CN118255857A

CN118255857A - 马铃薯耐寒相关蛋白StC3H14及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN118255857A
Application number: CN202410581246.6A
Authority: CN
Inventors: 黄斌全; 孙思凡; 耿慧云; 施清竹
Original assignee: Yunnan University YNU
Current assignee: Yunnan University YNU
Priority date: 2024-05-11
Filing date: 2024-05-11
Publication date: 2024-06-28

Abstract

本发明公开了马铃薯耐寒相关蛋白StC3H14及其编码基因与应用。本发明所要解决的技术问题是如何提高植物抗逆性，为此提供了蛋白质StC3H14及其相关的生物材料在提高植物抗逆性中的应用，所述蛋白序列为序列2所示。实验证明，在马铃薯中过表达StC3H14基因可提高转基因植株的耐寒性。因此，耐寒相关蛋白StC3H14及其编码基因在调控植物抗逆过程中具有重要的理论意义和实用价值。

Description

马铃薯耐寒相关蛋白StC3H14及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及变异或遗传工程领域，尤其涉及与马铃薯耐寒相关蛋白StC3H14及其编码基因与应用。

背景技术

植物的生长发育往往会受到各种环境的影响，包括非生物胁迫和生物胁迫。全球气候变暖逐渐加剧了全球农作物产量的限制，其中极端气候是影响农作物生长和产量的一个重要因素。马铃薯(Solanum tuberosum L.)是全球第四大粮食作物，其单产产量高，营养丰富，经济价值较高，是一种重要的粮食、饲料以及工业原料用作物，通过对植物耐冷机理的研究，培育耐寒的马铃薯新品种是提高冷胁迫下的马铃薯产量的最有效的途径之一。

马铃薯是无性繁殖作物，由于其自交不亲和性严重限制马铃薯的传统育种。长期的育种实践表明，用常规杂交育种方法难以选育出优质、高产、耐寒的马铃薯新品种。目前，有关CCCH基因能够改良马铃薯耐寒性的研究比较少。

发明内容

本发明要解决的问题是如何提高植物的抗逆性，尤其是耐冷性。

为解决上述问题，本发明提供了上调或增强或提高目的植物抗逆性的方法，所述方法包括通过步骤S来上调或增强或提高目的植物抗逆性，所述步骤S包括S1和/或S2；所述S1为上调或增强或提高所述目的植物中蛋白质的编码基因的表达，所述S2为上调或增强或提高所述蛋白质的活性和/或含量；

本发明还提供了培育高抗逆性植物的方法，所述方法包括通过步骤S来培育高抗逆性植物，所述步骤S包括S1和/或S2；所述S1为上调或增强或提高所述目的植物中蛋白质的编码基因的表达，所述S2为上调或增强或提高所述蛋白质的活性和/或含量；

本发明还提供了下调或抑制或降低植物抗逆性的方法，包括如下步骤：下调或抑制或降低目的植物中靶基因的表达，使植物抗逆性下调或抑制或降低。

上述蛋白质为蛋白质StC3H14，为如下A1)或A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

A2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

A3)将A1)或A2)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物抗逆性相关的蛋白质。

上述目的植物含有所述靶基因，所述靶基因编码StC3H14，StC3H14为如下B1)或B2)或B3)：

B1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

B2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

B3)将B1)或B2)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物抗逆性相关的蛋白质。

所述植物育种的指标包括提高植物抗逆性。所述植物育种的目的包括改善植物的抗逆能力。

上述蛋白质中，所述蛋白质标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSU M62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述蛋白质中，所述80％以上的同一性可为至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

上述蛋白质中，序列2(SEQ ID No.2)由294个氨基酸残基组成。

上述蛋白质来源于马铃薯。

上述方法中所述抗逆性为耐冷性。

上述应用中，所述植物是如下任一种：

C1)双子叶植物，

C2)管状花目植物，

C3)茄科植物，

C4)茄属植物，

C5)马铃薯。

本发明还提供了蛋白质的应用，所述应用可为所述蛋白质在调控植物抗逆性和/或制备调控植物抗逆性的产品中的应用，还可为所述蛋白质在创制耐寒新种质植物育种和/或制备耐寒种质资源中的应用；

所述蛋白质为蛋白质StC3H14，为如下E1)或E2)或E3)：

E1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

E2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

E3)将E1)或E2)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物抗逆性相关的蛋白质。

本发明还提供了生物材料的应用，所述应用可为生物材料在调控植物抗逆性和/或制备调控植物抗逆性的产品中的应用，也可为所述生物材料在植物育种和/或制备植物育种产品中的应用。

所述调控可为上调或增强或提高，也可为下调或抑制或降低。

所述生物材料为下述任一种：

G1)编码所述蛋白质的核酸分子；

G2)含有G1)所述核酸分子的表达盒；

G3)含有G1)所述核酸分子的重组载体、或含有G2)所述表达盒的重组载体；

G4)含有G1)所述核酸分子的重组微生物、或含有G2)所述表达盒的重组微生物、或含有G3)所述重组载体的重组微生物；

G5)含有G1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有G2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

G6)含有G1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有G2)所述表达盒的转基因植物组织；

G7)含有G1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有G2)所述表达盒的转基因植物器官。

所述转基因植物是通过基因工程的重组DNA技术等生物学方法得到的植物。

上述G3)中，所述重组载体可为植物基因编辑载体。所述植物基因编辑载体可为pBWA(V)KS-ccDB-StC3H14-3×flag。上述重组载体通过限制性内切酶BsaI(Eco31I)酶切载体pBWA(V)KS-ccDB-3×flag并将其与核苷酸序列是序列表中序列2自5′端第1位-第882位的StC3H14基因利用同源重组克隆酶(Hieff Clone Universal One Step Cloning Kit，YEASEN公司)连接，得到重组质粒pBWA(V)KS-ccDB-StC3H14-3×flag。

G3)中另一植物编辑载体可为重组质粒pBWA(V)KS-StC3H14-RNAi。用限制性内切酶BsaI(Eco31I)酶切载体pBWA(V)KS-RNAi，而后在载体pBWA(V)KS-StC3H14-RNAi的BsaI-(Eco31I)酶切位点间正反向插入了序列表中序列1自5′端第1位-第282位所示的序列(中间由茎环loop序列分隔开)，得到重组质粒pBWA(V)KS-StC3H14-RNAi。

进一步地，所述生物材料中，G4)所述重组微生物具体可为酵母、细菌、藻和真菌。

进一步的，所述重组微生物可为农杆菌。所述农杆菌为GV3101.

进一步地，所述生物材料中，G6)所述植物组织可来源于根、茎、叶、花、果实、种子、花粉、胚和/或花药。

进一步地，所述生物材料中，G7)所述转基因植物器官可为转基因植物的根、茎、叶、花、果实和种子。

上述应用中，所述蛋白质来源于马铃薯。

上述应用中所述抗逆性为耐冷性。

上述应用中，所述植物是如下任一种：

H1)双子叶植物，

H2)管状花目植物，

H3)茄科植物，

H4)茄属植物，

H5)马铃薯。

本发明还提供了一种产品，所述产品为上述的蛋白质或生物材料。

本发明提供了一种StC3H14蛋白及其编码基因，将该基因导入马铃薯栽培种中，得到转StC3H14基因的甘薯植株，将转基因甘薯植株进行冷胁迫处理，发现其与野生型栽培种比较，耐冷性增强，具体体现在更低的叶片电导率、更低的MDA含量和可溶性糖含量增加。结果表明StC3H14基因及其所编码的蛋白对植物的冷胁迫抗性具有重要的作用。本发明所提供的StC3H14蛋白及其编码基因在提高植物耐冷研究中具有重要的应用价值。本发明将在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

附图说明

图1为马铃薯转基因植株的PCR检测结果图。(A)为过表达转基因植株PCR鉴定。(B)为干扰转基因植株PCR鉴定，其中M为DNA分子Marker，W为水的空白对照，P为载体质粒，WT为野生型材料，OE1-10为过表达转基因材料，R1、4、5等为干扰转基因材料。

图2为StC3H14基因在过表达转基因马铃薯植株、野生型植株(WT)中和干扰转基因马铃薯植株中的表达量。结果表明在过表达转基因植株OE-4、OE-7、OE-8中StC3H14基因的表达量与野生种(WT)相比显著提高，而在干扰转基因植株RNAi-10、RNAi-11、RNAi-24中StC3H14基因的表达量与野生种(WT)相比显著降低。

图3为转StC3H14马铃薯过表达植株、野生型植株和干扰植株在冷胁迫下的生长情况，马铃薯植株的冷胁迫处理6h及恢复后植株生长状态见图3中A，处理6h后马铃薯植株的叶片电导率测定结果见图3中B。

图4为转StC3H14马铃薯过表达植株、野生型植株和干扰植株在冷胁迫下相关生理指标的含量。图4A为丙二醛(MDA)含量的测定，图4B为可溶性糖含量的测定。其中Control为空白对照，Cold为4℃冷胁迫处理2天。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例采用GraphPad Prism 9统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用One-way ANOVA检验，ns表示无显著性差异，P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异。

实施例1、StC3H14蛋白在提高植物耐寒性中的应用

一、与马铃薯耐寒相关蛋白StC3H14及其编码基因的获得

实验材料：马铃薯野生品种Solanum commersonii无菌苗展开叶叶片取下，液氮速冻，-80℃保存。

克隆载体pMD19-T为宝生物工程(大连)公司产品，产品目录号为6013。载体pBWA(V)KS-ccDB-3×flag和pBWA(V)KS-RNAi为武汉伯远生物科技有限公司产品。植物总RNA提取试剂盒全式金(TransGen Biotech，北京)的Transzol植物总RNA提取试剂盒(目录号：ET101)。PrimeScript RT Kit试剂盒为TaKaRa(宝生物(工程)有限公司，大连)公司的产品(目录号：RR047)。

1、cDNA模板的获得

用植物总RNA提取试剂盒提取马铃薯野生品种Solanum commersonii的幼嫩叶片的总RNA，将该总RNA用QuantScript RT Kit Quant cDNA Kit反转录出第一链cDNA。

2、以步骤1获得的cDNA为模板，根据同源克隆方法设计特异引物1和2进行PCR扩增，将扩增片段和克隆载体pMD19-T连接，得到重组质粒2。将重组质粒2进行测序，获得StC3H14片段的核苷酸序列。

引物1：5｀-ATGGATTTCAGAAAAAGGACTAGA-3｀，

引物2：5｀-TCACTCTCCTGTTTTCCGCAA-3｀。

3、根据测序结果获得StC3H14 基因的核苷酸序列。StC3H14基因的编码序列(CDS)为序列表中序列1的第1-885位核苷酸；基因编码的蛋白命名为StC3H14，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2；序列表中序列2由294个氨基酸残基组成。

序列1(SEQ ID No.1,885bp)具体如下：

5｀-ATGGATTTCAGAAAAAGGACTAGAAATGATGTTGGTGCTAATGTTAATGGCGGTGTGAAGAAATATAAGCCAGAAATGGACTCAATATCAGGTGGTGTAGGCAGCAAATCAAAGCCATGCACGAAGTTCTTCAGCACTGCTGGATGCCCCTTTGGTGAGAGCTGCCATTTCCTTCATTACGTCCCTGGTGGCTATAGTGCAGTGACCCAGATGATGAAATTGACACCAGCTCCATCTTTGAGAAATGCTGCAGCTCCCCCTAATTCCAATGGAAATGCTCCTTCTATGAAAACCAAACTTTGCAACAAATTCAACACGGCGGAGGGATGCAAATTTGGAGATAAATGCAATTATGCTCATGGGGAGTGGGAAATTGGAAAGCATACCATTCCTTCACAAGAGGATCCACGTGCAATGGGGTTTGGATCTATGCCAGGTCGTTTTGGTGGTGGGCGGGGGGAACCTGCTATCTCAGGACCTGCTGCTAGCTTTGGTACATCAGCCACTGCAAAGATCAGTGTGGATGCTTCCCTGGCCGGAGCCATCATTGGGAAGGGTGGAGTGAATTCTAAACAGATTTGTAGGCAGACAGGAGCCAAGCTGGCAATCCGTGATCATGAAACAGATGCAAATCTCCGAAACATAGAGTTAGAGGGCACGTTTGAACAAATTTCCCAGGCCAGTGCCATGGTAAGGGAGTTGATCAACAGCCTTGGTCCTGTAGGTGGCCCTGGAAGAACACATGGAAATTCTGGTGGCCCGGCTCCTCCAATGAACAACCTCAAGACAAAGTTGTGTGAGAATTTTGCTAAAGGATCTTGCACATTTGGAGACAGGTGCCACTTTGCTCATGGTGCTGCTGAATTGCGGAAAACAGGAGAGTGA-3｀。

序列2(SEQ ID No.2 294aa)具体如下：

MDFRKRTRNDVGANVNGGVKKYKPEMDSISGGVGSKSKPCTKFFSTAGCPFGESCHFLHYVPGGYSAVTQMMKLTPAPSLRNAAAPPNSNGNAPSMKTKLCNKFNTAEGCKFGDKCNYAHGEWEIGKHTIPSQEDPRAMGFGSMPGRFGGGRGEPAISGPAASFGTSATAKISVDASLAGAIIGKGGVNSKQICRQTGAKLAIRDHETDANLRNIELEGTFEQISQASAMVRELINSLGPVGGPGRTHGNSGGPAPPMNNLKTKLCENFAKGSCTFGDRCHFAHGAAELRKTGE。

二、重组质粒的构建

A、重组质粒pBWA(V)KS-ccDB-StC3H14-3×flag的构建

1、人工合成序列表的序列1的自5′末端起第1-882位所示的双链DNA分子。以该双链DNA分子为模板，以引物3和引物4进行PCR扩增，回收得到两端含有重组臂的双链DNA分子(片段1)。

片段1的序列：

引物3：5｀-AACACGGGGGACTTTGCAACATGGATTTCAGAAAAAGGACTAGAA-3｀，

引物4：

2、完成步骤1后，用限制性内切酶BsaI-(Eco31I)酶切载体pBWA(V)KS-ccDB-3×fla g，回收约9458bp的载体骨架2。

载体骨架2的序列：

3、将片段1与载体骨架2利用同源重组克隆酶(Hieff Clone Universal One StepCl oning Kit，YEASEN公司)连接，50℃连接20mins，得到重组质粒pBWA(V)KS-ccDB-StC3H14-3×flag。将目的质粒转化大肠杆菌Trans1-T1(购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为CD501-02)，37℃培养20h，进行重组载体的PCR分析和酶切鉴定，并进行测序验证。测序结果表明，pBWA(V)KS-ccDB-StC3H14-3×flag是在载体pBWA(V)KS-ccDB-3×flagp的插入核苷酸序列是序列表中序列2自5′端第1位-第882位的StC3H14基因，保持pBWA(V)KS-ccD B-3×flag的其他核苷酸不变得到的StC3H14基因表达载体。

B、重组质粒pBWA(V)KS-StC3H14-RNAi的构建

1、人工合成名称为片段1(tgtF)、片段2(loop)和片段3(tgtR)的双链DNA分子。

片段1(tgtF)的核苷酸序列为：

其中，带虚下划线的核苷酸为与下述载体骨架2一致的同源臂。带双下划线的核苷酸为序列1的第1-282位。

片段2(loop)：

5｀-AAATGCTCCTCCTGCAGGTCTAGTTTTTCTCCTTCATTTTCTTGGTTAGGACCCTTTTCTCTTTTTATTTTTTTGAGCTTTGATCTTTCTTTAAACTGATCTATTTTTTAATTGATTGGTTATGGTGTAAATATTACATAGCTTTAACTGATAATCTGATTACTTTATTTCGTGTGTCTATGATGATGATGATAGTTACAGAGCCCGGGCAGGAGCA TTT-3｀。其中，带单下划线的核苷酸为与下述片段3(tgtR)一致的同源臂。

片段3(tgtR)：

其中，带单下划线的核苷酸为与上述片段2(loop)一致的同源臂，带波浪线的核苷酸为与下述载体骨架2一致的同源臂。

2、完成步骤1后，用限制性内切酶BsaI(Eco31I)单酶切载体pBWA(V)KS-RNAi，回收约8571bp的pBWA(V)KS-RNAi载体骨架。pBWA(V)KS-RNAi载体骨架的核苷酸序列序列：

3、将片段1、2、3与载体骨架2利用同源重组克隆酶(Hieff Clone Universal OneStep Cloning Kit，YEASEN公司)连接，50℃连接20mins，得到重组质粒pBWA(V)KS-StC3H14-RNAi。将目的质粒转化大肠杆菌Trans1-T1(购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为CD501-02)，37℃培养20h，进行重组载体的PCR分析和酶切鉴定，并进行测序验证。测序结果表明，pBWA(V)KS-StC3H14-RNAi是在载体pBWA(V)KS-StC3H14-RNAi的5-｀AACACGGGGGACTTTGCAACTGTAACTAGCTCTGTCTTCA-3｀的第26和27位核苷酸之间插入片段1(tgtF)、片段2(loop)和片段3(tgtR),得到的StC3H14的RNAi载体。

三、马铃薯转基因植株的获得

1、将重组质粒pBWA(V)KS-StC3H14-3×flag和pBWA(V)KS-StC3H14-RNAi分别单独转化根癌农杆菌GV3101，得到重组农杆菌，将重组农杆菌分别命名为GV3101/pBWA(V)KS-StC3H14-3×flag和GV3101/pBWA(V)KS-StC3H14-RNAi。

2、农杆菌的培养：活化农杆菌菌液后挑取单菌落接种于50mL的已加入对应抗生素的LB液体培养基(Kan 50μg/L+Rif 50μg/L)中，28℃下200rpm振荡培养，直到OD600值在0.6-0.8。5000rpm离心并去上清液，用适量体积的MS液体培养基(coolaber,货号PM10101)重悬菌体，重悬液OD600约为0.8。

3、侵染及共培养：取预培养2天的马铃薯植株为栽培品种Désirée的野生型植株(WT)茎段分别放置于上述制备好的GV3101/pBWA(V)KS-StC3H14-3×flag和GV3101/pBWA(V)KS-StC3H14-RNAi农杆菌菌液中，置于28℃，80rpm下轻轻摇晃15min，用镊子从离心管中取出茎段，放于滤纸将茎段残留的液体吸干后，将茎段置于共培养培养基上。注意相互间隔，锡箔纸包裹后，22℃下共培养2天。

共培养培养基配置方案为：MS20固体培养基+2mg/L NAA+1mg/L 6-BA，pH＝5.8。

4、愈伤诱导培养：将共培养后的茎段轻轻转移并平铺在含有1mg/L玉米素(ZT)、300mg/L头孢霉素(CS)和0.1mg/L 1-萘乙酸(NAA)的MS固体培养基上的滤纸上，27±1℃的黑暗条件下进行愈伤诱导培养。之后每周更换1次诱导培养基。

5、抗性筛选：待选择培养2周后将在诱导出愈伤组织的茎段转移到含有1mg/L玉米素(ZT)、300mg/L CS和50mg/L Kan的MS固体培养基上进行抗性愈伤的筛选，每两周更换一次培养基，直至诱导出芽。剪下转至含有300mg/L CS的MS固体培养基中进行生根培养，培养条件为27±1℃、每天13h光照、光照强度为3000Lx。

6、拟转基因植株的获得：将上步诱导出芽的茎段剪下转至含有300mg/L CS的MS固体培养基中进行生根培养，27±1℃、每天13h光照、光照强度为3000Lx条件下培养4周左右，直到生根生出完整的拟转基因植株。将GV3101/pBWA(V)KS-StC3H14-3×flag介导的拟转基因植株命名为StC3H14基因拟转基因植株，将GV3101/pBWA(V)KS-StC3H14-RNAi介导的拟转基因植株命名为干扰拟转基因植株。

四、马铃薯转基因植株的鉴定

转基因植株的鉴定：过表达StC3H14基因和干扰转基因株系的鉴定均使用PCR检测的方法。利用CTAB法分别提取拟转基因植株(StC3H14基因拟转基因植株和干扰拟转基因植株)和野生型甘薯Désirée植株的基因组DNA，对其进行PCR检测，同时分别以pBWA(V)KS-StC3H14-3×flag和pBWA(V)KS-StC3H14-RNAi载体质粒DNA为阳性对照，水和野生型植株DNA为阴性对照，以引物9、引物10进行过表达转基因植株PCR鉴定；引物9和引物11进行干扰转基因植株PCR鉴定。

引物9：5｀-TCATTTGGAGAGAACACGGG-3｀，

引物10：5｀-CTCTCCTGTTTTCCGCAA-3｀，

引物11：5｀-GAGAAAAGGGTCCTAACCAAGA-3｀。

将扩增得到的PCR产物在1％(w/v)的琼脂糖凝胶中进行电泳分离，过表达转基因PCR阳性植株应该具有一条特异的900bp左右的电泳条带，干扰转基因PCR阳性植株应该具有一条特异的300bp左右的电泳条带，记录下PCR阳性植株的株系号，即确定为过表达StC3H14基因的转基因株系。引物9和引物10的PCR产物为750bp-1000bp条带的StC3H14基因拟转基因植株为过表达StC3H14基因植株，其编号为OE2、OE4、OE5、OE7、OE8、OE9。采用无性繁殖的方法扩繁过表达StC3H14基因的植株OE4、OE7、OE8，由同一株转基因幼苗扩繁得到的植株作为一个株系，得到过表达StC3H14基因株系OE4、OE7、OE8。

引物9和引物11的PCR产物为300bp左右条带的干扰拟转基因植株为干扰转基因植株，其编号为R1、R4、R7、R10、R11、R24。采用无性繁殖的方法扩繁干扰转基因植株R10、R11和R24，由同一株转基因幼苗扩繁得到的植株作为一个株系，得到干扰转基因株系R10、R11和R24。

实验结果见图1。其中M为DNA分子Marker，W为水的空白对照；P为载体质粒；WT为野生型材料；OE1-10为StC3H14基因拟转基因植株；R1、4、5等为干扰转基因材料。结果表明，OE2、OE4、OE5、OE7、OE8、OE9为过表达StC3H14转基因阳性植株；R1、R4、R7、R10、R11、R24为干扰StC3H14转基因阳性植株。

之后用TroZol试剂盒提取野生型和所有的转基因株系整株的RNA，用qRT-PCR检测StC3H14基因的表达量，试剂盒SYBR Premix Ex Taq为TaKaRa(宝生物(工程)有限公司，大连)公司的产品(目录号：RR420)，引物12和引物13用于表达量的分析。

引物12：5｀-TTCATTACGTCCCTGGTGGC-3｀，

引物13：5｀-GGAGCTGCAGCATTTCTCAA-3｀。

实验结果见图2中，结果表明在过表达转基因植株OE4、OE7、OE8中StC3H14基因的表达量与野生种(WT)相比显著提高，而在干扰转基因植株RNAi10、RNAi11、RNAi24中StC3H14基因的表达量与野生种(WT)相比显著降低。

二、转StC3H14基因马铃薯植株耐冷性的鉴定

1、耐冷性鉴定

马铃薯植株为栽培品种Désirée的野生型植株(WT)、过表达StC3H14基因株系OE4、OE7、OE8以及干扰转基因株系R10、R11和R24。

实验重复三次，每次重复的步骤如下：

(1)取生长4周左右大小的试管苗种植于装有人工土壤(由1体积份蛭石和1体积份营养土混合而成)的小花盆中，每个株系种植3株。

(2)完成步骤(1)后，放置于光照培养箱中适应培养4周左右(22±1℃，16h光照/8h黑暗)。

(3)完成步骤(2)后，将上步培养4周大小的植株置于-3℃的光照培养箱低温处理6h，取其叶片用于后续电导率测定实验。处理完后重新置于正常培养条件下进行恢复处理(22±1℃，16h光照/8h黑暗)。

马铃薯植株的冷胁迫处理6h及恢复后植株生长状态见图3中A，处理6h后马铃薯植株的叶片电导率测定结果见图3中B。结果表明，冷胁迫处理后，过表达StC3H14转基因马铃薯相较野生型植株和干扰转基因植株的生长状态良好，其叶片电导率相比野生型植株和干扰转基因植株明显降低，说明在马铃薯中过表达StC3H14基因可明显增强马铃薯的耐冷性。

2、生理生化指标的测定

(1)丙二醛(MDA)含量的测定

植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，MDA是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度，即MDA的含量越高，植物遭受逆境伤害的程度越大。

参考文献(He SZ，Han YF，Wang YP，Zhai H，Liu QC.In vitro selection andide ntification of sweetpotato(Ipomoea batatas(L.)Lam.)plants tolerant toNaCl.Plant Cell Tissue Organ Cult，2009，96：69-74)的方法，检测马铃薯植株的MDA含量。马铃薯植株为步骤2空白对照的马铃薯植株或步骤2中4℃冷胁迫处理2天的马铃薯植株。实验需重复三次，结果取平均值。

实验结果见图4中A(Control为空白对照，Cold为4℃冷胁迫处理2天)，结果表明，过表达StC3H14转基因马铃薯植株中MDA含量显著低于对照植株和干扰转基因植株。

(2)可溶性糖含量的测定

植物在正常条件下，可溶性糖作为重要的渗透调节物质通常含量很低，但遇到干旱、低温、盐等胁迫时，可溶性糖含量便会大量积累，并且其含量多少和植物的抗逆性有关。因此，脯氨酸可以作为植物抗逆性的一项生化指标。

参考文献(Gao S,Yuan L,Zhai H,Liu CL,He SZ,Liu QC.Transgenic sweetpotato plants expressing an LOS5 gene are tolerant to salt stress.Plant CellTissue Organ Cult 2011,107：205-213)的方法，检测马铃薯植株的可溶性含量。马铃薯植株为步骤2空白对照的马铃薯植株或步骤2中4℃冷胁迫处理2天的马铃薯植株。实验需重复三次，结果取平均值。

实验结果见图4中B(Control为空白对照，Cold为4℃冷胁迫处理2天)，结果表明，过表达StC3H14转基因马铃薯植株中可溶性糖含量显著高于对照植株和干扰转基因植株。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims

1.上调或增强或提高目的植物抗逆性的方法，其特征在于，所述方法包括通过步骤S来上调或增强或提高目的植物抗逆性，所述步骤S包括S1和/或S2；所述S1为上调或增强或提高所述目的植物中蛋白质的编码基因的表达，所述S2为上调或增强或提高所述蛋白质的活性和/或含量；

所述蛋白质为蛋白质StC3H14，为如下A1)或A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

2.培育高抗逆性植物的方法，其特征在于，所述方法包括通过步骤S来培育高抗逆性植物，所述步骤S包括S1和/或S2；所述S1为上调或增强或提高所述目的植物中蛋白质的编码基因的表达，所述S2为上调或增强或提高所述蛋白质的活性和/或含量；

所述蛋白质为蛋白质StC3H14，为如下B1)或B2)或B3)：

B1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

3.下调或抑制或降低植物抗逆性的方法，包括如下步骤：下调或抑制或降低目的植物中靶基因的表达，使植物抗逆性下调或抑制或降低；所述目的植物含有所述靶基因，所述靶基因编码StC3H14，StC3H14为如下C1)或C2)或C3)：

C1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

C2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

C3)将C1)或C2)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物抗逆性相关的蛋白质。

4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述蛋白质来源于马铃薯。

5.蛋白质的应用，其特征在于，所述应用为如下任一种：

D1)所述蛋白质在调控植物抗逆性和/或制备调控植物抗逆性的产品中的应用，

D2)所述蛋白质在植物育种和/或制备植物育种产品中的应用；

所述蛋白质为蛋白质StC3H14，为如下E1)或E2)或E3)：

E1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

6.生物材料的应用，其特征在于，所述应用为如下任一种：

F1)生物材料在调控植物抗逆性和/或制备调控植物抗逆性的产品中的应用，

F2)所述生物材料在植物育种和/或制备植物育种产品中的应用；

所述生物材料为下述任一种：

G1)编码权利要求4中所述蛋白质的核酸分子；

G2)含有G1)所述核酸分子的表达盒；

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述蛋白质来源于马铃薯。

8.根据权利要求1-4所述的方法或权利要求5-7所述的应用，其特征在于，所述抗逆性为耐冷性。

9.根据权利要求1-4所述的方法或权利要求5-7所述的应用，其特征在于，所述植物是如下任一种：

H1)双子叶植物，

H2)管状花目植物，

H3)茄科植物，

H4)茄属植物，

H5)马铃薯。

10.产品，其特征在于，所述产品为权利要求1中所述的蛋白质或权利要求2中所述的生物材料。