CN105585624B - 一种青蒿pdr亚家族转运蛋白及其功能验证方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种青蒿PDR亚家族转运蛋白，该蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或者如SEQ ID NO:2所示；或者该蛋白由在高严谨条件与编码氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示的蛋白质的核酸的互补链杂交的核酸编码。进一步地，发明人将该蛋白命名为AaPDR1，为青蒿分泌型腺毛特异表达的转运蛋白，酵母转运实验和青蒿中干扰该转运蛋白证明AaPDR1参与青蒿中青蒿素合成途径中间产物二氢青蒿酸的转运。该发明对于为青蒿素的规模化生产提供高产、稳定新药源具有重要意义。

Description

一种青蒿PDR亚家族转运蛋白及其功能验证方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种青蒿PDR亚家族转运蛋白及其功能验证方法和应用。
背景技术
青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿属的一年生草本植物。其地上部分所提取的含有过氧桥的倍半萜内酯氧化物——青蒿素，是目前应用最广泛，疗效最好的抗疟疾药物，特别是对脑型疟疾和抗氯喹疟疾更加有效。目前，青蒿素联合疗法(ACTs)是世界卫生组织推荐的最有效的治疗疟疾的方法。但其青蒿素在植物青蒿中的含量低，尚无法完全满足全球的市场需求。青蒿具有分泌型腺毛(glandular trichomes)和非分泌型腺毛(nonglandulartrichomes)。在青蒿叶片的正面和背面、茎秆、花上都大量存在分泌型腺毛，这里是大量次生代谢物的累积场所，青蒿素也被认为储存于此处。
ATP结合盒式(ATP binding cassette，ABC)转运蛋白是一大类非常多样化非常特殊的超级家族。大部分ABC转运蛋白直接参与到各种分子的跨膜运输。此转运蛋白利用水解ATP释放能量对细胞质内多种生物分子进行跨膜运输，转运底物包括：脂类、氨基酸、生物碱、萜类物质等。根据对于细胞质的转运方向可以粗略分为摄取转运蛋白(importer)和外排转运蛋白(exporter)。ABC转运蛋白的特征是具有ATP结合区域(ATP-bindingcassette)，也被称为核酸结合区域(nucleotide-binding domain，NBD)，具有一些非常保守的模序(motif)，包括Walker A和Walker B序列、ABC signature motif、H loop和Qloop。植物中有大量的ABC转运蛋白，近年来的研究表明植物ABC转运蛋白不仅仅涉及到植物激素、酯类、金属离子、次生代谢物、外源化学物质的转运有关，而且对于植物和病原体互作以及离子通道的建成都有重要作用。多向耐药性(pleiotropic drug resistance，PDR)转运蛋白属于ABC转运蛋白家族G亚家族，包含反向的核酸结合区域-跨膜结合区域(NBD-TMD)类型的转运蛋白。
发明内容
针对青蒿素在植物青蒿中的含量低，无法有效满足市场需求的问题，发明人考虑到如果通过对青蒿分泌型腺毛转录组数据库分析，筛选出参与青蒿素合成途径相关转运蛋白，并且验证其功能，那么就可以利用基因工程手段提高转运蛋白的转运效率，从而提高青蒿中青蒿素的含量。AaPDR1是发明人从青蒿中克隆得到的一种ABC转运蛋白，属于青蒿PDR转运蛋白亚家族，因此是一种青蒿PDR亚家族转运蛋白，命名为AaPDR1。为了验证AaPDR1的功能，发明人利用酵母突变体AD12345678体外转运实验证明AaPDR1是青蒿素直接前体物质二氢青蒿酸的从胞内到胞外的外排转运蛋白。并且采用基因工程手段，将该AaPDR1转运蛋白反义干扰载体转化青蒿，可以显著抑制青蒿素的合成。因此，克隆AaPDR1基因及其外排功能的研究对于提高青蒿素含量和生产代谢产物的基因工程育种具有重要意义。经对现有技术文献的检索发现，尚未发现有与本发明的AaPDR1基因序列相关的报道。
本发明提供一种青蒿PDR亚家族转运蛋白，所述青蒿PDR亚家族转运蛋白具有以下一种或者两种特征：
1)所述青蒿PDR亚家族转运蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或者所述青蒿PDR亚家族转运蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
2)所述青蒿PDR亚家族转运蛋白由在高严谨条件与编码氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示的蛋白质的核酸的互补链杂交的核酸编码。
进一步地，所述青蒿PDR亚家族转运蛋白由如SEQ ID NO:1所示的核酸编码。
进一步地，所述青蒿PDR亚家族转运蛋白存在于植物青蒿(Artemisia annua L.)中，所述青蒿PDR亚家族转运蛋白具有转运二氢青蒿酸的功能。“高严谨条件”的核酸杂交一般是指本领域技术人员认可的低盐、高温条件下的核酸杂交，是本领域的公知常识。
本发明实际上是提供了一种多肽或者一种蛋白质，该多肽或者蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明还提供如上所述的青蒿PDR亚家族转运蛋白的功能验证方法，包括以下步骤：
(1)从青蒿cDNA文库中克隆到所述青蒿PDR亚家族转运蛋白的核酸序列，如SEQ IDNO:1所示，即AaPDR1基因；
(2)把AaPDR1基因可操作性地连接于酵母表达调控序列，形成含AaPDR1基因的酵母表达载体；
(3)将含所述AaPDR1基因的酵母表达载体转入酵母菌AD12345678，得到转基因酵母菌，所述转基因酵母菌获得了二氢青蒿酸外排的功能，从而验证了所述青蒿PDR亚家族转运蛋白具有外排二氢青蒿酸的功能。
本发明还提供验证如上所述的青蒿PDR亚家族转运蛋白功能的另一种方法，包括以下步骤：
(1)从青蒿cDNA文库中克隆到所述青蒿PDR亚家族转运蛋白的核酸序列，如SEQ IDNO:1所示，即AaPDR1基因；
(2)把AaPDR1基因可操作性地连接于表达调控序列，形成含AaPDR1基因的植物反义干扰表达载体；
(3)将含所述AaPDR1基因的植物反义干扰表达载体转化根癌农杆菌EH105，获得具有所述干扰表达载体的根癌农杆菌菌株；
(4)利用所述步骤3构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿，经卡那霉素筛选得到抗性苗，再经PCR检测为阳性的植株即为转基因青蒿；
(5)对获得的所述转基因青蒿进行青蒿素、二氢青蒿酸和青蒿酸含量测定，进而获得青蒿素合成受抑制的青蒿植株，从而验证了所述青蒿PDR亚家族转运蛋白具有影响青蒿素合成的功能。
进一步地，可以将上面两种验证方法合并，即包括以下步骤：
(1)从青蒿cDNA文库中克隆到所述青蒿PDR亚家族转运蛋白的核酸序列，如SEQ IDNO:1所示，即AaPDR1基因；
(2)把AaPDR1基因可操作性地连接于酵母表达调控序列，形成含AaPDR1基因的酵母表达载体；
(3)将含所述AaPDR1基因的酵母表达载体转入酵母菌AD12345678，得到转基因酵母菌，所述转基因酵母菌获得了二氢青蒿酸外排的功能，从而验证了所述青蒿PDR亚家族转运蛋白具有外排二氢青蒿酸的功能；
(4)把AaPDR1基因可操作性地连接于表达调控序列，形成含AaPDR1基因的植物反义干扰表达载体；
(5)将含所述AaPDR1基因的植物反义干扰表达载体转化根癌农杆菌EH105，获得具有所述干扰表达载体的根癌农杆菌菌株；
(6)利用所述步骤5构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿，经卡那霉素筛选得到抗性苗，再经PCR检测为阳性的植株即为转基因青蒿；
(7)对获得的所述转基因青蒿进行青蒿素、二氢青蒿酸和青蒿酸含量测定，进而获得青蒿素合成受抑制的青蒿植株，从而验证了所述青蒿PDR亚家族转运蛋白具有影响青蒿素合成的功能。
优选地，采用引物AaPDR1-FP1(如SEQ ID NO:3所示)：AAACCCTTTTTGCTTTCTAATTGATTCA和AaPDR1-RP1(如SEQ ID NO:4所示)：TTATCTCTTCTGGAAATTAAAGGA对进行AaPDR1基因克隆。
优选地，将AaPDR1基因构建在酵母表达载体上，为了方便表达载体的构建，正向引物中引入了SpelI的酶切位点，反向引物中引入了PstI的酶切位点，引物为：Spe I-AaPDR1-FP(如SEQ ID NO:5所示)：TATACCCCAGCCTCGACTAGTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA和AaPDR1-PstI-RP(如SEQ ID NO:6所示)：CTTGATATCGAATTCCTGCAGTTATCTCTTCTGGAAATTAA。
优选地，将AaPDR1基因部分序列构建在植物反义表达载体上，为了方便表达载体的构建，正向引物中引入了BamHI的酶切位点，反向引物中引入了SacI的酶切位点，引物为：Anti-PDR1-SacI-FP(如SEQ ID NO:7所示)：CGAGCTCATGGAAGGAAGTGATATACACAA和Anti-PDR1-BamHI-RP(如SEQ ID NO:8所示)：CGGGATCCCCATTGTACGTCACCTTTCCAG。
优选地，通过AaPDR1基因所在表达盒上游的35S启动子区域和AaPDR1分别设计正向引物(35SFP：GAAGATGCCTCTGCCGACAGTG，如SEQ ID NO:9所示)和反向引物(AaPDR1-BamHI-RP：CGGGATCCCCATTGTACGTCACCTTTCCAG，如SEQ ID NO:8所示)对转基因青蒿的AaPDR1基因进行检测。
进一步地，上述转化根癌农杆菌EH105的具体方法是采用冻融法进行转化。
进一步地，青蒿素含量采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器法(HPLC-ELSD)进行测定。
本发明还保护含有如上所述的青蒿PDR亚家族转运蛋白的核酸序列的表达载体或宿主细胞。优选地，所述表达载体包括含AaPDR1基因的酵母表达载体；所述宿主细胞包括含AaPDR1基因的酵母表达载体的酵母菌AD12345678。
本发明还保护如上所述的青蒿PDR亚家族转运蛋白在提高青蒿素含量的青蒿育种中的应用，或者在制备抗疟疾药物中的应用。进一步地，本发明涉及如上所述的青蒿PDR亚家族转运蛋白在酵母菌中参与二氢青蒿酸从胞内向胞外外排转运，其二氢青蒿酸外排功能在青蒿素合成途径和积累的应用。
本发明提供了一种青蒿PDR亚家族转运蛋白，并以AaPDR1为例提供了其氨基酸序列(如SEQ ID NO:2所示)和核苷酸序列(如SEQ ID NO:1所示)，同时验证了AaPDR1参与二氢青蒿酸的从胞内向胞外转运。AaPDR1基因序列为发明人首次克隆，该蛋白的功能也是首次验证。
AaPDR1在叶片发育初期及不同组织部位中的表达谱与青蒿素合成途径中分泌型腺毛特异性表达的基因ADS、CYP71AV1、DBR2和ALDH1的表达谱基本一致，说明AaPDR1很可能参与青蒿素合成。其启动子融合GUS转青蒿证明AaPDR1为青蒿分泌型腺毛特异表达转运蛋白；烟草和酵母亚细胞定位证明AaPDR1定位于细胞膜上。酵母突变体AD12345678体外转运实验证明，AaPDR1转运蛋白对二氢青蒿酸具有外排功能(图1)。利用转基因技术将青蒿AaPDR1转运蛋白反义干扰载体转化青蒿，可以显著抑制青蒿素合成。克隆AaPDR1基因及其外排功能的研究对于提高青蒿素含量和生产代谢产物的基因工程育种具有重要意义。
附图说明
图1是相同时间不同浓度下三种酵母AD12345678转化株体内分别的二氢青蒿酸的含量柱状图。
图2是不同时间相同浓度下两种酵母AD12345678转化株体内分别的二氢青蒿酸的含量柱状图。
图3是AaPDR1反义干扰转基因植株AaPDR1基因表达量的柱状图。
图4是AaPDR1反义干扰转基因植株青蒿素含量的柱状图。
图5是AaPDR1反义干扰转基因植株二氢青蒿酸含量的柱状图。
图6是AaPDR1反义干扰转基因植株青蒿酸含量的柱状图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步的说明：下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明中所涉及的农杆菌为根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EH105，该菌株可以从市场上公开购买(来源于澳大利亚CAMBIA公司，菌株编号为Gambar1)。本发明中所涉及的酵母突变体AD12345678是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)改造的突变株，基因型为MATα,PDR1-3,ura3,his1,Δyor1::hisG,Δsnq2::hisG,Δpdr5::hisG,Δpdr10::hisG,Δpdr11::hisG,Δycf1::hisG,Δpdr3::hisG,Δpdr15::hisG，用于验证转运蛋白的功能。对AD12345678的报道可见1998年Anabelle Decottignies等人发表的文章(ATPase and Multidrug Transport Activities of the Overexpressed YeastABC Protein Yor1p.The Journal of Biological Chemistry,1998,Vol.273,No.20:12612-22)。该菌株是现有技术中可以获得的菌株。本发明省略了对该菌株的构建，而是直接获赠于奥塔哥大学Masakazu Niimi教授和天主教鲁汶大学AndréGoffeau教授。该菌株的另一个编号名称是MGY260。
本发明通过对青蒿分泌型腺毛转录组数据分析，从青蒿中克隆AaPDR1基因，构建含AaPDR1基因的酵母表达载体，转入酵母突变体AD12345678，验证酵母体外外排二氢青蒿酸的功能。构建含AaPDR1基因的植物反义干扰表达载体，用根癌农杆菌EH105介导，采用叶盘法将AaPDR1基因干扰表达载体转化青蒿；PCR检测外源目的基因AaPDR1的整合情况，通过HPLC-ELSD测定青蒿中青蒿素含量，表明获得转基因青蒿的青蒿素含量也显著被抑制。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的青蒿AaPDR1蛋白多肽时，可以将青蒿AaPDR1蛋白编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成青蒿AaPDR1蛋白表达载体。
如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
实施例1、青蒿AaPDR1基因的克隆
1.青蒿基因组总RNA的提取
取青蒿叶片组织，置于液氮中研碎，加入盛有裂解液的1.5mL Eppendorf(EP)离心管中，充分振荡后，按照TIANGEN试剂盒的说明书抽提总RNA。用琼脂糖胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。
2.青蒿AaPDR1基因的克隆
以所提取的总RNA为模板，在PowerScript反转录酶的作用下合成cDNA；根据AaPDR1基因的序列设计基因特异性引物，通过PCR从总cDNA中扩增AaPDR1基因，并测序。发明人对青蒿完成的全基因组测序和转录组测序，AaPDR1基因的序列来自发明人实验室的数据库。
通过上述步骤，获得了青蒿中该转录蛋白的全长4278bp，编码序列(SEQ ID NO:1)并推导出其蛋白编码序列(SEQ ID NO:2)，其中，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。
表1 PCR引物
引物名称 引物序列(5’→3’)
AaPDR1-FP1 AAACCCTTTTTGCTTTCTAATTGATTCA
AaPDR1-RP1 TTATCTCTTCTGGAAATTAAAGGA
表2 PCR的反应体系
青蒿cDNA 1μL
10×KOD Plus Buffer 5μL
dNTP 5μL
MgSO<sub>4</sub> 2μL
AaPDR1-FP1 1μL
AaPDR1-RP1 1μL
KOD Plus 1μL
ddH<sub>2</sub>O 34μL
总体积 50μL
实施例2、含AaPDR1基因的酵母表达载体的构建
将AaPDR1基因构建在酵母表达载体上，为了方便表达载体的构建，正向引物中引入了SpelI的酶切位点，反向引物中引入了PstI的酶切位点，引物如表3所示；
表3 AaPDR1-PDR196载体构建的PCR引物
实施例3、AaPDR1转运蛋白酵母突变体AD12345678转运实验
1、酵母AD12345678转化
1.1感受态制备
-70℃取出AD12345678菌株在YPD培养基上划线，28℃培养三天，挑取生长较快的克隆于10mL的YPD液体培养基中能中过夜培养(28℃，220rpm)，第二天测OD600后将菌液稀释至浓度为0.4，继续摇菌2-4h，室温2500rpm离心10min，去上清，然后用40mL 1×TE(或灭菌水)悬浮，再室温2500rpm离心10min，小心去上清，用2mL 1×LiAC/0.5×TE悬浮，室温放置10min，即为酵母感受态细胞。
1.2酵母转化
将1.5μL质粒加入无菌的1.5mL离心管中，再加入10μL 10mg/mL的鲑鱼精DNA(鲑鱼精DNA需100℃煮沸5min，再放在冰上冷却备用)，100μL感受态，轻轻混匀后，加入700μL 1×LiAc/40％PEG3350/1×TE，震荡混匀后放在30℃金属水浴锅30min，期间颠倒3次。然后加入88μL DMSO，42℃，热击7min，转化后的菌13200rpm离心15s，吸掉上清后加入1mL 1×TE悬浮菌，然后再离心，弃上清后加入100μL的1×TE，悬浮菌后全部涂板。
2、二氢青蒿酸体外转运实验
从在30℃培养箱中培养三天的平板上挑取较大的斑于50mL U缺SD液体培养基中过夜培养(28℃，180rpm)至OD600＝1.0，然后离心用50mL含有二氢青蒿酸的U缺SD液体培养基悬浮，继续培养(28℃，180rpm)。培养0.5h，1.5h，3h，4.5h和6h取样，离心用蒸馏水洗两次，加入甲醇超声提取，HPLC测定酵母菌体内各时间样品二氢青蒿酸的含量。
实施例4、含AaPDR1基因的植物反义干扰表达载体的构建
将AaPDR1基因部分序列构建在植物反义表达载体上，为了方便表达载体的构建，正向引物中引入了BamHI的酶切位点，反向引物中引入了SacI的酶切位点，引物如表4所示；
表4 pCAMBIA2300-anti-AaPDR1体构建的PCR引物
引物名称 引物序列(5’→3’)
Anti-PDR1-SacI-FP CGAGCTCATGGAAGGAAGTGATATACACAA
Anti-PDR1-BamHI-RP CGGGATCCCCATTGTACGTCACCTTTCCAG
实施例5、根癌农杆菌介导的AaPDR1反义干扰载体遗传转化青蒿获得转基因青蒿 植株
1.含AaPDR1反义干扰表达载体的根癌农杆菌工程菌的获得
将实施例4中含AaPDR1的植物反义干扰表达载体采用冻融法转入根癌农杆菌(如EHA105，为市场有公开出售的生物材料，可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambar 1)，并进行PCR验证。结果表明，含AaPDR1的植物反义干扰表达载体已成功构建到根癌农杆菌菌株中。
2.根癌农杆菌介导AaPDR1基因转化青蒿
2.1.外植体的预培养
青蒿种子用75％乙醇浸泡1min，再用20％NaClO浸泡20min，无菌水冲洗3-4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS(Murashige andSkoog,1962)固体培养基中，25℃、16h/8h(light/dark)光照培养，即可获得青蒿无菌苗。待苗长至5cm左右后,剪取无菌苗叶片外植体用于转化。
2.2.农杆菌与外植体的共培养
将所述的叶片外植体，转到共培养培养基(1/2MS+AS 100μmol/L)中，滴加含活化好的所述含AaPDR1植物反义干扰表达载体的根癌农杆菌工程菌的1/2MS悬液，使外植体与菌液充分接触，28℃暗培养3d。以滴加在不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照。
2.3.抗性再生植株的筛选
将所述的共培养3d的青蒿外植体转入到发芽筛选培养基(MS+6-BA 0.5mg/L+NAA0.05mg/L+Kan50mg/L+Cb 500mg/L)上于25℃、16h/8h光照培养，每两周继代培养一次，经过2-3次继代后即可获得Kan抗性丛生芽。将生长良好的抗性丛生芽剪下转入生根培养基(1/2MS+Cb 125mg/L)上培养至生根，从而获得Kan抗性再生青蒿植株。
3.转基因青蒿植株的PCR检测
根据目的基因所在表达盒上游的35S启动子区域和AaPDR1分别设计正向引物(35SFP：GAAGATGCCTCTGCCGACAGTG)和反向引物(AaPDR1-BamHI-RP：CGGGATCCCCATTGTACGTCACCTTTCCAG)对目的基因进行检测。结果表明，利用所设计的PCR特异引物，能扩增出特异DNA片段。而以非转化青蒿基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段。
本实施例将所述的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得用于转化青蒿的含AaPDR1植物反义干扰表达载体的根癌农杆菌菌株，利用所构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿，获得经PCR检测的转基因青蒿植株。
实施例6、利用HPLC测定转基因青蒿和转基因酵母中青蒿素和二氢青蒿酸含量
1.HPLC条件及系统适用性以及标准溶液的配制
HPLC：采用water alliance 2695系统，使用Waters C18柱，青蒿素测定流动相使用甲醇:水体积比60％：40％，二氢青蒿酸测定流动相适用乙腈：0.1％冰醋酸(pH 3.2)体积比60％：40％；流速为1.0mL/min；ELSD检测系统为wateralliance 2420，蒸发光散射检测器漂移管温度为40℃，载气压力5bar；青蒿素出峰时间为7min左右，二氢青蒿酸出峰时间为13min左右。青蒿素进样体积为20uL，二氢青蒿酸进样体积为40uL。根据标准品的浓度和峰面积计算出样品中的青蒿素及二氢青蒿酸含量，再除以青蒿粉末干重，从而计算出青蒿素和二氢青蒿酸占样品干重的含量。精密称取青蒿素标准品(Sigma公司)2.0mg用1mL甲醇完全溶解，得到2mg/mL青蒿素标准品溶液，保存于-20℃备用。
2.样品的制备
在青蒿植株的上，中和下部共取新鲜的青蒿叶片，于45℃烘箱中烘至恒重。然后从烘干的枝条上敲下叶片，磨成粉末。称取约0.1g干粉于2mL Eppendorf管中，加入2mL乙醇，用40W超声波处理30min，5000rpm离心10min，取上清用0.22μm滤膜过滤，即可用于HPLC测定。
对于二氢青蒿酸处理的转基因酵母菌二氢青蒿酸测定，结果如图1-2所示，10μM二氢青蒿酸添加到酵母培养基中，培养6个小时后，结果表明，转AaPDR1基因的酵母(图中表示为PDR196-PDR1)体内二氢青蒿酸含量小于5nmol(每克酵母鲜重)，而对照组酵母(图中表示为PDR196)体内二氢青蒿酸含量接近于8nmol(每克酵母鲜重)，这说明AaPDR1转运蛋白对于二氢青蒿酸具有外排功能。图1中，不同浓度(5μM，10μM和25μM)二氢青蒿酸添加到酵母培养基中，培养相同时间(6个小时)HPLC测定酵母体内二氢青蒿酸的含量，PDR196-PDR1是酵母AD12345678转PDR196-PDR1载体的转化株，PDR196-△PDR1是酵母AD12345678转PDR196-△PDR1载体(△PDR1是指去掉PDR1的ATP区域的结构域)的转化株，PDR196是指酵母AD12345678转PDR196空载体的转化株。图2中，10μM二氢青蒿酸添加到酵母培养基中，培养一段时间后HPLC测定酵母体内二氢青蒿酸的含量，PDR196-PDR1是酵母AD12345678转PDR196-PDR1载体的转化株，PDR196是指酵母AD12345678转PDR196空载体的转化株。
本发明获得的转基因青蒿中的青蒿素含量与对照相比降低了80％，结果如图3-6所示，青蒿素的合成明显受到抑制，由此可见，AaPDR1基因的表达抑制影响了青蒿中二氢青蒿酸的转运，从而降低了青蒿素的含量。图中，CK表示对照组，AaPDR1-anti-1、3、10表示转基因基因青蒿的不同株系。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (6)

1.一种青蒿PDR亚家族转运蛋白的功能验证方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)从青蒿cDNA文库中克隆到所述青蒿PDR亚家族转运蛋白的核酸序列SEQ ID NO:1所示，即AaPDR1基因；
(2)把AaPDR1基因可操作性地连接于酵母表达调控序列，形成含AaPDR1基因的酵母表达载体；
(3)将含所述AaPDR1基因的酵母表达载体转入酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AD12345678，得到转基因酵母菌，所述转基因酵母菌获得了二氢青蒿酸外排的功能，从而验证了所述青蒿PDR亚家族转运蛋白具有外排二氢青蒿酸的功能。
2.一种青蒿PDR亚家族转运蛋白的功能验证方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)从青蒿cDNA文库中克隆到所述青蒿PDR亚家族转运蛋白的核酸序列，如SEQ ID NO:1所示，即AaPDR1基因；
(2)把AaPDR1基因可操作性地连接于表达调控序列，形成含AaPDR1基因的植物反义干扰表达载体；
(3)将含所述AaPDR1基因的植物反义干扰表达载体转化根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EH105，获得具有所述干扰表达载体的根癌农杆菌菌株；
(4)利用所述步骤3构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿，经卡那霉素筛选得到抗性苗，再经PCR检测为阳性的植株即为转基因青蒿；
(5)对获得的所述转基因青蒿进行青蒿素、二氢青蒿酸和青蒿酸含量测定，进而获得青蒿素合成受抑制的青蒿植株，从而验证了所述青蒿PDR亚家族转运蛋白具有影响青蒿素合成的功能。
3.一种青蒿PDR亚家族转运蛋白的功能验证方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)从青蒿cDNA文库中克隆到所述青蒿PDR亚家族转运蛋白的核酸序列，如SEQ ID NO:1所示，即AaPDR1基因；
(2)把AaPDR1基因可操作性地连接于酵母表达调控序列，形成含AaPDR1基因的酵母表达载体；
(3)将含所述AaPDR1基因的酵母表达载体转入酿酒酵母AD12345678，得到转基因酵母菌，所述转基因酵母菌获得了二氢青蒿酸外排的功能，从而验证了所述青蒿PDR亚家族转运蛋白具有外排二氢青蒿酸的功能；
(4)把AaPDR1基因可操作性地连接于表达调控序列，形成含AaPDR1基因的植物反义干扰表达载体；
(5)将含所述AaPDR1基因的植物反义干扰表达载体转化根癌农杆菌EH105，获得具有所述干扰表达载体的根癌农杆菌菌株；
(6)利用所述步骤5构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿，经卡那霉素筛选得到抗性苗，再经PCR检测为阳性的植株即为转基因青蒿；
(7)对获得的所述转基因青蒿进行青蒿素、二氢青蒿酸和青蒿酸含量测定，进而获得青蒿素合成受抑制的青蒿植株，从而验证了所述青蒿PDR亚家族转运蛋白具有影响青蒿素合成的功能。
4.一种如权利要求2或3任一项所述的青蒿PDR亚家族转运蛋白的功能验证方法，其特征在于，所述转化根癌农杆菌EH105的具体方法是采用冻融法进行转化。
5.一种青蒿PDR亚家族转运蛋白在提高青蒿素含量的青蒿育种中的应用，其特征在于，所述青蒿PDR亚家族转运蛋白具有以下特征：所述青蒿PDR亚家族转运蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
6.一种青蒿PDR亚家族转运蛋白在制备抗疟疾药物中的应用，其特征在于，所述青蒿PDR亚家族转运蛋白具有以下特征：所述青蒿PDR亚家族转运蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。
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