CN108047320A

CN108047320A - 蛋白GmMYB12及编码基因在提高大豆异黄酮积累和耐盐性中的应用

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Publication number: CN108047320A
Application number: CN201810150555.2A
Authority: CN
Inventors: 王飞兵; 崔家顺; 赵娇娇; 杨杰; 范宁; 刘嘉奇; 汪欢
Original assignee: Huaiyin Institute of Technology
Current assignee: Heilongjiang Xilian Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2018-02-13
Filing date: 2018-02-13
Publication date: 2018-05-18
Anticipated expiration: 2038-02-13
Also published as: CN108047320B

Abstract

本发明公开了蛋白GmMYB12及编码基因在提高大豆异黄酮积累和耐盐性中的应用。本发明提供一种蛋白，是如下(a)或(b)：(a)由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的由序列SEQ ID NO.2衍生的蛋白质。本发明的实验证明，将所述蛋白的编码基因导入大豆中，转基因大豆中异黄酮含量显著提高，同时提高转基因大豆植株的耐盐性。本发明的蛋白及其编码基因对培育高异黄酮和耐盐性增强大豆品种具有重要的应用价值；本发明将在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

Description

蛋白GmMYB12及编码基因在提高大豆异黄酮积累和耐盐性中的应用

技术领域

本发明涉及一种植物相关蛋白GmMYB12及其编码基因与应用，特别是来源于大豆的与异黄酮积累相关蛋白GmMYB12及其编码基因与应用。

背景技术

类黄酮是一类广泛存在于植物中的多酚类次生代谢产物。在自然界中，类黄酮与许多的功能都有关，例如类黄酮是花、果实和种子颜色的主要显色物质，能够保护植物抵御紫外线和防止病源微生物侵袭，能够提高农作物产量，调节植物生长素的运输，在植物和细菌的相互作用中作为信号分子，促进花粉萌发并且和花粉的育性直接相关。

植物类黄酮生物合成途径主要有两类基因控制：结构基因和调节基因。其中，结构基因直接编码与类黄酮次生代谢生物合成有关的各种酶类，而调节基因则是控制结构基因表达强度和表达方式的一类基因。目前从多种植物中克隆了与类黄酮生物合成的主要结构基因和调节基因，并阐明了这些主要结构基因编码的酶的生化作用机制。然而，调控这些结构基因表达的分子机制仍然不是很清楚。

近年来，有关类黄酮生物合成的相关研究主要集中在类黄酮合成的调控基因上。许多植物的类黄酮合成调控基因均已被克隆鉴定，这些调控基因通过调控类黄酮生物合成结构基因来调控植物类黄酮合成的种类和数量。类黄酮合成主要由R2R3-MYB、bHLH、WD40三类转录因子调控，这三类转录因子以MYB-bHLH-WD40(MBW)复合体形式调控编码类黄酮合成相关酶的结构基因的表达，最终调节类黄酮的合成。

大豆(Glycine max)是中国和亚洲许多国家的重要作物之一，在中国分布广泛，资源丰富，也是许多传统食品和动物饲料的主要成份。大豆中不仅富含丰富的蛋白质，而且含有很强生物活性物质大豆类黄酮(异黄酮)。研究表明，大豆异黄酮能清除体内多余的自由基，增加抗氧化酶的活性，从而起到抗氧化的作用，另外还能够调节体内免疫机制，增强体质、缓解疲劳。临床研究以及流行病学调查表明，大豆异黄酮具有抑制肿瘤生长、缓解运动疲劳、治疗心血管疾病、预防和治疗骨质疏松以及缓解妇女更年期综合症等多种生理保健作用。

因此，克隆大豆异黄酮生物合成关键基因，利用基因工程技术提高大豆异黄酮的含量，培育高异黄酮含量的大豆新品种是改良大豆营养保健功效的重要途径。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种与大豆异黄酮积累和耐盐性相关蛋白及其编码基因和应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

本发明所提供的蛋白，名称为GmMYB12，来源于大豆，是如下(a)或(b)所述的蛋白质：

(a)由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物异黄酮积累和耐盐性相关的由SEQ ID NO.2衍生的蛋白质。

所述与植物异黄酮积累和耐盐性相关蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

所述与植物异黄酮积累和耐盐性相关蛋白的编码基因为如下(1)-(3)中任何一种的DNA分子；

(1)如SEQ ID NO.1所示的DNA分子；

(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码与植物异黄酮积累和耐盐性相关蛋白的DNA分子；

(3)与(1)或(2)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或者至少具有99％同源性且编码与植物异黄酮积累和耐盐性相关蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

序列表中的SEQ ID NO.1由1116个碱基组成，编码的氨基酸序列是序列表中SEQID NO.2所示的蛋白。

含有所述与植物异黄酮积累和耐盐性相关蛋白的编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组表达载体为将上述蛋白的编码基因插入表达载体中，得到表达上述蛋白的重组表达载体。作为一种优选技术方案，所述重组表达载体是在载体pCBGUS的多克隆位点间插入所述编码基因得到的重组表达载体，但不限于此；

所述载体pCBGUS是通过包括如下步骤的方法得到的：

(1)将pCAMBIA1301载体经过HindIII和EcoRI双酶切，回收载体大片段；

(2)将pBI121载体经过HindIII和EcoRI双酶切，回收包含gusA基因的片段；

(3)将步骤(1)中回收的载体大片段与步骤(2)中回收的包含gusA基因的片段连接，得到重组载体pCBGUS。

所述pCAMBIA1301载体购自CAMBIA公司；所述pBI121载体购自Clontech公司。

扩增所述与植物异黄酮积累和耐盐性相关蛋白的编码基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。作为一种优选技术方案，所述引物对为如下所示：

GmMYB12-GC-F：5’-AAACAAAACCCATGGGAAGGG-3’

GmMYB12-GC-R：5’-TCTTGGATGAATCAAGAGAGAAACC-3’

上述蛋白、上述基因或上述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在提高植物异黄酮积累和耐盐性中的应用也属于本发明的保护范围。

一种培育转基因植物的方法，为将上述与植物异黄酮积累和耐盐性相关蛋白的编码基因导入目的植物，获得转基因植物，所述转基因植物组织中的异黄酮含量高于所述目的植物，同时耐盐性显著增强。

作为一种优选技术方案，所述与植物异黄酮积累和耐盐性相关蛋白的编码基因是通过所述重组表达载体导入目的植物中。

所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物优选为大豆，但不限于此。

所述植的物组织为植物种子和叶片。

本发明的有益效果：

本发明所提供的GmMYB12基因所编码的蛋白可以提高植物异黄酮积累和耐盐性。本发明所提供的GmMYB12蛋白及其编码基因在提高植物异黄酮积累和耐盐性上具有重要的应用价值，为提高大豆异黄酮积累和耐盐性的研究提供重要的依据。本发明的蛋白及其编码基因对培育高异黄酮积累和耐盐性植物品种具有重要的应用价值，从而提高农作物产量具有重要意义。本发明将在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

附图说明

图1本发明大豆GmMYB12基因植物表达载体简图。

图2本发明GmMYB12转基因大豆植株的PCR检测结果图。

图3本发明中大豆苷(Daidzin)、黄豆黄苷(Glycitin)和染料木苷(Genistin)的标准曲线图。其中，A为大豆苷(Daidzin)的标准曲线图；B为黄豆黄苷(Glycitin)的标准曲线图；C为染料木苷(Genistin)的标准曲线图。

图4本发明GmMYB12转基因大豆植株耐盐性盆栽鉴定，WT为野生型大豆植株，OE2、OE6和OE7为转基因大豆植株。

图5本发明GmMYB12转基因大豆植株抗逆生理生化指标测定，WT为野生型大豆植株，OE2、OE6和OE7为转基因大豆植株。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。

下述实施例中，所用的试验材料及其来源包括：

大豆(Glycine max)品种Williams 82和中豆32，由淮阴工学院生命科学与食品工程学院江苏省植物生产与加工实践教育中心实验室保存。

大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α由淮阴工学院生命科学与食品工程学院江苏省植物生产与加工实践教育中心实验室保存。克隆载体PMD-18-Simple T、各类限制性内切酶、Taq聚合酶、连接酶、dNTP、10×PCR buffer和DNA marker购自宝生物工程大连有限公司。所有的化学试剂都从美国西格玛化学公司和上海国药化学试剂公司购买。

本发明中常规的分子生物学操作具体参见《分子克隆》【Molecular Cloning.2nded.Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989】。

下述实施例中常规的基因操作参照分子克隆文献进行【Sambook J,Frets EF,Mannsdes T et al.In:Molecular Cloning.2nd ed.Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989】。

实施例1大豆GmMYB12蛋白及其编码基因的获得

1.实验材料

参照Jia等(2017)【TengjiaoJia,Jing An,Zhen Liu,Bingjun Yu,JianjunChen.Salt stress induced soybean GmIFS1 expression and isoflavoneaccumulationand salt tolerance in transgenic soybean cotyledonhairy roots andtobacco.Plant Cell,Tissue and Organ Culture,2017,128:469-477】的方法，将大豆品种‘Williams 82’植物叶片材料取下，液氮速冻，-80℃保存。

2.叶片总RNA提取和纯化

取Williams 82叶片约2.0g，在液氮中研磨成粉状，加入10mL离心管，用Applygen植物RNA提取试剂盒(Applygen Technologies Inc，Beijing)提取Williams 82叶片总RNA，试剂盒中包括：Plant RNA Reagent，植物组织裂解、分离RNA、去除植物多糖和多酚；Extraction Reagent，有机抽提去除蛋白质、DNA、多糖和多酚；Plant RNA Aid，去除植物多糖多酚和次生代谢产物。利用QIAGEN Oligotex Mini mRNA Kit(QIAGEN，GmbH，Germany)从总RNA中纯化mRNA。最后，取1μL于1.2％琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，另取2μL稀释至500μL，用紫外分光光度计检测其质量(OD260)和纯度(OD260/OD280)，提取Williams 82叶片总RNA，经非变性胶琼脂糖凝胶电泳检测，28S和18S条带清晰，且二者亮度比值为1.5～2︰1，表明总RNA没有降解，纯化所得mRNA符合实验要求，可用于大豆GmMYB12蛋白cDNA全长的克隆。

3.GmMYB12蛋白cDNA的全长克隆

以NCBI(National Center for Biotechnology Information)上的GmMYB12的cDNA序列设计引物进行GmMYB12蛋白cDNA的全长克隆。

引物序列如下：

GmMYB12-GC-F：5’-AAACAAAACCCATGGGAAGGG-3’

GmMYB12-GC-R：5’-TCTTGGATGAATCAAGAGAGAAACC-3’

以Williams 82叶片总RNA经Oligo(dT)反转录为模板，用高保真的FastPfu酶，进行PCR扩增，PCR条件为95℃1min，随后95℃20s，53℃20s和72℃1min，进行36个循环，最后72℃延伸5min。琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，获得1362bp长度的扩增片段。

综合上述步骤的结果，获得了目的cDNA序列，其核苷酸序列如序列表中序列SEQID NO.1所示。序列表中序列SEQ ID NO.1由1116个碱基组成，自5’端第1位-第1116位碱基为其开放阅读框，编码具有序列表中序列SEQ ID NO.2所示的氨基酸残基序列的蛋白质。序列表中序列SEQ ID NO.2由371个氨基酸残基组成。将该基因命名为GmMYB12，将其编码的蛋白命名为GmMYB12。

实施例2 GmMYB12基因过表达载体的构建

将实施例1中测序鉴定正确的含有序列表SEQ ID NO.1所示核苷酸的DNA片段用BamHI和SacI进行双酶切后与载体pCBGUS连接获得含有GmMYB12基因片段的重组载体pCBGUS，再对含有GmMYB12基因片段的重组载体pCBGUS进行酶切获得带有gusA基因的GmMYB12基因片段，用1％琼脂糖凝胶回收DNA片段，通过T₄ DNA连接酶将回收的GmMYB12基因片段与含有双35S启动子pYPx245质粒连接，酶切鉴定和序列分析测定获得了含有大豆GmMYB12基因的重组植物表达载体pCAMBIA1301-GmMYB12该表达载体还包含gusA报告基因和带内含子卡那霉素抗性标记基因，载体如图1所示。

实施例3 GmMYB12基因转化大豆

将实施例2构建的大豆GmMYB12基因的植物表达载体pCAMBIA1301-GmMYB12用转化大豆，参照如下文献【蔡雯雯.农杆菌介导大豆遗传转化体系的优化研究.南京农业大学硕士学位论文，2012】，具体方法如下：

1.种子气体灭菌及种子萌发

取发育饱满无病害的健康大豆种子置于打开的培养皿里。将培养皿放入带有密封盖的干燥器中(确保密封盖可以运行)，干燥器内放入一个装有150mL 10％NaClO，逐滴地沿着锥形瓶壁加入10mL 12mol/L的浓盐酸，确保容器内有足够的反应生成的氯气气体后。盖上干燥器的盖子静置6h。

2.大豆无菌苗和外植体的获得

灭完菌后将培养皿的盖子盖上取出。放至无菌操作台数分钟吹至氯气味道散尽。将经过气体灭菌的种子挤朝下接种到发芽培养基中，培养皿面积规格100X25mm，每皿约10粒种子，五个萌发培养皿装入一个塑料袋中，在每个袋子上切个4-5切口，每个切口大约2mm，在25℃18h光照6h黑暗下条件下培养所需天数。

培养皿中选择无污染的绿色健壮幼苗子叶节，保留2mm下胚轴区域，沿2片子叶中间纵切子叶节，将2片子叶分开，切去顶芽及侧芽，保留完整的子叶，用解剖刀在子叶与下胚轴交接处3mm范围内的叶腋处适当划6-8刀伤口，一方面防止在培养过程中叶腋的生长，另一方面是创造伤口以利于农杆菌浸染。注意所切伤口不宜过深，以免影响分化。切好的外植体放入培养皿中备用。每个无菌苗可产生2个用于转化的子叶节外植体。

3.农杆菌的准备

(1)将pCAMBIA1301-GmMYB12用电击法转化根癌农杆菌EHA105菌株(BiovectorCo.,LTD)，得到含有pCAMBIA1301-GmMYB12的重组农杆菌，并涂布于含有卡那霉素抗性的平板筛选转化子。

(2)挑取农杆菌单菌接种于5mL LB液体培养基(利福平50μg/mL，氯霉素100μg/mL)中，28℃，250rpm培养20h。

(3)取1mL菌液转接入20-30mL LB液体培养基(利福平50μg/mL，氯霉素100μg/mL)中，28℃，250rpm培养约12h，测OD 600≈1.5。

(4)8000rpm，4℃，10min离心收集菌体，重悬于农杆菌转化渗透液(5％蔗糖，0.05％Silwet L-77)并稀释至OD 600≈0.8。

4.农秆菌介导转化大豆

(1)将上面制备好的子叶节外植体放入重悬后的农杆菌菌液，浸泡30min，大约每30mL菌液放40个子叶节外植体。

(2)不定芽诱导：侵染结束后，将子叶节外植体放入铺有无菌滤纸的大培养皿中，吸去多余的表面菌液。然后将外植体近轴面朝下接种在铺有无菌滤纸的固体共培养基上，在25℃黑暗下共培养3d。共培养之后，用液体不定芽诱导培养基SIM清洗2-3次除去子叶节外植体表面的农杆菌。应确保子叶节外植体表面的农杆菌去除干净，避免农杆菌在培养基中进一步生长。用无菌滤纸吸干子叶节外植体表面的多余水分后即可将子叶节子叶近轴面朝下，下胚轴倾斜45℃插入培养基中进行不定芽诱导培养。14d后统计每个处理的外植体的芽数。

(3)不定芽伸长：每14d转接1次，转接时切去下胚轴莲部的老化组织，待见不定芽时，将外植体转入芽伸长培养基。期间记录芽伸长数。

(4)根诱导：待丛生芽长至3-4cm时，切下丛生芽接到生根培养基中诱导生根。培养温度为25℃、相对湿度为70-75％、光周期16/6h。至丛生芽长出2个主根。

(5)苗驯化、移栽：待根系有一定的发育时，将培养瓶开盖，在气候箱中(相对湿度85％，光照度3000Lux，温度25℃)炼苗5-7d。取出小植株，洗净根部的培养基，栽入盛有灭菌后的沙、土质量比为1：1混合物的花盆中，在气候箱中培养7-14d放入温室生长至成熟。

实施例4 GmMYB12基因转基因大豆植株PCR检测

(1)试验方法

用CTAB法提取大豆转基因植株和野生型植株的基因组DNA。用常规方法进行PCR检测，所使用的GmMYB12基因引物为：primer 1：5’-GAACTCGCCGTAAAGACTGG-3’和primer2：5’-GACCCTTCCTCACTCGATGC-3’。在0.2mLEppendorf离心管中加入10×PCR buffer 2μL、4dNTP(10mol/L)1μL、引物(10μmol/L)均为1μL、模板DNA(50ng/uL)2μL、Taq DNA聚合酶0.25μL，加ddH₂O至总体积20μL。反应程序为94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸2min，共35个循环。

(2)试验结果

电泳检测扩增结果见图2(图2中，泳道M为Maker；泳道W：水；泳道P：阳性对照(重组质粒pCAMBIA1301-GmMYB12)；泳道WT：野生型大豆植株；泳道OE1-OE8：为转化pCAMBIA1301-GmMYB12的大豆转基因植株)。从图中可见，转化pCAMBIA1301-GmMYB12的大豆转基因植株和阳性对照扩增出1045bp的目标条带，表明GmMYB12基因已经整合到大豆的基因组中，并证明这些再生植株为转基因植株；野生型大豆植株没有扩增出1045bp的目标条带。转基因植株为后续功能分析。

实施例5高效液相色谱法测定GmMYB12基因转基因大豆籽粒异黄酮含量

1.标样的准备

大豆异黄酮标准品：大豆苷(Daidzin)、黄豆黄苷(Glycitin)、染料木苷(Genistin)，纯度≥98％，均购自美国Sigma公司。

2.标准品的配置以及标准曲线的绘制

分别精密称取3种标准品各2.5mg，用甲醇(HPLC级)定容至25mL，配成标准品母液。分别精密吸取母液0.0625、0.125、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00mL定容到10mL，摇匀备用。然后分别从各标准储备液中吸取一定量，用甲醇分别稀释到0、1、2、3、4、5μg/mL,待测。以峰面积(Y)为纵坐标，大豆异黄酮浓度(X)为横坐标，对各组分浓度与峰面积关系进行回归分析，分别绘制三种标准品的标准曲线(图3)。

3.转基因大豆籽粒样品异黄酮提取

转基因大豆籽粒、转空载体对照大豆(CK)和野生型对照大豆(WT)籽粒均匀粉碎后过40目筛，准确称取100mg粉样，加入80％(v/v)的甲醇提取液4mL，室温下静置2.5h，置于80℃水浴14h，12 000g离心15min，经0.45μm滤膜过滤得预处理液，将上清液转入HPLC专用小瓶中封口，4℃下保存待测。

4.转基因大豆籽粒样品异黄酮测定

(1)试验方法

利用高效液相色谱法测定(高效液相色谱仪为美国Agilent公司1200型)

(1)将上述得到的待测异黄酮溶液在旋转蒸发器中集中收集，并用N₂干燥。

(2)立即使异黄酮溶解于1mL乙腈︰甲醇︰二氯甲烷(V︰V︰V)＝45︰20︰35的溶剂中。

(3)将待测样品通过0.22μL注射器过虑后，直接将10μl样品到加入到色谱柱中。

(4)采用Phenomenex C₁₈色谱柱(150mm×4.6mm，5μm),以甲醇︰水(V︰V)＝30︰70为流动相，柱温为40℃，流速1.0mL/min检测波长254nm处的吸收峰的变化。

(5)每个待测样品，重复测定3次。

(2)试验结果

根据上述建立的大豆苷(Daidzin)、黄豆黄苷(Glycitin)、染料木苷(Genistin)的标准曲线(图4)，分别测定转基因大豆、转空载体对照大豆和野生型对照大豆籽粒中的异黄酮含量。其中总异黄酮含量是三种异黄酮含量之和。结果如表1所示，表1中OE2、OE6、OE7分别表示3个转基因大豆植株的待测样品；CK代表转空载体对照大豆；WT代表野生型对照大豆。转空载体对照大豆(CK)和野生型对照大豆(WT)籽粒中的异黄酮含量无显著差异；转基因大豆植株的总异黄酮含量与野生型对照植株(WT)相比显著提高，分别是其含量的52％、69％、44％，表明导入GmMYB12基因显著提高大豆异黄酮积累。

表1大豆籽粒异黄酮含量测定结果

实施例6GmMYB12基因转基因大豆植株耐盐性鉴定

(1)试验方法

为了进一步验证转基因大豆材料的耐盐性，将纯合的转基因大豆和野生型大豆种子表面消毒，用纯净水催芽，挑选长势一致的幼苗，种植在以营养土：蛭石(w：w)＝1:2的营养土中，注意每天浇水，等到植株长到4片真叶时开始进行盐胁迫处理。用含有200mM NaCl的1/2霍格兰营养液每个2d灌溉1次，每次200mL，处理4w，观察其表型，进行照相并调查其存活率。

(2)试验结果

结果显示，在盐胁迫处理条件4w后，结果见图4，耐盐盆栽实验表明转基因材料与野生型材料相比，差异很明显，转基因材料的生长状态显著优于野生型材料，野生型材料逐渐褐化死亡。表明过表达GmMYB12基因显著提高转基因大豆植株的耐盐性。

实施例7 GmMYB12基因转基因大豆植株耐盐生理生化指标的测定

1.脯氨酸含量测定

(1)试验方法

植物在正常条件下，游离脯氨酸含量很低，但遇到盐、干旱等胁迫时，游离的氨基酸便会大量积累，并且积累指数和植物的抗逆性有关。因此，脯氨酸可以作为植物抗逆性的一项生化指标。

测定方法参考文献【Feibing Wang,Weili Kong,Gary Wong,Lifeng Fu,RihePeng,Zhenjun Li,Quanhong Yao.AtMYB12 regulates flavonoids accumulationand abiotic stresstolerance in transgenic Arabidopsis thaliana.MolecularGenetics and Genomics,2016,291:1545-1559】，检测大豆植株的脯氨酸含量。大豆植株为空白对照中处理2w的大豆植株、盐胁迫2w的大豆植株。实验需重复三次，结果取平均值。

(2)试验结果

实验结果见图5中A(Normal为空白对照，Salt为盐胁迫)。结果表明，转基因大豆OE2植株、OE6植株和OE7植株的脯氨酸含量显著高于野生型大豆植株。

2.SOD活性测定

(1)试验方法

超氧化物歧化酶(SOD)活性可以作为植物抗逆性的一项生理生化指标。SOD的活性越低，植物遭受逆境伤害的程度越大。

测定方法参考文献【Feibing Wang,Weili Kong,Gary Wong,Lifeng Fu,RihePeng,Zhenjun Li,Quanhong Yao.AtMYB12 regulates flavonoids accumulationand abiotic stresstolerance in transgenic Arabidopsis thaliana.MolecularGenetics and Genomics,2016,291:1545-1559】，检测大豆植株的SOD活性。大豆植株为空白对照中处理2w的大豆植株、盐胁迫2w的大豆植株。实验需重复三次，结果取平均值。

(2)试验结果

实验结果见图5中B(Normal为空白对照，Salt为盐胁迫)。结果表明，转基因大豆OE2植株、OE6植株和OE7植株的SOD活性显著高于野生型大豆植株。

3.POD活性测定

(1)试验方法

过氧化物酶(POD)活性可以作为植物抗逆性的一项生理生化指标。POD的活性越低，植物遭受逆境伤害的程度越大。

(2)试验结果

实验结果见图5中C(Normal为空白对照，Salt为盐胁迫)。结果表明，转基因大豆OE2植株、OE6植株和OE7植株的POD活性显著高于野生型大豆植株。

4.MDA含量测定

(1)试验方法

植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛(MDA)是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度，即MDA的含量越高，植物遭受逆境伤害的程度越大。

测定方法参考文献【Feibing Wang,Weili Kong,Gary Wong,Lifeng Fu,RihePeng,Zhenjun Li,Quanhong Yao.AtMYB12 regulates flavonoids accumulationand abiotic stresstolerance in transgenic Arabidopsis thaliana.MolecularGenetics and Genomics,2016,291:1545-1559】，检测大豆植株的MDA含量。大豆植株为空白对照中处理2w的大豆植株、盐胁迫2w的大豆植株。实验需重复三次，结果取平均值。

(2)试验结果

实验结果见图5中D(Normal为空白对照，Salt为盐胁迫)。结果表明，转基因大豆OE2植株、OE6植株和OE7植株的MDA含量显著低于野生型大豆植株。

5.H₂O₂含量测定

(1)试验方法

植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使H₂O₂发生累积。H₂O₂可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。因此，H₂O₂的含量越高，植物遭受逆境伤害的程度越大。

(2)试验结果

实验结果见图5中E(Normal为空白对照，Salt为盐胁迫)。结果表明，转基因大豆OE2植株、OE6植株和OE7植株的H₂O₂含量显著低于野生型大豆植株。

序列表

<110> 淮阴工学院

<120> 蛋白GmMYB12及编码基因在提高大豆异黄酮积累和耐盐性中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1116

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 1

atgggaaggg ctccttgttg tgagaaagtg ggattgaaga aggggaggtg gacagcagag 60

gaggatgaga tcttggcaaa atacattcag gccaatgggg aaggttcttg gaggtcattg 120

cctaaaaatg caggattatt aaggtgtggg aagagttgca ggctgagatg gattaactat 180

ttgagagctg accttaaaag aggaaacatt tctgctgaag aggaaaatac cattgttaag 240

ttgcacgctt cttttggtaa caggtggtct ttgatagcaa atcacttacc aggaagaaca 300

gacaacgaga taaaaaacta ctggaattct cacctcagca ggaaaattta cagtttccca 360

ggtgcaggtg caggtgcaag tgcagggatc atggatacac ctaaggtagt atatattcct 420

cccaagcgca aatgtggtag aacaagtcgt tgggccatga agaaaaacaa aacatacacc 480

caaaaagtca atgataggat taaccagaga cacacacaaa ttggtttccc tcaacagaac 540

agtgacaccg cagttccgac gccaccaact ccgtctctag agagtgaggg tttgtcaaac 600

gccgttaatg acttcaaggt cctggacggt gacgtggcag agtttgatga gccgagaacg 660

gaggagctgg aggcggaggt aaataaacgt gacaatagcg ttggaggcgt ggaagaaagt 720

agtaataccg atgaagacat cttgggactg tgtgaactag agggcattaa tgaggacagt 780

gggatgttgt tgggttttag tgacattttg gaaagttgcc ttgcggaaac aacatgtggg 840

gtttgggaca taagtgaaga gagagaaagc aatgacgtgg tggcggctga tgcttgtcgc 900

gacaaaatag catcgagtga ggaagggtca tgctcttcca tgaatcaaga ctgggactgg 960

gagagcgtgt tagagtttag taacgctgtt gataattggg aggaccaaga caaattgctc 1020

acttggctgt gggaggacga tgactgcaag agattgggag agacagatac tcagatacta 1080

caaaacgaca tggttattga ttggtttctc tcttga 1116

<210> 2

<211> 371

<212> PRT

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 2

Met Gly Arg Ala Pro Cys Cys Glu Lys Val Gly Leu Lys Lys Gly Arg

1 5 10 15

Trp Thr Ala Glu Glu Asp Glu Ile Leu Ala Lys Tyr Ile Gln Ala Asn

20 25 30

Gly Glu Gly Ser Trp Arg Ser Leu Pro Lys Asn Ala Gly Leu Leu Arg

35 40 45

Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Ile Asn Tyr Leu Arg Ala Asp

50 55 60

Leu Lys Arg Gly Asn Ile Ser Ala Glu Glu Glu Asn Thr Ile Val Lys

65 70 75 80

Leu His Ala Ser Phe Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Asn His Leu

85 90 95

Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Tyr Trp Asn Ser His Leu

100 105 110

Ser Arg Lys Ile Tyr Ser Phe Pro Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ser Ala

115 120 125

Gly Ile Met Asp Thr Pro Lys Val Val Tyr Ile Pro Pro Lys Arg Lys

130 135 140

Cys Gly Arg Thr Ser Arg Trp Ala Met Lys Lys Asn Lys Thr Tyr Thr

145 150 155 160

Gln Lys Val Asn Asp Arg Ile Asn Gln Arg His Thr Gln Ile Gly Phe

165 170 175

Pro Gln Gln Asn Ser Asp Thr Ala Val Pro Thr Pro Pro Thr Pro Ser

180 185 190

Leu Glu Ser Glu Gly Leu Ser Asn Ala Val Asn Asp Phe Lys Val Leu

195 200 205

Asp Gly Asp Val Ala Glu Phe Asp Glu Pro Arg Thr Glu Glu Leu Glu

210 215 220

Ala Glu Val Asn Lys Arg Asp Asn Ser Val Gly Gly Val Glu Glu Ser

225 230 235 240

Ser Asn Thr Asp Glu Asp Ile Leu Gly Leu Cys Glu Leu Glu Gly Ile

245 250 255

Asn Glu Asp Ser Gly Met Leu Leu Gly Phe Ser Asp Ile Leu Glu Ser

260 265 270

Cys Leu Ala Glu Thr Thr Cys Gly Val Trp Asp Ile Ser Glu Glu Arg

275 280 285

Glu Ser Asn Asp Val Val Ala Ala Asp Ala Cys Arg Asp Lys Ile Ala

290 295 300

Ser Ser Glu Glu Gly Ser Cys Ser Ser Met Asn Gln Asp Trp Asp Trp

305 310 315 320

Glu Ser Val Leu Glu Phe Ser Asn Ala Val Asp Asn Trp Glu Asp Gln

325 330 335

Asp Lys Leu Leu Thr Trp Leu Trp Glu Asp Asp Asp Cys Lys Arg Leu

340 345 350

Gly Glu Thr Asp Thr Gln Ile Leu Gln Asn Asp Met Val Ile Asp Trp

355 360 365

Phe Leu Ser

370

Claims

1.一种蛋白，是如下(a)或(b)：

(a)由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：该基因是如下(1)-(3)中任何一种的DNA分子；

(1)如SEQ ID NO.1所示的DNA分子；

4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为将权利要求1所述蛋白的编码基因插入表达载体中，得到表达权利要求1所述蛋白的重组载体。

6.扩增权利要求2或3所述基因全长或其任意片段的引物对。

7.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述编码基因或权利要求4所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调节植物异黄酮积累和耐盐性中的应用；所述植物具体为双子叶植物或单子叶植物。

8.一种培育转基因植物的方法，其特征在于：为将权利要求1所述蛋白的编码基因导入目的植物，获得转基因植物，所述转基因植物组织中的异黄酮含量高于所述目的植物，同时耐盐性显著增强。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述植的物组织为植物种子和叶片；权利要求1所述蛋白的编码基因通过权利要求4或5所述的重组载体导入目的植物。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述植物具体为双子叶植物或单子叶植物。