CN109593737B - 红花CtACO3基因、其编码蛋白质及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体是红花CtACO3基因及其编码蛋白质在提高红花中黄酮类化合物含量中的应用。本发明首次提供了红花CtACO3参与红花黄酮生物合成途径相关基因的调控，CtACO3通过转基因的方法转入红花中，可以提高醌式查尔酮类化合物的含量。

Description

红花CtACO3基因、其编码蛋白质及应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，是红花CtACO3基因、其编码蛋白质及应用。

背景技术

传统中药红花(Carthami Flos)具有活血祛瘀，通经活络的功效，其主要成分为黄酮类化合物，羟基红花黄色素A(HSYA)、Carthamin、槲皮素及其苷类、山萘酚及其苷类被认为是其发挥药理活性的主要活性成分。因此，通过红花黄酮代谢通道关键基因的调控是提高红花黄酮含量的一种有效方法。

黄酮类成分是植物重要的次生代谢产物，广泛地受到外界环境及刺激的影响。作为气态植物激素，乙烯调节植物生长，发育和应激反应的各种过程，并且作为传导外界刺激的信号分子。研究表明，乙烯及其前体ACC的外源应用可以诱导黄酮醇积累。ACO参与乙烯生物合成的最后步骤并催化ACC至乙烯，其与植物的生理和生物化学变化密切相关。但ACO对黄酮类化合物积累或黄酮类代谢途径的影响仍不清楚。

发明内容

本发明的目的在于提供红花CtACO3基因的核苷酸序列及其编码蛋白和应用。

本发明的第一方面，提供一种红花CtACO3(ACC氧化酶)基因，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。所述的红花CtACO3基因全长1920bp，其开放阅读框(ORF，Open ReadingFrame)区包含了1005bp，编码334个氨基酸，开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的第二方面，提供一种红花CtACO3蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第三方面，提供一种重组表达载体、重组菌或转基因植物，所述的重组表达载体、重组菌或转基因植物含有上述红花CtACO3基因SEQ ID NO.1或其开放阅读框SEQID NO.3。

优选的，在制备所述的重组表达载体、重组菌或转基因植物时，用于扩增红花CtACO3基因开放阅读框的引物对分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示：

CtACO3F：GAGCTTTCGCGGATCCGCCACCATGGGACACACACTGAT(SEQ ID NO.4)；

CtACO3R：ATTTAATTACCTGCAGGGCTTTCAGCGGCAATGGGGGTGG(SEQ ID NO.5)。

优选的，所述的重组表达载体为植物表达载体。更优选真核表达载体pMT39。

优选的，所述的重组菌，即宿主细胞，为大肠杆菌、农杆菌等。优选为农杆菌。更优选农杆菌GV3101。

本发明的第四方面，提供上述的红花CtACO3基因在提高红花中黄酮类化合物含量中的应用。

优选的，所述的红花CtACO3基因提高红花重要活性成分醌式查尔酮，如羟基红花黄色素A(HSYA)、Carthamin的含量。

本发明的第四方面，提供上述的红花CtACO3蛋白在提高红花中黄酮类化合物含量中的应用。

优选的，所述的红花CtACO3蛋白提高红花重要活性成分醌式查尔酮，如羟基红花黄色素A(HSYA)、Carthamin的含量。

本发明的第六方面，提供一种提高红花中黄酮类化合物含量的转基因方法，所述的提高红花中黄酮类化合物含量的转基因方法是将含有上述红花CtACO3基因或其开放阅读框的重组菌采用花粉管通道法遗传转化红花。

花粉管通道法在1983年被我国学者周光宇第一次提出，目前，该技术已经被应用在黄瓜，玉米等多种转基因农作物上。这个技术解决了开花植物组织再生率低的问题，而且操作简单稳定，尤其适用于药用植物红花这一类药用部位为花器官且组织再生率低的物种(Zhou,G.Weng,J.Zeng,Y.Huang,J.Qian,S.Liu,G.Introduction of exogenous DNAintocotton embryos.Methods Enzymol.1983,(101):433-481.)。

优选的，包括以下步骤：

A、构建含有上述红花CtACO3基因或其开放阅读框的重组表达载体；

B、用步骤A构建的重组表达载体转化农杆菌，得到重组菌；

C、步骤B得到的重组菌通过花粉管通道法转化盛开期的红花柱头；

D、种子成熟后，采集并种下T0代种子，采集T1代植株花器官，筛选获得转基因阳性植株。

更优选的，包括以下步骤：

I、载体构建：设计无缝克隆引物扩增CtACO3的ORF区，扩增引物为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，构建真核表达载体pMT39，将扩增产物与载体连接后，生成含目的基因的重组载体；

II、农杆菌介导的转化，具体操作方法为：

a.在温室中培育红花植株，温度25℃，昼夜节律为16小时光照/8小时黑暗；

b.将步骤I获得的重组载体用热击法转入农杆菌GV3101中，在LB+卡那霉素+链霉素的培养基上进行筛选，PCR扩增得到阳性克隆菌液，在LB培养基大摇，至菌液浓度OD约为0.8；菌液5000prm，离心5分钟，弃去上清；

c.用5％蔗糖溶液重悬，加入0.02％的表面活性剂silwet-77重悬；

d.用微量注射器吸取含目的基因的重悬菌液转化盛开期的红花柱头，转化结束后，立即将花用牛皮纸密封，重复操作，直至花朵闭合，取下牛皮纸，让植株恢复原来的生长环境；

e.待种子成熟后，采集获得T0代种子，翻土施肥后，种下T0代种子，待T1代植株花盛开时采集花器官样品；

f.设计引物SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7进行基因组水平验证，筛选出转基因阳性植株。

本发明的第七方面，提供一种采用上述的提高红花中黄酮类化合物含量的转基因方法获得的红花转基因植株或种质。

本发明优点在于：

本发明首次提供了红花CtACO3参与红花黄酮生物合成途径相关基因的调控，CtACO3通过转基因的方法转入红花中，可以刺激上游基因的表达，抑制下游基因的表达，同时，可以提高醌式查尔酮类化合物的含量。实验证明，过表达红花CtACO3可以明显提高红花重要活性成分醌式查尔酮，如羟基红花黄色素A、carthamin的含量。

附图说明

图1.CtACO3编码的氨基酸序列与红花中其他ACO基因序列的同源比对结果。

图2.CtACO3编码的氨基酸序列与其他物种中查尔酮合酶的系统进化树分析。

图3.红花过表达CtACO3的载体图谱。

图4.过表达CtACO3对黄酮生源途径基因的影响，CK：空载处理组；OVX：过表达CtACO3组。

图5.过表达CtACO3对黄酮生源途径代谢产物的影响，CK：空载处理组；OVX：过表达CtACO3组。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。所使用的实验方法若未特殊说明，均为常规实验方法。

下述实施例中所使用的材料，试剂等。如无特殊说明，均可从商业途径得到。

红花为野生型云南巍山品种，种植于第二军医大学药学院温室。

SMART^TM RACE cDNAAmplification Kit购自Clonetech公司。

KOD-Plus-Neo购自Toyobo。

pMD-19T simple Vector购自Takara。

实施例1.红花CtACO3全长cDNA的克隆

一、设计并合成RACE引物

CtACO3-GSP1:GCCAACCTTGACCGTATCTATGG(SEQ ID NO.8)

CtACO3-GSP2:GGGAAGTGATGCCGTGATCTATC(SEQ ID NO.9)

Trizol法提取RNA，利用SMARTer^TM RACE cDNAAmplification Kit试剂盒进行反转录建立5’和3’文库。

以红花5’和3’RACE cDNA文库为模板，利用通用引物UPM(Universal PrimerAMix)和设计的GSP引物，做PCR扩增，获得CtACO3的5’端序列和3’序列，得到1143bp的5’-保守片段和955bp的带polyA尾的3’-保守片段。

将CtACO3序列测序获得的5’和3’-cDNA片段序列在Vector NTI Suite9.0上进行序列拼接，获得一条cDNA全长序列。

根据这条序列的cDNA末端设计扩增全长cDNA的PCR引物5’-Full length ofCtACO3(AATAACAGAGAAGTATGTCATTAGGGT，SEQ ID NO.10)和3’-Full length of CtACO3(CTAATACGACTCACTATAGGGCAAG，SEQ ID NO.11)。以总RNA反转录的cDNA为模板，进行PCR扩增全长cDNA，测序。得到CtACO3基因的全长cDNA序列，总共1921bp(如SEQ ID NO.1所示)。

二、基因序列分析

CtACO3基因全长1921bp，开放阅读框(Open Reading Frame)区包含了1005bp(如SEQ ID NO.3所示)，编码335个氨基酸。多序列比对表明，其编码的氨基酸与同样来自红花的ACO1、ACO2和ACO4的同源性较低，具有48.7％的同源性(图1)。系统进化树结果显示，CtACO3氨基酸序列(如SEQ ID NO.2所示)与NCBI数据库中其他物种的ACO基因具有较高的相似性，与Chrysanthemum morifolium ACO基因(KX644895.1)具有87％的相似性，与Lactuca sativa ACO基因(AB158346.1)具有86％的相似性(图2)。

实施例2.CtACO3花粉管通道法转化红花植株

为了进一步分析CtACO3的功能，我们将其通过花粉管通道法转入红花中，观察过表达CtACO3之后，对黄酮代谢通道上其他基因以及黄酮代谢产物的影响。

一、载体构建

设计无缝克隆引物扩增CtACO3的ORF区，扩增引物为SEQ ID NO.4(GAGCTTTCGCGGATCCGCCACCATGGGACACACACTGAT)和SEQ ID NO.5(ATTTAATTACCTGCAGGGCTTTCAGCGGCAATGGGGGTGG)，构建真核表达载体pMT39，将扩增产物与载体连接后，生成含目的基因的重组载体。

二、农杆菌介导的转化

具体操作方法为：

A.在温室中培育红花植株，温度25℃，昼夜节律为16小时光照/8小时黑暗。

B.将对照质粒和重组载体用热击法转入农杆菌GV3101中，在LB+卡那霉素+链霉素的培养基上进行筛选，PCR扩增得到阳性克隆菌液，在LB培养基扩大培养，至菌液浓度OD约为0.8。菌液5000prm，离心5分钟，弃去上清。

C.用现配的5％蔗糖溶液重悬，加入0.02％的表面活性剂silwet-77重悬。

D.用微量注射器吸取含目的基因的重悬菌液转化盛开期的红花柱头，转化结束后，立即将花用牛皮纸密封，重复操作，直至花朵闭合，取下牛皮纸，让植株恢复原来的生长环境。

E.待种子成熟后，采集获得T0代种子，翻土施肥后，种下T0代种子，待T1代植株花盛开时采集花器官样品。

三、转基因验证

设计引物进行基因组水平验证，

ID-F：CGATTTGTGTACGCCCGACAGTC(SEQ ID NO.6)；

ID-R：CGATGTAGGAGGGCGTGGATATG(SEQ ID NO.7)；

PCR体系是：

PCR程序是94℃热启动2min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸，35个循环。琼脂糖凝胶电泳结果显示，从31株中筛选出8株转基因阳性植株。

四、过表达CtACO3对黄酮生源途径中其他基因的影响

对阳性转基因植株和对照植株的花器官提取RNA，并反转录为cDNA，将样品cDNA浓度平衡成一致浓度。设计黄酮代谢通道上基因的荧光定量引物，引物序列如下表1所示，设置qPCR程序，95℃热启动3分钟，95℃变性10分钟，58℃退火20秒，72℃延伸35秒。在ABI7500仪器上进行实验。60S作为内参，相对定量法2^-△△Ct分析转录表达情况。

表1.黄酮代谢通道基因荧光定量引物

结果显示(图4)，CtCHS1，CtCHI1和CtDFR1的表达在转基因植株中明显升高，具有共调节作用，升高最明显的CHS1比空白质粒组升高了约4倍，CHI1和DFR1也上升了约1倍。而CtPAL1,CtC4H1和Ct4CL1在转基因植株中表达明显下调，下降最多的是C4H，总共下调了约90％。

五、过表达CtACO3对黄酮代谢产物的影响分析

Ultra-high-performance liquid chromatography coupled to electrosprayionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry(UPLCESI-QTOF-MS)系统被用来分析过表达CtACO3对黄酮生源途径中代谢产物的影响。

芦丁、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、山奈酚、槲皮素、槲皮素-3-O-葡萄糖、D-苯丙氨酸、木犀草素、芹菜素、黄芩素、柚皮素购买自阿拉丁，羟基红花黄色素(HSYA)和Carthamin为本实验室自提。采用标准曲线法对样品中的化合物含量进行定量。

将红花花冠样品置于50℃烘箱中烘至恒重，磨成粉末，取约10mg，精密称定，置于1ml 70％甲醇溶液中浸泡12小时，

超声处理40分钟，13000prm离心10分钟，取上清进样。

结果显示(图5)，和空载组比较，多数黄酮类化合物均呈现不同程度的上调，其中醌式查尔酮结构化合物HSYA上调了22％，Carthamin上调了20％，而山萘酚上调了60％，黄芩素和芦丁上调了约100％。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

序列表

<110> 中国人民解放军第二军医大学

<120> 红花CtACO3基因、其编码蛋白质及应用

<130> /

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1920

<212> DNA

<213> 红花(Carthami Flos)

<400> 1

gtcattttcg cggtggctga gatcagccac ttcttccccg ataacggaga ccggcacact 60

ggccatatcg gtggtcatca tgcgccagct ttcatccccg atatgcacca ccgggtaaag 120

ttcacgggag actttatctg acagcagacg tgcactggcc agggggatca ccatccgtcg 180

ccccggcgtg tcaataatat cactctgtac atccacaaac agacgataac ggctctctct 240

tttataggtg taaaccttaa actgccgtac gtataggctg cgcaactgtt gggaagggcg 300

atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca gctggcgaaa gggggatgtg ctgcaaggcg 360

attaagttgg gtaacgccag ggttttccca gtcacgacgt tgtaaaacga cggccagtga 420

attgtaatac gactcactat agggcgattg aatttagcgg ccgcgaattg gcccttctaa 480

tacgactcac tatagggcaa gcagtggtat caacgcagag tacatggggc cacttttttg 540

tttcacattt tccatacaca cacaaaaaca actttttcag aaaaacaaag aagaaaacta 600

agaaagcaat ggaggcattc ccaattgtga acatggagaa gctcaatgga gaagaaagat 660

ctgcaacatt gaagcttatt aatgatgctt gtgagaactg gggattcttt gagattgtga 720

accatgggat atcaaccgag cttttggaca ctgtggagaa gatgacaaag gggcattaca 780

agaagtgcat ggaggagagg ttcaaagaaa tggtggcaag caaaggatta gaagccgttc 840

agaacgaaat cgaagatttg gattgggaga gcactttcca tctccgacat ctccctgaat 900

ccaacatcta cgatatccct gatcttcaag acgaatacag gaaggtaatg aaggagtttg 960

ctaaagagat tgagaaacta gctgaggata ttttagacat tttgtgtgag aatctggggt 1020

tagagaaggg ttacctgaag aaagctttct atggctccaa gggtcccacc ttcgggacga 1080

aggtgagcaa ctatcccccg tgccctaagc ccgatcttat caagggtctg cgggcccaca 1140

ccgatgctgg cggcgtcatc ttgctcttcc aggacgataa ggtcagcggg ctccagctcc 1200

tcaaggacgg aaactggatc gatgttccac cgatgcacca ttccatcgtc atcaacctgg 1260

gtgatcagct cgaggtaatc accaacggaa ggtacaagag tgtgatgcac agagtgatcg 1320

ctcaaacaga cgggacccgg atgtcgatag cgtcgtttta caacccggga agtgatgccg 1380

tgatctatcc cgcaccacaa ttggtaaaca aggacgaaaa agagaacaat acgtacccga 1440

agtttgtgtt tgaggactac atggaactct atactcgagt taagtttcag ccgaaggagc 1500

ctcggtttga agcaatgaag accatagata cggtcaaggt tggcccgatc gcatcgttta 1560

aagtcaacaa acacacagta ctggtgtttg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgaatttagt 1620

aaaataaatc taagtgatta tacaaaaaat gacatgtgtt gggagtatat tcataggtat 1680

tatcttttta tggtgtcttg tagacatcta taaatggttt gaataagaac accatatctt 1740

gagataccct aatgacatac ttctctgtta tttctatata taaaattata tgtatttatt 1800

atatacacat tctaaaaaaa aaaaaaaaaa agtactctgt gttgttacta ttgcttgccc 1860

tatagtgagt cgtattagaa gggccaactt tcttgtacac taaattccat ttttcttgta 1920

<210> 2

<211> 334

<212> PRT

<213> 红花(Carthami Flos)

<400> 2

Met Glu Ala Phe Pro Ile Val Asn Met Glu Lys Leu Asn Gly Glu Glu

1 5 10 15

Arg Ser Ala Thr Leu Lys Leu Ile Asn Asp Ala Cys Glu Asn Trp Gly

20 25 30

Phe Phe Glu Ile Val Asn His Gly Ile Ser Thr Glu Leu Leu Asp Thr

35 40 45

Val Glu Lys Met Thr Lys Gly His Tyr Lys Lys Cys Met Glu Glu Arg

50 55 60

Phe Lys Glu Met Val Ala Ser Lys Gly Leu Glu Ala Val Gln Asn Glu

65 70 75 80

Ile Glu Asp Leu Asp Trp Glu Ser Thr Phe His Leu Arg His Leu Pro

85 90 95

Glu Ser Asn Ile Tyr Asp Ile Pro Asp Leu Gln Asp Glu Tyr Arg Lys

100 105 110

Val Met Lys Glu Phe Ala Lys Glu Ile Glu Lys Leu Ala Glu Asp Ile

115 120 125

Leu Asp Ile Leu Cys Glu Asn Leu Gly Leu Glu Lys Gly Tyr Leu Lys

130 135 140

Lys Ala Phe Tyr Gly Ser Lys Gly Pro Thr Phe Gly Thr Lys Val Ser

145 150 155 160

Asn Tyr Pro Pro Cys Pro Lys Pro Asp Leu Ile Lys Gly Leu Arg Ala

165 170 175

His Thr Asp Ala Gly Gly Val Ile Leu Leu Phe Gln Asp Asp Lys Val

180 185 190

Ser Gly Leu Gln Leu Leu Lys Asp Gly Asn Trp Ile Asp Val Pro Pro

195 200 205

Met His His Ser Ile Val Ile Asn Leu Gly Asp Gln Leu Glu Val Ile

210 215 220

Thr Asn Gly Arg Tyr Lys Ser Val Met His Arg Val Ile Ala Gln Thr

225 230 235 240

Asp Gly Thr Arg Met Ser Ile Ala Ser Phe Tyr Asn Pro Gly Ser Asp

245 250 255

Ala Val Ile Tyr Pro Ala Pro Gln Leu Val Asn Lys Asp Glu Lys Glu

260 265 270

Asn Asn Thr Tyr Pro Lys Phe Val Phe Glu Asp Tyr Met Glu Leu Tyr

275 280 285

Thr Arg Val Lys Phe Gln Pro Lys Glu Pro Arg Phe Glu Ala Met Lys

290 295 300

Thr Ile Asp Thr Val Lys Val Gly Pro Ile Ala Ser Phe Lys Val Asn

305 310 315 320

Lys His Thr Val Leu Val Phe Val Cys Val Cys Val Cys Val

325 330

<210> 3

<211> 1005

<212> DNA

<213> 红花(Carthami Flos)

<400> 3

atggaggcat tcccaattgt gaacatggag aagctcaatg gagaagaaag atctgcaaca 60

ttgaagctta ttaatgatgc ttgtgagaac tggggattct ttgagattgt gaaccatggg 120

atatcaaccg agcttttgga cactgtggag aagatgacaa aggggcatta caagaagtgc 180

atggaggaga ggttcaaaga aatggtggca agcaaaggat tagaagccgt tcagaacgaa 240

atcgaagatt tggattggga gagcactttc catctccgac atctccctga atccaacatc 300

tacgatatcc ctgatcttca agacgaatac aggaaggtaa tgaaggagtt tgctaaagag 360

attgagaaac tagctgagga tattttagac attttgtgtg agaatctggg gttagagaag 420

ggttacctga agaaagcttt ctatggctcc aagggtccca ccttcgggac gaaggtgagc 480

aactatcccc cgtgccctaa gcccgatctt atcaagggtc tgcgggccca caccgatgct 540

ggcggcgtca tcttgctctt ccaggacgat aaggtcagcg ggctccagct cctcaaggac 600

ggaaactgga tcgatgttcc accgatgcac cattccatcg tcatcaacct gggtgatcag 660

ctcgaggtaa tcaccaacgg aaggtacaag agtgtgatgc acagagtgat cgctcaaaca 720

gacgggaccc ggatgtcgat agcgtcgttt tacaacccgg gaagtgatgc cgtgatctat 780

cccgcaccac aattggtaaa caaggacgaa aaagagaaca atacgtaccc gaagtttgtg 840

tttgaggact acatggaact ctatactcga gttaagtttc agccgaagga gcctcggttt 900

gaagcaatga agaccataga tacggtcaag gttggcccga tcgcatcgtt taaagtcaac 960

aaacacacag tactggtgtt tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtga 1005

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

gagctttcgc ggatccgcca ccatgggaca cacactgat 39

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 5

atttaattac ctgcagggct ttcagcggca atgggggtgg 40

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 6

cgatttgtgt acgcccgaca gtc 23

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 7

cgatgtagga gggcgtggat atg 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 8

gccaaccttg accgtatcta tgg 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 9

gggaagtgat gccgtgatct atc 23

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 10

aataacagag aagtatgtca ttagggt 27

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 11

ctaatacgac tcactatagg gcaag 25

Claims (10)

1.一种红花CtACO3基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的红花CtACO3基因，其特征在于，所述的红花CtACO3基因的开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.一种红花CtACO3蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种重组表达载体或重组菌，其特征在于，所述的重组表达载体或重组菌含有红花CtACO3基因SEQ ID NO.1或其开放阅读框SEQ ID NO.3。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体或重组菌，其特征在于，在制备所述的重组表达载体或重组菌时，用于扩增红花CtACO3基因开放阅读框的引物对分别如SEQ ID NO.4和SEQID NO.5所示。

6.根据权利要求4所述的重组表达载体或重组菌，其特征在于，所述的重组表达载体为植物表达载体；所述的重组菌为大肠杆菌或农杆菌。

7.一种如权利要求1所述的红花CtACO3基因在提高红花中黄酮类化合物含量中的应用。

8.一种如权利要求3所述的红花CtACO3蛋白在提高红花中黄酮类化合物含量中的应用。

9.一种提高红花中黄酮类化合物含量的转基因方法，其特征在于，所述的提高红花中黄酮类化合物含量的转基因方法是将含有红花CtACO3基因SEQ ID NO.1或其开放阅读框SEQ ID NO.3的重组菌采用花粉管通道法遗传转化红花。

10.根据权利要求9所述的提高红花中黄酮类化合物含量的转基因方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、构建含有红花CtACO3基因或其开放阅读框的重组表达载体；

B、用步骤A构建的重组表达载体转化农杆菌，得到重组菌；

C、步骤B得到的重组菌通过花粉管通道法转化盛开期的红花柱头；

D、种子成熟后，采集并种下T0代种子，采集T1代植株花器官，筛选获得转基因阳性植株。

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