CN110923246A

CN110923246A - 烟草NtMYB12基因及其在调控脂肪酸合成中的应用

Info

Publication number: CN110923246A
Application number: CN201911355067.6A
Authority: CN
Inventors: 王中; 杨军; 武明珠; 李锋; 谢小东; 张剑锋; 李泽锋; 罗朝鹏; 魏攀; 王晨
Original assignee: Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC
Current assignee: Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC
Priority date: 2019-12-25
Filing date: 2019-12-25
Publication date: 2020-03-27
Anticipated expiration: 2039-12-25
Also published as: CN110923246B

Abstract

本发明属于烟草基因工程领域，具体涉及一个烟草NtMYB12基因及其在调控脂肪酸合成中的应用专利申请。该基因全长2530bp，其中编码区全长1254bp，包含3个内含子和4个外显子，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。NtMYB12蛋白在细胞内定位为细胞核内，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。该转录蛋白表达量或含量升高后，脂肪酸含量降低；而降低该转录蛋白含量后，脂肪酸含量升高。发明人通过对烟草NtMYB12基因的初步研究，发现该基因与种子脂肪酸合成紧密关联。基于此，可为植株生理代理调节、新品种培育奠定良好技术基础。

Description

烟草NtMYB12基因及其在调控脂肪酸合成中的应用

技术领域

本发明属于烟草基因工程领域，具体涉及一个烟草NtMYB12基因及其在调控脂肪酸合成中的应用专利申请。

背景技术

植物中脂肪酸（Fatty acids，FA）的分布非常广泛、种类繁多、含量丰富，在植物多个生理过程中发挥着重要的功能，例如作为主要成分组成植物分泌的蜡质和植物表皮角质层，有效防止外部机械损伤、热量和水分散失及病原菌侵害；植物细胞膜脂中不饱和脂肪酸含量升高，膜脂相变温度会相应降低，从而增加细胞膜的流动性，使植物的抗寒性有所提高；脂肪酸还可以作为重要的信号分子参与信号转导过程、参与对植物生长发育的调控及对各种逆境胁迫的响应和适应；脂肪酸还是各种含油种子的子叶和胚乳中重要的存储物质，为种子萌发过程提供能量；同时植物脂肪酸是人类油脂的重要来源之一，为人类提供营养和能量。而就栽培烟草（Nicotiana tabacum L.）而言，其中的脂肪酸又可分为挥发性低级脂肪酸和半挥发性高级脂肪酸两大类，其中亚油酸和亚麻酸会增加烟叶的刺激性，而碳原子在12以上的各类高级脂肪酸则可赋予烟叶特殊的香气，对烟叶的品质和风味有重要的影响。

已有研究表明，植物脂肪酸的合成受多种因素的影响，包括转录调控、植物激素和环境因子等。而仅就转录调控而言，在不同组织结构部位所参与的转录因子类型也是不同的。

转录因子MYB12作为一种转录调控因子，已有研究多认为该转录因此能够促进类黄酮的合成，其调控功能是通过与MYB11和MYB111形成蛋白复合体，通过直接促进查尔酮合酶基因（chalcone synthase，CHS）、查尔酮异构酶基因（chalcone isomerase，CHI）、黄烷酮-3-羟化酶基因（flavonol 3-hydroxylase，F3H）、类黄酮-3’-羟化酶基因（flavonol 3’-hydroxylase，F3’H）和黄酮醇合酶基因（flavonol synthase，FLS）的表达来实现的。但近年来研究也表明转录因子MYB12具有多种调节功能，与植物的多种生理和代理调节具有高度关联。也因此，对于该基因功能的进一步深入研究，可为植物生长调控和作物新品种培育奠定一定技术基础。

发明内容

基于对烟草NtMYB12基因的初步研究，本发明的目的在提供烟草NtMYB12转录因子再脂肪酸合成中的新应用，从而为作物代谢产物调控、新品种培育奠定一定技术基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

烟草NtMYB12基因，全长2530bp，其中编码区全长1254bp，包含3个内含子和4个外显子，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

所述烟草NtMYB12基因在种子脂肪酸合成中的应用，利用基因沉默技术、基因编辑或者基因超表达方法，通过调节烟草NtMYB12基因表达量，来调节控制烟草种子中脂肪酸含量情况。

含有所述NtMYB12基因的超表达载体，以pCAMBIA1301质粒作为载体，通过与NtMYB12基因的CDS全长序列进行重组制备获得，所述NtMYB12基因的CDS全长序列，具体PCR扩增时，PCR扩增用引物序列设计为：

NtMYB12a-SpeI-F ：5’-AGAGACTAGTATGGGAAGA—GCACCTTGTTGTG-3’，

NtMYB12a-KpnI-R ：5’-TGACGGTACCAGACAAAAGCC—AAGCGACAA-3’。

针对NtMYB12基因的RNAi表达载体，以pHellsgate 2为质粒载体，以NtMYB12基因中的部分CDS序列为目标序列，构建过程中，针对NtMYB12基因中的部分CDS序列，具体PCR扩增用引物序列设计为：

NtMYB12a-R-F：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCAAGCCGACCCTCAGTAAAGA-3’，

NtMYB12a-R-R：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGCCATTCC—ATCCCACTATCTGAA-3’。

所述烟草NtMYB12基因的PCR制备方法，具体包括如下步骤：

（一）基因组提取，

（二）设计引物，并进行PCR扩增

设计特异性扩增引物对如下：

NtMYB12-F：5’-ATGGGAAGAGCACCTTGTTGTG-3’，

NtMYB12-R：5’-GACAAAAGCCAAGCGACAA-3’。

利用所述烟草NtMYB12基因的烟草新品种培育方法，通过转基因技术、瞬时表达技术或基因组编辑技术，构建含有NtMYB12基因的病毒诱导沉默载体、RNAi干涉载体、超表达载体或基因组编辑载体，转化烟草，筛选获得种子脂肪酸含量变化的烟草新品种；

具体例如：基于基因工程中相关技术，利用超表达载体pCAMBIA1301、或RNAi载体pHellsgate 2，构建获得含有NtMYB12基因中CDS序列的重组超表达载体、或者针对NtMYB12基因中CDS序列的RNAi载体，然后转化烟草植株，筛选获得种子中脂肪酸含量变化的植物新品种。

换言之，一种培育种子低脂肪含量/高脂肪酸含量含量烟草新品种培育方法，利用超表达载体pCAMBIA1301、或RNAi载体pHellsgate 2来对NtMYB12基因表达量进行调节，从而获得种子中脂肪酸含量明显变化的烟草新品种。

烟草NtMYB12基因所编码NtMYB12转录蛋白，对应NtMYB12基因中的1254bp长度的编码区，由417个氨基酸构成，该蛋白在细胞内定位为细胞核内，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

烟草NtMYB12转录蛋白在脂肪酸合成调控中的应用，该转录蛋白表达量或含量升高后，脂肪酸含量降低；而降低该转录蛋白含量后，脂肪酸含量升高。

本申请中，发明人通过对烟草NtMYB12基因的初步研究，发现其所编码的NtMYB12转录蛋白定位在细胞核内。进一步通过对该基因的沉默和超表达的功能验证，结果表明该基因与种子脂肪酸合成紧密关联。基于此，可为植株生理代理调节、新品种培育奠定良好技术基础。

附图说明

图1烟草NtMYB12的亚细胞定位分析；NLS为已知的核定位蛋白，NtMYB12-GFP融合蛋白的位置与NLS完全重合，表明该融合蛋白也定位在细胞核中；

图2不同烟草组织中NtMYB12基因的表达模式分析及其表达载体构建；（a）盛花期不同组织器官中NtMYB12基因的表达水平；（b）NtMYB12基因结构及其过表达、RNAi载体、基因编辑位点示意图；（c）过表达和RNAi中NtMYB12基因的转录水平；（d）基因编辑植株突变体的高通量测序鉴定；

图3 NtMYB12促进烟草类黄酮的合成；野生型、NtMYB12过表达、NtMYB12-RNAi和NtMYB12基因编辑突变体的花序表型（a）、花青素含量（b）、黄酮醇含量（c）和绿原酸含量含量（d）；

图4 NtMYB12抑制烟草种子中脂肪酸的合成；NtMYB12过表达、NtMYB12-RNAi和NtMYB12基因编辑突变体的种子形态（a）、种子千粒重（b）、幼苗形态（c）及种子中脂肪酸含量（d）；

图5脂肪酸代谢相关基因表达水平的qPCR鉴定。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。

生物材料：

红花大金元、K326，均为常用烟草品种材料；相关烟草材料种植于郑州烟草院种植基地，培育条件为：22℃、16h光/8h暗；

相关引物合成及测序工作，由郑州擎科生物科技有限公司合成和提供；

pMDTM18-T Vector，Takara公司；

实验试剂：

烟草RNA快速提取试剂盒（RT0110），Gene Answer公司产品；

DNaseⅠ（#E1091-01)，Omega公司产品；

PrimeScript™ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (6210A) ，TAKARA公司产品；

植物基因组DNA快速提取试剂盒（DE117），Imagene公司产品

AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AP-GX-250G) ，Axygen公司产品，

十七酸甲酯，美国AccuStandard 公司产品；

实验仪器：

NanoDrop2000 超微量分光光度计，赛默飞世尔科技有限公司；

激光共聚焦显微镜ZEISS LSM 700，Germany；

定量PCR仪LightCycler®96，Roche公司产品。

实施例1

本实施例就烟草NtMYB12基因的克隆获得过程简要介绍如下。

（一）基因组提取，并反转录为cDNA

红花大金元幼苗正常生长30天左右，采集幼苗叶片组织收获后立即用液氮速冻，经液氮充分研磨后，利用烟草RNA快速提取试剂盒（参考说明书进行操作即可）提取烟草叶片总RNA；随后用DNaseⅠ消化去除基因组DNA；最后利用琼脂糖凝胶检测 RNA的质量，并利用用Nanodrop测定RNA样品的浓度；选择质量和浓度都良好的样品进行cDNA第一链的合成（参考PrimeScript™ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书操作即可），制备cDNA样品备用。

另一方面，利用DNA快速提取试剂盒提取烟草基因组DNA备用。

（二）设计引物，并进行PCR扩增

基于现有烟草基因组数据库，设计特异性扩增引物对如下：

NtMYB12-F：5’-ATGGGAAGAGCACCTTGTTGTG-3’，

NtMYB12-R：5’-GACAAAAGCCAAGCGACAA-3’；

分别以步骤（1）中所提取DNA和所制备cDNA为模板进行PCR扩增，并将扩增得到的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳参数：130V电泳30min。

在紫外灯下将目的条带割出，装入1.5ml离心管中，利用凝胶回收试剂盒回收目的片段后，与pMDTM18-T质粒连接，10μL连接体系设计如下：

pMDTM18-T Vector (Takara) ，1μl；

所回收PCR扩增片段，02 pmol；

Solution I， 5μl；

dd-H₂O 加至10μl；

16℃连接反应过夜。

随后将全部10µl连接产物热激转化大肠杆菌感受态细胞，并挑选阳性克隆测序，对用测序正确的阳性克隆，提取质粒后-20℃保存，用于后续分析和载体构建。

基于测序结果和对测序结果的分析，可知本申请所提供的烟草NtMYB12基因，全长2530bp，其中编码区（CDS）全长1254bp，包含3个内含子和4个外显子，其碱基序列如SEQID NO.1所示，具体如下：

ATGGGAAGAGCACCTTGTTGTGAGAAAGTGGGTCTCAAAAGAGGCAGATGGACTGCAGAAGAGGATGAAATTCTCACTAAATATATTCAAACTAACGGCGAAGGCTCTTGGAGATCATTACCCAAAAATGCTGGTACGTACGACCTTAGCCTTTCCAATACCATATTCTTCTATTGAACCTCACATCCTGCAGTTAAATTTTCTTTATTTAAAGTTTATACTAATTTATTTTGTTGTGTTCTTTTGTGCTTTGAAGGCTTACTTAGATGTGGAAAGAGTTGCCGACTGAGATGGATTAATTACTTGAGGTCTGATTTGAGGAGAGGTAACATAACTTCTGAAGAGGAAGACATAATCATCAAGTTACATGCAACTTTGGGTAACAGGTATTTTCCCCAACGTAAACGACTCAATAATAGCAACTACACACTGGTAAATGAAAAAAAATCATGGGCACCTATATTTCATTTTATATGACATCATTTTTCATTTTAGTCTATATAAAAAAGAATAAGAGCTTCATCTGTTTGAAAATAATTTAGCTAGCGTTTGGACATAAATTTGAAAAAAGATTTTTTGAAGTTGCGATGAAAAATAATTTTTGAAAGTTAGAAATTATTTTCGGACATGCATTTTATTTGAAAAAAAGTTGTAGTTTTGTGAGCGGAAGAAAAAATTTTACCCAAAAACTGTCCTAAATCTTTTTTTGGGAACTTGCAATTTTTTGATTTTTTTTTTCAAAACATGATCATAATATATATTCCATAAACAAACAATATTTTCAATTTATTTTTGTAAAAAATGAAGCCAAAATCTATGTCCAAACATCTTCTTACTTTTGACTTTTGATGATTTTACTCTTACTGGCATAGTTTTATAGCGACAAAAATGTGACACGTTAAAACGACGAGTTTCAATAATTTTTCTTTTTCTAAAATTTGTCCATAAAACAGAGGGAGGCAGAGTACTTTTTTTTCTTTAATTTCATGTTTTCTCCACTTTATACTCTTTTGCCTGAAAAAAAGAAACAAAGAAGGGCTTAAGAGTTCCGGACACTTTACAGGGCATTTTTTTGTACATCCTTTTGTGCTGATGAATAAGTTATTGGTTCCCGCCAGTTCAATAATCCTTGGGTTTTCCCATGACGAATGACATGCTTTTGACCCTTTCTTCAACTTTTTCTATTATTAGTTATATAGCAGCTTTGGTCTGAGTCGGTGTGACTAAAATTAGCAGTGGCAATTTAATTTAGAAAAATGGTACTATAAAGAAGAAAGACAGTAAAAGAAAAAGGAGAAAAAGTAGAAAAAATGACATTTGTTAGTTGAGACATTAAATATGATGATGAAATATGAATATACCATCTTTCTAATATTTTCTAGTGTCAATTAATTCTATTATTACTATATTTGCAGATGGTCTCTAATAGCGGCACATTTACCAGGTAGAACAGACAATGAGATTAAAAACTACTGGAACTCTCATCTAAGCAGAAAAGTTGAAAGCTTAAGGATTCCAAGCGACGAAAAGCTGCCTCAAGCTGTAGTTGATTTGGCTAAGAAAGGAACTTTGAACCCTATCAAATGTAGAGTTGGCAAAACAAGCCGACCCTCAGTAAAGAAAAACAAAACGTTTAAAAAGTCTAGTTCAAGTTTGTCAGAGCCTAAGCAACCTAAAGAAAGTAGTGAACCTTTAAATTCAATAGTTCCTATGCCCTCAACTCCAAACATGGAAAAAGAGGCCTTATCTAGCACCATTAGCTCATGGTTAGAAGGTAACAATGTCATGGATTCCATGCAAGAAGAGGTAGCAAACGTAGCCGCGCCAAATCCTTGGTCGGGATCTAGAGAGGCCCAGAGCAGCCTTAGTTCAGGTTAGTACTTAAACTATTAGAGAGAACATACTTTTAATTACTTAATTATATTATATCTCAACACGTGAGCTTAAACTTTTCTCATGAGTTGATATCATGTTGAATTATATTTTGTCTTTAACAGATAGTGGGATGGAATGGCTTGAGGAAATTATGCCAATGGTCATTGCCGATCAAGATATGGACCCAAATGAATTCATTTTGACTTATTTAGACAACGGGCAAGGAGAAAGCCCGGAAAAAGTAACCAACGAGGCAGAAAATAACTGCGGGACCACGAACAGAATCAATGAACGTAACAACAAAGATCACGTTAATAAAATGGTATCAAGTGAAAATACACAACTGGAGAGTAGTCCAGAGAGTGAGACTGTATCAATAAATATTCTGAAAGATGTACAAGAGAATAGCAACGAATCGAAATTATTAATGGAAGATAGTACAGTTGAATGGGATTGGCAAGAGATAGCAGATGACATGAGAGAAGTATGGTCATGGGAAGAAACAGGGCAAGACAACATGTTAATTAATCACAGTTGGCCGCTATGGGATAATACTGGCACTGAGTTCACGAATGAAATAACGGTGGAAATGGATTCCGTGCTGCACAGTGAAAACCCAAACCATAGTGCCCTTGTCGCTTGGCTTTTGTCTTAG。

烟草NtMYB12基因所编码NtMYB12转录蛋白，对应NtMYB12基因中的1254bp长度的编码区，由417个氨基酸构成，该蛋白在细胞内定位为细胞核内，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体氨基酸序列如下：

MGRAPCCEKVGLKRGRWTAEEDEILTKYIQTNGEGSWRSLPKNAGLLRCGKSCRLRWINYLRSDLRRGNITSEEEDIIIKLHATLGNRWSLIAAHLPGRTDNEIKNYWNSHLSRKVESLRIPSDEKLPQAVVDLAKKGTLNPIKCRVGKTSRPSVKKNKTFKKSSSSLSEPKQPKESSEPLNSIVPMPSTPNMEKEALSSTISSWLEGNNVMDSMQEEVANVAAPNPWSGSREAQSSLSSDSGMEWLEEIMPMVIADQDMDPNEFILTYLDNGQGESPEKVTNEAENNCGTTNRINERNNKDHVNKMVSSENTQLESSPESETVSINILKDVQENSNESKLLMEDSTVEWDWQEIADDMREVWSWEETGQDNMLINHSWPLWDNTGTEFTNEITVEMDSVLHSENPNHSALVAWLLS*。

进一步地，发明人对烟草NtMYB59基因在细胞内的的亚细胞定位及表达模式进行了分析，具体实验过程简要介绍如下。

（1）亚细胞定位情况

参考现有常规操作，分别构建35S:NtMYB12-GFP和35S:GFP表达载体，并转化烟草原生质体，转化成功后用激光共聚焦显微镜检测荧光信号。

实验过程中，利用已知的核定位蛋白NLS作为参照。

结果如图1所示。观察过程中，若NtMYB12-GFP绿色荧光信号与NLS红色信号重合，则表明融合蛋白也定位于细胞核中。而从图1亚细胞定位结果可以看出，NtMYB12-GFP融合蛋白定位为细胞核内，表明NtMYB12具有转录因子属性。

（2）表达模式分析

分别收取红花大金元盛花期烟草叶片、茎秆、根、花蕾、花冠、雄蕊和雌蕊等组织样品，立即放入液氮中速冻，并-80℃保存备用；

利用烟草RNA快速提取试剂盒提取各组织的总RNA，并利用PrimeScript™ II 1stStrand cDNA Synthesis Kit获得各组织的cDNA样品，经Nanodrop测定cDNA样品的浓度后，用于qPCR定量检测NtMYB12基因表达水平。

定量PCR过程中，分析所用引物为：

qNtMYB12-F: 5’-GCGGCACATTTACCAGGTAG-3’，

qNtMYB59-R: 5’-TTACTGAGGGTCGGCTTGTT-3’；

内参引物NtL25-F：5’-CAAAAGTTACATTCCACCG-3’，

NtL25-R：5’-TTTCTTCGTCCCATCAGGC-3’。

结果如图2（a）所示，烟草NtMYB12基因在花冠中的表达量最高，其次是在花蕾、雌/雄蕊和叶片组织中。

实施例2

在实施例1基础上，为对烟草NtMYB12基因进行具体分析和验证，发明人进一步构建了针对该基因的超表达载体和RNAi表达载体，以及基因编辑用重组载体，不同重组质粒载体结构示意图如图2（b）所示。本实施例就相关重组质粒表达载体的构建过程简要介绍如下。

（1）序列克隆

以实施例1中所知烟草NtMYB12基因全长CDS为目标序列，分别克隆全长CDS（不包含终止密码）和部分CDS序列用于过表达和RNAi表达载体的构建；

具体过表达载体构建时PCR扩增用引物序列设计为：

NtMYB12a-SpeI-F ：5’-AGAGACTAGTATGGGAAGAGCACCTTGTTGTG-3’，

NtMYB12a-KpnI-R ：5’-TGACGGTACCAGACAAAAGCCAAGCGACAA-3’；

RNAi表达载体构建时PCR扩增用引物序列设计为：

NtMYB12a-R-F：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCAAGCCGACCCTCAGTAAAGA-3’，

NtMYB12a-R-R：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGCCATTCCATCCCACTATCTGAA-3’；

（NtMYB12a-R-F中5’端部分的“GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT”、NtMYB12a-R-R中5’端部分的“GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT”为attB1和attB2接头序列）

（2）连接、转化和筛选

将步骤（1）中扩增产物分别与pCAMBIA1301（构建超表达载体）、pHellsgate 2（干扰载体）进行连接；

并将连接产物分别转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆提取质粒进行PCR鉴定和测序鉴定。

对测序鉴定正确质粒，转化农杆菌感受态细胞后，制备浸染液用于烟草转基因。

另一方面，发明人利用现有CRISPR/Cas9基因编辑技术，选择位于NtMYB12基因上第一个外显子上的位点设计基因编辑引物，具体引物序列为：

M12Cris-F：5’-ATTGGATCATTACCCAAAAATGC-3’，

M12Cris-R：5’- AAACGCATTTTTGGGTAATGATC-3’；

将引物对经退火配对后连接pHSE401载体，转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆提取质粒，质粒经PCR鉴定和测序鉴定后，转化农杆菌感受态，用于烟草转基因。

实施例3

在实施例2所构建载体基础上，发明人进一步进行了烟草转化以对NtMYB59基因功能进行进一步验证和研究，具体实验情况简要介绍如下。

（一）转化烟草（即烟草转基因）

采用叶盘法转化烟草，具体过程为：

首先，将生长旺盛的K326烟草叶片消毒后剪成1cm²小块，置于MS分化培养基（每升MS培养液中加入1 mL 6-BA 和 100 µL NAA，调节pH至5.8-5.9，加入 2.5 g 植物凝胶，无菌封口膜密封后 120 ℃高压灭菌 30 min，冷却至 50 ℃，超净台内加入 1 mL Cep 抗生素和1 mL 潮霉素，混匀倒板）中，28℃、光照强度2000Lx、光照时间为16 h/d的条件下，预培养2天；

转入含有目标质粒的农杆菌菌液中（实施例2所制备）侵染15min左右，期间摇荡菌液数次，确保侵染均匀，最后用无菌滤纸吸干多余菌液；

接入MS分化培养基中，28℃、黑暗条件下共培养4天；

用无菌水将共培养后的植物体洗涤3次，无菌纸吸干后，转入含潮霉素（10 mg/L）和羧苄青霉素（500 mg/L）的MS分化培养基中，恒温培养；每隔10天更换1次培养基；

待不定芽长至1-2cm时，将丛生不定芽切割成单个小芽，转移到含潮霉素（10 mg/L）、羧苄青霉素（500 mg/L）和活性炭（0.5 mg/L）的MS生根培养基（每升培养基加入2 µL NAA 激素溶液，调节pH至5.8-5.9，加入2.5 g 植物凝胶，无菌封口膜密封后120 ℃高压灭菌30min，冷却至50 ℃在超净台内倒板）中，促进其生根；

待根系发育好后，将组培苗取出，用清水洗净根部的培养基，剪掉下部少量叶片，转移到盛有疏松无菌土的花盆中，按常规管理培养。

（二）转基因植株的鉴定及基因表达水平检测

待上述（一）中筛选的转基因幼苗长至8片真叶时，提取叶片RNA样品，进一步进行qPCR验证，确定阳性转基因植株。结果如图2（c）所示。具体而言：

过表达阳性植株中，NtMYB12基因的表达水平显著升高；而RNAi植株中NtMYB12基因的表达水平则显著降低。

对基因编辑突变体幼苗叶片的基因组DNA进行提取后，用包含编辑位点的特异性引物扩增大约250bp片段，电泳检测后，送交生物公司建库测序。测序完成后，分析各植株中突变基因型所占的比例，选择突变频率>90%（结果如图2（d）所示）的用于后续的实验分析。

（三）类黄酮含量测定

针对步骤（二）中所鉴定转基因幼苗或突变体，利用超高效液相-三重四级杆串联质谱法测定类黄酮含量，具体测定方法参考如下：

取50 mg烟叶样品，转入1.5 mL乙醇-水提取液(内标：伞形花内酯75 ng/mL)，常温下超声1 h；然后14000 rpm离心机条件下离心取上清液后检测。

分析条件为：

色谱条件：

BEH Phenyl色谱柱（2.1×150 mm，1.7μm)，流动相为 0.1%甲酸水（A）和0.1%甲酸甲醇（B）；

洗脱梯度：

0-2 min内B相由5%升到15%，

2-10 min B相保持15%，

10.01-15 min B相升到100%；

流速为0.3 mL/min，柱温为35℃，进样量为1μl；

质谱条件：

电喷雾电离源电离，正离子电离模式下，毛细管电压为4kV，雾化气压力为40psi，干燥气流量为12L /min，干燥气温度为290℃，鞘气流量为11 L/min，鞘气温度为200℃，采用实时多反应监测（dMRM）模式扫描。

结果如图3所示。结合图3中相关表型及测定结果可以看出，在NtMYB12过表植株中黄酮醇（flavonol）类物质含量显著地升高，而在NtMYB12-RNAi和ntmyb12突变体植株中黄酮醇的含量显著地降低。同时，花青素和绿原酸的含量也呈现类似的变化，表明NtMYB12能够促进烟叶中类黄酮和绿原酸的合成。

（四）脂肪酸测定

将各转基因植株及基因编辑突变体植株培育至收获种子后，将所收获种子在生长室干燥直至重量不再变化后用于脂肪酸的提取和测定。

脂肪酸的提取具体参考如下操作：

准确称量10mg左右的成熟种子放在玻璃管中，加入4ml的1M盐酸甲醇提取液（甲醇96.91%，盐酸3.09%，内标十七酸甲酯25ppm）后，迅速盖上盖子；

放入80℃水浴锅中水浴2h，取出后冷却至室温，加入1ml正己烷，再加入2ml 0.9% (w/v) NaCl溶液，充分涡旋震荡约50s，室温条件下2300rpm离心 5min；

小心吸取700μl上清液至GC小瓶，4℃冰箱保存待测。

标准曲线的制作采用AOCS Rapeseed混标和内标十七酸甲酯。具体而言：

用2ml正己烷溶解100mg混标制成50mg/ml母液，将母液用正己烷稀释成0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mg/ml 五个浓度梯度，每个浓度都包含100µg/ml的内标。

利用岛津GC-2014气相色谱仪，采用色谱柱 Supelco wax-10（Supelco，Cat. No.24079）测定各样品。

色谱分析程序为：

起始温度160℃保持1min，然后以4℃/min 的速率上升至240℃，保持16min。

待程序结束后，依据各峰的保留时间确定脂肪酸的组分，用分析软件绘制各组分的标准曲线。待样品测定后，用标准曲线分析样品中个组分的含量。

结果如图4所示。

从图4结果可以看出，NtMYB12基因不同表达量情况下，种子色泽有明显区别，而结合脂肪酸测定结果而言，在NtMYB12过表植株中脂肪酸的含量显著降低，而在NtMYB12-RNAi和ntmyb12突变体植株中脂肪酸的含量则显著升高。

进一步地，发明人对NtMYB12过表达植株中脂肪酸代谢相关基因的表达水平进行了检测，具体结果如下表和图5所示。

表，RNA-seq检测NtMYB12过表达植株中脂肪酸代谢相关基因的表达水平

。

从图5可以看出，随着NtMYB12基因表达量变化，与脂肪酸合成代谢相关基因（）表达量也发生了明显变化，同步抑制了脂肪酸合成。换言之，烟草NtMYB12转录因子能够抑制种子中脂肪酸的合成，而这种抑制作用是通过提高多个油脂水解酶基因（包括多个LACS、 LOX、FAH等）的表达水平来实现的。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国烟草总公司郑州烟草研究院

<120> 烟草NtMYB12基因及其在调控脂肪酸合成中的应用

<130> none

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2530

<212> DNA

<213> Nicotiana tabacum

<400> 1

atgggaagag caccttgttg tgagaaagtg ggtctcaaaa gaggcagatg gactgcagaa 60

gaggatgaaa ttctcactaa atatattcaa actaacggcg aaggctcttg gagatcatta 120

cccaaaaatg ctggtacgta cgaccttagc ctttccaata ccatattctt ctattgaacc 180

tcacatcctg cagttaaatt ttctttattt aaagtttata ctaatttatt ttgttgtgtt 240

cttttgtgct ttgaaggctt acttagatgt ggaaagagtt gccgactgag atggattaat 300

tacttgaggt ctgatttgag gagaggtaac ataacttctg aagaggaaga cataatcatc 360

aagttacatg caactttggg taacaggtat tttccccaac gtaaacgact caataatagc 420

aactacacac tggtaaatga aaaaaaatca tgggcaccta tatttcattt tatatgacat 480

catttttcat tttagtctat ataaaaaaga ataagagctt catctgtttg aaaataattt 540

agctagcgtt tggacataaa tttgaaaaaa gattttttga agttgcgatg aaaaataatt 600

tttgaaagtt agaaattatt ttcggacatg cattttattt gaaaaaaagt tgtagttttg 660

tgagcggaag aaaaaatttt acccaaaaac tgtcctaaat ctttttttgg gaacttgcaa 720

ttttttgatt ttttttttca aaacatgatc ataatatata ttccataaac aaacaatatt 780

ttcaatttat ttttgtaaaa aatgaagcca aaatctatgt ccaaacatct tcttactttt 840

gacttttgat gattttactc ttactggcat agttttatag cgacaaaaat gtgacacgtt 900

aaaacgacga gtttcaataa tttttctttt tctaaaattt gtccataaaa cagagggagg 960

cagagtactt ttttttcttt aatttcatgt tttctccact ttatactctt ttgcctgaaa 1020

aaaagaaaca aagaagggct taagagttcc ggacacttta cagggcattt ttttgtacat 1080

ccttttgtgc tgatgaataa gttattggtt cccgccagtt caataatcct tgggttttcc 1140

catgacgaat gacatgcttt tgaccctttc ttcaactttt tctattatta gttatatagc 1200

agctttggtc tgagtcggtg tgactaaaat tagcagtggc aatttaattt agaaaaatgg 1260

tactataaag aagaaagaca gtaaaagaaa aaggagaaaa agtagaaaaa atgacatttg 1320

ttagttgaga cattaaatat gatgatgaaa tatgaatata ccatctttct aatattttct 1380

agtgtcaatt aattctatta ttactatatt tgcagatggt ctctaatagc ggcacattta 1440

ccaggtagaa cagacaatga gattaaaaac tactggaact ctcatctaag cagaaaagtt 1500

gaaagcttaa ggattccaag cgacgaaaag ctgcctcaag ctgtagttga tttggctaag 1560

aaaggaactt tgaaccctat caaatgtaga gttggcaaaa caagccgacc ctcagtaaag 1620

aaaaacaaaa cgtttaaaaa gtctagttca agtttgtcag agcctaagca acctaaagaa 1680

agtagtgaac ctttaaattc aatagttcct atgccctcaa ctccaaacat ggaaaaagag 1740

gccttatcta gcaccattag ctcatggtta gaaggtaaca atgtcatgga ttccatgcaa 1800

gaagaggtag caaacgtagc cgcgccaaat ccttggtcgg gatctagaga ggcccagagc 1860

agccttagtt caggttagta cttaaactat tagagagaac atacttttaa ttacttaatt 1920

atattatatc tcaacacgtg agcttaaact tttctcatga gttgatatca tgttgaatta 1980

tattttgtct ttaacagata gtgggatgga atggcttgag gaaattatgc caatggtcat 2040

tgccgatcaa gatatggacc caaatgaatt cattttgact tatttagaca acgggcaagg 2100

agaaagcccg gaaaaagtaa ccaacgaggc agaaaataac tgcgggacca cgaacagaat 2160

caatgaacgt aacaacaaag atcacgttaa taaaatggta tcaagtgaaa atacacaact 2220

ggagagtagt ccagagagtg agactgtatc aataaatatt ctgaaagatg tacaagagaa 2280

tagcaacgaa tcgaaattat taatggaaga tagtacagtt gaatgggatt ggcaagagat 2340

agcagatgac atgagagaag tatggtcatg ggaagaaaca gggcaagaca acatgttaat 2400

taatcacagt tggccgctat gggataatac tggcactgag ttcacgaatg aaataacggt 2460

ggaaatggat tccgtgctgc acagtgaaaa cccaaaccat agtgcccttg tcgcttggct 2520

tttgtcttag 2530

<210> 2

<211> 417

<212> PRT

<213> Nicotiana tabacum

<400> 2

Met Gly Arg Ala Pro Cys Cys Glu Lys Val Gly Leu Lys Arg Gly Arg

1 5 10 15

Trp Thr Ala Glu Glu Asp Glu Ile Leu Thr Lys Tyr Ile Gln Thr Asn

20 25 30

Gly Glu Gly Ser Trp Arg Ser Leu Pro Lys Asn Ala Gly Leu Leu Arg

35 40 45

Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Ile Asn Tyr Leu Arg Ser Asp

50 55 60

Leu Arg Arg Gly Asn Ile Thr Ser Glu Glu Glu Asp Ile Ile Ile Lys

65 70 75 80

Leu His Ala Thr Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Ala His Leu

85 90 95

Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Tyr Trp Asn Ser His Leu

100 105 110

Ser Arg Lys Val Glu Ser Leu Arg Ile Pro Ser Asp Glu Lys Leu Pro

115 120 125

Gln Ala Val Val Asp Leu Ala Lys Lys Gly Thr Leu Asn Pro Ile Lys

130 135 140

Cys Arg Val Gly Lys Thr Ser Arg Pro Ser Val Lys Lys Asn Lys Thr

145 150 155 160

Phe Lys Lys Ser Ser Ser Ser Leu Ser Glu Pro Lys Gln Pro Lys Glu

165 170 175

Ser Ser Glu Pro Leu Asn Ser Ile Val Pro Met Pro Ser Thr Pro Asn

180 185 190

Met Glu Lys Glu Ala Leu Ser Ser Thr Ile Ser Ser Trp Leu Glu Gly

195 200 205

Asn Asn Val Met Asp Ser Met Gln Glu Glu Val Ala Asn Val Ala Ala

210 215 220

Pro Asn Pro Trp Ser Gly Ser Arg Glu Ala Gln Ser Ser Leu Ser Ser

225 230 235 240

Asp Ser Gly Met Glu Trp Leu Glu Glu Ile Met Pro Met Val Ile Ala

245 250 255

Asp Gln Asp Met Asp Pro Asn Glu Phe Ile Leu Thr Tyr Leu Asp Asn

260 265 270

Gly Gln Gly Glu Ser Pro Glu Lys Val Thr Asn Glu Ala Glu Asn Asn

275 280 285

Cys Gly Thr Thr Asn Arg Ile Asn Glu Arg Asn Asn Lys Asp His Val

290 295 300

Asn Lys Met Val Ser Ser Glu Asn Thr Gln Leu Glu Ser Ser Pro Glu

305 310 315 320

Ser Glu Thr Val Ser Ile Asn Ile Leu Lys Asp Val Gln Glu Asn Ser

325 330 335

Asn Glu Ser Lys Leu Leu Met Glu Asp Ser Thr Val Glu Trp Asp Trp

340 345 350

Gln Glu Ile Ala Asp Asp Met Arg Glu Val Trp Ser Trp Glu Glu Thr

355 360 365

Gly Gln Asp Asn Met Leu Ile Asn His Ser Trp Pro Leu Trp Asp Asn

370 375 380

Thr Gly Thr Glu Phe Thr Asn Glu Ile Thr Val Glu Met Asp Ser Val

385 390 395 400

Leu His Ser Glu Asn Pro Asn His Ser Ala Leu Val Ala Trp Leu Leu

405 410 415

Ser

Claims

1.烟草NtMYB12基因，其特征在于，该基因全长2530bp，其中编码区全长1254bp，包含3个内含子和4个外显子，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述烟草NtMYB12基因在种子脂肪酸合成中的应用，其特征在于，利用基因沉默技术、基因编辑或者基因超表达方法，通过调节烟草NtMYB12基因表达量，来调节控制种子中脂肪酸含量情况。

3.含有权利要求1所述NtMYB12基因的超表达载体，其特征在于，以pCAMBIA1301质粒作为载体，通过与NtMYB12基因的CDS全长序列进行重组制备获得，所述NtMYB12基因的CDS全长序列，具体PCR扩增时，PCR扩增用引物序列设计为：

NtMYB12a-SpeI-F ：5’-AGAGACTAGTATGGGAAGA—GCACCTTGTTGTG-3’，

NtMYB12a-KpnI-R ：5’-TGACGGTACCAGACAAAAGCC—AAGCGACAA-3’。

4.针对权利要求1所述NtMYB12基因的RNAi表达载体，其特征在于，以pHellsgate 2为质粒载体，以NtMYB12基因中的部分CDS序列为目标序列，构建过程中，针对NtMYB12基因中的部分CDS序列，具体PCR扩增用引物序列设计为：

NtMYB12a-R-F：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCAAGCCGACCCTCAGTAAAGA-3’，

5.权利要求1所述烟草NtMYB12基因的PCR制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

（一）提取基因组，

（二）设计引物，并进行PCR扩增

设计特异性扩增引物对如下：

NtMYB12-F：5’-ATGGGAAGAGCACCTTGTTGTG-3’，

NtMYB12-R：5’-GACAAAAGCCAAGCGACAA-3’。

6.利用权利要求1所述烟草NtMYB12基因的烟草新品种培育方法，其特征在于，通过转基因技术、瞬时表达技术或基因组编辑技术，构建含有NtMYB12基因的病毒诱导沉默载体、RNAi干涉载体、超表达载体或基因组编辑载体，转化烟草，筛选获得种子脂肪酸含量变化的烟草新品种。

7.权利要求1所述烟草NtMYB12基因所编码NtMYB12转录蛋白，其特征在于，对应NtMYB12基因中的1254bp长度的编码区，由417个氨基酸构成，该蛋白在细胞内定位为细胞核内，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

8.权利要求7所述烟草NtMYB12转录蛋白在脂肪酸合成调控中的应用，其特征在于，该转录蛋白表达量或含量升高后，脂肪酸含量降低；而降低该转录蛋白含量后，脂肪酸含量升高。