箱中烘至恒重。然后从烘干的枝条上敲下叶和花蕾，磨成粉末。称取约0.1g干粉于2mL Eppendorf管中，加入2mL乙醇，用40W超声波处理30min，5000rpm离心10min，取上清用0.22μm滤膜过滤，即可用于HPLC-ELSD测定青蒿素的含量。

采用HPLC-ELSD测定青蒿素含量，样品进样体积为20μl，根据峰面积代入线形回归方程计算出样品中的青蒿素含量(mg)，再除以样品的青蒿叶干重(g)，从而计算出青蒿植株中青蒿素的含量。

转AaORAi干扰载体的转基因植株可显著降低了青蒿中青蒿素含量。在非转化普通青蒿含量为9.30mg/g DW时，同时期转AaORAi干扰载体青蒿中青蒿素的含量平均达到6.31mg/g DW，其含量是非转化青蒿含量的0.678倍。

本实施例采用HPLC-ELSD法测定了转基因青蒿中青蒿素含量，采用转化AaORAi干扰载体代谢工程策略发现AaORA基因的表达与青蒿素的含量具有较为明显的关系，为利用该基因进行过表达研究进而提高青蒿中青蒿素的含量提供了有力的基础资料。

Claims (6)

1.一种青蒿AaORA蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

2.一种编码权利要求1所述青蒿AaORA蛋白的核酸序列。

3.如权利要求2所述的核酸序列，其特征在于，其碱基序列

如(a)SEQ ID NO：5中第1～1101位所示，

或者是(b)SEQ ID NO：5序列中第1～1101位所示的核苷酸中一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子取代后产生的序列。

4.一种植物干扰表达载体，其特征在于，包含如权利要求2所述的核酸序列。

5.一种根癌农杆菌菌株，其特征在于，包含如权利要求4所述的植物干扰表达载体。

6.一种转基因青蒿植株的获得方法，其特征在于，包括如下步骤：

(a)克隆权利要求2所述的核酸序列；

(b)把所述核酸序列可操作性地连接于表达调控序列，得到植物干扰表达载体；

(c)将植物干扰表达载体转化根癌农杆菌EH105；

(d)利用构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿植株，经卡那霉素筛选得到抗性苗，再经PCR检测为阳性的植株，即转基因青蒿植株。