CN103898130A

CN103898130A - 桑椹白藜芦醇合成酶基因的克隆和植物表达载体的构建

Info

Publication number: CN103898130A
Application number: CN201410075320.3A
Authority: CN
Inventors: 王罡; 王萍; 季静; 易乐飞; 钟影; 周向红
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2014-03-04
Filing date: 2014-03-04
Publication date: 2014-07-02
Anticipated expiration: 2034-03-04
Also published as: CN103898130B

Abstract

本发明涉及一种桑椹白藜芦醇合成酶基因的克隆和植物表述载体的构建。该基因具有序列SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列。通过从新鲜桑椹果实提取总RNA，用3'RACE技术克隆了桑椹白藜芦醇合成酶基因（MaRS），得到完整的基因序列为1496bp。构建了植物表达载体pCAMBIA2300-MaRS-Kana。将植物表达载体pCAMBIA2300-MaRS-Kana通过电击法转入农杆菌C58细胞，应用烟草植物表达系统，对克隆的MaRS基因编码的酶活性进行验证，MaRS基因能够催化烟草体内的反式香豆酸-COA和丙二酰-COA结合，形成白藜芦醇，使代谢方向向下游流动，合成白藜芦醇衍生物，证明该基因能提高植物白藜芦醇含量，因此MaRS基因具有应用于保健食品和美容产品开发的价值。此外，MaRS基因能提高植物的抗病性，具有应用到植物抗逆基因工程的价值。

Description

桑椹白藜芦醇合成酶基因的克隆和植物表达载体的构建

技术领域

本发明涉及一种白藜芦醇合成酶（resveratrol synthase，RS）基因的克隆和植物表达载体的构建，具体为桑椹白藜芦醇合成酶基因（MaRS）的克隆。

背景技术

白藜芦醇合成酶是植物体内白藜芦醇（resveratrol，Res）生物合成途径的关键酶。白藜芦醇合成酶能够催化苯丙氨酸代谢途径中的反式香豆酸-COA和丙二酰-COA结合，形成白藜芦醇。

白藜芦醇化学名为3,4,5-三羟基芪，是多羟基芪类化合物，该物质多存在于植物的木质部。目前在21科、31属、72种植物中发现了Res，如葡萄科的葡萄属、蛇葡萄属，豆科的落花生属、决明属，蓼科的蓼属等。存在该物质的植物多为常见的药用植物，如决明、藜芦、虎杖等，也有部分为食物，如葡萄、花生、桑椹等。

近年来发现Res具有抗肿瘤作用，它对胃肠道癌、生殖器官癌、皮肤癌等多种癌症都有不同程度的拮抗作用。Res的抗癌机理还未得到统一认识，普遍认为其对肿瘤细胞的起始、增殖和发展三个阶段都有影响。即：通过抗氧化、抗突变、诱导二期药代酶的作用发挥抗起始活性；通过抗炎、抑制环加氧酶和氢过氧化物酶的活性在肿瘤的促进阶段起抑制作用；诱导人早幼粒白血病细胞的分化而抑制肿瘤的发展。廖纪元等通过研究白黎芦醇诱导宫颈癌细胞株Hela的细胞生长和发育的改变，以及细胞周期的进行和凋亡等，结果显示，Res作用后，Hela细胞的增殖速度减慢，DNA合成减少。

“法国悖论”的出现让人们发现了Res对心血管保护的重要作用，如今该方面已经成为研究热点。Res具有抗心血管疾病的作用，它可以通过增加一氧化氮合酶的表达，增加NO含量，从而激活鸟苷酸环化酶（GC），提高环磷酸鸟苷水平，发挥保护作用；其次，白藜芦醇具有抗氧化、清除自由基及抗脂质过氧化作用，进一步发挥对心血管的保护功能；第三，白藜芦醇对血管有广泛的舒张效应等。

同时，人们进一步研究发现，白藜芦醇对于防辐射、脑和神经的保护、延缓衰老、延长寿命以及预防老年痴呆等均有一定的作用，白藜芦醇已经成为仅次于紫杉醇的第二大受人们高度关注的天然药物。

白藜芦醇是植物免遭外在环境包括微生物等刺激的代谢产物。当植物受到病原菌的侵染时，赤松素、白藜芦醇、四羟反式芪等植保素在植物体内的合成明显增加。白藜芦醇能抑制植物病原真菌菌丝的生长及孢子的萌发，是植物在抵御生物或非生物胁迫中产生的植物保护素。实验已经证实白藜芦醇能够抑制葡萄上病原真菌的生长，如灰霉菌、根霉菌以及拟垄点霉。Liu等克隆的廖属植物STS基因转化到拟南芥中进行表达，通过HPLC，HPLC-ESI-MS等检测，发现在拟南芥中表达了一个反式-白藜芦醇苷，其表达产物能抑制炭疽病病原体次盘孢（Colletotrichum higginsianum）的孢子产生，从而抑制该病菌，由此可见该基因可以加强作物的抗病原菌性和品质。

目前，Res在医学上已经有了广泛的应用，人们对Res产量的需求也越来越大，然而，Res虽来源广泛，但植物中含量非常低，化学合成虽条件成熟但有一定的限制性。现代分子生物学研究手段的发展，使得多种芪合酶基因被陆续分离鉴定，为通过DNA重组技术和遗传工程调控生产白藜芦醇及其衍生物开辟了道路。

桑椹是桑科（Moraceae）桑属（Morus L.）的多年生木本植物桑树（Morus alba L.）的果实，其中含有多种功能性成分，如芦丁、花青素、白黎芦醇等，具有良好的防癌、抗衰老、抗溃疡、抗病毒等作用。目前，从葡萄、花生、虎杖等植物中已克隆到白藜芦醇合成酶基因，但未见以桑椹为材料克隆白藜芦醇合成酶基因的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种桑椹白藜芦醇合成酶基因，并构建了该基因的植物表达载体。通过提取新鲜桑椹总RNA，用同源克隆和RACE技术克隆了桑椹白藜芦醇合成酶基因（MaRS），得到完整的基因序列为1496bp。构建了植物表达载体pCAMBIA2300-MaRS-Kana应用烟草表达系统，对克隆的MaRS基因功能进行了验证，MaRS基因能够在烟草中正常表达，产生白藜芦醇及其衍生物。

本发明的第二个目的是提供桑椹白藜芦醇合成酶基因编码的蛋白质。

本发明的第三个目的是提供带有桑椹白藜芦醇合成酶基因的具有3种不同筛选标记的植物表达载体。

本发明提供了一种桑椹白藜芦醇合成酶基因（MaRS），如序列表SEQ ID NO.7中所示的核苷酸序列。

本发明提供了一种桑椹白藜芦醇合成酶基因（MaRS）编码的蛋白质，如序列SEQ ID NO.8中所示的氨基酸序列。

本发明提供了一种桑椹白藜芦醇合成酶基因（MaRS）重组克隆载体pMD18-T-MaRS。

本发明提供了一种含有上述白藜芦醇合成酶基因MaRS的重组植物表达载体pCAMBIA2300-MaRS-Kana。

本发明提供了含有上述白藜芦醇合成酶基因（MaRS）完整编码阅读框序列的宿主细胞，如含有上述重组表达载体的宿主细胞也属于本发明的保护范围。所述的宿主细胞选自大肠杆菌细胞、农杆菌细胞、烟草植物细胞。

本发明的基因克隆方法由下述步骤组成：

1）桑椹总RNA抽提

桑椹经液氮研磨后加入裂解液裂解，然后加入等体积的氯仿，振荡混匀后离心，取上清液加入LiCl，混匀后离心，RNA沉淀用75%乙醇漂洗，自然干燥后加入适量DEPC处理水溶解。

2）桑椹白藜芦醇合成酶基因（MaRS）中央保守区克隆

取桑椹总RNA反转录生成第一链cDNA。设计上游引物SEQ ID NO.1 SP1和下游引物SEQ ID NO.2 SP2，以cDNA为模板做PCR扩增，将PCR扩增产物连接于pMD18-T载体，获得桑椹白藜芦醇合成酶基因（MaRS）中央保守区。

3）桑椹白藜芦醇合成酶基因（MaRS）3′端序列克隆

根据中央保守区序列设计3′RACE的嵌套引物：SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。取桑椹总RNA反转录生成第一链cDNA，反转录反应体系及反应条件按3′-Full RACE Core Set Ver.2.0说明操作。第一轮PCR采用SP1与试剂盒的3′RACE Outer Primer进行，第二轮PCR采用SP2与试剂盒的3′RACE Inner Primer进行。将PCR扩增产物连接于pMD18-T载体，获得桑椹白藜芦醇合成酶基因（MaRS）3′端序列。

4）桑椹白藜芦醇合成酶基因（MaRS）5′端序列克隆

根据中央保守区序列设计5′RACE的嵌套引物：

SEQ ID NO.5 ：SP5 5' CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGAC 3'和SEQ ID NO.6 ：SP6 5' GTGACGAGGACTCGAGCTCAAGC 3，参考5′-Full RACE kit试剂盒（TAKARA）说明书，使用Alkaline Phosphatase对总RNA中裸露的5′磷酸基团进行去磷酸反应。使用 Tobacco Acid Pyrophosphatase去掉mRNA的5′帽子结构，保留一个磷酸基团。将5′RACE Adaptor与mRNA的5′端连接起来。反转录反应体系及反应条件按5′-Full RACE kit说明操作。第一轮PCR采用SP1与试剂盒的5′RACE Outer Primer进行，第二轮PCR采用SP2与试剂盒的5′RACE Inner Primer进行。将PCR扩增产物连接于pMD18-T载体，获得桑椹白藜芦醇合成酶基因（MaRS）5′端序列。

5）上述3次的测序结果拼接后获得了完整的基因序列，见序列表SEQ ID NO.7。

本发明构建含桑椹白藜芦醇合成酶基因（MaRS）的植物表达载体pCAMBIA2300-MaRS-Kana，包括下述步骤：

1）构建含有白藜芦醇合成酶基因（MaRS）的中间载体pMD18-T-MaRS：

设计由序列SEQ ID NO.9：F1 5' AACTCGGTGTTCGATACCTTA 3'所示的上游引物F1和由序列SEQ ID NO.10：R1 5' CACTAATGACAGCGTGGAATA 3'所示的下游引物R1，以白藜芦醇合成酶基因酶基因的cDNA为模板做PCR扩增，将PCR扩增产物连接于pMD18-T载体，获得含有序列SEQ ID NO.7所示的桑椹白藜芦醇合成酶基因（MaRS）编码序列的中间载体pMD18-T-MaRS。

2）构建植物表达载体pCAMBIA2300-MaRS-Kana：

质粒pMD18-T-MaRS及植物表达载体pCAMBIA2300分别经BamHI和Sal I酶切后，质粒pMD18-T-MaRS酶切产物经切胶回收后，经琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化，获得MaRS片段；植物表达载体pCAMBIA2300酶切后经DNA产物纯化试剂盒纯化，获得线性的pCAMBIA2300片段；在T4连接酶剂盒的指导下进行连接反应，获得携带有MaRS基因的植物表达载体pCAMBIA2300-MaRS-Kana。

3）白藜芦醇合成酶基因转入烟草

将植物表达载体pCAMBIA2300-MaRS-Kana通过电击转化法转入到农杆菌株C58中，利用农杆菌转化烟草叶盘法，将基因转入烟草中，对烟草进行PCR检测，获得具有桑椹白藜芦醇合成酶基因的转基因烟草植株。利用高效液相分析方法，对转基因烟草植株中白藜芦醇进行定性定量分析。成功证明白藜芦醇合成酶基因具有使烟草中苯丙氨酸代谢途径中的反式香豆酸-COA和丙二酰-COA结合，形成白藜芦醇的功能。

本发明所述的桑椹白藜芦醇合成酶基因的应用于制备转基因植物品种、微生物菌株、提高白藜芦醇合成含量、应用于保健食品、美容产品的开发。

所述的桑椹白藜芦醇合成酶基因应用于制备转基因植物，提高植物的抗病性、抗逆性，应用于植物基因工程。

本发明所述的桑椹白藜芦醇合成酶基因（MaRS）可望用于制备转基因玉米、水稻、小麦向日葵、马铃薯、棉花、谷子、大麦以及花卉和蔬菜等植物。

本发明通过提取新鲜桑椹果实总RNA，用3'RACE技术克隆了桑椹白藜芦醇合成酶基因（MaRS），得到完整的基因序列为1496bp。构建了植物表达载体pCAMBIA2300-MaRS-Kana，应用烟草植物表达系统，对克隆的pCAMBIA2300-MaRS-Kana进行了功能验证，桑椹白藜芦醇合成酶基因（MaRS）能够产生白藜芦醇以及下游次级代谢产物，使植物产生或提高白藜芦醇含量、提高植物的抗病性。

附图说明

图1为pMD18-T-MaRS载体示意图。

图2为pCAMBIA2300-MaRS-Kana酶切结果。

图3为pCAMBIA2300-MaRS-Kana载体示意图。

图4为转基因烟草阳性苗PCR检测结果。

图5为HPLC检测烟草对照及转基因株系中白藜芦醇的含量。

具体实施方式

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

桑椹总RNA抽提

100mg桑椹经液氮研磨后加入700μL CTAB裂解液[0.1mol/L Tris-Cl（pH8.0），1.4mol/L NaCl，0.05mol/L EDTA，2g/100mL CTAB，2g/100mL PVP]，涡旋振荡混匀后，置于60℃水浴30min；加入等体积的氯仿，振荡混匀，室温12000rpm离心10min，取上清液；加入1/4体积10mol/L LiCl，放置30min，12000rpm离心10min，弃上清液；加入1mL 75%乙醇漂洗沉淀，12000rpm离心5min，弃上清液；自然干燥后加入适量DEPC处理水溶解RNA。

实施例2

桑椹白藜芦醇合成酶基因（MaRS）中央保守区克隆

取1μg总RNA，以Random hexamer为引物，按RevertAidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis kit说明操作，反转录生成第一链cDNA。

根据葡萄、花生、虎杖等植物的芪合酶基因序列的保守性设计一对引物，如序列表所示： SEQ ID NO.1：SP1 5' AGGCAATCAAAGAGTGGGG 3'和SEQ ID NO.2：SP2 5' TGAGCAATCCAAAATATTGAGTT 3'。

PCR反应在25mL体系中进行，体系中含有1×Dream Buffer（with 2mmol/L MgCl₂），200μmol/L dNTP，0.5mmol/L引物，2U Dream Taq DNA聚合酶，1mL第一链cDNA。PCR循环为95℃预变性5min；接着30个循环，每个循环中95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s；最后72℃充分延伸5min。

参考UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒（BBI）说明书对扩增产物进行切胶回收。

吸取培养过夜的DH5α菌液100μL加到5mL LB液体培养基中，摇床培养37℃ 2h，当OD₆₀₀达到0.3~0.5时取出试管，无菌条件下将菌液转移到冰预冷过的1.5mL离心管中冰浴10 min。4000 rpm 4℃离心5min，弃上清。细胞沉淀用1mL冰浴冷过的0.1mol/L CaCl₂溶液重悬，冰浴20 min。4000 rpm 4℃离心5min，弃上清，吸干残余液体。细胞沉淀用100μL冰浴冷过的0.1mol/L CaCl₂溶液重悬。4℃冰箱保存。

参考pMD18-T Vector试剂盒（TAKARA）说明书，采用TAKARA的pMD18-T Vector试剂盒中的Solution I将切胶回收产物与T载体连接起来。

参考pMD18-T Vector试剂盒（TAKARA）说明书，将连接产物转入DH5α感受态细胞中。

在转化产物中加入400μL LB液体培养基中进行摇床培养37℃ 200 rpm养2h，4000 rpm离心5min，弃上清，吸取100μL LB液体培养基重新悬浮沉淀，均匀的涂布在含X-Gal、IPTG、Amp的LB固体培养基平皿上，正置30 min待吸收后，37℃倒置培养16～18h后形成单菌落。

从转化平板上挑取白色单菌落于5mL含Amp的LB液体培养基中，37℃ 200 rpm振荡培养过夜。将菌液倒入1.5mL的EP管中，12000 rpm离心1 min，收集菌体，用于质粒抽提，参考柱式质粒小量抽提试剂盒（BBI）说明书抽提质粒。以质粒为模板进行PCR反应以检验T载体克隆是否成功。最后挑选至少3～5个克隆子测序。

实施例3

桑椹白藜芦醇合成酶基因（MaRS）3′RACE

根据中央保守区序列设计3′RACE的嵌套引物，如需列表所示：SEQ ID NO.3：SP3 5' CGCTGATGGTGGGTCGGCTGTA3'和SEQ ID NO.4：SP4 5' GATGAGGGCTCCGCCGAAAGAC 3'。

反转录反应体系及反应条件按3′-Full RACE Core Set Ver.2.0说明操作。第一轮PCR采用SP1与试剂盒的3′RACE Outer Primer进行，第二轮PCR采用SP2与试剂盒的3′RACE Inner Primer进行。扩增产物TA克隆后挑选至少3～5个克隆子测序。

实施例4

桑椹白藜芦醇合成酶基因（MaRS）5′RACE

根据中央保守区序列设计5′RACE的嵌套引物，如序列表所示：SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。参考5′-Full RACE kit试剂盒（TAKARA）说明书，使用Alkaline Phosphatase对总RNA中裸露的5′磷酸基团进行去磷酸反应。使用 Tobacco Acid Pyrophosphatase去掉mRNA的5′帽子结构，保留一个磷酸基团。然后将5′RACE Adaptor与mRNA的5′端连接起来。反转录反应体系及反应条件按5′-Full RACE kit说明操作。第一轮PCR采用SP1与试剂盒的5′RACE Outer Primer进行，第二轮PCR采用SP2与试剂盒的5′RACE Inner Primer进行。扩增产物TA克隆后挑选至少3～5个克隆子测序。

实施例5

克隆载体pMD18-T-MaRS的构建过程

参考pMD 18-T Vector试剂盒（TAKARA）说明书，采用TAKARA的pMD 18-T Vector试剂盒中的Solution I将切胶回收MaRS基因片段与T载体连接起来。

参考pMD 18-T Vector试剂盒（TAKARA）说明书，将连接产物转入Top10感受态细胞中。

在转化产物中加入400μL LB液体培养基中进行摇床培养37℃ 200 rpm培养2h，4000 rpm离心5min，弃上清，吸取100μL LB液体培养基重新悬浮沉淀，均匀的涂布在含X-Gal、IPTG、Amp的LB固体培养基平皿上，正置30 min待吸收后，37℃倒置培养16～18h后形成单菌落。

以引物F1、R1对3~4个克隆子进行PCR反应，反应条件为：94℃，3 min；94℃，30sec；54℃，30 sec；72℃，2 min30sec，30个循环；72℃，10 min，PCR产物电泳验证，选择电泳条带正确克隆子送华大基因测序公司测序，测序结果在NCBI中进行BLAST比对。克隆载体图谱见图1。

实施例6

植物表达载体pCAMBIA2300-MaRS-Kana的构建过程

将克隆载体pMD18-T-MaRS和pCAMBIA2300植物表达空载体，用SalⅠ酶和BamH Ⅰ酶（Famentas）分别进行酶切，其反应体系为：

Plasmid	60μL
		BamHⅠ（8U/μL）	2μL
SalⅠ（15U/μL）	2μL
		10×Ft buffer	20μL
ddH₂O	122μL

反应条件为37℃水浴2 h。参考琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（天根）说明书对MaRS片段进行回收，参考DNA产物回收试剂盒（天根）对pCAMBIA2300植物表达空载体片段进行回收，参考T4连接酶反应试剂盒说明书（全式金）对回收产物进行连接，连接产物转化Ecoli. Top10，涂布于含卡那霉素100mg/L的LB平板。挑取克隆子，于5mL含Kna的LB液体培养基中，37℃ 200 rpm 振荡培养过夜。将菌液倒入1.5mL的EP管中，12000 rpm离心1 min，收集菌体，用于质粒抽提，参考柱式质粒小量抽提试剂盒（BBI）说明书抽提质粒。以质粒为模板，以MaRS上下游引物F1和R1进行PCR反应，以检验pCAMBIA2300-MaRS-Kana体克隆是否成功。

PCR反应体系如下：

反应条件为：94℃预热3min；解链94℃ 30s，退火55℃ 30s，延伸72℃ 1min 20s，30个循环后；72℃延伸8 min。

PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，对PCR阳性克隆子进行酶切鉴定，进一步验证是否连接成功，如图2为酶切电泳图。选择3个克隆子送华大基因测序公司测序，结果表明载体pCAMBIA2300-MaRS-Kana构建正确，植物表达载体图谱见图3。

实施例7

用于植物转基因的农杆菌工程菌种C58/pCAMBIA2300-MaRS的构建

1 农杆菌感受态细胞制备

（1）将农杆菌C58单菌落接种于5mL YEP液体培养基中，28℃，180 rpm振荡培养。

（2）将上述菌液转入l00mL YEP液体培养基中，28℃，180 rpm振荡培养至OD₆₀₀值约为0.5。

（3）冰浴30min后，4℃，4000 rpm离心l0min，收集菌体，重悬于20mL预冷的H₂O中。

（4）4℃，4000 rpm离心10min，收集菌体，重悬于预冷的10%甘油中，每管200μL速冻，存于-80℃备用。

2 植物表达载体的电击转化

（1）将-80℃取出的C58感受态细胞置于冰上，使其缓慢融化；

（2）加入4μL质粒，混匀，冰浴5min；

（3）转移至电击杯中；

（4）设置电击转化仪参数：1500V，0.2s，电击转化；

（5）室温静置2min后加入500μL YEB液体培养基，28℃，180 rpm振荡培养3h；

（6）室温4000 rpm离心10min，去除400μL上清液，将剩下的菌液混匀涂布于含 100mg/L卡那霉素和25mg/L利福平抗性的YEB平板上，倒置平板，28℃培养48h。

（7）挑取单菌落，菌落PCR验证。

实施例8

农杆菌介导法转化烟草

1 烟草无菌苗的培养

烟草种子经过春化后，用针穿孔的纸将种子包成小包，放在含有氯气的密闭容器中3.5 h。将种子点入无菌苗培养基表面，每皿约30粒，封口。16h/8h光周期培养，光照为1000 Lx。将发芽的幼苗移到三角瓶中，生长两个月后可用于转化。

2 烟草的农杆菌转化

2.1侵染菌液的制备

（1）挑取阳性农杆菌单菌落，接种到5mL含有100mg/L卡那霉素的YEP液体培养基中，28℃、200 rpm摇菌过夜。

（2）次日按1∶100接种量，于50mL 加有抗生素的YEP培养基中扩菌，摇菌至OD₆₀₀=0.6~0.9时，4000 rpm室温离心10 min收集菌体。用等量MS液体培养基重悬菌体。

2.2外植体浸染及抗性筛选培养

（1）将无菌烟草叶片切成0.5cm×0.5cm小片备用，浸入制备好的农杆菌菌液，侵染30min，其间轻摇3~4次，使叶片充分接触菌液；吸去多余菌液，接种于铺有滤纸的共培养基中，25℃ 暗培养3d。

（2）取出烟草叶片，MS液体培养基洗净，吸干。转接到含有头孢霉素（400 mg/L）和适当浓度的抗性筛选标记（如100 mg/L Kan）的筛选培养基中，25℃，16h/8h光周期培养。14d转接一次。

（3）直至外植体上不定芽长至0.5~1cm时，将芽切下转入到生根培养基中。待不定根长至1~2cm时，将烟草组培苗从组培瓶中取出，用自来水洗净培养基，转化苗移栽至含有蛭石、珍珠岩、营养土的培养基质中，并覆盖保鲜膜。7d后去掉保鲜膜，在阳光充足，较为湿润的环境下进行培养。

本实验用到的培养基如表1所示。

表1- 烟草转化各生长阶段培养基配方

培养基名称	培养基配方
		无菌苗培养	MS
诱导培养基	MS+1mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA
		重悬液	MS+100μmol/L AS
共培养基	MS+1mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+100 μmol/L AS
		筛选培养基	MS+1mg/ L 6-BA+0.1mg/L NAA+400 mg/L cef+100 mg/L kan
生根培养基	MS +400 mg/L cef+100 mg/L kan（琼脂为5g/L）

除特殊说明外，其他培养基均加入7 g/L琼脂和30g/L蔗糖，pH为5.8

将配制好的培养基进行高压灭菌（121 ℃，20 min）。

实施例9

转基因烟草基因组DNA的PCR检测

1 CTAB法提取烟草总DNA

（1）取培养于温室的转化烟草叶片约100 mg，放入到EP管中，用液氮研磨成粉末，加入600μL DNA提取液，65℃水浴1h，其间每10 min上下颠倒一次。

（2）加入等体积的氯仿∶异戊醇（24∶1），涡旋震荡，静置5min，12000rpm，离心10min。

（3）取上清转至新的EP管中，加入等体积的异丙醇，轻缓颠倒混匀，放置5min，12000 rpm，10min室温离心，去上清。

（4）用75%乙醇洗涤沉淀2次，室温下挥干，加入50μL重蒸水。

（5）取1μL DNA样品在0.8%琼脂糖凝胶、电泳缓冲液1×TAE、电压为120V的条件下电泳20min，凝胶成像仪观察，其余放-20℃保存备用。

（6）以烟草叶片基因组DNA为模板做PCR检测，引物为如序列表所示： SEQ ID NO.11：F2 5' TTCTCCTCAATCGCCCTCAAAAT 3'和SEQ ID NO.12：R2 5' ATCCTCAAAGCAAACCCAAGTAT 3'，反应条件：94℃，4 min；94℃，30 s；55℃，30s；72℃，45s，30个循环；72℃，8 min。取PCR产物5μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，如图4，说明MaRS基因已成功转入烟草。

实施例10

转基因烟草的功能验证

1、烟草叶片中白藜芦醇的提取

称取1.0g新鲜烟草叶片，经液氮研磨后倒入50 mL离心管中，加入20mL分析纯甲醇充分震荡，于4℃黑暗浸提24h。5000 rpm离心15min，取上清；用减压旋转蒸发仪，40℃水浴蒸干，用2mL的色谱纯甲醇进行溶解，经过0.45μmol的滤膜过滤，取20μL进行测定。

2、白藜芦醇高效液相色谱分析

色谱柱：Lanbo Kromasil C18（4.6mmi.d×250nm，5μm）；柱：流动相为乙腈∶乙酸乙酯（9∶1V/V）；流速：0.8 mL/min；检测波长：306nm；柱温：常温检测。

3、标准曲线的制备

精密称取白藜芦醇对照品5.0 mg，置25mL的容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成0.2mg/mL的标准溶液，分别取0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8mL母液于10mL容量瓶中用甲醇定容，配制成0、0.5、1、2、4、8、16 μg/mL母液。分别取20μL进样，重复3次，测得峰面积，以样品浓度X为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，通过回归计算，求得回归方程。

4、样品中白藜芦醇的检测

取10株转基因为阳性的烟草新鲜叶片为样品，按上述方法制备样品提取液进行测定。HPLC检测白藜芦醇含量测定方法如下：

（1）打开HPLC系统预热30 min。

（2）用甲醇冲洗C18色谱柱30 min。

（3）用流动相先跑基线，待基线平稳后，用加样针吸取20 μL步骤1样品注入HPLC系统的上样阀，将样品上柱。

（4）每个样品上样后用流动相洗脱至少45 min，直至色谱检测系统中基线上没有吸收峰为止。停止洗脱，将数据保存。

（5）待所有样品用C18柱完全分离后，用甲醇冲洗C18色谱柱直至基线跑平。

通过HPLC测定转基因烟草中白藜芦醇素含量明显高于野生型烟草，说明该基因在烟草中进行表达，并使植物中积累了白藜芦醇（如图5）。

序列表

<110> 天津大学

<120> 桑椹白藜芦醇合成酶基因的克隆和植物表达载体的构建

<130> 20140226

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工系列

<220>

<221> gene

<222> (1)..(19)

<400> 1

aggcaatcaa agagtgggg 19

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工系列

<220>

<221> gene

<222> (1)..(23)

<400> 2

tgagcaatcc aaaatattga gtt 23

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工系列

<220>

<221> gene

<222> (1)..(22)

<400> 3

cgctgatggt gggtcggctg ta 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工系列

<220>

<221> gene

<222> (1)..(22)

<400> 4

gatgagggct ccgccgaaag ac 22

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工系列

<220>

<221> gene

<222> (1)..(23)

<400> 5

ccagtgagca gagtgacgag gac 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工系列

<220>

<221> gene

<222> (1)..(23)

<400> 6

gtgacgagga ctcgagctca agc 23

<210> 7

<211> 1496

<212> DNA

<213> 人工系列

<220>

<221> gene

<222> (1)..(1496)

<400> 7

caccatatcc tcatctattc ttctcaacct ttaaactcgg tgttcgatac cttaaagcag 60

caagcaatgg cgccgactaa cgggttcgta gaggaaagcc agacagcgat cccacgaggt 120

ggtcctggtg tagcctcaat tctagcaatt ggcacatcca atcctagcaa ctacttcaat 180

caagctgaat atgctgatta ttacttcaga gtcactaatt ctgagcacat gacagaattg 240

aaagagaaat tcaagcgtat ttgtgagaaa tcattgataa agaaacggca catgaggttg 300

acggaagata tcctcaaagc aaacccaagt atgtgtacct acgatggggc atcaataaat 360

gaacgtatgg atctaaaaat tgtggagatg ccaaagcttg gtgaaagcgc agcaatagag 420

gccctcaaag agtggggcca accgaaatca aaaattaccc acatcatcgt caattccact 480

tctggagtgg acatgcctgg cgccgattat cagttgatca ggtcgcttgg cctcaaaaca 540

tccgtcaaga gagtcatgct ctaccaccaa ggttgcttcg ccggcggcac cgtccttcgc 600

attgcaaagg acttggccga gaacaaccct ggagcacgtg ttctcgttgt ttgttctgaa 660

ctcaccatcc ccactttccg cggtccctcg gaggaagaca gtgcttctct tgtcggccaa 720

gcaatcttcg ctgatggtgg gtcggctgta atcgtcggtg ccaacgtacc cgatgagggc 780

tccgccgaaa gaccattgtt tcggcttgtt tcaaattcac aagttattct tcctaactca 840

gaaaacacag tagggggaca tttacgtgat tgcggactca caattgtatt gtctcctgaa 900

gtgccgaatc tgattggcaa aaacattctg ccatgtttgg aagaagcatt taccccattt 960

ggaattagtg attggaactc actattttgg gtgccacatc ccggcggtgc tgccattttg 1020

agggcgattg aggagaaagc cgagctaaag aaggagaagc ttaaggacac ttggaatgtg 1080

tggagtgagt atggaaatat gtcaagtgca actgtgtttt ttatactgaa tcagatgagg 1140

aagaggtcgt tggcggagaa aaagagcact accggtgacg gattggagtg gggagttctg 1200

cttgggttcg ggccgggtct cacagtggag acagtggtgt tgcagagcgt ccccattgtt 1260

gcatagattg tgaaataatt atcgggattc taccaaggct aaaaatcgca attaataaaa 1320

gatgtatcat actaatgtat tccacgctgt cattagtgtg tgatacttag tactaccggt 1380

ctttaaaaac attattataa attgtaccgc actatgattt tttttttaaa gaataagtga 1440

caaacaaata aaaatgtttt ttttttcccc cttttttttt ttcctaaaaa aaaaaa 1496

<210> 8

<211> 470

<212> PRT

<213> 人工系列

<220>

<221> MUTAGEN

<222> (1)..(470)

<400> 8

Met Ala Leu Ala Leu Tyr Ser Asn Phe Leu Ala Asn His Glu Thr Ile

1 5 10 15

Arg Cys His Val Gly Ser Lys Leu His Ser His Lys Arg Phe Asn Tyr

20 25 30

Phe Gly Ser Ile Val Ile Ala Lys Phe Ser Ser Ser Arg Gln Ile Pro

35 40 45

Thr Tyr Leu Gln Lys Ser Pro Arg Ile Arg Cys Gly Leu Asp Ser Arg

50 55 60

Gly Leu Glu Leu Trp Lys Gln Lys Leu Pro Ser Ala His Ser Ile Asn

65 70 75 80

Gln Asn Val Pro Lys Gly Asn Thr Ile Cys Lys Phe Pro Glu Asp Val

85 90 95

Ala Leu Met Val Arg Lys Lys Trp Gly Gln Leu Ala Lys Thr Ala Ile

100 105 110

Val Ala Ile Phe Ile Leu Ser Val Thr Ser Lys Ala Asp Ala Val Asp

115 120 125

Ala Leu Lys Thr Cys Thr Cys Leu Leu Lys Glu Cys Arg Leu Glu Leu

130 135 140

Ala Lys Cys Ile Ala Asn Pro Ala Cys Ala Ala Asn Val Ala Cys Leu

145 150 155 160

Gln Thr Cys Asn Asn Arg Pro Asp Glu Thr Glu Cys Gln Ile Lys Cys

165 170 175

Gly Asp Leu Phe Glu Asn Ser Val Val Asp Glu Phe Asn Glu Cys Ala

180 185 190

Val Ser Arg Lys Lys Cys Val Pro Arg Lys Ser Asp Val Gly Glu Phe

195 200 205

Pro Val Pro Asp Pro Ser Val Leu Val Gln Lys Phe Asp Met Asn Asp

210 215 220

Phe Ser Gly Lys Trp Tyr Ile Thr Arg Gly Leu Asn Pro Thr Phe Asp

225 230 235 240

Ala Phe Asp Cys Gln Leu His Glu Phe His Thr Glu Asp Asn Lys Leu

245 250 255

Val Gly Asn Leu Ala Trp Arg Ile Arg Thr Pro Asp Gly Gly Phe Phe

260 65 270

Thr Arg Ser Ala Val Gln Lys Phe Val Gln Asp Pro Lys Tyr Pro Gly

275 280 285

Ile Leu Tyr Asn His Asp Asn Glu Tyr Leu His Tyr Glu Asp Asp Trp

290 295 300

Tyr Ile Leu Ser Ser Lys Val Glu Asn Ser Pro Asp Asp Tyr Ile Phe

305 310 315 320

Val Tyr Tyr Lys Gly Arg Asn Asp Ala Trp Asp Gly Tyr Gly Gly Ser

325 330 335

Val Leu Tyr Thr Arg Ser Ala Val Leu Pro Glu Ser Ile Ile Pro Glu

340 345 350

Leu Gln Thr Ala Ala Gln Lys Val Gly Arg Asp Phe Asn Thr Trp Ile

355 360 365

Lys Thr Asp Asn Thr Cys Gly Pro Glu Pro Pro Leu Val Glu Arg Leu

370 375 380

Glu Lys Lys Val Glu Glu Gly Glu Arg Thr Ile Ile Lys Glu Val Glu

385 390 395 400

Glu Ile Glu Glu Glu Val Glu Lys Val Arg Asp Lys Glu Val Ser Leu

405 410 415

Phe Ser Arg Leu Ser Glu Gly Phe Lys Glu Leu Gln Gln Asp Glu Glu

420 425 430

Asn Leu Ile Arg Glu Leu Ser Lys Glu Glu Met Glu Ile Leu Asp Gly

435 440 445

Leu Lys Met Glu Ala Thr Glu Val Glu Lys Leu Phe Gly Asn Ala Leu

450 455 460

Pro Ile Arg Lys Leu Arg

465 470

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工系列

<220>

<221> gene

<222> (1)..(21)

<400> 9

aactcggtgt tcgatacctt a 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工系列

<220>

<221> gene

<222> (1)..(21)

<400> 10

cactaatgac agcgtggaat a 21

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工系列

<220>

<221> gene

<222> (1)..(23)

<400> 11

ttctcctcaa tcgccctcaa aat 23

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工系列

<220>

<221> gene

<222> (1)..(23)

<400> 12

atcctcaaag caaacccaag tat 23

Claims

1.一个桑椹白藜芦醇合成酶基因，其特征在于选自以下核苷酸序列之一：

SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列；

SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的99%的同源序列或者其他等位基因及其衍生的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的桑椹白藜芦醇合成酶基因，其特征在于为SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列。

3.权利要求1或2所述的桑椹白藜芦醇合成酶基因编码的蛋白质，其特征在于所述的蛋白质具体为SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。

4.一种重组载体，其特征在于含有权利要求1所述的桑椹白藜芦醇合成酶基因全序列或部分片段。

5.一种权利要求4所述的重组载体，其特征在于它是pMD18-T-MaRS。

6.一种权利要求4所述的重组载体，其特征在于它是植物表达载体pCAMBIA2300-MaRS-Kana。

7.一种宿主细胞，其特征在于含有权利要求1所述的桑椹白藜芦醇合成酶基因全序列或部分片段。

8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于它是大肠杆菌细胞、农杆菌细胞、烟草植物细胞。

9.权利要求1所述的桑椹白藜芦醇合成酶基因的应用于制备转基因植物品种、微生物菌株、提高白藜芦醇合成含量、应用于保健食品、美容产品的开发。

10.权利要求1所述的桑椹白藜芦醇合成酶基因的特征应用于制备转基因烟草、玉米、水稻、小麦向日葵、马铃薯、棉花、谷子、大麦以及花卉和蔬菜植物。