CN102575262B - 能够赋予环境胁迫耐受性至植物的基因和利用该基因的方法 - Google Patents
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Abstract
根据本发明，将环境胁迫耐受性赋予植物或改善了植物的环境胁迫耐受性。将至少一个基因导入植物中，所述基因选自由选自第一组(包括At2g33080)的LRR‑RLP基因、选自第二组(包括At1g69990)的LRR‑RLK基因和选自第三组(包括At5g39390)的LRR‑RLK基因所组成的组，或在植物中改变内在的该基因的表达控制区。
Description
技术领域
本发明涉及已经将给定基因导入其中的植物或其中已经改变了内在的该基因的表达控制区的植物，用于通过导入给定基因至植物或改变其中内在的该基因的表达控制区而赋予环境胁迫耐受性至所述植物的方法，以及用于产生已经赋予了环境胁迫耐受性的植物的方法。
背景技术
植物生长的可能性取决于不同的环境因素，如温度、湿度和土壤中盐的浓度。在一些情况下，以此类因素为特征的环境适合某种植物但是不适合其他植物。通常，会影响植物生长的上述因素称作环境胁迫。给定植物在以某些环境胁迫为特征的环境中不能生长或遭受致命损害的情况被解释为该植物缺少环境胁迫耐受性。另一方面，给定植物可以在以某些环境胁迫为特征的环境中生长的情况被解释为该植物具有环境胁迫耐受性。
将植物进行栽培，旨在使用它们的一些组织(例如，种子、根、叶或茎)或旨在产生多种物质如脂肪和油。目前已知的从植物产生的脂肪和油的实例包括大豆油、芝麻油、橄榄油、椰子油、米糠油、棉籽油、向日葵油、玉米油、红花油、棕榈油和菜籽油。此类脂肪和油广泛地用于家居和工业应用。另外，使用从植物产生的脂肪和油作为生物柴油燃料或生物塑料的原料，并且其可应用性因作为石油的替代能源而日益增加。
如果可以赋予环境胁迫耐受性至植物，则可能扩展植物可以生长的地区，从而允许有效使用有限的土地空间。特别地，将能量作物如甘蔗用作生物燃料的原料。因此，期望此类能量作物获得针对多种环境胁迫的抗性。也就是说，如果可以赋予环境胁迫耐受性至上述能量作物，则所述能量作物可以在因上述环境因素而不能栽培该作物的地区栽培。
专利文件1和2以及非专利文件1中描述了用于赋予环境胁迫耐受性至植物的技术。专利文件1公开了通过导入基因至植物来赋予盐胁迫耐受性至该植物的方法，其中所述基因参与合成充当渗压剂的甘氨酸甜菜碱。专利文件2和非专利文献1公开了通过导入基因至植物中赋予环境胁迫耐受性至该植物的方法，其中所述基因编码源自烟草的受体样蛋白。
此外，在专利文件2和非专利文件1中，将编码受体样蛋白的基因导入。然而，这些文献没有公开采用编码具有富亮氨酸重复结构的受体样蛋白的基因或编码具有富亮氨酸重复结构的受体样蛋白激酶的基因的基因导入实例。另外，非专利文献2和3报道了具有富亮氨酸重复结构的受体样蛋白激酶在针对胁迫的反应中发挥重要作用。
引文表
专利文献
PTL 1：日本专利公开(特开)号8-266179A(1996)
PTL 2：日本专利公开(特开)号2001-252084A
PTL 3：日本专利公开(特表)号2007-530063A
非专利文献
NPL 1：Plant Physiology，2003年2月，第131卷，第454-462页
NPL 2：Plant Physiology，2007年4月，第113卷，第1203-1212页
NPL 3：Plant Cell，2005年4月，第17卷(4)，第1105-1119页
发明概述
技术问题
目前不可能通过将编码具有富亮氨酸重复结构的受体样蛋白的基因或编码具有富亮氨酸重复结构的受体样蛋白激酶的基因导入植物中赋予环境胁迫耐受性至该植物。
因此，鉴于上述情况，本发明的目的是提供用于探索基因的技术，所述基因具有赋予环境胁迫耐受性至植物或改善植物的环境胁迫耐受性的新功能，从而允许赋予环境胁迫耐受性至植物或允许改善植物环境胁迫耐受性。
技术问题的解决方案
为了达到上述目的，本发明人新近发现，通过分析具有富亮氨酸重复结构的许多蛋白质并且将编码具有富亮氨酸重复结构的受体样蛋白的特定基因或编码具有富亮氨酸重复结构的受体样蛋白激酶的特定基因导入植物中或改变内在的该基因的表达控制区，可以赋予环境胁迫耐受性至植物。这已经导致本发明的完成。
具体而言，本发明的植物是已经将至少一个基因导入其中的植物，所述基因选自由以下基因组成的组：选自第一组(包括At5g40170、At2g25440、At2g32680、At3g24900、At3g25020、At3g25010、At2g33020、At2g33080、At2g32660、At2g33050和At2g33060)的编码具有富亮氨酸重复结构的受体样蛋白的基因；选自第二组(包括At3g28450、At1g27190和At1g69990)的编码具有富亮氨酸重复结构的受体样激酶的基因；和选自第三组(包括At3g47570、At3g47580、At3g47090、At3g47110、At5g20480和At5g39390)的编码具有富亮氨酸重复结构的受体样激酶的基因；或它是其中内在的该基因的表达控制区已经改变的植物。
此外，用于赋予环境胁迫耐受性至本发明植物的方法包括导入至少一个基因，其中所述基因选自由以下基因组成的组：选自第一组(包括At5g40170、At2g25440、At2g32680、At3g24900、At3g25020、At3g25010、At2g33020、At2g33080、At2g32660、At2g33050和At2g33060)的编码具有富亮氨酸重复结构的受体样蛋白的基因；选自第二组(包括At3g28450、At1g27190和At1g69990)的编码具有富亮氨酸重复结构的受体样激酶的基因；和选自第三组(包括At3g47570、At3g47580、At3g47090、At3g47110、At5g20480和At5g39390)的编码具有富亮氨酸重复结构的受体样激酶的基因；或改变内在的该基因的表达控制区。
另外，用于产生本发明植物的方法包括步骤：制备已经将至少一个基因导入其中的转化植物，所述基因选自由以下基因组成的组：选自第一组(包括At5g40170、At2g25440、At2g32680、At3g24900、At3g25020、At3g25010、At2g33020、At2g33080、At2g32660、At2g33050和At2g33060)的编码具有富亮氨酸重复结构的受体样蛋白的基因；选自第二组(包括At3g28450、At1g27190和At1g69990)的编码具有富亮氨酸重复结构的受体样激酶的基因；和选自第三组(包括At3g47570、At3g47580、At3g47090、At3g47110、At5g20480和At5g39390)的编码具有富亮氨酸重复结构的受体样激酶的基因，或制备其中内在的该基因的表达控制区已经改变的转化植物；并且评价转化植物的后代植物的环境胁迫耐受性并选择具有显著改善的环境胁迫耐受性的株系。
这里，编码具有富亮氨酸重复结构的受体样蛋白的选自第一组的基因实例是由At5g40170、At2g25440、At2g32680、At3g24900、At3g25020、At3g25010、At2g33020、At2g33080、At2g32660、At2g33050和At2g33060所详述的基因和功能上与其等同的基因。特别优选地，选自第一组的基因是选自由At2g25440、At2g32680、At3g24900、At3g25020、At3g25010、At2g33020和At2g33080所详述的基因中的基因和功能上与其等同的基因。进一步优选地，选自第一组的基因是选自由At2g33020和At2g33080所详述的基因中的基因和功能上与其等同的基因。
特别优选地，编码具有富亮氨酸重复结构的受体样蛋白的选自第一组的基因编码任一种以下(a)至(c)的蛋白质：
(a)包含SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的蛋白质；
(b)蛋白质，其包含相对于SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列具有一个或多个氨基酸的缺失、置换、添加或插入的氨基酸序列并且具有富亮氨酸重复结构和受体样活性，和
(c)蛋白质，其由严格条件下杂交至包含与SEQ ID NO：1中所示核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸的多核苷酸编码并且具有富亮氨酸重复结构和受体样活性。
此外，编码具有富亮氨酸重复结构的受体样激酶的选自第二组的基因实例包括由At3g28450、At1g27190和At1g69990所详述的基因和功能上与其等同的基因。特别优选地，选自第二组的基因的实例包括选自由At1g27190和At1g69990所详述的基因组成的组中的基因和功能上与其等同的基因。
特别优选地，编码具有富亮氨酸重复结构的受体样激酶的选自第二组的基因是编码以下蛋白质(a)至(c)中任一种的基因：
(a)包含SEQ ID NO：4中所示氨基酸序列的蛋白质；
(b)蛋白质，其包含相对于SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列具有一个或多个氨基酸的缺失、置换、添加或插入的氨基酸序列并且具有富亮氨酸重复结构和受体样激酶活性，和
(c)蛋白质，其由严格条件下杂交至包含与SEQ ID NO：3中所示核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸的多核苷酸编码并且具有富亮氨酸重复结构和受体样激酶活性。
另外，编码具有富亮氨酸重复结构的受体样激酶的选自第三组的基因实例包括由At3g47570、At3g47580、At3g47090、At3g47110、At5g20480和At5g39390所详述的基因和功能上与其等同的基因。选自第三组的基因的特别优选的实例包括由At3g47110、At5g20480和At5g39390所详述的基因和功能上与其等同的基因。选自第三组的基因的进一步优选的实例包括由At5g20480和At5g39390所详述的基因和功能上与其等同的基因。
特别优选地，编码具有富亮氨酸重复结构的受体样激酶的选自第三组的基因是编码以下蛋白质(a)至(c)中任一种的基因：
(a)包含SEQ ID NO：6中所示氨基酸序列的蛋白质；
(b)蛋白质，其包含相对于SEQ ID NO：6中所示的氨基酸序列具有一个或多个氨基酸的缺失、置换、添加或插入的氨基酸序列并且具有富亮氨酸重复结构和受体样激酶活性，和
(c)蛋白质，其由严格条件下杂交至包含与SEQ ID NO：5中所示核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸的多核苷酸编码并且具有富亮氨酸重复结构和受体样激酶活性。
本发明的植物的实例包括双子叶植物如十字花科(Brassicaceae)的植物。十字花科植物的实例包括拟南芥(Arabidopsis thaliana)和油籽油菜。本发明的植物的其他实例包括单子叶植物如禾本科(Gramineae)的植物。禾本科植物的实例包括稻和甘蔗。
发明的有利效果
本发明的植物是就环境胁迫(如盐胁迫)耐受性而言显示出胜过野生型植物的显著改善的植物。此外，根据用于赋予环境胁迫的本发明方法，目的植物可以就环境胁迫耐受性而言显示出胜过野生型植物的显著改善。另外，根据用于产生本发明植物的方法，可以产生就环境胁迫耐受性而言显示出胜过野生型植物的显著改善的植物。因此，例如，在使用本发明的情况下，可以显著地扩展植物栽培条件，在生产植物本身时，可以增加生产量，并且可以降低植物生产的成本。
附图简述
[图1]图1是转化植物和野生型植物(在具有高盐浓度的培养基中)的发芽或生长状态的照片，其中含有At1g69990的ORF的片段已经导入所述转化植物中。
[图2]图2是转化植物和野生型植物(在具有高盐浓度的培养基中)的发芽或生长状态的照片，其中含有At5g39390的ORF的片段已经导入所述转化植物中。
[图3]图3是转化植物和野生型植物(在具有高盐浓度的培养基中)的发芽或生长状态的照片，其中含有At3g05650的ORF的片段已经导入所述转化植物中。
[图4]图4是转化植物和野生型植物(在具有高盐浓度的培养基中)的发芽或生长状态的照片，其中含有At2g33080的ORF的片段已经导入所述转化植物中。
[图5]图5是转化植物和野生型植物(在具有高盐浓度的培养基中)的发芽或生长状态的照片，其中含有At1g71830的ORF的片段已经导入所述转化植物中。
实施方案描述
以下，进一步详细描述本发明。
本发明的植物是已经将下述基因导入其中的植物：编码具有富亮氨酸重复结构的受体样蛋白(下文缩写为LRR-RLP)的基因；编码具有富亮氨酸重复结构的受体样激酶(下文缩写为LRR-RLK)的基因或功能上与LRR-RLP基因或LRR-RLK基因等同的基因；或是其中内在的该基因的表达控制区已经改变的植物。这种植物就环境胁迫耐受性而言显示出胜过野生型植物的改善。本文所用的术语“环境胁迫”指盐胁迫、高温胁迫、干旱胁迫等。特别优选地，赋予本发明植物的环境胁迫耐受性的类型是盐胁迫耐受性。即，优选地，本发明的植物就盐胁迫耐受性而言显示出胜过野生型植物的显著改善。环境胁迫(如盐胁迫)抗性的改善表明植物可以在其中存在造成野生型植物不可能或难以生长的环境胁迫的条件下生长。
随着外源靶基因导入植物中或改变目的植物中内在的该基因的表达控制区，可以显著地增加靶基因的表达水平至比野生型植物更高的水平。此外，上文所述的LRR-RLP基因、LRR-RLK基因等可以在本发明植物的全部植物组织中表达。它也可以在至少一些植物组织中表达。这里，术语“植物组织”指植物器官如叶、茎、种子、根和花。
此外，术语“表达控制区”在其含义上包括用于RNA聚合酶结合的启动子区和用于不同转录因子结合的区域。为改变转录性控制区，优选的是将例如内源转录性控制区中的启动子区替换为可以比所述内源启动子区更高表达的启动子区。
LRR-RLP基因
根据本发明，LRR-RLP基因包含编码具有富亮氨酸重复结构的受体样蛋白的基因，其选自包括由At5g40170所述的基因(称作At5g40170基因(这同样适用于以下基因))、At2g25440基因、At2g32680基因、At3g24900基因、At3g25020基因、At3g25010基因、At2g33020基因、At2g33080基因、At2g32660基因、At2g33050基因和At2g33060基因的第一组。本文中，术语“第一组”指由可以被评价为与At2g33080基因在功能上等同或相同的基因的组构成的组，其中所述基因以如以下实施例中所述的方式导入植物中，从而改善植物中的盐胁迫耐受性。可以使用例如SALAD数据库搜索或鉴定可以被评价为与At2g33080基因在功能上等同或相同的基因的组。
更具体地，对于拟南芥而言，第一组中所包括的LRR-RLP基因的实例是At5g40170基因、At2g25440基因、At2g32680基因、At3g24900基因、At3g25020基因、At3g25010基因、At2g33020基因、At2g33080基因、At2g32660基因、At2g33050基因和At2g33060基因。根据本发明，导入选自以上组的基因中的至少一个基因或改变内在的该基因的表达控制区。特别地，用于基因导入或改变表达控制区的本发明靶基因优选地是At2g25440基因、At2g32680基因、At3g24900基因、At3g25020基因、At3g25010基因、At2g33020基因或At2g33080基因，并且更优选地是At2g33020基因或At2g33080基因。根据本发明，特别优选导入At2g33080基因或改变内源性At2g33080基因的表达控制区。
作为实例，At2g33080基因的编码区的核苷酸序列在SEQ ID NO：1中显示并且由At2g33080基因编码的蛋白质的氨基酸序列在SEQ ID NO：2中显示。此外，在SEQ ID NOS：24、26、28、30、32、34、36、38、40和42中分别显示以下基因的编码区的核苷酸序列：At5g40170基因、At2g25440基因、At2g32680基因、At3g24900基因、At3g25020基因、At3g25010基因、At2g33020基因、At2g32660基因、At2g33050基因和At2g33060基因。在SEQID NOS：25、27、29、31、33、35、37、39、41和43中显示所编码蛋白质的氨基酸序列。
此外，根据本发明，可以导入功能上与拟南芥来源的上述LRR-RLP基因如At2g33080基因等同的基因或可以改变内在的该基因的表达控制区。这里，术语“功能上等同的基因”指编码LRR-RLP的基因，其包含于所述第一组中并且从非拟南芥属生物获得。
不具体地限制功能上等同的上述基因。可以通过检索含有多种生物的基因序列的数据库鉴定这种基因。具体而言，例如，使用SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列或SEQ IDNO：2中所示的氨基酸序列作为查询序列，检索DDBJ/EMBL/GenBank国际核苷酸序列数据库或SWISS-PROT数据库。因而，可以在数据库中轻易地检索到或鉴定靶基因。
这里，不限制非拟南芥属生物。然而，其一个实例是稻。具体而言，功能上等同的基因的一个实例是来自稻的Os01g0132100基因。此外，来自非拟南芥属或非稻植物的功能上等同的基因的实例是源自卷心菜(甘蓝(Brassica oleracea))的基因(UniProt数据库登录号ACB59218)。在SEQ ID NO：7中显示Os01g0132100基因的编码区的核苷酸序列。在SEQ IDNO：8中显示由该基因编码的蛋白质的氨基酸序列。在SEQ ID NO：9中显示ACB59218基因的编码区的核苷酸序列。在SEQ ID NO：10中显示由该基因编码的蛋白质的氨基酸序列。
此外，根据本发明，LRR-RLP基因不限于包含SEQ ID NOS：1、7、9、24、26、28、30、32、34、36、38、40和42中所示的核苷酸序列并且编码SEQ ID NOS：2、8、10、25、27、29、31、33、35、37、39、41和43中所示氨基酸序列的上述LRR-RLP基因。因而，LRR-RLP基因可以是这样的基因，其含有相对于SEQ ID NOS：2、8、10、25、27、29、31、33、35、37、39、41和43中所示的氨基酸序列具有一个或多个氨基酸的缺失、置换、添加或插入并且作为LRR-RLP基因发挥作用。这里，术语“多个氨基酸”指例如1至20个、优选地1至10个、更优选地1至7个、进一步优选地1至5个并且特别优选地1至3个氨基酸。此外，可以通过用本领域已知的技术改变编码上述LRR-RLP基因的核苷酸序列开展氨基酸缺失、置换或添加。可以通过已知的技术如Kunkel法或缺口双链体法(Gapped duplex method)或基于其的方法，将突变导入核苷酸序列中。例如，以使用位点定向诱变(例如，Mutant-K或Mutant-G(二者均为TAKARA Bio的商标名称)等的诱变试剂盒或LA PCR体外诱变系列试剂盒(商品名称，TAKARA Bio)导入突变。另外，诱变方法可以是：使用由EMS(甲磺酸乙酯)、5-溴尿嘧啶、2-氨基嘌呤、羟胺、N-甲基-N’-硝基-N亚硝基胍或其他致癌性化合物代表的化学突变剂的方法，或包括通常使用X射线、α射线、β射线、γ射线、离子束等的辐射处理或紫外(UV)处理的方法。
另外，LRR-RLP基因可以是与包含SEQ ID NOS：1、7和9中所示核苷酸序列并且编码SEQ ID NOS：2、8、10、25、27、29、31、33、35、37、39、41和43中所示氨基酸序列的LRR-RLP基因同源的基因。这里，术语“同源基因”通常指已经从共同祖先基因进化上分化的基因，包括2个类型物种的同源基因(直向同源物)和因相同物种内部发生的重叠分支所产生的同源基因(旁系同源物)。换句话说，以上术语“功能上等同的基因”指同源基因如直向同源物或旁系同源物。另外，以上术语“功能上等同的基因”也可以指不从共同基因进化，但是单纯具有类似功能的基因。
功能与包含SEQ ID NOS：1、7、9、24、26、28、30、32、34、36、38、40和42中所示核苷酸序列并且编码SEQ ID NOS：2、8、10、25、27、29、31、33、35、37、39、41和43中所示氨基酸序列的LRR-RLP基因相似的基因的实例包括编码具有与上述这些氨基酸序列具有70％或更多、优选80％或更多、更优选90％或更多并且最优选95％或更多的相似性的氨基酸序列并且具有LRR-RLP活性的蛋白质的基因。这里，相似性的值指可以基于默认设置，使用安装有BLAST(基本局部比对检索工具)程序的计算机和含有基因序列信息的数据库找到的值。
另外，当植物基因组信息仍未阐明时，可以通过以下方式鉴定具有与包含SEQ IDNOS：1、7、9、24、26、28、30、32、34、36、38、40和42中所示核苷酸序列并且编码SEQ ID NOS：2、8、10、25、27、29、31、33、35、37、39、41和43中所示氨基酸序列的LRR-RLP基因相似的功能的基因：从目的植物提取基因组或构建目的植物的cDNA文库并且随后分离在严格条件下与包含SEQ ID NOS：1、7、9、24、26、28、30、32、34、36、38、40和42中所示核苷酸序列的LRR-RLP基因的至少某些部分杂交的基因组区域或cDNA。这里，术语“严格条件”指特异性杂合体形成，但是非特异性杂合体从不形成的条件。例如，此类条件包括在45℃用6x SSC(氯化钠/柠檬酸钠)杂交，随后在50℃至65℃用0.2-1x SSC和0.1％SDS洗涤。备选地，此类条件包括在65℃至70℃用1x SSC杂交，随后在65℃至70℃用0.3xSSC洗涤。杂交可以通过常规的已知方法如J.Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold SpringHarbor Laboratory(1989)中所述的方法进行。
LRR-RLK基因
根据本发明，LRR-RLK基因包括编码具有富亮氨酸重复结构的受体样激酶的基因，并且选自包含At3g28450基因、At1g27190基因和At1g69990基因的第二组或包含At3g47570基因、At3g47580基因、At3g47090基因、At3g47110基因、At5g20480基因和At5g39390基因的第三组。
这里，术语“第二组”指由可以被评价为与At1g69990基因在功能上等同或相同的基因的组构成的组，其中所述基因以如以下实施例中所述的方式导入植物中，从而可以改善植物中的盐胁迫耐受性。此外，术语“第三组”指由可以被评价为与Ag5g39390基因在功能上等同或相同的基因的组构成的组，其中所述基因以如以下实施例中所述的方式导入植物中，从而改善植物中的盐胁迫耐受性。可以使用例如SALAD数据库搜索或鉴定可以被评价为与At1g69990基因或Ag5g39390基因在功能上等同或相同的基因的组。
更具体地，包含于第二组中的拟南芥LRR-RLK基因的实例是At3g28450基因、At1g27190基因和At1g69990基因。根据本发明，导入选自以上组的基因中的至少一个基因或改变内在的该基因的表达控制区。特别地，用于基因导入或改变表达控制区的靶基因优选地是At1g27190基因或At1g69990基因。根据本发明，特别优选导入At1g69990基因或改变内源性At1g69990基因的表达控制区。
作为实例，At1g69990基因的编码区的核苷酸序列在SEQ ID NO：3中显示并且由At1g69990基因编码的蛋白质的氨基酸序列在SEQ ID NO：4中显示。
更具体地，包含于第三组中的拟南芥LRR-RLP基因的实例是At3g47570基因、At3g47580基因、At3g47090基因、At3g47110基因、At5g20480基因和At5g39390基因。根据本发明，导入选自以上组的基因中的至少一个基因或改变内在的该基因的表达控制区。特别地，用于基因导入或改变表达控制区的靶基因优选地是At3g47110基因、At5g20480基因或At5g39390基因，并且更优选地是At5g20480基因或At5g39390基因。根据本发明，特别优选导入At5g39390基因或改变内源性At5g39390基因的表达控制区。
作为实例，At5g39390基因的编码区的核苷酸序列在SEQ ID NO：5中显示并且由At5g39390基因编码的蛋白质的氨基酸序列在SEQ ID NO：6中显示。
此外，根据本发明，可以导入功能上与拟南芥来源的上述LRR-RLK基因如At1g69990基因或At5g39390基因等同的基因或可以改变内在的该基因的表达控制区。这里，术语“功能上等同的基因”指编码LRR-RLK的基因，其包含于所述第二或第三组中并且从非拟南芥属生物获得。
不具体地限制功能上等同的上述基因。可以通过检索含有多种生物的基因序列的数据库鉴定这种基因。具体而言，例如，使用SEQ ID NO：3或5中所示的核苷酸序列或SEQ IDNO：4或6中所示的氨基酸序列作为查询序列，检索DDBJ/EMBL/GenBank国际核苷酸序列数据库或SWISS-PROT数据库。因而，可以在数据库中轻易地检索到或鉴定靶基因。
这里，不限制非拟南芥属生物。然而，其一个实例是稻。具体而言，At1g69990基因的功能上等同的基因的一个实例是来自稻的Os04g0487200基因。此外，来自非拟南芥属或非稻植物的At1g69990基因的功能上等同基因的实例包括源自西加云杉(Sitka Spruce)(北美云杉(Picea sitchensis))的基因(UniProt数据库登录号ABR16721)和源自欧洲葡萄(Vitis vinifera)的基因(UniProt数据库登录号CAO14859)。
在SEQ ID NO：11中显示Os04g0487200基因的编码区的核苷酸序列。在SEQ ID NO：12中显示由该基因编码的蛋白质的氨基酸序列。在SEQ ID NO：13中显示ABR16721基因的编码区的核苷酸序列。在SEQ ID NO：14中显示由该基因编码的蛋白质的氨基酸序列。在SEQID NO：15中显示由CAO14859基因的编码区编码的蛋白质的氨基酸序列。
此外，At5g39390基因的上述功能上等同基因的实例包括来自稻的Os02g0215700基因和02g0215500基因。另外，来自非拟南芥属或非稻植物的At5g39390基因的功能上等同基因的实例包括源自欧洲葡萄的基因(UniProt数据库登录号CAN83822和CAO41339)。
在SEQ ID NO：16中显示Os02g0215700基因的编码区的核苷酸序列。在SEQ ID NO：17中显示由该基因编码的蛋白质的氨基酸序列。在SEQ ID NO：18中显示Os02g0215500基因的编码区的核苷酸序列。在SEQ ID NO：19中显示由该基因编码的蛋白质的氨基酸序列。在SEQ ID NO：20中显示CAN83822基因的编码区的核苷酸序列。在SEQ ID NO：21中显示由该基因编码的蛋白质的氨基酸序列。在SEQ ID NO：22中显示CAO41339基因的编码区的核苷酸序列。在SEQ ID NO：23中显示由该基因编码的蛋白质的氨基酸序列。
此外，根据本发明，LRR-RLK基因不限于包含SEQ ID NOS：3、5、11、13、16、18、20和22中所示的核苷酸序列并且编码SEQ ID NOS：4、6、12、14、15、17、19、21和23中所示氨基酸序列的上述LRR-RLK基因。因而，LRR-RLK基因可以是这样的基因，其含有相对于SEQ IDNOS：4、6、12、14、15、17、19、21和23中所示的氨基酸序列具有一个或多个氨基酸的缺失、置换、添加或插入并且作为LRR-RLK基因发挥作用。这里，术语“多个氨基酸”指例如1至20个、优选地1至10个、更优选地1至7个、进一步优选地1至5个并且特别优选地1至3个氨基酸。此外，可以通过用本领域已知的技术改变编码上述LRR-RLK基因的核苷酸序列开展氨基酸缺失、置换或添加。也就是说，可以使用在关于上述“LRR-RLP基因”的段落中描述的方法。
此外，LRR-RLK基因可以是在关于“LRR-RLP基因”的上文段落中描述的同源基因。LRR-RLK基因的实例包括编码具有与SEQ ID NOS：4、6、12、14、15、17、19、21和23中所示的氨基酸序列具有70％或更多、优选80％或更多、更优选90％或更多并且最优选95％或更多的相似性的氨基酸序列并且具有LRR-RLK活性的蛋白质的基因。本文中，术语“相似性”具有在关于“LRR-RLP基因”的上文段落中描述的相同含义。
另外，如关于“LRR-RLP基因”的上文段落中所述，可以通过以下方式鉴定LRR-RLK基因：从目的植物提取基因组或构建目的植物的eDNA文库并且分离在严格条件下与包含SEQ ID NOS：3、5、11、13、16、18、20和22中所示核苷酸序列的LRR-RLK基因的至少某些部分杂交的基因组区域或eDNA。这里，术语“严格条件”具有在关于“LRR-RLP基因”的上文段落中描述的相同含义。
随着导入第一组所包括的LRR-RLP基因、第二组所包括的LRR-RLK基因或第三组所包括的LRR-RLK基因或者改变内在的该基因的表达控制区，本发明的植物是就环境胁迫(如盐胁迫)抗性而言显示出胜过野生型植物的显著改善的植物。用于将这种基因导入植物中的技术的实例是用于导入表达载体的技术，在所述表达载体中将上述外源基因置于能够在该植物中引起表达的启动子的控制下。用于改变内在的基因的表达控制区的技术的实例是用于改变目的植物中内源基因的启动子的技术。
优选的实例是用于用于导入表达载体的技术，在所述表达载体中将以上基因置于能够在目的植物中引起表达的启动子的控制下。
表达载体
构建表达载体以含有能够在植物内部引起表达的启动子和上述LRR-RLP基因或LRR-RLK基因。就充当表达载体母体的载体而言，可以使用常规已知的多种载体。例如，可以使用质粒、噬菌体、粘粒等，并且可以根据所述载体导入的植物细胞和导入方法适当地选择这种载体。此类载体的具体的实例包括pBR322、pBR325、pUC19、pUC119、pBluescript、pBluescriptSK和pBI载体。具体地，当用于将载体导入植物中的方法使用农杆菌时，优选地使用pBI双元载体。此类pBI双元载体的具体实例包括pBIG、pBIN19、pBI101、pBI121和pBI221。
不具体地限制本文待使用的启动子，只要它能够使上述基因在植物内部表达即可。可以适宜地使用任何已知的启动子。此类启动子的实例包括花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)、多种肌动蛋白基因启动子、多种遍在蛋白基因启动子、胭脂碱合酶基因启动子、烟草PR1a基因启动子、番茄核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶-氧化酶小亚基基因启动子和油菜籽蛋白基因启动子。这些启动子当中，可以更优选地使用花椰菜花叶病毒35S启动子、肌动蛋白基因启动子或遍在蛋白基因启动子。每种上述启动子的使用能够使任何基因在其导入植物细胞中时强烈表达。
另外，也可以在本文使用具有在植物中引起部位特异性表达的功能的启动子。就此类启动子而言，可以使用常规已知的任何启动子。当上述基因使用此类启动子以部位特异性方式表达时，在其器官中表达以上基因的植物就环境胁迫耐受性而言显示出胜过野生型植物的显著改善。
此外，除启动子和以上基因之外，表达载体还可以含有其他DNA区段。不具体地限制这类其他DNA区段，并且其实例包括终止子、选择标记、增强子和用于增强翻译效率的核苷酸序列。另外，以上重组表达载体还可以具有T-DNA区域。T-DNA区域可以增强基因导入的效率，尤其当以上重组表达载体使用农杆菌导入植物时。
不具体地限制转录终止子，只要它具有作为转录终止位点的功能并且可以是任何已知的转录终止子。例如，具体而言，可以优选地使用胭脂碱合酶基因的转录终止区(Nos终止子)、花椰菜花叶病毒35S的转录终止区(CaMV35S终止子)等。它们当中，可以更优选地使用Nos终止子。在以上重组载体的情况下，可以通过在适宜位置安置转录终止子防止合成过长转录物和强启动子降低质粒在导入植物细胞后的拷贝数的现象。
作为转化体选择标记，例如可以使用耐药基因。此类耐药基因的具体实例包括针对潮霉素、博来霉素、卡那霉素、庆大霉素、氯霉素的耐药基因等。通过选择可以在含有以上抗生素的培养基中生长的植物，能够容易地选择出转化的植物。
用于增加翻译效率的核苷酸序列的实例是来自烟草花叶病毒的ω序列。将这种ω序列设置在启动子的非翻译区(5′UTR)内，从而可以增加融合基因的翻译效率。如此，取决于目的，重组表达载体可以含有多种DNA区段。
不具体地限制用于构建重组表达载体的方法。对于适当选择的充当母体的载体，可以按预定顺序导入以上启动子和以上基因并且如果需要，以上其他DNA区段。例如，将以上基因和启动子(并且，如果需要，转录终止子等)连接以构建表达盒，并且随后可以将该盒导入载体中。在表达盒的构建中，例如，准备DNA区段的切割位点以具有彼此互补的突出末端并且随后用连接酶进行反应，这使得指定DNA区段的顺序成为可能。此外，当表达盒含有终止子时，可以将多个DNA区段从上游按以下顺序设置：启动子、以上基因和终止子。另外，也不具体地限制用于构建表达载体的试剂(即，限制酶、连接酶等的类型)。因而，可以适当地选择并且使用市售试剂。
另外，不具体地限制用于复制以上表达载体的方法(产生方法)，并且可以在本文中使用常规已知的复制方法。通常，此类表达载体可以在作为宿主的大肠杆菌(Escherichia coli)中复制。此时，可以根据载体的类型选择大肠杆菌的优选类型。
转化
通过一般转化方法将上述的表达载体导入目的植物中。不具体地限制用于将表达载体导入植物细胞中的方法(转化方法)。可以根据植物细胞使用常规已知的适宜导入方法。具体而言，例如，可以使用采用农杆菌的方法或涉及直接导入植物细胞中的方法。就使用农杆菌的方法而言，例如可以使用在Bechtold，E.，Ellis，J.和Pelletier，G.(1993)InPlanta Agrobacterium-mediated gene transfer by infiltration of adultArabidopsis plants(通过浸润成体拟南芥植物的植物内农杆菌介导基因转移法).C.R.Acad.Sci.Paris Sci.Vie，316，1194-1199中描述的方法，或在Zyprian E，Kado Cl，Agrobacterium-mediated plant transformation by novel mini-T vectors in conjunction with a high-copy vir region helper plasmid(借助新微型T载体与高拷贝vir区辅助质粒组合的农杆菌介导的植物转化法)，Plant Molecular Biology，1990，15(2)，245-256中描述的方法。
就用于将表达载体直接导入植物细胞的方法而言，可以使用微注射法、电穿孔法、聚乙二醇法、粒子枪法、原生质体融合法、磷酸钙法等。
另外，当使用将DNA直接导入植物细胞的方法时，可以在本文中使用的DNA含有为表达靶基因所需的转录单位如启动子和转录终止子，以及靶基因。在这种情况下，载体功能不是必需的。另外，可以在本文中使用没有转录单位的只含有靶基因的蛋白质编码区的DNA，只要所述DNA整合至宿主的转录单位中并且随后靶基因可以表达。
将以上表达载体或不含有表达载体但含有靶基因的表达盒导入其中的植物细胞的实例包括植物器官如花、叶和根的每种组织、愈伤组织的细胞和悬浮培养的细胞。此时，适宜的表达载体可以根据待产生的植物的类型构建，或可以事先构建通用表达载体并且随后导入植物细胞中。
不具体地限制导入表达载体的植物或换而言之，经过改善以具有环境胁迫耐受性的植物。具体而言，可以通过诱导以上基因的表达而期望任何植物具有改善环境胁迫耐受性的效果。目的植物的实例包括但不限于双子叶植物和单子叶植物如属于十字花科、禾本科、茄科(Solanaceae)、豆科(Leguminosae)、杨柳科(Salicaceae)等的植物(见下文)。
十字花科：拟南芥、油籽油菜(芜青(Brassica rapa)、欧洲油菜(Brassicanapus)、芸苔(Brassica campestris))、卷心菜(甘蓝(Brassica oleraceavar.capitata))、NapA(白菜(Brassica rapa var.pekinensis))、青菜(Brassica rapavar.chinensis)、蔓青(蔓青原变种(Brassica rapa var.rapa))、叶用芜青(Brassicarapa var.hakabura)、雪里蕻(potherb mustard)(Brassica rapa var.lancinifolia)、小菘菜(Komatsuna)(Brassica rapa var.peruviridis)、白菜(pak choi)(青菜(Brassicarapa var.chinensis))、白萝卜(daikon)(萝卜(Raphanus sativus))、日本辣根(山葵(Wasabia japonica))等。
茄科：烟草(Nicotiana tabacum)、茄子(Solanum melongena)、马铃薯(Solaneumtuberosum)、番茄(Lycopersicon lycopersicum)、辣椒(红辣椒(Capsicum annuum))、碧冬茄(petunia)等。
豆科：大豆(Glycine max)、豌豆(Pisum sativum)、蚕豆(Vicia faba)、紫藤(多花紫藤(Wisteria floribunda))、花生(落花生(Arachis hypogaea))、鸟足三叶草(日本百脉根(Lotus corniculatusvar.japonicus))、菜豆(Phaseolus vulgaris)、红豆(azukibean)(赤豆(Vigna angularis))、金合欢属(Acacia)植物等。
菊科(Asteraceae)：菊花(Chrysanthemum morifolium)、向日葵(Helianthusannuus)等。
棕榈科(Arecaceae)：油棕榈(油棕(Elaeis guineensis)、洲油棕榈(Elaeisoleifera))、椰子(Cocos nucifera)、海枣(Phoenix dactylifera)、巴西棕榈(Copernicia)等。
漆树科(Anacardiaceae)：蜡树(木蜡树(Rhus succedanea))、腰果(Anacardiumoccidentale)、漆树(Toxicodendron vernicifluum)、芒果(Mangifera indica)、阿月浑子(Pistacia vera)等。
葫芦科(Cucurbitaceae)：南瓜(笋瓜(Cucurbita maxima)、南瓜(Cucurbitamoschata)、西葫芦(Cucurbita pepo)、黄瓜(Cucumis sativus)、蛇瓜(snake gourd)(王瓜(Trichosanthes cucumeroides))、葫芦(小葫芦(Lagenaria siceraria var.gourda))等。
蔷薇科(Rosaceae)：扁桃(Amygdalus communis)、玫瑰(蔷薇属(Rosa))、草莓(草莓属(Fragaria))、樱桃(李属(Prunus)、苹果(Malus pumila var.domestica)等。
石竹科(Caryophyllaceae)：康乃馨(香石竹(Dianthus caryophyllus))等。
杨柳科(Salicaceae)：杨(毛果杨(Populus trichocarpa)、欧洲黑杨(Populusnigra)或欧洲山杨(Populus tremula))等。
禾本科：玉米(玉蜀黍(Zea mays))、稻(Oryza sativa)、大麦(Hordeum vulgare)、小麦(普通小麦(Triticum aestivum))、竹(刚竹属(Phyllostachys))、甘蔗(Saccharumofficinarum)、紫狼尾草(象草(Pennisetum pupureum))、蔗茅(沙生蔗茅(Erianthusravenae))、芒草(日本银草)(Miscanthus virgatum)、高粱(高粱属(Sorghum))和柳枝稷(黍属(Panicum))等。
百合科(Liliaceae)：郁金香(郁金香属(Tulipa))、百合(百合属(Lilium))等。
这些实例中，能充当生物燃料原料的能量作物如甘蔗、玉米、油籽油菜和向日葵可以是优选的目标。可以通过改善能量作物的环境胁迫耐受性显著地扩展相关能量作物的栽培地区和栽培条件。具体而言，甚至可以在野生型植物在环境因素(例如，平均温度，土壤中盐的浓度等)影响下不能生长的地区栽培能量作物。因而，可以降低生物燃料如生物乙醇、生物柴油、生物甲醇、生物二甲醚(bioDME)、bioGTL(BTL)和生物丁醇的成本。
另外，如上文所述，可以从多种植物分离并且使用可以用于本发明中的LRR-RLP基因和LRR-RLK基因。可以根据就环境胁迫耐受性而言待改善的目的植物的类型，适当地选择并且使用此类LRR-RLP基因和LRR-RLK基因。具体而言，当目的植物是单子叶植物时，优选地导入已经从单子叶植物分离的LRR-RLP基因或LRR-RLK基因。特别地，当目的植物是稻时，优选地导入源自稻的LRR-RLP基因(SEQ ID NO：7)或LRR-RLK基因(SEQ ID NO：11、16或18)。
此外，在本发明中，甚至目的植物是单子叶植物时，可以导入源自双子叶植物的LRR-RLP基因或LRR-RLK基因。具体而言，例如，可以将源自拟南芥的LRR-RLP基因或LRR-RLK基因不仅导入双子叶植物中，还导入划分为单子叶植物的多种植物中。
其他步骤和方法
在以上转化后，可以通过常规已知的方法进行从植物中选择适当的转化体的步骤。不具体地限制这种选择方法。例如，可以基于耐药性如潮霉素抗性做出选择。备选地，在转化体生长后，可以选择作为整体或在其任意器官或组织中具有显著改善的环境胁迫耐受性的转化体。
另外，可以从通过根据常规方法的转化获得的转化植物来获得后代植物。基于环境胁迫耐受性选择已经将LRR-RLP基因或LRR-RLK基因导入其中的仍保留性状的后代植物。因此，可以产生因为具有以上性状而能够显示改善的环境胁迫耐受性的稳定植物株系。另外，可以从转化的植物或其后代植物获得植物细胞或繁殖材料，如种子、果实、茎干、愈伤组织、块茎、切穗(cut ear)或切块(lump)。可以基于此类材料从中大量产生因为具有以上性状而能够显示改善的环境胁迫耐受性的稳定植物株系。
此外，本发明的植物可以包括包含成体植物、植物细胞、植物组织、愈伤组织和种子中至少任一者的物质。即，根据本发明，处于允许其最终生长以变成植物的状态下的任何物质可以视为植物。此外，植物细胞包括多种形式的植物细胞。此类植物细胞的实例包括悬浮培养的细胞、原生质体和叶切片。作为此类植物细胞增殖/分化的结果，可以获得植物。此外，可以根据植物细胞的类型，通过常规已知的方法从植物细胞中繁殖出植物。
如上文所述，根据本发明，可以提供下述植物，随着向其中导入LRR-RLP基因或LRR-RLK基因或者改变其中内在的该基因的表达控制区，所述植物就环境胁迫(如盐胁迫)耐受性而言显示出胜过野生型植物的改善。
实施例
下文参考以下实施例更详细地描述本发明，但是本发明的技术范围不限于此。
[实施例1]
1.材料和方法
1-1.实验材料
作为实验材料，使用拟南芥突变体的种子(活化标签T-DNA株系：Weigel T-DNS株系，总计20072个株系)。此外，从诺丁汉拟南芥保藏中心(Nottingham Arabidopsis StockCentre，NASC)购买种子。关于用作实验材料的种子，可以参考Weigel，D.等人，PlantPhysiol.，122，1003-1013(2000)。
1-2.方法
1-2-1.耐盐突变体的选择
将Weigel T-DNA株系的种子无菌播种在含有125mM或150mM NaCl的改良MS琼脂(1％)培养基[B5培养基中的维生素，10g/l蔗糖和8g/L琼脂(细菌培养基用；Wako PureChemical Industries有限公司)]上并且随后在22℃在30-100μmol/m2/sec的照明下(16小时明亮期/8小时黑暗期的循环)下培养。播种后2至4周，选择耐盐候选突变体。此外，关于MS培养基，见Murashige，T.等人，(1962)Physiol.Plant.，15，473-497。另外，关于B5培养基，见Gamborg，O.L.等人，(1968)Experimental Cell Research，50，151-158。
1-2-2.DNA制备
通过TAIL-PCR方法确定T-DNA插入至由此所选的耐盐拟南芥株系的基因组中的位点。首先，从栽培的拟南芥植物收获幼叶并且随后在液氮冷冻下碾碎。使用DNA制备试剂盒(DNeasy Plant Mini Kit，QIAGEN)，根据随同该试剂盒所包括的标准操作方案制备DNA。
1-2-3.TAIL-PCR方法和T-DNA插入位点的推定
设定三种类型的特异性引物TL1、TL2和TL3位于Weigel T-DNA株系中所用的活化标签载体(pSKI015：GenBank登录号AF187951)的左侧T-DNA序列(T-DNA左边界)附近。在使用任意引物P1和以下PCR反应液及反应条件下，进行TA1L-PCR(主编，Isao Shimamoto和Takuji Sasaki，新版，Plant PCR Experimental Protocols，2000，第83-89页，Shujunsha，东京，日本；Genomics 25，674-681，1995；Plant J.，8，457-463，1995)，从而扩增邻近T-DNA的基因组DNA。
引物TL1、TL2、TL3和P1的具体序列如下。
TL1：5′-TGC TTT CGC CAT TAA ATA GCG ACG G-3′(SEQ ID NO：44)
TL2：5′-CGC TGC GGA CAT CTA CAT TTT TG-3′(SEQ ID NO：45)
TL3：5′-TCC CGG ACA TGA AGC CAT TTA C-3′(SEQ ID NO：46)
P1：5′-NGT CGA SWG ANA WGA A-3′(SEQ ID NO：47)
此外，在SEQ ID NO：47中，“n”代表“a”、“g”、“c”或“t”(存在位置：1和11)，“s”代表“g”或“c”(存在位置：7)，并且“w”代表“a”或“t”(存在位置：8和13)。
在表1和表2中分别显示第一轮PCR反应液组成和反应条件。
表1
表2
#1：94℃(30秒)/95℃(30秒)
#2：5个循环：94℃(30秒)/65℃(30秒)/72℃(1分钟)
#3：1个循环：94℃(30秒)/25℃(1分钟)→在3分钟内升至72℃/72℃(3分钟)
#4：94℃(15秒)/65℃(30秒)/72℃(1分钟)，
94℃(15秒)/68℃(30秒)/72℃(1分钟)，和
15个循环：94℃(15秒)/44℃(30秒)/72℃(1分钟)
#5：72℃(3分钟)
在表3和表4中分别显示第二轮PCR反应液组成和反应条件。
[表3]
[表4]
#6：94℃(15秒)/64℃(30秒)/72℃(1分钟)，
94℃(15秒)/64℃(30秒)/72℃(1分钟)，和
12个循环：94℃(15秒)/44℃(30秒)/72℃(1分钟)
#5：72℃(5分钟)
在表5和表6中分别显示第三轮PCR反应液组成和反应条件。
[表5]
[表6]
#7：20个循环：
94℃(30秒)/44℃(30秒)/72℃(1分钟)
#5：72℃(3分钟)
随后，将第二和第三反应产物进行琼脂凝胶电泳，并且随后证实扩增的存在或不存在和反应产物的特异性。另外，使用BigDye终止循环测序试剂盒Ver 3.1(AppliedBiosystems)和特异性引物TL3，使第三扩增产物直接接受测序反应。然后，使用AB1 PRISM3100Genetic Analyzer(Applied Biosystems)测定核苷酸序列。
作为结果，测定了5种不同的核苷酸序列。具体而言，获得了538-bp序列信息、311-bp序列信息、498-bp序列信息、633-bp序列信息和245-bp序列信息。获得的序列在SEQ IDNOS：48至52中显示。
使用获得的序列信息对拟南芥属信息资源(TAIR：http://www.arabidopsis.org/)进行BLAST检索。因而，发现T-DNA插入位点按以下顺序存在：在拟南芥染色体1基因[AGI(拟南芥基因组初始基因代码)代码：At1g69990]与基因[AGI(拟南芥基因组初始基因代码)代码：At1g70000]之间的位点；拟南芥染色体5基因[AGI(拟南芥基因组初始基因代码)代码：At5g39400]的位点；拟南芥染色体3基因[AGI(拟南芥基因组初始基因代码)代码：At3g05630]的位点；拟南芥染色体2基因[AGI(拟南芥基因组初始基因代码)代码：At2g33110]的位点；和在拟南芥染色体1基因[AGI(拟南芥基因组初始基因代码)代码：At1g71810]与基因[AGI(拟南芥基因组初始基因代码)代码：At1g71820]之间的位点。
1-2-4.对激活的基因的预测
基于在上文1-2-3中所揭示的各T-DNA插入位点(在At1g69990与At1g70000之间的位点、At5g39400的位点、At3g05630的位点、At2g33110的位点和在At1g71810与At1g71820之间的位点)附近10-Kb范围内存在的推定可读框(ORF)基因的序列，预测激活的基因。
1-2-5.获得预测的基因
为了扩增含有在1-2-4中已经预测被激活的LRR-RLK(富亮氨酸重复序列的受体样蛋白激酶)基因(At1g69990)、LRR-RLK(富亮氨酸重复序列的受体样蛋白激酶)基因(At5g39390)、LRR(富亮氨酸重复序列)蛋白基因(At3g05650)和LRR(富亮氨酸重复序列)蛋白基因(At2g33080)的ORF区的片段，基于TAIR(http://www.arabidopsis.org/home.html)公开的序列信息，设计并且合成针对每个片段的PCR引物对(表7)。此外，如此设计这些引物，从而将导入表达载体中所需要的限制酶位点添加至每条引物(表7)。
表7
为了扩增含有LRR-RLK(富亮氨酸重复序列受体样蛋白激酶)基因(At1g71830)的ORF区的片段，基于TAIR(http://www.arabidopsis.org/home.html)公开的序列信息，设计并且合成三对引物(表8)。这里，如此设计引物组(正向1和反向3)，从而将导入表达载体中所需要的限制酶位点添加至每条引物(表8)。
表8
根据1-2-2中所述的方法，从野生型拟南芥(生态型Col-0)制备模板DNA。使用TaKaRa Ex Taq(Takara Bio Inc.)和Platinum Pfx DNA聚合酶(Invitrogen)或Phusion高保真DNA聚合酶(New England BioLabs：NEB)作为酶，并且使用表7中所列的引物对作为引物。对于PCR反应液组成和反应条件，参考每种酶所附带的操作方案。此外，对于LRR-RLK基因(At1g71830)，使用表8中所列的三对引物和Platinum Pfx DNA聚合酶(Invitrogen)作为酶，进行PCR，从而获得三种PCR扩增产物。将PCR扩增产物用2％琼脂糖凝胶(TAE缓冲液)进行电泳，并且随后将片段用溴化乙啶染色。使用解剖刀切下含有目的片段的凝胶。洗脱目的DNA片段并且使用GFX PCR DNA和凝胶条带纯化试剂盒(Amersham)进行纯化。使用这三个DNA片段作为模板并且使用正向1和反向3作为引物，实施重叠PCR。
如同上述情况，将每种PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，随后切下并且纯化。使用加A试剂盒(QIAGEN)，将腺嘌呤添加至如此获得的DNA片段。使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen)，将已经添加了腺嘌呤的扩增的DNA连接至TA克隆pCR2.1载体，并且随后转化至该试剂盒中所包括的感受态细胞(大肠杆菌TOP10)中。转化后，在补充有50微升/ml卡那霉素的LB培养基中培养细胞，并且随后选择转化体。出现的菌落在补充有50微升/ml卡那霉素的LB培养基中进行液体培养。使用质粒微量制备试剂盒(QIAGEN)，从如此获得的微生物制备质粒DNA。
将含有LRR-RLK基因(At1g69990)的ORF的片段、含有LRR-RLK基因(At5g39390)的ORF的片段、含有LRR蛋白基因(At3g05650)的ORF的片段、含有LRR蛋白基因(At2g33080)的ORF的片段、含有LRR-RLK基因(At1g71830)的ORF的片段分别克隆至载体中，随后测定核苷酸序列并且进行序列分析。
1-2-6.植物表达载体的构建
将含有LRR-RLK基因(At1g69990)、LRR-RLK基因(At5g39390)、LRR蛋白基因(At3g05650)、LRR蛋白基因(At2g33080)和LRR-RLK基因(At1g71830)的ORF的片段插入含有来自烟草花叶病毒的ω序列的植物表达载体pBI121中。因而，制备构建体。
首先，用限制酶Sal I和BsrG I处理已经如1-2-5克隆了含有LRR-RLK基因(At1g69990)的ORF的片段的pCR2.1载体。
接下来，类似地，含有ω序列的pBI121用限制酶Sal I和BsrG I处理。用这些限制酶消化的产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳。将含有LRR-RLK基因(At1g69990)的ORF的约1850bp片段和含有ω序列的pBI121从凝胶中使用GFX PCR DNA和凝胶条带纯化试剂盒(Amersham)分别提取出来并纯化。
为使用含有ω序列的pBI121片段作为载体导入含有LRR-RLK基因(At1g69990)的ORF的片段，将所述载体和插入物以1∶10的比率混合，随后使用等量的TaKaRa连接试剂盒第2版(Takara Bio Inc.)在16℃进行过夜连接反应。
将全部量的反应液添加至100微升感受态细胞(大肠杆菌菌株DH5α，TOYOBO)，从而根据随同该试剂盒中所包括的操作方案进行转化。将细胞涂布至含有50微克/ml卡那霉素的LB琼脂培养基并且随后培养过夜。出现的菌落在补充有50微克/ml卡那霉素的LB培养基中进行液体培养。使用质粒微量制备试剂盒(QIAGEN)，从如此获得的微生物制备质粒DNA。
将如此获得的含有LRR-RLK基因(At1g69990)的ORF的片段亚克隆至表达载体中，随后测定核苷酸序列并且进行序列分析。
将LRR-RLK基因(At5g39390)、LRR蛋白基因(At2g33080)和LRR-RLK基因(At1g71830)以上文所述的方式并入表达载体中，随后测定核苷酸序列并且进行序列分析。将LRR蛋白基因(At3g05650)克隆至TA克隆pCR2.1载体中，用Sal I限制酶处理，并用DNA平端化试剂盒(Takara Bio Inc.)平末端化，随后用苯酚氯仿处理并且随后用BsrG I限制酶处理。类似地，将含有ω序列的pBI121用Sal I限制酶处理，并用DNA平端化试剂盒(TakaraBio Inc.)平末端化，随后用苯酚氯仿处理并且随后用BsrG I限制酶处理。将每个基因以上文所述的方式并入表达载体中，随后测定核苷酸序列并且进行序列分析。
1-2-7.使用农杆菌方法将基因导入拟南芥中
通过电穿孔法(Plant Molecular Biology Manual，第2版，B.G.Stanton，A.S.Robbert，Kluwer Acdemic Publishers，1994)，将1-2-6中所构建的植物表达载体导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)C58C1菌株中。随后，通过Clough等人(PlantJ.，16，735-743，1998)描述的浸润法，将其中已经导入了植物表达载体的根癌农杆菌导入野生型拟南芥(生态型Col-0)中。
使用含有卡那霉素的培养基选择转化体。通过自我授粉从转化体产生T2代植物。
1-2-8.证实转化体的表型
耐盐性试验：
将1-2-7中所制备的种子和用作对照的非重组野生型拟南芥植物的种子无菌播种在含有150mM NaCl的改良MS琼脂培养基上。这些种子在22℃和16小时明亮期/8小时黑暗期下并且以范围从约30至45μE/cm2的光强度培育。
2.结果
图1至图5显示含有转化植物的平板的照片，所述转化植物中分别导入了含有野生型基因的ORF的片段、LRR-RLK基因(At1g69990)的ORF的片段、LRR-RLK基因(At5g39390)的ORF的片段、LRR-RLP基因(At3g05650)的ORF的片段、LRR-RLP基因(At2g33080)的ORF的片段和LRR-RLK基因(At1g71830)的ORF的片段，每张照片显示以上1-2-8中所述的耐盐性试验结果。图1、2和4显示在具有高盐浓度的培养基中，导入了含有LRR-RLK基因(At1g69990)的ORF的片段、LRR-RLK基因(At5g39390)的ORF的片段、LRR-RLP基因(At2g33080)的ORF的片段的转化植物发芽并生长。结果表明，转化的植物就耐盐性而言显示出胜过野生型植物的改善。
然而如图3和5中所示，导入了含有LRR-RLP基因(At3g05650)的ORF的片段和LRR-RLK基因(At1g71830)的ORF的片段的转化植物没有显示明显改善的耐盐性。
Claims (2)
1.用于赋予盐胁迫耐受性至十字花科(Brassicaceae)植物的方法，包括导入至少一个导入基因，
其中所述基因是编码具有富亮氨酸重复结构的受体样蛋白的At2g33080，其中At2g33080编码SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的蛋白质。
2.用于产生十字花科植物的方法，所述方法包括步骤：
制备导入了至少一个基因的十字花科转化植物，其中所述基因是编码具有富亮氨酸重复结构的受体样蛋白的At2g33080，其中At2g33080编码SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的蛋白质，和
评价十字花科转化植物的后代植物的盐胁迫耐受性以选择具有显著改善的盐胁迫耐受性的株系。
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