CN115058433A - 一种烟叶落黄调控基因NtMYB2、蛋白及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种烟叶落黄调控基因NtMYB2、蛋白及其应用。烟草NtMYB2基因受烟草叶龄调控，在落黄的烟叶中表达量较高。与K326相比，烟草NtMYB2基因过表达烟草植株表现出烟叶落黄时间较早的早衰表型。烟草NtMYB2基因在烟草落黄调控过程中发挥重要作用，可应用于烟叶落黄的基因功能研究和基因工程育种。
Description
技术领域
本发明属于烟草基因工程技术领域，具体涉及一种与烟叶落黄相关的烟草NtMYB2基因、蛋白及其在调控烟叶落黄中的应用。
背景技术
烟草是重要经济作物，叶片是其收获器官，随着烟草进入生育后期，叶片进入落黄阶段，烟草上部、中部、下部叶片成熟时期不相同，通常，生产上采用不同部位不同时期采收的策略完成，拖延了采收时间，另一方面，环境因素如接近采收时期连续雨天可能会造成烟叶“二次返青”影响采收。因此，利用基因工程技术，可以调控烟叶落黄时间，有效解决不同部位烟草叶片成熟度不一致及返青问题。
目前，在植物中，MYB转录因子家族是植物转录因子家族中较大的一类家族，其含有高度保守的DNA结合域，是由50-52个氨基酸为一个重复单元的肽段。MYB转录因子家族成员在植物生物与非生物胁迫、次生代谢和生长发育中起重要作用。目前，没有MYB转录因子在烟叶落黄上的研究和应用。
在烟叶生产中，烟草叶片落黄通过改变光合作用的持续时间或者通过改变营养物质的转移效率来影响产量。烟叶落黄过程中营养物质的消耗、转运和转化会对烟叶的产量和品质起决定性作用。
利用基因工程技术，从烟草中鉴定出烟叶落黄相关调控基因并将其应用到烟草分子育种中，对于保证烟叶的品质和产量具有重要的意义。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一个调控烟叶落黄的烟草NtMYB2基因，利用烟叶落黄相关的NtMYB2基因所构建的重组过表达载体转化烟草，提高NtMYB2基因表达量进而能够调控烟叶落黄时间，从而为品种选育提供育种中间材料。
一种烟叶落黄调控基因NtMYB2，基因CDS序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步的，所述的基因序列还包括相似性不低于95％的具有类似功能的基因序列；所述的类似功能包括调控烟叶落黄。
进一步的，所述的调控烟叶落黄包括调控烟叶落黄时间。
本发明的第二个目的是提供一种烟叶落黄调控蛋白，蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步的，所述的蛋白序列还包括相似性不低于95％的具有类似功能的蛋白序列；所述的类似功能包括调控烟叶落黄。
进一步的，所述的调控烟叶落黄包括调控烟叶落黄时间。
本发明的第三个目的是提供所述的烟叶落黄调控基因NtMYB2用于调控烟叶落黄的应用。
进一步的，所述的烟叶落黄调控基因NtMYB2用于调控烟叶落黄的时间。
进一步的，通过过表达烟叶落黄调控基因NtMYB2，获得烟叶落黄时间提前的烟草转化植株。
进一步的，过表达烟叶落黄调控基因NtMYB2的载体为双元农杆菌载体pCHF3。
构建重组表达载体时，将NtMYB2基因CDS碱基序列插入花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子之后。
所述转化烟草为使用含有重组过表达载体的农杆菌侵染烟草愈伤组织，利用农杆菌介导的转化方法，将花椰菜花叶病毒35S启动子和烟草NtMYB2基因整合进烟草基因组。在烟草内，通过对NtMYB2基因过表达，使烟叶落黄时间提前。
本发明首次在烟草中完成了NtMYB2基因的克隆、表达和功能分析，分析结果表明该基因与烟草的烟叶落黄相关。在烟草中，过表达NtMYB2基因使烟叶落黄时间明显提前，从而为品种选育提供育种中间材料。
附图说明
图1烟草NtMYB2基因克隆PCR扩增产物电泳图；
图1中M为2000bp DNA maker；1为NtMYB2基因扩增结果；2为阴性对照；
图2烟草NtMYB2基因在烟叶发育过程中的表达模式分析；
图2中S1为幼嫩烟草叶片；S2为成熟叶片；S3为开始落黄的叶片；S4为充分落黄的叶片；
图3烟草NtMYB2基因过表达植株中NtMYB2的表达量分析；
图4烟草NtMYB2基因过表达植株和K326对照的烟叶落黄情况分析；
图5烟草NtMYB2基因过表达植株和K326对照的烟叶生理指标分析。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，而不会形成对本发明的限制，在介绍具体实施例前，就下述实施例中所涉及部分生物材料、实验试剂、实验仪器等基本情况简要介绍如下。
生物材料：
烟草材料，栽培烟草(Nicotiana tabacum)品种K326保存于本实验室。过量表达烟草基因所用到的载体质粒pCHF3保存于本实验室，载体构建方法参考文献(https://www.mdpi.com/2073-4409/8/1/50)。
实验试剂：
本实验开展过程中所使用的试剂及试剂盒如下：限制性内切酶购于NEB(北京)有限公司；RNA提取TRIzol试剂盒购于康为世纪生物科技有限公司；高保真DNA扩增酶、反转录试剂盒和荧光定量试剂盒购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司；DNA凝胶回收试剂盒MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit、质粒DNA小量纯化试剂盒MiniBEST Plasmidpurification Kit购买于Invitrogen公司；卡那霉素、利福平等抗生素购于上海生工生物工程有限公司。
实施例1
本实施例主要就NtMYB2基因的鉴定和克隆过程简要介绍说明如下。
1、总RNA提取
采用康为世纪公司的TRIzol试剂提取法提取RNA，具体步骤如下：在正常生长条件下，生长4周的栽培烟草K326取材后迅速在液氮中研磨成粉末状，每30-50mg组织加入1mlTRIzon Reagent(cwbiotech)，混匀；室温放置5min后，加入200μl氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置2min。4℃12,000rpm离心10分钟，小心取出上层水相，转入另一离心管中，加入等体积的70％乙醇。将混合液全部转移到吸附柱中，12,000rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液，加入700μl Buffer RW1，12,000rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液。加入500μl Buffer RW2，12,000rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液。空离2min，倒掉收集管中的废液，室温放置5min，加入30μl水，室温放置1分钟，12,000rpm离心1分钟，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。所提RNA经DNA酶(Fermentas)处理。
2、反转录反应
反转录步骤采取诺唯赞公司R323试剂盒，具体步骤如下：取1μg K326总RNA进行反转录，加入4×gDNA wiper Mix 4μl，加入去离子水补足到16μl；42℃保温2min后，加入4μl的5×HiScript III qRT SuperMix，反应终体积为20μl；37℃反应15min，85℃加热5s终止反应。获得的cDNA在-20℃保存。
3、NtMYB2基因的鉴定与克隆
通过分析烟草叶片落黄前后的转录组数据，发现一个在烟草叶片落黄过程中表达量显著上调的烟草基因NtMYB2。烟草NtMYB2基因在茄科基因组网站中烟草基因组数据库
(ftp://ftp.solgenomics.net/genomes/Nicotiana_tabacum/edwards_et_al_2017)登录号为Nitab4.5_0000465g0070.1，该基因被注释编码一种MYB型转录因子，具体功能未知。
PCR扩增参考了Clontech公司的In-fisuon方法，人工合成一对引物，并在其5’和3’端分别加上20bp载体序列，载体序列为F:5′-AGAACACGGGGGACGAGCTC-3′，如SEQ ID NO.3所示；R:5′-GATCCCCGGGTACCGAGCTC-3′，如SEQ ID NO.4所示。
上游引物及下游引物如下：
NtMYB2-F：5′-ATGAATATTTGTACTAATAAG-3′，如SEQ ID NO.5所示，
NtMYB2-R：5′-GAAAAGTGGCATTTCCTCATG-3′，如SEQ ID NO.6所示；
以上述K326品种整株烟草幼苗cDNA作为模板，以NtMYB2-F和NtMYB2-R为引物，采用高保真2×Phanta Max Master Mix(Dye Plus)(Vazyme)进行PCR扩增；50μl反应体系设计如下：
反应程序:95℃，3min预变性；95℃，15s；56℃，15s；72℃，1min；35个循环，最后72℃延伸5min；反应结束后，电泳检测PCR结果(图1)。电泳后，在紫外光照射下进行切胶回收，利用凝胶回收试剂盒(TAKARA)回收目的基因片断。对所回收扩增产物进行测序，即为NtMYB2基因核苷酸序列，由609bp组成。其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例2
烟草叶片不同发育时期NtMYB2基因表达模式分析
本实施例选用烟草栽培品种K326植株进行烟草NtMYB2基因在烟草叶片不同发育时期的表达模式分析。取烟草栽培品种K326植株尚未发育完全叶片、已经发育完全但未落黄叶片、已经发育完全且部分落黄叶片和已经发育完全且充分落黄叶片，分别代表幼嫩叶片S1、成熟叶片S2、开始落黄叶片S3和充分落黄叶片S4。并按照实施例1所述的方法提取RNA。提取的RNA经反转录得到cDNA，并以cDNA为模板，利用NtMYB2的特异引物进行实时定量PCR检测，引物序列如下：
前端引物F:CACTTATTGCTGGTAGACTTCCTG，如SEQ ID NO.7所示，
末端引物R:TTGCTTTTTGCTTGCTCTCCTTTT，如SEQ ID NO.8所示，
结果显示，烟草NtMYB2基因的表达量在烟草叶片落黄后显著上调(图2)，NtMYB2基因在烟叶充分落黄时期S4的表达量是幼嫩叶片时期S1的45.7倍。
实施例3
利用实施例1所获得NtMYB2基因，发明人进一步构建了转化用的过表达载体pCHF3-NtMYB2，相关过程简要介绍如下。
首先将实施例1所获得NtMYB2基因与经Sac I酶切后的pCHF3质粒进行连接，参照Clontech公司的In-fusion无缝连接说明书，按试剂盒要求建立连接10μL的反应体系如下：5x in-fusion 2μl；pCHF3(Sac I酶切)4μl；NtMYB2基因扩增产物4μL；50℃,15min，放冰上，用于下一步的转化。采用热激法，将上述连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，具体过程为：无菌条件下取2μl连接产物加到感受态细胞中，轻轻混匀后冰浴30min；42℃热激90s，将离心管迅速转到冰浴中放置2-3min；加无抗生素的LB培养基800μl，37℃摇床温和摇振1h左右；取200μl培养液涂于含壮观霉素100μg/ml的LB固体培养基上，37℃倒置培养12-16h。
挑取培养基中长出白色菌斑，分别接种于含有100μg/ml壮观霉素的LB液体培养基中振荡培养12-16h，用自身引物和载体引物进行PCR验证，引物序列如下：
自身引物：CGGCCTCGAACCTTCTCAAA，如SEQ ID NO.9所示；
载体引物：GTGTGTGCGCAATGAAACTG，如SEQ ID NO.10所示；
结果正确的阳性克隆进一步送公司测序，以确保重组质粒构建正确。
实施例4
利用热激法，将实施例3所制备pCHF3-NtMYB2载体转化农杆菌GV3101(购于北京全式金生物技术有限公司)，挑选单菌落进行PCR验证，以确定表达载体pCHF3-NtMYB2成功转化农杆菌。
转化烟草植株：
采用农杆菌介导叶盘转化法获得转基因烟草植株，具体步骤如下：
1.无菌苗培养：取适量K326种子，用75％酒精表面消毒30秒，无菌水清洗3次，再用15％双氧水浸泡8分钟，无菌水清洗3次后浸泡在无菌水中24小时。经消毒的种子点播在MS培养皿上，待长出3片小叶后将幼苗转移到含有MS的组培瓶中培养，在人工气候室培养45天左右，选择生长健壮的叶片进行农杆菌侵染。
2.农杆菌侵染：取出经鉴定正确保存的农杆菌菌液，待完全融化后吸取500uL于相应抗性的50mL YEP液体培养基中，于28℃/220rpm培养至OD600为0.6。取50mL菌液，4000rpm离心10分钟，去上清。收集菌体，并重悬至OD600为0.6，然后加入终浓度为20mg/L的AS，用于侵染。将无菌苗的叶片边缘剪掉，沿主叶脉将叶片剪成1cm2的叶盘放入农杆菌侵染液中侵染5分钟。
3.共培养与继代培养：将侵染的叶片捞出，用滤纸吸干农杆菌，叶面朝下平铺在共培养基上，放入人工气候室，黑暗培养3天。S1继代：将共培养3天的叶片叶面朝上转移到S1分化培养基中，在人工气候室黑暗培养1周左右转移至光照下继续培养，至叶片边缘长出0.5cm左右的丛芽。S2继代：将S1上长出的丛芽转移到S2分化培养基上，去除未长出丛芽的叶片部分，光照培养2周待丛芽长成幼苗。S3继代：将S2上的小苗转移到S3分化培养基上，光照培养2周。生根培养：去除小苗底部膨大部分和发黄的叶片，转移小苗至含有生根培养基组培瓶中，光照培养2周。
4.转基因烟草的获得：待小苗生出8条左右、长约3cm的根时，打开培养瓶的盖子进行炼苗。3天后将幼苗转移到装有无菌土的花盆中，盖上塑料膜保温。一周后去除保鲜膜，使其在自然条件下快速生长。
5.转基因烟草的阳性鉴定：按照实施例1中的方法提取所获得的转基因烟草总RNA，经反转录得到cDNA。利用实施例2中NtMYB2基因的特异引物进行实时定量PCR检测。结果显示，和对照相比，NtMYB2基因过表达烟草植株1(OE1)和过表达烟草植株5(OE5)，两个转基因烟草株系中NtMYB2基因的表达量均显著上调，分别为对照的45.3倍和55.0倍(图3)。
烟叶落黄表型鉴定
将上述转pCHF3-NtMYB2烟草的阳性植株OE1和OE5转移至温室培养，自交，收集转基因种子。同时以转pCHF3空载体的烟草为对照，用于后续的烟叶落黄表型鉴定。
观察烟草叶片落黄情况。如图4所示，和对照相比，NtMYB2基因过表达烟草植株具有明显的叶片落黄提前表现。同时，利用乙醇法测定NtMYB2基因过表达烟草植株及对照K326烟草叶片叶绿素含量。如图5A所示，与对照K326烟草叶片(0.835μg/mg)相比，NtMYB2基因过表达植株OE1和OE5烟叶中叶绿素含量(0.435μg/mg和0.365μg/mg)均明显下降。进一步，利用电导仪测量NtMYB2基因过表达烟草植株和对照K326烟草叶片的离子渗透率。如图5B所示，与对照K326烟草叶片(31.3％)相比，NtMYB2基因过表达烟草植株OE1和OE5烟草叶片离子渗透率(17.6％和13.3％)均明显下降。综合上述表型数据和生理生化数据，在烟草中过表达NtMYB2基因使烟叶落黄时间明显提前。
序列表
<110> 湖南中烟工业有限责任公司
<120> 一种烟叶落黄调控基因NtMYB2、蛋白及其应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 609
<212> DNA
<213> 烟草(Nicotiana tabacum)
<400> 1
atgaatattt gtactaataa gtcgtcgtca ggagtgaaga aaggtgcatg gactgaagaa 60
gaagatgttc tattgaaaaa atgcatcgag aaatatggag aaggaaaatg cagaaagagc 120
tgcagattaa ggtggctaaa ttatctaagg ccacatataa agagaggaga cttctctttt 180
gatgaagtag atctcatttt gaggcttcat aagctatggt cacttattgc tggtagactt 240
cctggaagga cggcaaacga tgtcaaaaac tactggaaca gccatcttcg caagaagtta 300
attgctcctc atgatcaaaa ggagagcaag caaaaagcaa agaagatcac catattcaga 360
cctcggcctc gaaccttctc aaagacaaat acttgtgtta aaagtaacac aaatactgta 420
gataaggata ttgaaggcag cagcgaaata attagattca acgataattt gaagccaaca 480
actgaagaat tgacggatga tggaattcaa tggtgggccg atttactagc taacaattac 540
aacaataatg ggattgagga agctgataat tcatcaccaa ctttgttgca tgaggaaatg 600
ccacttttc 609
<210> 2
<211> 203
<212> PRT
<213> 烟草(Nicotiana tabacum)
<400> 2
Met Asn Ile Cys Thr Asn Lys Ser Ser Ser Gly Val Lys Lys Gly Ala
1 5 10 15
Trp Thr Glu Glu Glu Asp Val Leu Leu Lys Lys Cys Ile Glu Lys Tyr
20 25 30
Gly Glu Gly Lys Cys Arg Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Leu Asn Tyr
35 40 45
Leu Arg Pro His Ile Lys Arg Gly Asp Phe Ser Phe Asp Glu Val Asp
50 55 60
Leu Ile Leu Arg Leu His Lys Leu Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Leu
65 70 75 80
Pro Gly Arg Thr Ala Asn Asp Val Lys Asn Tyr Trp Asn Ser His Leu
85 90 95
Arg Lys Lys Leu Ile Ala Pro His Asp Gln Lys Glu Ser Lys Gln Lys
100 105 110
Ala Lys Lys Ile Thr Ile Phe Arg Pro Arg Pro Arg Thr Phe Ser Lys
115 120 125
Thr Asn Thr Cys Val Lys Ser Asn Thr Asn Thr Val Asp Lys Asp Ile
130 135 140
Glu Gly Ser Ser Glu Ile Ile Arg Phe Asn Asp Asn Leu Lys Pro Thr
145 150 155 160
Thr Glu Glu Leu Thr Asp Asp Gly Ile Gln Trp Trp Ala Asp Leu Leu
165 170 175
Ala Asn Asn Tyr Asn Asn Asn Gly Ile Glu Glu Ala Asp Asn Ser Ser
180 185 190
Pro Thr Leu Leu His Glu Glu Met Pro Leu Phe
195 200
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agaacacggg ggacgagctc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gatccccggg taccgagctc 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgaatattt gtactaataa g 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaaaagtggc atttcctcat g 21
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cacttattgc tggtagactt cctg 24
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttgctttttg cttgctctcc tttt 24
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cggcctcgaa ccttctcaaa 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gtgtgtgcgc aatgaaactg 20
Claims (10)
1.一种烟叶落黄调控基因NtMYB2，其特征在于，基因CDS序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的烟叶落黄调控基因NtMYB2，其特征在于，所述的基因序列还包括相似性不低于95％的具有类似功能的基因序列；所述的类似功能包括调控烟叶落黄。
3.根据权利要求2所述的烟叶落黄调控基因NtMYB2，其特征在于，所述的调控烟叶落黄包括调控烟叶落黄时间。
4.一种烟叶落黄调控蛋白，其特征在于，蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。
5.根据权利要求4所述的烟叶落黄调控蛋白，其特征在于，所述的蛋白序列还包括相似性不低于95％的具有类似功能的蛋白序列；所述的类似功能包括调控烟叶落黄。
6.根据权利要求5所述的烟叶落黄调控蛋白，其特征在于，所述的调控烟叶落黄包括调控烟叶落黄时间。
7.权利要求1或2或3所述的烟叶落黄调控基因NtMYB2用于调控烟叶落黄的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，烟叶落黄调控基因NtMYB2用于调控烟叶落黄的时间。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，通过过表达烟叶落黄调控基因NtMYB2，获得烟叶落黄时间提前的烟草转化植株。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，过表达烟叶落黄调控基因NtMYB2的载体为双元农杆菌载体pCHF3。
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Citations (1)
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| US10415052B2 (en) * | 2013-03-15 | 2019-09-17 | The Regents Of The University Of California | Tissue specific reduction of lignin |
-
2021
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Non-Patent Citations (1)
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|---|
| 陈邦兰 等: "烟草自然抗性相关巨噬细胞蛋白基因家族的鉴定与分析", 安徽农业科学 * |
Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
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| CN116751788B (zh) * | 2023-06-15 | 2024-06-14 | 湖南省烟草公司长沙市公司 | 一种烟草落黄调控基因NtRALF08、蛋白、多肽、落黄促进剂、制备方法及应用 |
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