CN101289514B - 一种培育耐逆植物的方法及其专用dna片段 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种培育耐逆植物的方法及其专用DNA片段。本发明提供的融合蛋白，包括叶绿体转运肽和磷酸海藻糖合成酶，叶绿体转运肽位于融合蛋白的氨基端，磷酸海藻糖合成酶位于叶绿体转运肽的羧基端。融合蛋白还可包括磷酸海藻糖磷酸酶，磷酸海藻糖磷酸酶位于磷酸海藻糖合成酶的羧基端。将本发明的融合蛋白的编码基因导入植物中，可以显著提高植物的耐逆性。本发明的融合蛋白及其编码基因对培育耐逆植物品种，特别是培育耐非生物胁迫如耐干旱和/或耐盐植物品种，从而提高农作物产量具有重要意义。

Description

一种培育耐逆植物的方法及其专用DNA片段

技术领域

本发明涉及一种培育耐逆植物的方法及其专用DNA片段。

背景技术

我国是一个严重干旱、缺水的国家，也是世界上荒漠化和沙化面积大、分布广、危害严重的国家之一。为了提高水资源的利用率、治理荒漠化土地，迫切需要培育节水耐旱经济作物。随着对生命活动机制研究的深入和基因工程技术的发展，利用基因工程手段培育耐旱植物已经成为当今植物基因工程领域的热点。

在旱、寒、盐、热等逆境条件下植物体内面临多重挑战：细胞内产生并积累了大量有害物质；膜系统和蛋白质变性；细胞与外界环境之间离子或水的动态平衡无法维持；植物生长所需的水分、养分及能量无法供应等。往往是旱、热或是寒、旱多重逆境共存，因此提高植物的耐逆性应是提高植物的综合耐逆能力。

人们注意到当线虫Aphelenchus avenae缓慢进入脱水状态时，其干重的20％转化为海藻糖(Anhydrobiosis in nematodes：carbohydrate and lipid metabolismduring dehydration.J.Exp.Zool.1975，，193，335±342.)，在其它微生物和复苏植物中也观察到了耐逆与海藻糖积累的关联性。从嗜热菌thermus菌种中分离出能耐受6％NaCl的17个菌株，但如这些菌株的海藻糖合成基因发生缺失突变，则菌株无法在2％NaCl的培养基上生长(Distribution of Genes for Synthesis ofTrehalose and Mannosylglycerate in Thermus spp.and Direct Correlation ofThese Genes with Halotolerance.APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY.2005，71(5)：2460-2466)。

海藻糖是一种由两个葡萄糖分子以α，α-1，1糖苷键相连而成的非还原二糖，在生物界中广泛存在。研究表明海藻糖能清除有害的氧自由基(Banaroudj，N.，Lee，D.H.，and Goldberg，A.L.(2001)Trehalose accumulation during cellularstress protects cells and cellular proteins from damage by oxygen radicals.J.Biol.Chem.，276，24261±24267)，保护蛋白和磷脂膜抗氧化胁迫((2001)Trehalose is required for the acquisition of tolerance to a variety ofstresses in the filamentous fungus Aspergillus nidulans.Microbiology 147：1851-1862)。另外，海藻糖具有特殊的立体化学结构，能嵌入膜磷脂的头部极性分子之间，与多个位点结合减少磷脂分子的横向运动(On the decrease in lateralmobility of phospholipids by sugars Biophys J BioFAST，2006)，维持细胞膜在高渗透压下的稳定状态，阻止细胞内膜变性，抑制膜融合、降低相变温度、保持膜的流动性。同时，海藻糖的羟基和蛋白的极性基团可通过氢键相互作用，在缺水或高温情况下有助于维持蛋白的立体构象。体外实验证明海藻糖能保护蛋白构象并有利于其体外复性(Arch Biochem Biophys.2005 Dec 1；444(1)：52-60.Trehalose and glycerol stabilize and renature yeast inorganicpyrophosphatase inactivated by very high temperatures)，体内实验也证明海藻糖不仅能防止蛋白的高温变性，同时能阻止已部分变性蛋白的聚集，使其保持一定的折叠构象，以利于分子伴侣对它重新修复激活(Multiple effects oftrehalose on protein folding in vitro and in vivo.Mol Cell.1998Apr；1(5)：639-48.)。近几年的研究显示海藻糖和其前体6-磷酸-海藻糖还可直接与某些蛋白相互作用，改变其活性，启动植物的耐非生物胁迫和抗病机制。

酵母内高浓度的海藻糖能够提高酵母热激转录蛋白hsfl的转录活性从而激活酵母的一部分耐热机制(Mol Cell Biol.2006 Dec 4；The natural osmolytetrehalose is a positive regulator of the heat-induced activity of yeast heatshock transcription factor)。在添加了海藻糖的培养基上生长的拟南芥，有35个基因的表达增强，包括与抗逆境、抗病信号传导相关的基因：如过氧化物酶、脯氨酸脱氢酶、类衰老基因SG2和一些与磷酸化调控和钙信号传导相关基因，同时还有与糖代谢、利用相关的基因如Atkin11等(Trehalose Mediated GrowthInhibition of Arabidopsis Seedlings Is Due to Trehalose-6-PhosphateAccumulation，Plant Physiology，2004，135：879-890)。高浓度的海藻糖促进淀粉的合成并抑制淀粉的降解。淀粉合成的限速酶ADP-葡萄糖焦磷酸化酶是四聚体异构酶，由大小亚基构成。小亚基起催化作用，大亚基APL3和APL4起调控作用。海藻糖能提高APL3和APL4基因的表达(Differential Pattern of Expression andSugar Regulation of Arabidopsis thaliana ADP-glucosePyrophosphorylase-encoding Genes THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 2005，280(9)：8143-8149)，抑制淀粉降解基因SEX1和β-淀粉酶基因BMY8/BAM3的表达(Plant Mol Biol.2007 Jan；63(2)：195-206.Epub 2006 Sep 23.ABI4mediates the effects of exogenous trehalose on Arabidopsis growth andstarch breakdown.)。在叶绿体内6-磷酸-海藻糖T6P的积累，会还原活化ADP-葡萄糖焦磷酸化酶，从而加速生成淀粉的前体物质ADP-葡萄糖(Trehalose6-phosphate regulates starch synthesis via posttranslational redoxactivation of ADP-glucose pyrophosphorylase PNAS，2005，102(31)：11118-11123)。淀粉的积累降低植物可代谢糖的浓度，减缓植物的垂直生长，节约碳源和其它的资源，有利于逆境条件下植物的生存。

海藻糖或是6-磷酸-海藻糖还可能通过调节氮代谢提高生物的耐逆性。大肠杆菌的GlnD能感知细胞内谷胺酰胺浓度，调节细胞内与氮的吸收利用相关基因的表达。而GlnD的突变表达体(只表达蛋白N末端的37-40％)能部分抑制大肠杆菌otsBA或otsA::Tn10突变体的低耐逆性。该突变体在高盐浓度而氮源充足的条件下，GlnD的下游信号传导基因Glnk的表达被调高，而GlnD野生型细菌在这一环境下Glnk表达量不变(JOURNAL OF BACTERIOLOGY，June 2006，p.4218-4226 Vol.188，No.12 Transposon Mutations in the 5

End of glnD，the Gene for a NitrogenRegulatory Sensor，That Suppress the Osmosensitive Phenotype Caused by ot sBALesions in Escherichia coli)。

海藻糖主要有三种合成途径，应用广泛的是(TPS-TPP)途径。磷酸海藻糖合成酶(TPS)催化葡萄糖基团从NDP-葡萄糖(UDP-/ATP-/CTP-/TTP-)转移到6-磷酸-葡萄糖上，产生6-磷酸-海藻糖和NDP(UDP/ATP/CTP/TTP)。磷酸海藻糖磷酸酶(TPP)催化6-磷酸-海藻糖的脱磷酸反应，最终生成海藻糖。TPP很可能是受海藻糖反馈抑制的酶，随着海藻糖浓度的升高，TPP酶活性降低，生物体内海藻糖前体T6P的浓度就会升高。除微生物和一些复苏植物外，自然界一般植物体内海藻糖的浓度低于0.15毫克/克干重。

Karim等人克隆了酵母的TPS基因并采用叶绿体定位策略，成功地获得了耐旱的转基因烟草(Improved drought tolerance without undesired side effects intransgenic plants producing trehalose.Plant Mol.Biol.，67：371-386)，但从酵母、昆虫、链霉菌等细胞中分离的磷酸海藻糖合成酶只能特异地利用UDP-葡萄糖或GDP-葡萄糖中的一种作为底物合成6-磷酸-海藻糖，而叶绿体中大量存在着ADP-葡萄糖。非致病性菌耻垢分枝杆菌的TPS能利用所有天然存在的NDP-葡萄糖(ADP-葡萄糖、CDP-葡萄糖、GDP-葡萄糖、TDP-葡萄糖和UDP-葡萄糖)作为葡萄糖供体，其中UDP-葡萄糖、ADP-葡萄糖和GDP-葡萄糖为最适底物(Trehalose-phosphate synthase of Mycobacterium tuberculosis.Cloning.expression and properties of recombinant enzyme.Eur.J.Biochem.，2002，269(24)：6091-6100)。

发明内容

本发明的目的是提供一种培育耐逆植物的方法及其专用DNA片段。

本发明提供了一种融合蛋白，包括叶绿体转运肽和磷酸海藻糖合成酶，所述叶绿体转运肽位于所述融合蛋白的氨基端，所述磷酸海藻糖合成酶位于所述叶绿体转运肽的羧基端。

所述融合蛋白还可包括磷酸海藻糖磷酸酶，所述磷酸海藻糖磷酸酶位于所述磷酸海藻糖合成酶的羧基端。

所述叶绿体转运肽可来自双子叶植物或单子叶植物；如来自拟南芥，其序列为序列表中的序列6，编码基因为序列表的序列5。

所述磷酸海藻糖合成酶和磷酸海藻糖磷酸酶来自耻垢分支杆菌。

所述融合蛋白具体可为下述a)、b)、c)或d)的蛋白质：

a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列2衍生的蛋白质；

c)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

d)将序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列4衍生的蛋白质。

所述融合蛋白中，在序列4自氨基末端第582至586位氨基酸残基为连接肽(GSGSG)，编码序列为序列表的序列3自5’端第1772至1786位核苷酸(GGATCAGGTTCTGGA)。

上述b)或d)中的融合蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述b)中的融合蛋白的编码基因可通过将序列表中序列1自5′端第29至1771位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变得到。上述d)中的融合蛋白的编码基因可通过将序列表中序列3自5′端第29至2536位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变得到。

所述融合蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

所述编码基因具体可为如下1)至6)的DNA分子之一：

1)其编码序列是序列表中序列1自5′末端第29-1771位脱氧核糖核苷酸所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

3)与1)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子；

4)其编码序列是序列表中序列3自5′末端第29-2536位脱氧核糖核苷酸所示的DNA分子；

5)在严格条件下与4)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

6)与4)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。

上述严格条件可为在5×SSC，5×Denhardt’S溶液，0.05mg/mL鱼精DNA，50％去离子甲酰胺溶液中，在65℃下杂交，然后在室温用2×SSC，0.1％SDS，在42℃用0.25×SSC，0.1％SDS各洗膜15分钟两次。

含有所述基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌均属本发明的保护范围。

所述表达盒中除上述编码基因外还可以含有序列表中序列1自5′末端第1775-2577位脱氧核糖核苷酸所示的DNA分子或含有序列表中序列3自5′末端第2537-2921位脱氧核糖核苷酸所示的DNA分子。

可用现有的植物表达载体构建含有所述融合蛋白编码基因的重组表达载体。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用所述融合蛋白编码基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的融合的蛋白编码基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述表达载体具体可为如图1所示的表达载体或如图2所示的表达载体。

本发明还提供了一种培育耐逆植物的方法，是将所述融合蛋白的编码基因导入植物细胞，得到耐逆性增强的植物。

可通过任何常规方法将所述融合蛋白的编码基因导入植物细胞，如通过如图1所示的表达载体或如图2所示的表达载体将所述融合蛋白的编码基因导入植物细胞，得到耐逆性增强的植物。

所述耐逆性具体可为耐盐和/或耐旱。

本发明提供了一种融合蛋白，包括叶绿体转运肽和磷酸海藻糖合成酶，叶绿体转运肽位于融合蛋白的氨基端，磷酸海藻糖合成酶位于叶绿体转运肽的羧基端。融合蛋白还可包括磷酸海藻糖磷酸酶，磷酸海藻糖磷酸酶位于磷酸海藻糖合成酶的羧基端。将本发明的融合蛋白的编码基因导入植物中，可以显著提高植物的耐逆性。本发明的融合蛋白及其编码基因对培育耐逆植物品种，特别是培育耐非生物胁迫如耐干旱和/或耐盐植物品种，从而提高农作物产量具有重要意义。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

附图说明

图1为质粒pCAMBIA2300::fuTPS的结构图

图2为质粒pCAMBIA2300::dTPSP的结构图

图3为转pCAMBIA2300::dTPSP植株的干旱和盐处理后的照片

图4为转pCAMBIA2300::dTPSP植株的电泳鉴定

具体实施方式

细菌基因组DNA的提取采用SDS裂解法，植物基因组DNA的提取采用CTAB法，具体参见Sambrook and Russell″Molecular Cloning：A Laboratory Manual″(2001)；Cloning：A Practical Approach，″Volumes I and II″(D.N.Glover，ed.，1985)。

细胞总RNA的提取采用TRIZOL RNA提取液(鼎国生物技术公司)，并按供应商提供的方案进行总RNA的提取。将得到的总RNA用DNase酶(Prmega，America)消化，以去除残存的DNA，以分光光度计(Eppendorf公司，德国)检测样品中总RNA的浓度。取5μg总RNA，用反转录试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)按试剂盒的方法进行反转录，以得到的cDNA片段为模板进行如下所示的PCR扩增反应。

除非有特殊说明，25μl PCR反应体系为：0.μg模板DNA、1.5mM MgCl₂、20mMTris-HCl(pH8.4)、50mM KCl、0.2mM dNTP混合物、0.2μM正向引物和0.2μM反向引物，以及1U的pfu高保真DNA聚合酶(上海申能博彩生物技术公司)。按照下列方案在PCR-热循环仪(Eppendorf公司，德国)中进行PCR循环反应：94℃预变性4分钟，94℃变性30秒，按各特定温度复性，复性时间30秒，72℃延伸，延伸时间各反应特定，30个循环，最后72℃、10分钟。

本发明中所用的引物均为上海生工公司合成。

本发明中所用的引物如下：

P1：5’-TCTCCGGAGAGTGGCCACGAA-3’

P2：5’-GAAGCTCCCGGAGTCGGACTCG-3’；

P3：5’-TCAGTCACACAAAGAGTAAAGAAGA-3’；

P4：5’-GGAATCGGTAAGGTCAGGAAGGT-3’；

P5：5’-CCGACTCCGGGAGCTTCTAGTAATTTCCCTTTGCTT-3’；

P6：5’-TTCTGTGGTATTTGAGCATTTCG-3’；

P7：5’-CGTGGCCACTCTCCGGAGAGGAATCGGTAAGGTCAG-3’；

P8：5’-CCTTCCTGACCTTACCGATTCCTCTCCGGAGAGTGGCCACGAAAC-3’；

P11：5’-CGCCGTGCGCCGCGGCGCATAGTCACGCCGGCTCATATTAGG-3’；

P12：5’-TAAGGGCAGCCCATACAAATG-3’；

P13：5’-GCCGGTGAATTCGCTGAGCA-3’；

P14：5’-ACTCATTCCAGAACCTGATCCGAAGCTCCCGGAGTCGGACTC-3’；

P15：5’-TTCGGATCAGGTTCTGGAATGAGTCTTTCGGGGGATCTGCAG-3’；

P16：5’-TGCTCGAAGAGAAGCGCATCA-3’。

以下实施例中所用的拟南芥为哥伦比亚生态型野生拟南芥。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、培育耐逆植物

一、磷酸海藻糖合成酶基因的克隆

耻垢分枝杆菌基因组约7Mb，环状，全基因组序列测定已完成(GenbankAccession NC_008596)。其中磷酸海藻糖合成酶基因长1512bp，编码503个氨基酸(Genbank Accession ABK71484)。

参照生物学模式菌株耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的序列人工合成1506bp的片段的磷酸海藻糖合成酶基因(三博远志)，测序表明该片段为不含起始密码子和终止密码子的磷酸海藻糖合成酶基因序列，与基因库中序列吻合，将该磷酸海藻糖合成酶基因片段命名为TPS(其序列是自序列1的5′末端第266-1771位核苷酸)。

二、拟南芥RuBisCO基因叶绿体转运肽DNA片段的获得

1、N端片段的获得

根据拟南芥RuBisCO基因(Genbank Accession NM_202369)序列分析，合成引物P3和P4，以拟南芥总RNA反转录得到的cDNA为模板，通过55℃复性30秒，72℃延伸30秒PCR反应扩增得到265bp的DNA片段，测序结果表明该片段为拟南芥RuBisCO基因N端编码转运肽的DNA序列，将该片段命名为AtTP(其序列是自序列1的5′末端第1-265位核苷酸)。

2、下游序列的获得

依据拟南芥基因组序列信息合成引物P5和P6，以拟南芥基因组DNA为模板，通过55℃复性30秒，72℃延伸1分钟PCR反应扩增得到823bp的DNA片段，测序结果表明该片段含有拟南芥RuBisCO基因的下游序列，将该片段命名为AtTrbcS(其序列是自序列1的5′末端第1755-2577位核苷酸)。

三、融合基因的获得

合成PCR反应融合引物P7和P8。以P3、P7为引物，AtTP为模板，通过55℃复性30秒，72℃延伸30秒PCR扩增得到约284bpDNA片段；同时以P8、P2为引物，TPS为模板，通过55℃复性30秒，72℃、2分钟PCR扩增得到1528bp DNA片段。将两片段回收，分别取0.1μg混合，作为模板，在不加入引物的条件下，65℃复性30秒，72℃延伸2分钟，反应5个循环，然后加入引物P3和P2，56℃复性30秒，72℃延伸2分钟，反应30个循环，得到1771bp的DNA片段。取0.1μg该片段和0.1μg AtTrbcS，混合作为模板，在不加引物的条件下，65℃复性30秒，72℃延伸2分钟，反应5个循环，然后加入引物P3和P6，56℃复性，72℃延伸2分钟30秒，反应30个循环。

将得到的DNA片段进行测序，结果表明，DNA片段如序列表中的序列1所示，将该DNA片段命名为fuTPS，序列表中序列1的第29至1771位核苷酸编码序列表中序列2所示的氨基酸。fuTPS包含了完整的TPS基因片段(序列1第266-1771位核苷酸)，同时在5’端融合了拟南芥RuBisCO基因N端编码转运肽的DNA片段(序列1的29-265位核苷酸)，以及3’端融合了RuBisCO基因终止区的DNA片段(序列1的1775-2577位核苷酸)。

将fuTPS连接到质粒pBluescript IIKS(-)(Genbank Accession Number X52329)的Sma I-Hinc II位点处，将得到的重组质粒命名为pBS::fuTPS。

四、融合基因fuTPS植物表达载体的构建

BstXI和XhoI酶切质粒pCAMBIA2300(Genbank Accession Number AF234315)，回收787bp的35S启动子片段，将787bp的35S启动子片段插入pUC18(GenbankAccession Number L09136)的SphI和SalI酶切位点间，得到重组质粒pUC18::35S。随后SpeI和KpnI酶切质粒pBS::fuTPS，得到约2600bp的含有fuTPS的片段，将该片段插入到XbaI和KpnI酶切的pUC18::35S上，得到重组质粒pUC18::35S-fuTPS。

HindIII-KpnI酶切pUC18::35S-fuTPS，回收约3.4kb的35S-fuTPS片段，插入到经过同样酶切的pCAMBIA2300上，得到重组质粒pCAMBIA2300::fuTPS(图1)。fuTPS受到35S启动子控制，终止子为拟南芥RuBisCO基因终止区。

将质粒pCAMBIA2300::fuTPS转入到根癌农杆菌LBA4404中，得到菌株LBA4404/TPS，用于植物组织的侵染。

五、培育耐逆植物

1)转基因植株的获得

拟南芥按常规方法培养，培养条件为：光照时间16/8小时，光照强度不低于5000Lux，温度22摄氏度，湿度70％。

培养介质为按1∶1混匀的蛭石和草炭土，每周浇一次“花无缺”营养液(每2升水加1克，上海永通化工有限公司)，幼苗生长约25天后，第一个花序长到高8厘米左右时从基部掐除，再过一周时间二次抽薹，花蕾刚要露白时进行侵染。农杆菌使用浓度OD6001.2-1.4，菌液4000转离心10分钟收集菌体，以等体积的5％蔗糖溶液悬浮，测其OD600值，换算后用5％的蔗糖稀释至浸染时的使用浓度OD6000.8，加入万分之三体积的Silwet L-77溶液，混匀后进行浸染，浸染方法采取“蘸花法”，即用枪头吸取农杆菌液滴蘸花絮。遮光24小时后重新正常生长。5-6天后进行第二次侵染，共浸染3次。侵染结束后约一个月左右收种。

所得T1代种子在抗性培养基上筛选出转基因苗，方法为：70％酒精表面消毒5分钟，次氯酸钠溶液(5％次氯酸钠+0.5％SDS)，消毒15分钟，无菌水洗涤5遍，播种于1/2MS固体培养基(加卡那霉素30mg/l+羧卞125mg/l)。4℃冰箱放置3天后置于正常培养间光照培养，十天后将抗性苗移至蛭石和草炭土的营养基质中，常规培养，两个半月后收种为T2代种子。

将用上述方法筛选得到的T2代转基因植株的种子培育成小苗，进行耐旱试验。共得到了30个株系的转TPS基因拟南芥。

2)耐旱试验

将步骤1)得到的30个株系的转TPS基因拟南芥和非转基因拟南芥进行耐旱实验。

具体方法如下：将经过卡那筛选的30个株系的转TPS基因拟南芥和非转基因拟南芥，每个株系各7株，同时对称地移栽到同一小钵的两侧。每个转基因株系设3个重复。常规管理，浇水3次后停止浇水，三周后复水，一周后观察并拍照。

实验结果显示，非转基因拟南芥全部枯死，而转TPS基因拟南芥的30个株系中，有2个株系的转基因植株存活，且大部分叶片保持绿色，植株生长良好。

3)转基因植株的鉴定

将在步骤2)的试验中存活的2个转基因株系进行PCR鉴定。

取这2个株系的T2代植株的叶片和非转基因拟南芥的叶片，分别提取基因组DNA。提取基因组DNA采用用CTAB法(Steiner JJ，Poklemba CJ，Fjellstrom RG，Elliott LF.，A rapid one-tube genomic DNA extraction process for PCR andRAPD analyses.Nucleic Acids Res.1995 Jul 11；23(13)：2569-70.)。

分别以500ng提取的基因组DNA为模板，进行PCR反应。反应体系为25μl，含有500ng基因组DNA、1.5mM MgCl₂、20mM Tris-HCl(pH8.4)、50mM KCl、0.2mM dNTP混合物、0.2μM引物P3和0.2μM引物P2、1U的Taq聚合酶(上海申能博彩生物技术公司)。按照下列方案在PCR-热循环仪(Eppendorf公司，德国)中进行PCR循环：先94℃、5分钟；再94℃、30秒，52℃、30秒，72℃、1分钟，共30个循环；最后72℃、10分钟。

将扩增产物进行电泳，对转基因植物进行PCR实验确认。上述2个株系转TPS基因拟南芥在预期位置均有有PCR扩增条带。

实施例2、培育耐逆植物

一、磷酸海藻糖合成酶基因和磷酸海藻糖磷酸酶基因的克隆

1、磷酸海藻糖合成酶基因的克隆

同实施例1的步骤一。

2、磷酸海藻糖磷酸酶基因的克隆

耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的磷酸海藻糖磷酸酶基因为长750bp，编码249个氨基酸(Nucleotide Accession CP000480，Protein AccessionABK73322)的DNA片段。

参照生物学模式菌株耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的序列人工合成750bp的片段的磷酸海藻糖磷酸酶基因(三博远志)，测序表明，该片段为磷酸海藻糖磷酸酶基因片段，与基因库中序列吻合，将该扩增到的磷酸海藻糖磷酸酶基因片段命名为TPP(其序列是自序列3的5′末端第1787-2536位核苷酸)。

二、拟南芥RuBisCO基因叶绿体转运肽DNA片段和烟草RuBisCO基因转录终止区DNA片段的获得

1、拟南芥RuBisCO基因叶绿体转运肽DNA片段的获得

同实施例1的步骤二的1。

2、烟草RuBisCO基因转录终止区DNA片段的获得

合成引物P11和P12，以烟草基因组DNA为模板，通过55℃复性30秒，72℃、30秒PCR反应扩增得到407bp的DNA片段.测序结果表明，该片段含有烟草RuBisCO基因的3’终止区和22bp的TPP3’端序列，将该片段命名为NtTrbcS(其序列是自序列3的5′末端第2515至2921位核苷酸)。

三、融合基因的获得

合成PCR反应融合引物P7和P8。以P3、P7为引物，AtTP为模板，通过55℃复性30秒，72℃、30秒PCR扩增得到284bp DNA片段；同时以P8、P2为引物，TPS为模板，通过55℃复性30秒，72℃、2分钟PCR扩增得到1528bp DNA片段。将两片段回收，分别取0.1μg混合，作为模板，在不加入引物的条件下，65℃复性30秒，72℃延伸2分钟，反应5个循环，然后加入引物P3和P13，56℃复性30秒，72℃延伸2分钟，反应30个循环，得到1510bp的DNA片段，将该片段命名为dTPSP1，连接到质粒pBluescript II KS(-)的SmaI位点，并测序。序列分析表明dTPSP1包含了TPS基因片段，并融合了拟南芥RuBisCO基因N端编码转运肽的DNA片段，将该质粒命名为pBS::dTPSP1。

0.01μg TPS为模板，P1和P14为引物，65℃复性，72℃延伸2分钟，反应25个循环，得到1527bp的DNA片段。同时分别取0.1μg TPP和NtTrbcS，混合作为模板，在不加引物的条件下，65℃复性30秒，72℃延伸2分钟，反应5个循环，然后加入引物P15和P12，56℃复性，72℃延伸2分钟，反应30个循环，得到1153bp的DNA片段。将上述得到的1527bp和1153bp PCR片段分别回收纯化，取0.1μg混合，在不加引物的条件下，65℃复性，72℃延伸2分钟，反应5个循环，然后加入引物P16和P12，60℃复性30秒，72℃延伸2分钟，反应30个循环，得到1740bp的DNA片段，该片段被命名位dTPSP2，被连接到质粒pBluescript II KS(-)的Hinc II位点处，并测序。序列分析表明dTPSP2包含了TPS基因片段靠3’端的一部分，同时融合了全长的TPP基因片段以及烟草RuBisCO基因终止区的DNA片段，该质粒被命名为pBS::dTPSP2。

Mlu I-Kpn I双酶切pBS::TPSP2，回收1.7kb的片段，插入到经过同样酶切的pBS::TPSP1质粒上，重组质粒被命名为pBS::dTPSP。

dTPSP包含了完整的TPS基因片段(序列3第266-1771位核苷酸)，TPP基因片段(序列3第1787-2536位核苷酸)，TPS和TPP基因间的连接肽DNA序列(序列3第1772-1786位核苷酸)同时在5’端融合了拟南芥RuBisCO基因N端编码转运肽的DNA片段(序列3第1-265位核苷酸)，以及3’端融合了RuBisCO基因终止区的DNA片段(序列3第2537-2921位核苷酸)。

四、融合基因dTPSP植物表达载体的构建

BstXI和XhoI酶切质粒pCAMBIA2300(Genbank Accession Number AF234315)，回收787bp的35S启动子片段，将787bp的35S启动子片段插入pUC18(GenbankAccession Number L09136)的SphI和SalI酶切位点间，得到重组质粒pUC18::35S。随后SpeI和KpnI酶切质粒pBS::dTPSP，得到约3000bp的含有dTPSP的片段，将该片段插入到XbaI和KpnI酶切的pUC18::35S上，得到重组质粒pUC18::35S-dTPSP。

HindIII和KpnI酶切pUC18::35S-dTPSP，回收约3.8kb的35S-TPSP片段，插入到经过同样酶切的pCAMBIA2300上，得到重组质粒pCAMBIA2300::dTPSP(图2)。包含完整的TPS和TPP融合基因并在其5‘端融合了拟南芥RuBisCO基因N端编码转运肽的dTPSPDNA片段受到35S启动子控制，终止子为烟草RuBisCO基因终止区。

该质粒pCAMBIA2300::dTPSP转入到农杆菌LBA4404中，得到菌株LBA4404/TPSP，用于植物组织的侵染。

五、培育耐逆植物

1)转基因植株的获得

拟南芥按常规方法培养，培养条件为：光照时间16/8小时，光照强度不低于5000Lux，温度22摄氏度，湿度70％。

培养介质为按1∶1混匀的蛭石和草炭土，每周浇一次“花无缺”营养液(每2升水加1克，上海永通化工有限公司)，幼苗生长约25天后，第一个花序长到高8厘米左右时从基部掐除，再过一周时间二次抽薹，花蕾刚要露白时进行侵染。农杆菌使用浓度OD6001.2-1.4，菌液4000转离心10分钟收集菌体，以等体积的5％蔗糖溶液悬浮，测其OD600值，换算后用5％的蔗糖稀释至浸染时的使用浓度OD6000.8，加入万分之三体积的Silwet L-77溶液，混匀后进行浸染，浸染方法采取“蘸花法”，即用枪头吸取农杆菌液滴蘸花絮。遮光24小时后重新正常生长。5-6天后进行第二次侵染，共浸染3次。侵染结束后约一个月左右收种。

所得T1代种子在抗性培养基上筛选出转基因苗，方法为：70％酒精表面消毒5分钟，次氯酸钠溶液(5％次氯酸钠+0.5％SDS)，消毒15分钟，无菌水洗涤5遍，播种于1/2MS固体培养基(加卡那霉素30mg/l+羧卞125mg/l)。4℃冰箱放置3天后置于正常培养间光照培养，十天后将抗性苗移至蛭石和草炭土的营养基质中，常规培养，两个半月后收种为T2代种子。

将用上述方法筛选得到的T2代转基因植株的种子培育成小苗，进行耐旱和耐盐试验。共得到了30个株系的转TPSP基因拟南芥。

2)耐旱试验

将步骤1)得到的30个株系的转TPSP基因拟南芥和非转基因拟南芥进行耐旱实验。

具体方法如下：将经过卡那筛选的30个株系的转TPSP基因拟南芥和非转基因拟南芥，每个株系各7株，同时对称地移栽到同一小钵的两侧。每个转基因株系设3个重复。常规管理，浇水3次后停止浇水，三周后复水，一周后观察并拍照。

转基因植株和对照植株的耐旱实验照片见图3A。图3A中，下为转基因植株，上为对照植株，以白牌隔开。

实验结果显示非转基因拟南芥全部枯死，而转TPSP拟南芥有的株系植株恢复生长良好。

3)耐盐试验

将步骤1)得到的30个株系的转TPSP基因拟南芥和非转基因拟南芥进行耐旱实验。

具体方法如下：将经过筛选的30个株系的转TPSP基因拟南芥和非转基因拟南芥，每个株系各6株，同时对称地移栽到同一小钵的两侧。每个转基因株系设3个重复。第一周浇“花无缺”营养液加上100mM Nacl盐水，第二周和第三周浇“花无缺”营养液加上200mM Nacl盐水。第四周观察并拍照。

转基因植株和转空载体植株的照片见图3B。图3B中，下为转基因植株，上为对照植株，以白牌隔开。

非转基因拟南芥渐渐死亡，而转TPSP拟南芥有的株系虽植株生长受影响，但植株仍保持绿色。

4)转基因植株的鉴定

在步骤2)和步骤3)的试验中均存活的转基因株系为4个。

取这4个株系T2代植株的叶片和非转基因拟南芥的叶片，分别提取基因组DNA。提取基因组DNA采用用CTAB法(Steiner JJ，Poklemba CJ，Fjellstrom RG，ElliottLF.，A rapid one-tube genomic DNA extraction process for PCR and RAPDanalyses.Nucleic Acids Res.1995 Jul 11；23(13)：2569-70.)。

分别以500ng提取的基因组DNA为模板，进行PCR反应。反应体系为25μl，含有500ng基因组DNA、1.5mM MgCl₂、20mM Tris-HCl(pH8.4)、50mM KCl、0.2mM dNTP混合物、0.2μM引物P3和0.2μM 引物P2、1U的Taq聚合酶(上海申能博彩生物技术公司)。按照下列方案在PCR-热循环仪(Eppendorf公司，德国)中进行PCR循环：先94℃、5分钟；再94℃、30秒，52℃、30秒，72℃、1分钟，共30个循环；最后72℃、10分钟。

将扩增产物进行电泳，对转基因植物进行PCR实验确认。结果见图4，图4中，泳道1-6泳道分别为：1：1Kb marker；2：非转基因植株；3-6：转基因植株。结果显示，上述4个株系的转TPSP基因拟南芥在预期位置均有有PCR扩增条带。

序列表

<110>北京北方杰士生物科技有限责任公司

<120>一种培育耐逆植物的方法及其专用DNA片段

<130>CGGNARY81387

<160>6

<210>1

<211>2577

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

tcagtcacac aaagagtaaa gaagaacaat ggcttcctct atgctctctt ccgctactat   60

ggttgcctct ccggctcagg ccactatggt cgctcctttc aacggactta agtcctccgc  120

tgccttccca gccacccgca aggctaacaa cgacattact tccatcacaa gcaacggcgg  180

aagagttaac tgcatgcagg tgtggcctcc gattggaaag aagaagtttg agactctctc  240

ttaccttcct gaccttaccg attcctctcc ggagagtggc cacgaaacca tctccgggac  300

ctccgacttc gtggtggtcg ccaaccggct accggtcgat ctggagcggc tgcccgacgg  360

caccacgcga tggaagcgga gccccggtgg cctggtgacc gcactggagc cgctgctgcg  420

caagcggcgc ggctcctgga tcggctgggc cggcgtcgcc gacagtgacg aggaaccgat  480

cgtccaggac ggtctgcagc tgcaccccgt gcggttgtcg gccgacgacg tcgcgaagta  540

ctacgaaggt ttctccaacg ccaccctgtg gccgctctac cacgacctga tcgtcaaacc  600

cgagtaccac cgcgagtggt gggaccggta tgtcgaggtc aaccgccgat tcgccgaggc  660

gacggcgcgc gcggcagccg agggtgccac ggtctggatc caggactacc agctgcagct  720

ggtgcccaag atgctgcgca tgctgcgccc cgatgtgacc atcggcttct tcctgcacat  780

cccgttcccg ccggtcgagc tgttcatgca gatgccgtgg cgcaccgaga tcgtggaagg  840

cctgctcggc gccgacctgg tcgggttcca cctgcccggc ggcgcgcaga acttcctggt  900

gctctcgcgc cggctggtcg gcgccaacac gtcgcgcgcc agcgtcggcg tacggtcgcg   960

cttcggtgag gtgcaggtcg gcttccgcac cgtcaaggtc ggcgccttcc ccatctcgat  1020

cgactcggcc gaactcgacg gcaaggcacg caaccgcgcc atacggcagc gggcccgcca  1080

gatccgcgcc gagctgggca acccccgcaa gatcatgctg ggcgtcgacc gcctcgacta  1140

caccaagggc atcgacgtgc ggctgcgggc actgtccgaa ctgctcgaag agaagcgcat  1200

caagcgtgac gacaccgtgc tggtgcagct cgcgacgccc agccgggaac gcgtcgagag  1260

ctacatcgcg atgcgtgagg acatcgaacg ccaggtcggc cacatcaacg gcgagtacgg  1320

cgaggtcggc cacccgatcg tgcactacct gcaccggccg atcccccgcg acgagctcat  1380

cgcgttcttc gtcgcggccg acgtcatgct cgtgacgccg ttgcgcgacg gcatgaacct  1440

ggtggccaag gagtacgtgg cgtgccgcag cgatctcggc ggtgcgctgg tgctcagcga  1500

attcaccggc gcggcagccg aactgcgcca ggcctacctg gtcaacccgc acgacctcga  1560

gggtgtcaag gacaagatcg aggccgcggt caaccagaac ccagaagagg gcaagcgccg  1620

tatgcgtgcg ctgcgccgcc aggtgctcgc gcacgacgtc gaccggtggg cacgctcatt  1680

cctcgacgcg ctggccgcca ccggcgagac gggcgactcc ggcgtgacgg gcgagtccac  1740

tcctgcgccc gagtccgact ccgggagctt ctagtaattt ccctttgctt ttgtgtaaac  1800

ctcaaaactt tatcccccat ctttgatttt atcccttgtt tttctgcttt tttcttcttt  1860

cttgggtttt aatttccgga cttaacgttt gttttccggt ttgcgagaca tattctatcg  1920

gattctcaac tgtctgatga aataaatatg taatgttcta taagtctttc aatttgatat  1980

gcatatcaac aaaaagaaaa taggacaatg cggctacaaa tatgaaattt acaagtttaa  2040

gaaccatgag tcgctaaaga aatcattaag aaaattagtt tcacattcaa ttcttgtcac  2100

atgattaacg agcttgagag gtttagagta acaatatctt gaagcaaaag atgacccact  2160

tgaaatctag tgatggatac ataagtggac gtgccttgtt taggatagga ttctggataa  2220

gagtctcgaa tattcatttt taccaagtat attcaaggat cttgtggatc atatatttcc  2280

tcaatcaaag ggacttgacc caaattcaca taaagatatt ttggagtcgt ttgtttaggt  2340

actttcgaaa taggataagc tatgtgtggg tcgtaaaaac tcaaaatttt ctttcatttt  2400

tttttttaat tttttcctaa ttagttactg atatagtgta aagttttgaa atattttaaa  2460

cgatttttac ccctttttaa taatttttgt accatttaat ctcaagaatt atacatattg  2520

tttaccaaaa ggttttggtc accatcgaaa acatcgaaat gctcaaatac cacagaa     2577

<210>2

<211>581

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2

Met Ala Ser Ser Met Leu Ser Ser Ala Thr Met Val Ala Ser Pro Ala

1               5                   10                  15

Gln Ala Thr Met Val Ala Pro Phe Asn Gly Leu Lys Ser Ser Ala Ala

            20                  25                  30

Phe Pro Ala Thr Arg Lys Ala Asn Asn Asp Ile Thr Ser Ile Thr Ser

        35                  40                  45

Asn Gly Gly Arg Val Asn Cys Met Gln Val Trp Pro Pro Ile Gly Lys

    50                  55                  60

Lys Lys Phe Glu Thr Leu Ser Tyr Leu Pro Asp Leu Thr Asp Ser Ser

65                  70                  75                  80

Pro Glu Ser Gly His Glu Thr Ile Ser Gly Thr Ser Asp Phe Val Val

                85                  90                  95

Val Ala Asn Arg Leu Pro Val Asp Leu Glu Arg Leu Pro Asp Gly Thr

            100                 105                 110

Thr Arg Trp Lys Arg Ser Pro Gly Gly Leu Val Thr Ala Leu Glu Pro

        115                 120                 125

Leu Leu Arg Lys Arg Arg Gly Ser Trp Ile Gly Trp Ala Gly Val Ala

    130                 135                 140

Asp Ser Asp Glu Glu Pro Ile Val Gln Asp Gly Leu Gln Leu His Pro

145                 150                 155                 160

Val Arg Leu Ser Ala Asp Asp Val Ala Lys Tyr Tyr Glu Gly Phe Ser

                165                 170                 175

Asn Ala Thr Leu Trp Pro Leu Tyr His Asp Leu Ile Val Lys Pro Glu

            180                 185                 190

Tyr His Arg Glu Trp Trp Asp Arg Tyr Val Glu Val Asn Arg Arg Phe

        195                 200                 205

Ala Glu Ala Thr Ala Arg Ala Ala Ala Glu Gly Ala Thr Val Trp Ile

    210                 215                 220

Gln Asp Tyr Gln Leu Gln Leu Val Pro Lys Met Leu Arg Met Leu Arg

225                 230                 235                 240

Pro Asp Val Thr Ile Gly Phe Phe Leu His Ile Pro Phe Pro Pro Val

                245                 250                 255

Glu Leu Phe Met Gln Met Pro Trp Arg Thr Glu Ile Val Glu Gly Leu

            260                 265                 270

Leu Gly Ala Asp Leu Val Gly Phe His Leu Pro Gly Gly Ala Gln Asn

        275                 280                 285

Phe Leu Val Leu Ser Arg Arg Leu Val Gly Ala Asn Thr Ser Arg Ala

    290                 295                 300

Ser Val Gly Val Arg Ser Arg Phe Gly Glu Val Gln Val Gly Phe Arg

305                 310                 315                 320

Thr Val Lys Val Gly Ala Phe Pro Ile Ser Ile Asp Ser Ala Glu Leu

                325                 330                 335

Asp Gly Lys Ala Arg Asn Arg Ala Ile Arg Gln Arg Ala Arg Gln Ile

            340                 345                 350

Arg Ala Glu Leu Gly Asn Pro Arg Lys Ile Met Leu Gly Val Asp Arg

        355                 360                 365

Leu Asp Tyr Thr Lys Gly Ile Asp Val Arg Leu Arg Ala Leu Ser Glu

    370                  375                380

Leu Leu Glu Glu Lys Arg Ile Lys Arg Asp Asp Thr Val Leu Val Gln

385                 390                 395                 400

Leu Ala Thr Pro Ser Arg Glu Arg Val Glu Ser Tyr Ile Ala Met Arg

                405                 410                 415

Glu Asp Ile Glu Arg Gln Val Gly His Ile Asn Gly Glu Tyr Gly Glu

            420                 425                 430

Val Gly His Pro Ile Val His Tyr Leu His Arg Pro Ile Pro Arg Asp

        435                 440                 445

Glu Leu Ile Ala Phe Phe Val Ala Ala Asp Val Met Leu Val Thr Pro

    450                 455                 460

Leu Arg Asp Gly Met Asn Leu Val Ala Lys Glu Tyr Val Ala Cys Arg

465                 470                 475                 480

Ser Asp Leu Gly Gly Ala Leu Val Leu Ser Glu Phe Thr Gly Ala Ala

                485                 490                 495

Ala Glu Leu Arg Gln Ala Tyr Leu Val Asn Pro His Asp Leu Glu Gly

            500                 505                 510

Val Lys Asp Lys Ile Glu Ala Ala Val Asn Gln Asn Pro Glu Glu Gly

        515                 520                 525

Lys Arg Arg Met Arg Ala Leu Arg Arg Gln Val Leu Ala His Asp Val

    530                 535                 540

Asp Arg Trp Ala Arg Ser Phe Leu Asp Ala Leu Ala Ala Thr Gly Glu

545                 550                 555                 560

Thr Gly Asp Ser Gly Val Thr Gly Glu Ser Thr Pro Ala Pro Glu Ser

                565                 570                 575

Asp Ser Gly Ser Phe

            580

<210>3

<211>2921

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

tcagtcacac aaagagtaaa gaagaacaat ggcttcctct atgctctctt ccgctactat     60

ggttgcctct ccggctcagg ccactatggt cgctcctttc aacggactta agtcctccgc    120

tgccttccca gccacccgca aggctaacaa cgacattact tccatcacaa gcaacggcgg    180

aagagttaac tgcatgcagg tgtggcctcc gattggaaag aagaagtttg agactctctc     240

ttaccttcct gaccttaccg attcctctcc ggagagtggc cacgaaacca tctccgggac     300

ctccgacttc gtggtggtcg ccaaccggct accggtcgat ctggagcggc tgcccgacgg     360

caccacgcga tggaagcgga gccccggtgg cctggtgacc gcactggagc cgctgctgcg     420

caagcggcgc ggctcctgga tcggctgggc cggcgtcgcc gacagtgacg aggaaccgat     480

cgtccaggac ggtctgcagc tgcaccccgt gcggttgtcg gccgacgacg tcgcgaagta     540

ctacgaaggt ttctccaacg ccaccctgtg gccgctctac cacgacctga tcgtcaaacc     600

cgagtaccac cgcgagtggt gggaccggta tgtcgaggtc aaccgccgat tcgccgaggc     660

gacggcgcgc gcggcagccg agggtgccac ggtctggatc caggactacc agctgcagct     720

ggtgcccaag atgctgcgca tgctgcgccc cgatgtgacc atcggcttct tcctgcacat     780

cccgttcccg ccggtcgagc tgttcatgca gatgccgtgg cgcaccgaga tcgtggaagg     840

cctgctcggc gccgacctgg tcgggttcca cctgcccggc ggcgcgcaga acttcctggt     900

gctctcgcgc cggctggtcg gcgccaacac gtcgcgcgcc agcgtcggcg tacggtcgcg     960

cttcggtgag gtgcaggtcg gcttccgcac cgtcaaggtc ggcgccttcc ccatctcgat    1020

cgactcggcc gaactcgacg gcaaggcacg caaccgcgcc atacggcagc gggcccgcca    1080

gatccgcgcc gagctgggca acccccgcaa gatcatgctg ggcgtcgacc gcctcgacta    1140

caccaagggc atcgacgtgc ggctgcgggc actgtccgaa ctgctcgaag agaagcgcat    1200

caagcgtgac gacaccgtgc tggtgcagct cgcgacgccc agccgggaac gcgtcgagag    1260

ctacatcgcg atgcgtgagg acatcgaacg ccaggtcggc cacatcaacg gcgagtacgg    1320

cgaggtcggc cacccgatcg tgcactacct gcaccggccg atcccccgcg acgagctcat    1380

cgcgttcttc gtcgcggccg acgtcatgct cgtgacgccg ttgcgcgacg gcatgaacct    1440

ggtggccaag gagtacgtgg cgtgccgcag cgatctcggc ggtgcgctgg tgctcagcga    1500

attcaccggc gcggcagccg aactgcgcca ggcctacctg gtcaacccgc acgacctcga    1560

gggtgtcaag gacaagatcg aggccgcggt caaccagaac ccagaagagg gcaagcgccg    1620

tatgcgtgcg ctgcgccgcc aggtgctcgc gcacgacgtc gaccggtggg cacgctcatt    1680

cctcgacgcg ctggccgcca ccggcgagac gggcgactcc ggcgtgacgg gcgagtccac    1740

tcctgcgccc gagtccgact ccgggagctt cggatcaggt tctggaatga gtctttcggg    1800

ggatctgcag cgcgcgctca ccgcggtcgc tgccacaccg cacctgctgg tcacatccga    1860

tttcgacggc acactcgcgc cgatcgtcaa caaccccgcc gacgcgcggc cgctcgccga    1920

tgccgccgag gccctcgccg cactcgcgga actgccgcag accgcctcgg cgctgatctc    1980

cggacgtgcc ctcgaggtgc tgcgcgcatt gtccgggatg ccggacacgg tgcacctggt  2040

gggaagccac ggcgcggagt tcacctccgg gttcggccac gacatcgaca ccgctctgct  2100

gcaacggatc accgatcggc tccacacgat cgcatcgggc aggcccggtg tcaccgtgga  2160

gaccaaaccg gcaagcgttg cgctgcacgt gcgtaacgcc tcgcccgaac acggcgcggc  2220

cgcgttgacc gaggcacgca cggccgccgc ggagtgggac gctcagctca ccgagggcaa  2280

ggcagtgctc gaattcgcgg ttatccagac cgacaagggt gaggcggtcg acatcctgcg  2340

gcaacaggaa aacgccacgg cagtggtgtt tttcggcgac gacgtcaccg acgagaaggc  2400

gttccgccgg ttgcgcggcg acgacgtcgg cgtcaaggtc ggaccgggtg agagcctcgc  2460

ggcgtaccgt gtcgactcac cggaagacgt tgccgcagcg cttgatcacc ttctcgccgt  2520

gcgccgcggc gcatagtcac gccggctcat attaggacaa cttaccctat tgtctgactt  2580

taggggcagt ttgtttgaaa tgttacttag cttctttttt tttcttcttc ccacaaaaat  2640

tgtttatgtt tcctactttc tattcggtgt atgtttttgg attcctacca agttatgaga  2700

actaataata attatgattt ggtgctttgt ttgtaaattt tgttgtttca cattcgtgtg  2760

gcgtatatga gtttcatctt gataatatct gcaaatctta aatgcaaatt atggtccaca  2820

cattcaccct catcccaacc acttctagaa tatgaaagtt attcaatcat tccttcactt  2880

cccaaaaagt tattgtgctt catttgtatg ggctgccctt a                      2921

<210>4

<211>835

<212>PRT

<213>人工序列

<400>4

Met Ala Ser Ser Met Leu Ser Ser Ala Thr Met Val Ala Ser Pro Ala

1               5                   10                  15

Gln Ala Thr Met Val Ala Pro Phe Asn Gly Leu Lys Ser Ser Ala Ala

            20                  25                  30

Phe Pro Ala Thr Arg Lys Ala Asn Asn Asp Ile Thr Ser Ile Thr Ser

        35                  40                  45

Asn Gly Gly Arg Val Asn Cys Met Gln Val Trp Pro Pro Ile Gly Lys

    50                  55                  60

Lys Lys Phe Glu Thr Leu Ser Tyr Leu Pro Asp Leu Thr Asp Ser Ser

65                  70                  75                  80

Pro Glu Ser Gly His Glu Thr Ile Ser Gly Thr Ser Asp Phe Val Val

                85                  90                  95

Val Ala Asn Arg Leu Pro Val Asp Leu Glu Arg Leu Pro Asp Gly Thr

            100                 105                 110

Thr Arg Trp Lys Arg Ser Pro Gly Gly Leu Val Thr Ala Leu Glu Pro

        115                 120                 125

Leu Leu Arg Lys Arg Arg Gly Ser Trp Ile Gly Trp Ala Gly Val Ala

    130                 135                 140

Asp Ser Asp Glu Glu Pro Ile Val Gln Asp Gly Leu Gln Leu His Pro

145                 150                 155                 160

Val Arg Leu Ser Ala Asp Asp Val Ala Lys Tyr Tyr Glu Gly Phe Ser

                165                 170                 175

Asn Ala Thr Leu Trp Pro Leu Tyr His Asp Leu Ile Val Lys Pro Glu

            180                 185                 190

Tyr His Arg Glu Trp Trp Asp Arg Tyr Val Glu Val Asn Arg Arg Phe

        195                 200                 205

Ala Glu Ala Thr Ala Arg Ala Ala Ala Glu Gly Ala Thr Val Trp Ile

    210                 215                 220

Gln Asp Tyr Gln Leu Gln Leu Val Pro Lys Met Leu Arg Met Leu Arg

225                 230                 235                 240

Pro Asp Val Thr Ile Gly Phe Phe Leu His Ile Pro Phe Pro Pro Val

                245                 250                 255

Glu Leu Phe Met Gln Met Pro Trp Arg Thr Glu Ile Val Glu Gly Leu

            260                 265                 270

Leu Gly Ala Asp Leu Val Gly Phe His Leu Pro Gly Gly Ala Gln Asn

        275                 280                 285

Phe Leu Val Leu Ser Arg Arg Leu Val Gly Ala Asn Thr Ser Arg Ala

    290                 295                 300

Ser Val Gly Val Arg Ser Arg Phe Gly Glu Val Gln Val Gly Phe Arg

305                 310                 315                320

Thr Val Lys Val Gly Ala Phe Pro Ile Ser Ile Asp Ser Ala Glu Leu

                325                 330                 335

Asp Gly Lys Ala Arg Asn Arg Ala Ile Arg Gln Arg Ala Arg Gln Ile

            340                 345                 350

Arg Ala Glu Leu Gly Asn Pro Arg Lys Ile Met Leu Gly Val Asp Arg

        355                 360                 365

Leu Asp Tyr Thr Lys Gly Ile Asp Val Arg Leu Arg Ala Leu Ser Glu

    370                 375                 380

Leu Leu Glu Glu Lys Arg Ile Lys Arg Asp Asp Thr Val Leu Val Gln

385                 390                 395                 400

Leu Ala Thr Pro Ser Arg Glu Arg Val Glu Ser Tyr Ile Ala Met Arg

                405                 410                 415

Glu Asp Ile Glu Arg Gln Val Gly His Ile Asn Gly Glu Tyr Gly Glu

            420                 425                 430

Val Gly His Pro Ile Val His Tyr Leu His Arg Pro Ile Pro Arg Asp

        435                 440                 445

Glu Leu Ile Ala Phe Phe Val Ala Ala Asp Val Met Leu Val Thr Pro

    450                 455                 460

Leu Arg Asp Gly Met Asn Leu Val Ala Lys Glu Tyr Val Ala Cys Arg

465                 470                 475                 480

Ser Asp Leu Gly Gly Ala Leu Val Leu Ser Glu Phe Thr Gly Ala Ala

                485                 490                 495

Ala Glu Leu Arg Gln Ala Tyr Leu Val Asn Pro His Asp Leu Glu Gly

            500                 505                 510

Val Lys Asp Lys Ile Glu Ala Ala Val Asn Gln Asn Pro Glu Glu Gly

        515                 520                 525

Lys Arg Arg Met Arg Ala Leu Arg Arg Gln Val Leu Ala His Asp Val

    530                 535                 540

Asp Arg Trp Ala Arg Ser Phe Leu Asp Ala Leu Ala Ala Thr Gly Glu

545                 550                 555                 560

Thr Gly Asp Ser Gly Val Thr Gly Glu Ser Thr Pro Ala Pro Glu Ser

                565                 570                 575

Asp Ser Gly Ser Phe Gly Ser Gly Ser Gly Met Ser Leu Ser Gly Asp

            580                 585                 590

Leu Gln Arg Ala Leu Thr Ala Val Ala Ala Thr Pro His Leu Leu Val

        595                 600                 605

Thr Ser Asp Phe Asp Gly Thr Leu Ala Pro Ile Val Asn Asn Pro Ala

    610                 615                 620

Asp Ala Arg Pro Leu Ala Asp Ala Ala Glu Ala Leu Ala Ala Leu Ala

625                 630                 635                 640

Glu Leu Pro Gln Thr Ala Ser Ala Leu Ile Ser Gly Arg Ala Leu Glu

                645                 650                 655

Val Leu Arg Ala Leu Ser Gly Met Pro Asp Thr Val His Leu Val Gly

            660                 665                 670

Ser His Gly Ala Glu Phe Thr Ser Gly Phe Gly His Asp Ile Asp Thr

        675                 680                 685

Ala Leu Leu Gln Arg Ile Thr Asp Arg Leu His Thr Ile Ala Ser Gly

    690                 695                 700

Arg Pro Gly Val Thr Val Glu Thr Lys Pro Ala Ser Val Ala Leu His

705                 710                 715                 720

Val Arg Asn Ala Ser Pro Glu His Gly Ala Ala Ala Leu Thr Glu Ala

                725                 730                 735

Arg Thr Ala Ala Ala Glu Trp Asp Ala Gln Leu Thr Glu Gly Lys Ala

            740                 745                 750

Val Leu Glu Phe Ala Val Ile Gln Thr Asp Lys Gly Glu Ala Val Asp

        755                 760                 765

Ile Leu Arg Gln Gln Glu Asn Ala Thr Ala Val Val Phe Phe Gly Asp

    770                 775                 780

Asp Val Thr Asp Glu Lys Ala Phe Arg Arg Leu Arg Gly Asp Asp Val

785                 790                 795                 800

Gly Val Lys Val Gly Pro Gly Glu Ser Leu Ala Ala Tyr Arg Val Asp

                805                 810                 815

Ser Pro Glu Asp Val Ala Ala Ala Leu Asp His Leu Leu Ala Val Arg

            820                 825                 830

Arg Gly Ala

        835

<210>5

<211>265

<212>DNA

<213>拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>5

tcagtcacac aaagagtaaa gaagaacaat ggcttcctct atgctctctt ccgctactat   60

ggttgcctct ccggctcagg ccactatggt cgctcctttc aacggactta agtcctccgc  120

tgccttccca gccacccgca aggctaacaa cgacattact tccatcacaa gcaacggcgg  180

aagagttaac tgcatgcagg tgtggcctcc gattggaaag aagaagtttg agactctctc  240

ttaccttcct gaccttaccg attcc                                        265

<210>6

<211>79

<212>PRT

<213>拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>6

Met Ala Ser Ser Met Leu Ser Ser Ala Thr Met Val Ala Ser Pro Ala

1               5                   10                  15

Gln Ala Thr Met Val Ala Pro Phe Asn Gly Leu Lys Ser Ser Ala Ala

            20                  25                  30

Phe Pro Ala Thr Arg Lys Ala Asn Asn Asp Ile Thr Ser Ile Thr Ser

        35                  40                  45

Asn Gly Gly Arg Val Asn Cys Met Gln Val Trp Pro Pro Ile Gly Lys

    50                  55                  60

Lys Lys Phe Glu Thr Leu Ser Tyr Leu Pro Asp Leu Thr Asp Ser

65                  70                  75

Claims (9)

1.一种融合蛋白，为下述a)、b)、c)或d)的蛋白质：

a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列2衍生的蛋白质；

c)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

d)将序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列4衍生的蛋白质。

2.权利要求1所述融合蛋白的编码基因。

3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因是如下1)或2)的DNA分子之一：

1)其编码序列是序列表中序列1自5′末端第29-1771位脱氧核糖核苷酸所示的DNA分子；

2)其编码序列是序列表中序列3自5′末端第29-2536位脱氧核糖核苷酸所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的表达盒。

5.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体，所述表达载体为如图1所示的表达载体或如图2所示的表达载体。

6.含有权利要求2或3所述基因的转基因细胞系。

7.含有权利要求2或3所述基因的重组菌。

8.一种培育耐逆植物的方法，是将权利要求1所述蛋白的编码基因导入植物细胞，得到耐逆性增强的植物。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述蛋白的编码基因通过如图1所示的表达载体或如图2所示的表达载体导入植物细胞；所述耐逆性为耐盐和/或耐旱。

Images