CN104975032B - 一个桑树白藜芦醇合成酶基因 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一个桑树白藜芦醇合成酶基因MaSTS。该基因全长1182bp，编码393个氨基酸。MaSTS是桑树白藜芦醇生物合成的最后一个关键基因，该基因能够在大肠杆菌BL21宿主细胞中成功表达，重组MaSTS蛋白以4‑香豆酰CoA和乙酰CoA为底物，转化成白藜芦醇。同时，将MaSTS转入tt4突变型拟南芥中，可通过阳性种子颜色来判断所转基因的表达功能；并用高效液相色谱（HPLC）检测转基因拟南芥植株与对照植株的白藜芦醇含量，实验结果是转基因拟南芥植株在27.5min处的白藜芦醇峰，较对照组有显著增高的峰值，表明该基因在转基因拟南芥植株中得到了过量表达。本发明能够应用于改良植物中白藜芦醇的生物合成。

Description

一个桑树白藜芦醇合成酶基因

技术领域

本发明涉及功能基因和植物基因育种技术领域，特别是涉及一个桑树白藜芦醇合成酶基因（MaSTS）。

背景技术

白藜芦醇(Resveratrol)于1940年首次从毛叶藜芦(Veratrum grandiflorum)根中被分离鉴定，是一种存在于植物中的具有二苯乙烯结构的非黄酮类天然多酚化合物，是植物在受到诸如紫外、损伤、真菌感染等胁迫而产生的植物抗生素。到目前为止，已在花生、桑椹、葡萄、松树和我国的传统中药虎杖、何首乌等70余种植物中发现。白藜芦醇在人体内具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、预防心脑血管疾病及保护肝脏的作用，这些特征也是评价大黄、何首乌、桑白皮等中药的重要指标。但芪类化合物在桑树体内合成途径仍是一片空白，至今仍未有具体的相关报道。

白藜芦醇合成酶是芪类化合物合成的关键酶，属于植物Ⅲ型聚酮化合物合成酶（polyketide synthase，PKS）家族中的一员，在植物体内多以基因家族的形式存在，与同属于植物 PKS 家族的另一成员CHS关系密切，二者的同源区域贯穿于整个编码区，一般认为STS基因是从CHS基因进化而来。它以苯丙氨酸代谢途径中间物4-香豆酰-CoA和丙二酰-CoA为底物合成芪类化合物的基本骨架。因此桑树白藜芦醇合成酶基因可应用于桑树白藜芦醇生物合成的调控，改良桑椹的品质。

发明内容

本发明的目的在于提供一个桑树白藜芦醇合成酶基因，包括核苷酸全序列以及编码的氨基酸序列。其表达产物能够高效地将底物4-香豆酰-CoA和丙二酰-CoA合成白藜芦醇。本发明以桑树的cDNA为模板，通过克隆获得了桑树白藜芦醇合成酶基因（MaSTS）全长mRNA序列以及编码的氨基酸序列，并在原核系统大肠杆菌BL21中表达获得MaSTS蛋白，体外酶活性分析验证其具有合成白藜芦醇功能。

本发明所述的一个桑树白藜芦醇合成酶基因全长的克隆，通过以下步骤实现：

（1）参考桑树转录组数据，设计引物扩增桑树的白藜芦醇合成酶基因；

（2）通过信息分析的方法预测基因结构及编码氨基酸序列；

（3）设计引物扩增全长CDS，并连接到pMD19-T Vector，挑选阳性克隆并测序。

本发明通过上述方法获得了一个桑树白藜芦醇合成酶基因，核苷酸全序列以及编码的氨基酸序列如序列表。

附图说明

图1 MaSTS全长扩增电泳图。1：MaSTS基因核心片段的克隆，M：Marker(Trans2K)；。

图2 MaSTS重组蛋白的诱导。M: Marker； 1：空载pET28a(+)表达； 2：总蛋白； 3：沉淀蛋白；4：上清蛋白； 5-6：250mM咪唑纯化蛋白。

图3 HPLC分析重组蛋白活性。A：白藜芦醇标准品；B：反应液后混合液检测（箭头所指为白藜芦醇）

图4 转基因验证基因功能。A：转基因阳性苗叶片GUS染色检测（tt4+MaSTS）；B：对照组叶片GUS染色检测(tt4)；C：转基因阳性T2代种子（tt4+MaSTS）；D：野生型拟南芥；E：对照组种子(tt4)。

图5 HPLC分析转基因拟南芥。A：白藜芦醇标准品；B：上线为转基因（tt4+MaSTS ），下线为对照（tt4），箭头为转基因（tt4+MaSTS ）植株的白藜芦醇峰。

本发明的优点是：本发明所述的桑树白藜芦醇合成酶基因，其表达产物具有将底物4-香豆酰-CoA和丙二酰-CoA合成白藜芦醇的功能。

具体实施方式：

实施例1 桑树MaSTS基因的克隆

1） 以重庆市审定桑树品种嘉陵40号为材料，提取成熟果实的总RNA，并将提取的总RNA进行反转录合成cDNA第一链，作为PCR扩增的模板。

2） 用设计的特异性引物：

STS-F：（5'>ATGGAATCGGTCAAAGAATTCCGAAA<3'）

STS-R：(5'> CTATGCAGAGTGATCAATTGCAACGCTAT <3')进行扩增，得到1182bp的基因片段（图1），连接到T克隆载体PMD19-T simple vector上，转化进入大肠杆菌，挑取阳性克隆并测序。

实施例2 桑树MaSTS基因原核表达诱导重组蛋白

1）根据获得的上述桑树品种的STS基因的CDS序列，设计特异引物：

STS-F1：（5'>CGCGGATCCATGGCGACACCCTCCTCCGT<3'）

STS-R1：(5'> CGAGCTCATTATTGATGGGAAGGCTGT<3')，添加酶切位点和保护碱基。

2）将获得的STS片段及表达载体pET28a (+)分别经BamHⅠ和Sac I双酶切，回收目的片段与载体。并与T4连接酶混合后，16℃过夜连接，经热激法转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，采用菌液PCR方法筛选阳性克隆并进行测序分析，最终构建成原核表达载体pET28(a+)-MaSTS。将pET28a (+)-MaSTS质粒转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)感受态细胞中，采用PCR法鉴定阳性克隆。

3）挑选阳性菌液，加入到5mL带有Kan抗性的LB液体培养基，37℃培养过夜； 然后按体积比1∶100接种于250mL的含Kan抗性的LB液体培养基，37 ℃培养至OD600nm值在0. 6～0. 8之间，加入IPTG至终浓度为0.4 mmol/L，在28℃下培养4h 最后对所收集菌体处理后，进行SDS-PAGE分析。

蛋白纯化和酶活性测定

1）将收集到细胞培养物于冰浴中超声破碎20min，分别取上清和沉淀进行电泳分析，12000 r/min离心20min取上清用于纯化。

2）用5倍柱体积的平衡缓冲液平衡镍柱，将目的蛋白上样，使蛋白质结合到层析柱上；分别用5mL的10mmol/L、40mmol/L、100mmol/L、250mmol/L咪唑洗脱液进行洗脱，所得蛋白-80℃保存；取纯化的蛋白10ul，进行SDS-PAGE电泳（图2）。

3）取纯化的蛋白液20μL，加入含有2mL 50 mM 4-香豆酸CoA和100 mM 丙二酰CoATris-HCl（pH8.0）的溶液中，30℃水浴反应30min。10000×g离心5min，取上清液并通过0.22μm滤膜过滤，避光待测。采用高效液相（HPLC）Waters 2487检测，C₁₈柱（4.6×150 mm），检测波长306nm，流动相A为甲醇，B为0.1%醋酸水溶液，流速为0.8mL/min，洗脱45min对反应产物进行分析，洗脱液变化如下表：结果见图3。

实施例3 转基因鉴定该基因的功能：

1）根据获得的上述桑树品种的STS基因的CDS序列，设计特异引物：

STS-F1：（5'> CGGATCCATGGAATCGGTCAAAGAATT<3'）

STS-R1：(5'> GACTAGTCTATGCAGAGTGATCAATTG<3')，添加酶切位点和保护碱基。

2）将带有酶切位点的STS片段及植物表达载体pLGNL分别经BamHⅠ和Spe I双酶切，回收目的片段与载体。并与T4连接酶混合后，16℃过夜连接，经热激法转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，采用菌液PCR方法筛选阳性克隆并进行测序分析，最终构建成植物表达载体pLGNL-MaSTS。将pLGNL-MaSTS质粒转入感受态农杆菌LBA4404中，采用PCR法鉴定阳性克隆。

3）挑选阳性菌液，加入5mL含有卡那、利福平和链霉素抗性的YEB液体培养基，28℃培养过夜，然后按体积比1∶100接种于250mL的含有卡那、利福平和链霉素抗性的YEB液体培养基，28 ℃培养至OD600nm值在0. 6～0. 8之间。

4）收集菌体，通过花粉介导法转入tt4突变型拟南芥，待种子成熟后，对种子进行卡那抗性筛选，阳性苗培养于人工气候箱至收种子成熟，转基因种子为淡黄色，据此可得MaSTS基因功能不具有查尔酮合酶基因功能（见图4）。

5）取T2代生长15天拟南芥，液氮冷冻磨碎，甲醇提取，酸化水解后HPLC分析，洗脱液条件如下，其他条件和例2中相同。并以tt4突变型拟南芥为对照（见图5）。转基因拟南芥在27.5min处的白藜芦醇峰，较对照组有显著增高的峰值，表明该基因在转基因拟南芥植株中得到了过量表达。

序列表1

西南大学

桑树白藜芦醇合成酶（MaSTS）基因核苷酸全序列

mRNA

桑树（Morus alba L）

1 atggaatcggtcaaagaattccgaaagggtcagcactctgaaggtccggcttccatcctg

61 gcaattggtactgccaatccatccaattgtgtttcgcaagctgattatcctgattttttg

121 tttcgcaccaccaacagcgagcacctgattcagctaaaagaaaaattcaaactcatgtgt

181 gaaaaaacaatgataaggaaacgacatatgtacctgactgaagaaatactcaagaaaaac

241 cctagtctttgcagctttatgaaaccatctctcgacaggcgccaagaaatggtagagcca

301 gagattccaaagttagcaaaggaagcagccatcaaagccttagaggagtgggggcaaccc

361 aagtctaaaatcactcaccttgtcttttgcaccacatcatgcgtcgccattcctggtcca

421 gactaccacctcatcaagctcctaggcctccctccctccgtcaaccgcaccatgacgtgc

481 ctgcacggttgttttagtggtgccgctgcccttcgcatcgcaaaggacctggctgagaac

541 aacaaaggagcccgagttctcgttgtctgttctgagatcatgaccttcaattttcgcgct

601 ccctcggaggcccatatggattttcttgttgggcagacaatcttcggagatggagctgcg

661 gctgccgtagttggtgctgatcccgacattcttatcgagcgaccaatattcatattggca

721 aacacagcacaggctatcctaccggattcagagggagcggttgaggggcacttgcgggaa

781 ttcgggatgacattacaattactaagaaaagtaccacagttgatcgctgacaatatgcag

841 aatgttttggaggaggcttttactcctatcggcataaaagattggaactcgatattttgg

901 atagctcacccaggcgggcgggcaattcttgactttctcgaagcaaagctcggtttaaaa

961 gaggacaaactacgggctagccgtcatgtgctgagcgagtatggaaacatggctggtggg

1021 tctgtcttttttgtattggatgatatgcggaagaaatctatagagaaagggaaggtcacg

1081 actggtgagggattagattggggcgtcctagtcggatgcgggccaggcttgacggcggaa

1141 gcggttgtgctgcatagcgttgcaattgatcactctgcatag

序列表2

西南大学

桑树白藜芦醇合成酶(MaSTS）基因编码的氨基酸序列

Amino Acid

桑树（Morus alba L）

1 MESVKEFRKGQHSEGPASILAIGTANPSNCVSQADYPDFLFRTTNSEHLIQLKEKFKLMC

61 EKTMIRKRHMYLTEEILKKNPSLCSFMKPSLDRRQEMVEPEIPKLAKEAAIKALEEWGQP

121 KSKITHLVFCTTSCVAIPGPDYHLIKLLGLPPSVNRTMTCLHGCFSGAAALRIAKDLAEN

181 NKGARVLVVCSEIMTFNFRAPSEAHMDFLVGQTIFGDGAAAAVVGADPDILIERPIFILA

241 NTAQAILPDSEGAVEGHLREFGMTLQLLRKVPQLIADNMQNVLEEAFTPIGIKDWNSIFW

301 IAHPGGRAILDFLEAKLGLKEDKLRASRHVLSEYGNMAGGSVFFVLDDMRKKSIEKGKVT

361 TGEGLDWGVLVGCGPGLTAEAVVLHSVAIDHSA

Claims (2)

1.一个桑树白藜芦醇合成酶基因MaSTS，其特征在于该基因的核苷酸全序列如SEQ IDNO：1所示，该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.权利要求1所述的一个桑树白藜芦醇合成酶基因MaSTS的克隆方法，其特征在于通过以下步骤实现：

（1）参考桑树转录组数据，设计引物扩增桑树的白藜芦醇合成酶基因；

（2）通过信息分析的方法预测基因结构及编码氨基酸序列；

（3）设计引物扩增全长CDS，并连接到pMD19-T Vector，挑选阳性克隆并测序。