CN105848470A - 转化植物、使用转化植物的含糖溢泌物的制造方法 - Google Patents

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CN105848470A CN201480070650.1A CN201480070650A CN105848470A CN 105848470 A CN105848470 A CN 105848470A CN 201480070650 A CN201480070650 A CN 201480070650A CN 105848470 A CN105848470 A CN 105848470A
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Abstract

从植物产生包含高浓度糖的溢泌物。导入编码AtSWEET8蛋白质的核酸或该核酸的同源核酸，和/或强化由该核酸或该同源核酸编码的蛋白质的表达。

Description

转化植物、使用转化植物的含糖溢泌物的制造方法
技术领域
本发明涉及通过导入规定的基因而获得了优异特性的转化植物和使用该转化植物的含糖溢泌物的制造方法。
背景技术
生物燃料、生物塑料的稳定生产要求廉价且稳定的原料糖供给。最具代表性的原料糖是甘蔗所蓄积的糖。为了从甘蔗取出糖，一般需要在规定的收获期采伐甘蔗，进行破碎加工、压榨、浓缩、纯化等处理。另外，收获后的旱田需要进行用于新的栽培的旱田保养、栽插、散布除草剂和/或防虫剂等管理作业。这样，一直以来，使用甘蔗等植物的原料糖的制造需要制造工序的成本、栽培成本等巨大的成本。
专利文献1中公开了使用能表达地导入了异种基因的植物来回收由该异种基因编码的异种蛋白质的方法。在专利文献1所公开的方法中，从能表达地导入了异种基因的植物采集溢泌物，从采集的溢泌物回收异种蛋白质。在专利文献1中作为溢泌物，例示了作为根茎的溢泌物和叶的介由排水组织(hydathode)的溢泌物而从植物渗出的吐水(guttation)。
另一方面，专利文献2和非专利文献1中，对于拟南芥(Arabidopsis thaliana)、稻(Oryza sativa)，公开了参与植物体内的糖运输的转运蛋白蛋白质。专利文献2和非专利文献1所公开的转运蛋白蛋白质作为GLUE蛋白质或SWEET蛋白质已知。通过将编码专利文献2和非专利文献1所公开的转运蛋白蛋白质的核酸导入植物，有时对根的糖运输量提高。
另外，非专利文献2中通过人工地使细胞膜小分子转运蛋白定位于内质网(endoplasmic reticulum；ER)，通过测定ER中的小分子转运蛋白活性而确认了细胞膜转运蛋白的功能。特别是对于葡萄糖转运蛋白GLUTs、SGLTs，使其定位于ER，使用FRET(荧光共振能量转移，Forster resonance energy transfer或fluorescence resonance energytransfer)法类推了它们本来的功能。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2002-501755号公报
专利文献2：日本特表2012-525845号公报
非专利文献
非专利文献1：Nature(2010)468,527-534
非专利文献2：FASEB J.(2010)24,2849-2858
发明内容
发明要解决的课题
如上，为了使用植物制造糖，成本的增大是非常大的问题，但如果能够使来自植物的溢泌物中以高浓度含有糖，则能够通过采集溢泌物来解决上述问题。专利文献1中虽然公开了从溢泌物回收异种蛋白质，但并没有公开从溢泌物回收糖。专利文献2和非专利文献1中虽然公开了参与糖运输的被命名为SWEET的转运蛋白蛋白质和编码它们的核酸，但并没有公开这些转运蛋白蛋白质、编码它们的核酸与溢泌物中的糖含量的关系。
因此，本发明鉴于上述事实，目的在于提供产生包含高浓度的糖的溢泌物的转化植物和使用该转化植物的糖的制造方法。
用于解决课题的方法
为了实现上述目的，本发明者们进行了深入研究，结果发现，在导入了编码参与植物体内的糖运输的规定转运蛋白蛋白质的核酸、强化了该核酸的表达的转化植物中，溢泌物的糖含量非常高，从而完成了本发明。
(1)转化植物或转化植物细胞，其中，导入了编码AtSWEET8蛋白质的核酸或该核酸的同源核酸，和/或强化了由该核酸或该同源核酸编码的蛋白质的表达。
(2)根据(1)所述的转化植物或转化植物细胞，其特征在于，所述编码AtSWEET8蛋白质的核酸是编码以下(a)～(c)的任一蛋白质的核酸，
(a)包含序列号2的氨基酸序列的蛋白质，
(b)包含与序列号2的氨基酸序列有90％以上的同一性的氨基酸序列、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质，
(c)包含由能够与包含序列号1的碱基序列的多核苷酸的全部或一部分在严格条件下杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质。
(3)根据(1)所述的转化植物或转化植物细胞，其特征在于，所述同源核酸是编码以下(a)～(c)的任一蛋白质的核酸，
(a)包含序列号5或7的氨基酸序列的蛋白质，
(b)包含与序列号5或7的氨基酸序列有90％以上的同一性的氨基酸序列、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质，
(c)包含由能够与包含序列号40～43的任一碱基序列的多核苷酸的全部或一部分在严格条件下杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质。
(4)根据(1)所述的转化植物或转化植物细胞，其特征在于，所述同源核酸是编码以下(a)或(b)的蛋白质的核酸，
(a)包含序列号3、4、6、8和9的任一氨基酸序列的蛋白质，
(b)包含与序列号3、4、6、8和9的任一氨基酸序列有90％以上的同一性的氨基酸序列、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质。
(5)根据(1)所述的转化植物或转化植物细胞，其特征在于，所述同源核酸是编码以下(a)～(c)的任一蛋白质的核酸，
(a)包含与序列号2记载的氨基酸序列有33％以上的一致度的氨基酸序列、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质，
(b)包含与序列号2记载的氨基酸序列中的从N末端至第213位的氨基酸序列有35％以上的一致度的氨基酸序列作为除了跨膜结构域以外的区域、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质，
(c)包含与序列号2记载的氨基酸序列中的第33～213位的氨基酸序列有37％以上的一致度的氨基酸序列作为除了同源性低的区域和跨膜结构域以外的区域、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质。
(6)根据(1)所述的转化植物或转化植物细胞，其特征在于，所述同源核酸是编码以下(a)～(c)的任一蛋白质的核酸，
(a)包含与序列号5记载的氨基酸序列有29％以上的一致度的氨基酸序列、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质，
(b)包含与序列号5记载的氨基酸序列中的从N末端至第205位的氨基酸序列有39％以上的一致度的氨基酸序列作为除了跨膜结构域以外的区域、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质，
(c)包含与序列号5记载的氨基酸序列中的第30～205位的氨基酸序列有40％以上的一致度的氨基酸序列作为除了同源性低的区域和跨膜结构域以外的区域、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质。
(7)根据(1)所述的转化植物或转化植物细胞，其特征在于，所述同源核酸是编码以下(a)～(c)的任一蛋白质的核酸，
(a)包含与序列号7记载的氨基酸序列有30％以上的一致度的氨基酸序列、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质，
(b)包含与序列号7记载的氨基酸序列中的从N末端至第195位的氨基酸序列有37％以上的一致度的氨基酸序列作为除了跨膜结构域以外的区域、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质，
(c)包含与序列号7记载的氨基酸序列中的第18～195位的氨基酸序列有39％以上的一致度的氨基酸序列作为除了同源性低的区域和跨膜结构域以外的区域、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质。
(8)转化植物或转化植物细胞，其中，导入了编码具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质的核酸，和/或强化了该蛋白质的表达，所述具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质具有共有序列，所述共有序列包含以下的氨基酸序列：
(N/S)(V/I)xxxxxFx(S/A)(1-3aa)TFxxI(V/F/M)Kx(K/R)(S/K/T)(V/T)x(D/E)(F/Y)(S/K)x(I/V/M)PY(V/I/L)x(T/A)x(L/M)(N/S)xxLW(V/T)(V/F/L)YGL(0-2aa)(V/I/F/L)xxxxxLVx(T/S)(I/V)N(A/G)xGxx(I/L)(E/H)(L/F/M/I)xY(L/I/V)x(L/I/V)(Y/F)Lxx(A/S/C)(2-4aa)(S/K/N)x(R/Q)(1-2aa)(V/I/M)xxxxxxx(L/V/I)xx(F/V/L)xx(V/I/M)xx(L/I/V)(V/T)(L/F)xx(V/I)(H/D/K)(D/S/N/G)(2-3aa)(R/K)xx(I/V/L/F)(I/V/L)Gx(L/M/I)xxx(F/L)xxxMYx(S/A)Pxx(V/A)xxxV(I/V)xx(R/K)S(V/T)(E/K)(Y/F)MPF(L/F)LS(L/F)(F/V)xF(I/L/V)N(G/A/S)xxWxxY(A/S)x(F/I/V/L)(2-3aa)Dx(F/Y)(I/V)xx(P/S)Nx(L/I)Gx(L/F/I)x(G/A)x(A/T/S)QLx(L/V)Yxx(Y/F)xx(A/S)(T/S)P。
(9)根据(8)所述的转化植物或转化植物细胞，其特征在于，所述共有序列包含：
MVDAKQVRFIIGVIGNVISFGLFAAPAKTFWRIFKKKSVEEFSYVPYVAT(V/I)MNCMLWVFYGLPVVHKDSxLVSTINGVGLVIE(L/I)FYV(G/A)(V/L)YLxYCGHK(Q/K)NxR(K/R)(K/N)ILx(Y/F)LxxEV(V/I)xV(A/V)xI(V/I)L(V/I)TLF(V/A)(I/L)K(N/G)DFxKQTFVG(V/I)ICD(V/I)FNIAMY(A/G)(S/A)PSLAI(I/F)(T/K)VV(K/R)TKS(V/T)EYMPFLLSLVCFVNA(A/G)IWT(S/T)YSLIFKIDxYVLASNGIGT(F/L)LALSQLIVYFMYYKSTPK(0-1aa)(E/D)KTVKPSEVEI(P/S)(A/G)T(N/E/D)RV。
(10)根据(8)所述的转化植物或转化植物细胞，其特征在于，所述具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质是AtSWEET8蛋白质或由编码AtSWEET8蛋白质的核酸的同源核酸编码的蛋白质。
(11)根据(10)所述的转化植物或转化植物细胞，其特征在于，所述AtSWEET8蛋白质是以下(a)～(c)的任一蛋白质，
(a)包含序列号2的氨基酸序列的蛋白质，
(b)包含与序列号2的氨基酸序列有90％以上的同一性的氨基酸序列、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质，
(c)包含由能够与包含序列号1的碱基序列的多核苷酸的全部或一部分在严格条件下杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质。
(12)根据(10)所述的转化植物或转化植物细胞，其特征在于，所述同源核酸是编码以下(a)～(c)的任一蛋白质的核酸，
(a)包含序列号5或7的氨基酸序列的蛋白质，
(b)包含与序列号5或7的氨基酸序列有90％以上的同一性的氨基酸序列、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质，
(c)包含由能够与包含序列号40～43的任一碱基序列的多核苷酸的全部或一部分在严格条件杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质。
(13)根据(10)所述的转化植物或转化植物细胞，其特征在于，所述同源核酸是编码以下(a)或(b)的蛋白质的核酸，
(a)包含序列号3、4、6、8和9的任一氨基酸序列的蛋白质，
(b)包含与序列号3、4、6、8和9的任一氨基酸序列有90％以上的同一性的氨基酸序列、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质。
(14)根据(10)所述的转化植物或转化植物细胞，其特征在于，所述同源核酸是编码以下(a)～(c)的任一蛋白质的核酸，
(a)包含与序列号2记载的氨基酸序列有33％以上的一致度的氨基酸序列、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质，
(b)包含与序列号2记载的氨基酸序列中的从N末端至第213位的氨基酸序列有35％以上的一致度的氨基酸序列作为除了跨膜结构域以外的区域、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质，
(c)包含与序列号2记载的氨基酸序列中的第33～213位的氨基酸序列有37％以上的一致度的氨基酸序列作为除了同源性低的区域和跨膜结构域以外的区域、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质。
(15)根据(10)所述的转化植物或转化植物细胞，其特征在于，所述同源核酸是编码以下(a)～(c)的任一蛋白质的核酸，
(a)包含与序列号5记载的氨基酸序列有29％以上的一致度的氨基酸序列、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质，
(b)包含与序列号5记载的氨基酸序列中的从N末端至第205位的氨基酸序列有39％以上的一致度的氨基酸序列作为除了跨膜结构域以外的区域、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质，
(c)包含与序列号5记载的氨基酸序列中的第30～205位的氨基酸序列有40％以上的一致度的氨基酸序列作为除了同源性低的区域和跨膜结构域以外的区域、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质。
(16)根据(10)所述的转化植物或转化植物细胞，其特征在于，所述同源核酸是编码以下(a)～(c)的任一蛋白质的核酸，
(a)包含与序列号7记载的氨基酸序列有30％以上的一致度的氨基酸序列、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质，
(b)包含与序列号7记载的氨基酸序列中的从N末端至第195位的氨基酸序列有37％以上的一致度的氨基酸序列作为除了跨膜结构域以外的区域、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质，
(c)包含与序列号7记载的氨基酸序列中的第18～195位的氨基酸序列有39％以上的一致度的氨基酸序列作为除了同源性低的区域和跨膜结构域以外的区域、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质。
(17)根据(1)或(8)所述的转化植物或转化植物细胞，其特征在于，是显花植物或来自显花植物。
(18)根据(17)所述的转化植物或转化植物细胞，其特征在于，所述显花植物是被子植物。
(19)根据(18)所述的转化植物或转化植物细胞，其特征在于，所述被子植物是单子叶植物。
(20)根据(19)所述的转化植物或转化植物细胞，其特征在于，所述单子叶植物是禾本科植物。
(21)根据(20)所述的转化植物或转化植物细胞，其特征在于，所述禾本科植物是稻属(Oryza)植物。
(22)根据(18)所述的转化植物或转化植物细胞，其特征在于，所述被子植物是双子叶植物。
(23)根据(22)所述的转化植物或转化植物细胞，其特征在于，所述双子叶植物是十字花科植物。
(24)根据(23)所述的转化植物或转化植物细胞，其特征在于，所述十字花科植物是拟南芥属(Arabidopsis)植物。
(25)溢泌物的制造方法，包括栽培或培养上述(1)～(24)的任一项所述的转化植物或转化植物细胞，从该转化植物或转化植物细胞采集溢泌物的工序。
(26)根据(25)所述溢泌物的制造方法，其特征在于，将栽培或培养所述转化植物或转化植物细胞的条件设置为相对湿度80％RH以上。
(27)根据(25)所述溢泌物的制造方法，其特征在于，所述溢泌物是排水液。
本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请2013-273130号的说明书和/或附图所记载的内容。
发明的效果
根据本发明，能够大幅提高来自植物的溢泌物中的糖含量。即，本发明所涉及的转化植物，通过导入编码特定的参与糖运输的转运蛋白蛋白质的核酸和/或强化该蛋白质的表达，能够产生具有高糖含量这样的特征的溢泌物。另外，本发明所涉及的溢泌物的制造方法，通过利用导入了编码特定的参与糖运输的转运蛋白蛋白质的核酸和/或强化了该蛋白质的表达的转化植物，能够制造高糖含量的溢泌物。进而，因为从上述转化植物采集的溢泌物是高糖含量的，因此能够作为制造醇、有机酸、烷烃和萜类化合物等时的原料使用。
附图说明
图1-1是基于AtSWEET8蛋白质的氨基酸序列制成的系统树的概略图。
图1-2是显示图1-1所示的系统树的部分区域的放大图。
图1-3是显示图1-1所示的系统树的部分区域的放大图。
图2-1是显示对于XP_002870717、EOA19049、XP004230255、EDQ53581、EDQ64580、EDQ72753和XP_001759812与序列号2的氨基酸序列一起进行多重比对分析而得的结果的图。
图2-2是接着图2-1之下的图，显示对于XP_002870717、EOA19049、XP004230255、EDQ53581、EDQ64580、EDQ72753和XP_001759812与序列号2的氨基酸序列一起进行多重比对分析而得的结果。
图3是显示对于XP_002870717和EOA19049与序列号2的氨基酸序列一起进行多重比对分析而得的结果的图。
图4是显示实施例中制作的核酸AtSWEET/pRI201AN的物理图谱的构成模式图。
图5是对于拟南芥中在实施例所记载的条件下产生排水液的部分进行拍摄而得的照片。
图6是显示实施例中制作的核酸pZH2B_GWOx_AtSWEET8、pZH2B_GWOx_AtSWEET11和pZH2B_GWOx_AtSWEET12的物理图谱的构成模式图。
图7是对于稻中在实施例所记载的条件下产生排水液的部分进行拍摄而得的照片。
具体实施方式
以下详细说明本发明。
在本发明中，将编码特定的参与糖运输的转运蛋白蛋白质的核酸导入细胞内和/或强化该蛋白质的表达。由此，能够从细胞内导入了该核酸和/或强化了该蛋白质的表达的转化植物，采集高糖浓度的溢泌物。其中，溢泌物是指从植物的组织渗出到外部的液体，是包含例如根溢泌液、种子渗出液、从排水组织渗出的排水液的含义。此外，液体从排水组织(hydathode)渗出的现象也称为吐水现象(guttation)。因此，排水液与吐水是同义的。特别是细胞内导入了编码特定的参与糖运输的转运蛋白蛋白质的核酸和/或强化了该蛋白质的表达的转化植物能够产生高糖浓度的排水液。
此外，在本说明书中，核酸是包含DNA和RNA这样的天然存在的核酸、PNA(肽核酸)、在碱基·糖·磷酸二酯部添加了化学修饰的核酸分子等人工核酸的含义。另外，作为编码参与糖运输的转运蛋白蛋白质的核酸，是包含基因组中存在的基因和该基因的转录产物两者的含义。
另外，在本说明书中，糖是用Cn(H2O)m的化学式表示的物质，包含多元醇的醛、酮衍生物、它们的亲缘衍生物、缩合物，是包含多糖、寡糖(低聚糖)、二糖和单糖的含义。也可以是糖的还原基结合了醇、苯酚、皂苷、色素等糖苷配基的配糖体。单糖有时基于碳数被分类为丙糖、丁糖、己糖、戊糖等，有时基于分子内的官能基被分类为具有醛基的醛糖、具有酮基的酮糖等。糖也有时根据距离醛基、酮基最远的手性碳的立体构型而被区分为D系列和L系列。作为单糖的具体例，可列举葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、木糖、木酮糖、核糖、赤藓糖、苏糖、赤藓酮糖、甘油醛、二羟基丙酮等，作为二糖的具体例，可列举蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖等。
本发明所适用的植物，通过将编码特定的参与糖运输的转运蛋白蛋白质的核酸导入细胞内和/或强化该蛋白质的表达，从而排水液等溢泌物所含的糖量与野生型相比有意义地提高。上述蛋白质可以在植物组织的全体细胞中表达，也可以在植物组织的至少一部分细胞中表达。其中植物组织是包含叶、茎、种子、根和花等植物器官的含义。本发明中导入核酸，与使编码转运蛋白蛋白质的核酸的每细胞的分子数与野生型中的分子数相比有意义地增大是同义的。另外，在本发明中，强化转运蛋白蛋白质的表达是指通过改变编码转运蛋白蛋白质的核酸的表达控制区域和/或将该核酸本身注入细胞内，来提高转录产物、翻译产物的表达量。
编码参与糖运输的转运蛋白蛋白质的核酸
上述的“编码特定的参与糖运输的转运蛋白蛋白质的核酸”是编码拟南芥的AtSWEET8蛋白质的核酸、和编码除了拟南芥以外的植物中的AtSWEET8蛋白质的核酸的同源核酸。此外，Nature(2010)468,527-534的Supplementary Figure 8中关于参与糖运输的转运蛋白蛋白质SWEET公开了基于氨基酸序列的系统树。本文献中，公开了来自拟南芥的SWEET蛋白质、来自稻的SWEET蛋白质、来自蒺藜苜蓿的SWEET蛋白质、来自莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的SWEET蛋白质、来自小立碗藓(Physcomitrella patens)的SWEET蛋白质、来自碧冬茄(Petunia hybrida)的SWEET蛋白质、来自秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的SWEET蛋白质、来自哺乳类的SWEET蛋白质。根据该系统树，能够理解作为参与糖运输的转运蛋白蛋白质的SWEET基于其氨基酸序列的类似性可分类为进化枝I～V的5类。在上述的拟南芥中，AtSWEET8蛋白质被分类为进化枝II。
对于本文献所公开的参与糖运输的转运蛋白蛋白质SWEET中来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的SWEET蛋白质、来自稻(Oryza sativa)的SWEET蛋白质、和蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)SWEET蛋白质和碧冬茄(Petunia hybrida)SWEET蛋白质，在下述表1中显示GenBank ID号(GenBank ID No)、从基因组数据算出的蛋白质编码区的索引(Index in theGenome)、基因名、蛋白质名、蛋白质符号、SWEET蛋白质进化枝号和来源生物种的对应。
表1
此外，本说明书中记载为AtSWEET的情况，指表1中的AtSWEET1、AtSWEET2、AtSWEET3、AtSWEET4、AtSWEET5、AtSWEET6、AtSWEET7、AtSWEET8、AtSWEET9、AtSWEET10、AtSWEET11、AtSWEET12、AtSWEET13、AtSWEET14、AtSWEET15、AtSWEET16和AtSWEETT17，记载为OsSWEET的情况，指表1中的OsSWEET1a、OsSWEET1b、OsSWEET2a、OsSWEET2b、OsSWEET3a、OsSWEET3b、OsSWEET4、OsSWEET5、OsSWEET6a、OsSWEET6b、OsSWEET7a、OsSWEET7b、OsSWEET7c、OsSWEET11、OsSWEET12、OsSWEET13、OsSWEET14、OsSWEET15和OsSWEET16。
编码AtSWEET8蛋白质的核酸的编码区的碱基序列和蛋白质的氨基酸序列分别示于序列号1和2。但是，作为本发明中的“编码特定的参与糖运输的转运蛋白的核酸”，不限于如上所述的以序列号1和2所示的碱基序列和氨基酸序列规定的基因。
例如，在本发明中，上述的“编码特定的参与糖运输的转运蛋白蛋白质的核酸”包含编码AtSWEET8蛋白质的核酸的同源核酸。该同源核酸是包含由共同的祖先基因进化分支的基因、以及与进化分支的基因不同的单纯具有类似的碱基序列的基因两者的含义。作为由共同的祖先基因进化分支的基因，包含2个种的同源基因(直向同源物(ortholog))和同一种内通过重复而产生的同源基因(旁系同源物(paralog))。此外，上述的编码AtSWEET8蛋白质的核酸的同源核酸可以基于关于编码AtSWEET8蛋白质的核酸的编码区的序列号1的碱基序列和序列号2的氨基酸序列，从GenBank等公知的数据库容易地检索、鉴定。
例如，从使用存储于GenBank数据库的数据利用ClustalW制成的系统树(图1-1～1-3)，作为编码AtSWEET8蛋白质的核酸的同源核酸，如图1-1中用框包围的那样，能够鉴定编码来自拟南芥(Arabidopsis lyrata)的SWEET蛋白质(XP_002870717)、来自荠菜(Capsella rubella)的SWEET蛋白质(EOA19049)、来自番茄(Solanum lycopersicum)的SWEET蛋白质(XP004230255)、来自小立碗藓(Physcomitrella patens)的SWEET蛋白质4种(EDQ53581、EDQ64580、EDQ72753和XP_001759812)的7种。将来自拟南芥的SWEET蛋白质(XP_002870717)的氨基酸序列示于序列号3，将来自荠菜的SWEET蛋白质(EOA19049)的氨基酸序列示于序列号4，将来自番茄的SWEET蛋白质(XP004230255)的氨基酸序列示于序列号5，将来自小立碗藓的SWEET蛋白质(EDQ53581)的氨基酸序列示于序列号6，将来自小立碗藓的SWEET蛋白质(EDQ64580)的氨基酸序列示于序列号7，将来自小立碗藓的SWEET蛋白质(EDQ72753)的氨基酸序列示于序列号8，以及将来自小立碗藓的SWEET蛋白质(XP_001759812)的氨基酸序列示于序列号9。
另外，作为编码来自番茄的SWEET蛋白质(XP004230255)的氨基酸序列(序列号5)的核酸的例子，可列举序列号40的碱基序列和序列号41的碱基序列。作为编码来自小立碗藓的SWEET蛋白质(EDQ64580)的氨基酸序列(序列号7)的核酸的例子，可列举序列号42的碱基序列和序列号43的碱基序列。
此外，图1-1～1-3所示系统树是在使用AtSWEET8蛋白质的氨基酸序列(序列号2)检索而得的结果中，补加了OsSWEET4蛋白质、OsSWEET5蛋白质、AtSWEET4蛋白质、AtSWEET5蛋白质、AtSWEET6蛋白质和AtSWEET7蛋白质的各氨基酸序列的结果。
如以上那样，作为“编码特定的参与糖运输的转运蛋白蛋白质的核酸”，可列举编码序列号2～9所示的氨基酸序列的核酸、包含序列号1和40～43所示的碱基序列的核酸。但是，在本发明中，上述“编码特定的参与糖运输的转运蛋白蛋白质的核酸”不限于这些具体的氨基酸序列和碱基序列。
例如，作为上述“编码特定的参与糖运输的转运蛋白蛋白质的核酸”，也可以是编码包含在序列号2～9所示的氨基酸序列中缺失、替换、添加或插入了1个或多个氨基酸序列的氨基酸序列、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质的核酸。其中，作为多个氨基酸，是指例如，1～20个、优选为1～10个、更优选为1～7个、进一步优选为1个～5个、特别优选为1个～3个。此外，氨基酸的缺失、替换或添加可以通过将上述编码参与糖运输的转运蛋白蛋白质的碱基序列通过该技术领域公知的方法改变来进行。为了在碱基序列中导入突变，可以通过Kunkel法或Gapped duplex(缺口双链体)法等公知方法或依据此的方法来进行，例如，使用利用了定点诱变法的突变导入用试剂盒(例如Mutant-K、Mutant-G(均为商品名，TAKARA Bio社制))等，或者使用LA PCR in vitro Mutagenesis系列试剂盒(商品名、TAKARA Bio社制)来导入突变。另外，作为突变导入方法，可以是使用以EMS(甲磺酸乙酯)、5-溴尿嘧啶、2-氨基嘌呤、羟胺、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍、其他致癌性化合物为代表那样的化学诱变剂的方法，也可以是通过以X射线、α射线、β射线、γ射线、离子束为代表那样的放射线处理和/或紫外线处理来进行的方法。
其中编码参与糖运输的转运蛋白的核酸，是指由该核酸编码的蛋白质具有参与糖运输的转运蛋白活性。参与糖运输的转运蛋白活性，是例如非专利文献1和2的Methods所记载那样的用细胞质定位或ER定位的FRET(荧光共振能量转移，Forster resonance energytransfer或fluorescence resonance energy transfer)糖传感器测定向内质网(endoplasmic reticulum；ER)内外的糖运输而得的活性。
另外，作为上述的“编码特定的参与糖运输的转运蛋白蛋白质的核酸”，可列举编码包含相对于序列号2～9所示的氨基酸序列的类似度(Similarity)或同一性(identity)例如为70％以上、优选为80％以上、更优选为90％以上、最优选为95％以上的氨基酸序列、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质的基因。其中，类似度和同一性的值是指使用安装了BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)程序的计算机程序和存储了基因序列信息的数据库以默认设定求得的值。
进而另外，作为上述“编码特定的参与糖运输的转运蛋白蛋白质的核酸”，也可以是编码相对于包含序列号1和40～43所示的碱基序列的DNA的互补链的全部或一部分在严格条件下杂交、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质的核酸。其中，严格条件是指形成所谓特异性杂种、不形成非特异性杂种的条件。可列举例如，在45℃、6×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)下杂交、然后在50～65℃、0.2～1×SSC、0.1％SDS下洗涤，或者作为这样的条件，可列举在65～70℃、1×SSC下杂交、然后在65～70℃、0.3×SSC下洗涤。杂交按照J.Sambrooket al.Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2nd Ed.,Cold Spring HarborLaboratory(1989)所记载的方法等现有公知的方法来进行。
对于图1-1～1-3所示的来自拟南芥的SWEET蛋白质(XP_002870717)、来自荠菜的SWEET蛋白质(EOA19049)、来自番茄的SWEET蛋白质(XP004230255)、来自小立碗藓的SWEET蛋白质4种(EDQ53581、EDQ64580、EDQ72753和XP_001759812)，将与序列号2的氨基酸序列一起进行多重比对分析而得的结果示于图2-1～2-2。如图2-1～2-2所示，由能够从系统树鉴定的7种同源核酸编码的蛋白质和AtSWEET8蛋白质彼此具有非常高的一致度，因此可以说在植物体中与AtSWEET8蛋白质具有同样的功能(参与糖运输的转运蛋白活性)的概率高。
其中，来自拟南芥的SWEET蛋白质(XP_002870717)与AtSWEET8蛋白质的氨基酸序列中的一致度为89％，来自荠菜的SWEET蛋白质(EOA19049)与AtSWEET8蛋白质的氨基酸序列中的一致度为88％，来自番茄的SWEET蛋白质(XP004230255)与AtSWEET8蛋白质的氨基酸序列中的一致度为44％，来自小立碗藓的SWEET蛋白质(EDQ53581)与AtSWEET8蛋白质的氨基酸序列中的一致度为36％，来自小立碗藓的SWEET蛋白质(EDQ64580)与AtSWEET8蛋白质的氨基酸序列中的一致度为33％，来自小立碗藓的SWEET蛋白质(EDQ72753)与AtSWEET8蛋白质的氨基酸序列中的一致度为38％，来自小立碗藓的SWEET蛋白质(XP_001759812)与AtSWEET8蛋白质的氨基酸序列中的一致度为34％。这样，由上述的7种同源核酸编码的蛋白质与AtSWEET8蛋白质之间有33％以上的一致度。
另外，同样地，对于来自番茄的SWEET蛋白质(XP004230255、序列号5)和来自小立碗藓的SWEET蛋白质(EDQ64580、序列号7)，将与AtSWEET8蛋白质以及由其他6种同源核酸编码的蛋白质之间的氨基酸序列中的一致度的结果归纳示于表2。
表2
如表2所示，来自番茄的SWEET蛋白质(XP004230255)与AtSWEET8蛋白质以及由其他6种同源核酸编码的蛋白质之间有29％以上的一致度。另外，如表2所示，来自小立碗藓的SWEET蛋白质(EDQ64580)与AtSWEET8蛋白质以及由其他6种同源核酸编码的蛋白质之间有30％以上的一致度。
由表2所示的结果，作为上述“编码特定的参与糖运输的转运蛋白蛋白质的核酸”，也可以是编码相对于序列号2所示的氨基酸序列有33％以上的一致度的氨基酸序列、相对于序列号5所示的氨基酸序列有29％以上的一致度的氨基酸序列、或相对于序列号7所示的氨基酸序列有30％以上的一致度的氨基酸序列，且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质的核酸。
此外，AtSWEET8蛋白质和由上述的7种同源核酸编码的蛋白质在C末端侧具有跨膜结构域。对于AtSWEET8蛋白质，在序列号2所示的氨基酸序列中从第214位至C末端为跨膜结构域。对于来自番茄的SWEET蛋白质(XP004230255)，在序列号5所示的氨基酸序列中从第206位至C末端为跨膜结构域。对于来自小立碗藓的SWEET蛋白质(EDQ64580)，在序列号7所示的氨基酸序列中从第196位至C末端为跨膜结构域。
对于AtSWEET8蛋白质、来自番茄的SWEET蛋白质(XP004230255)和来自小立碗藓的SWEET蛋白质(EDQ64580)中的除了跨膜结构域以外的区域，将与AtSWEET8蛋白质以及由其他6种同源核酸编码的蛋白质之间的氨基酸序列中的一致度的结果归纳示于表3。
表3
如表3所示，AtSWEET8蛋白质的除了跨膜结构域以外的区域与由上述7种同源核酸编码的蛋白质的除了跨膜结构域以外的区域之间有35％以上的一致度。另外，如表3所示，来自番茄的SWEET蛋白质(XP004230255)的除了跨膜结构域以外的区域与AtSWEET8蛋白质的除了跨膜结构域以外的区域以及由其他6种同源核酸编码的蛋白质的除了跨膜结构域以外的区域之间有39％以上的一致度。进而，如表3所示，来自小立碗藓的SWEET蛋白质(EDQ64580)的除了跨膜结构域以外的区域与AtSWEET8蛋白质的除了跨膜结构域以外的区域以及由其他6种同源核酸编码的蛋白质的除了跨膜结构域以外的区域之间有37％以上的一致度。
由表3所示的结果，作为上述“编码特定的参与糖运输的转运蛋白蛋白质的核酸”，也可以是编码包含相对于序列号2所示的氨基酸序列中的从N末端至第213位的氨基酸序列有35％以上的一致度的氨基酸序列、相对于序列号5所示的氨基酸序列中的从N末端至第205位的氨基酸序列有39％以上的一致度的氨基酸序列、或相对于序列号7所示的氨基酸序列中的从N末端至第195位的氨基酸序列有37％以上的一致度的氨基酸序列作为除了跨膜结构域以外的区域，且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质的核酸。
此外，AtSWEET8蛋白质和由上述7种同源核酸编码的蛋白质在N末端侧具有同源性低的区域。对于AtSWEET8蛋白质，在序列号2所示的氨基酸序列中从N末端至第32位为同源性低的区域。对于来自番茄的SWEET蛋白质(XP004230255)，在序列号5所示的氨基酸序列中从N末端至第29位为同源性低的区域。对于来自小立碗藓的SWEET蛋白质(EDQ64580)，在序列号7所示的氨基酸序列中从N末端至第17位为同源性低的区域。
对于AtSWEET8蛋白质、来自番茄的SWEET蛋白质(XP004230255)和来自小立碗藓的SWEET蛋白质(EDQ64580)中的除了同源性低的区域和跨膜结构域以外的区域，将与AtSWEET8蛋白质以及由其他6种同源核酸编码的蛋白质之间的氨基酸序列中的一致度的结果归纳示于表4。
表4
如表4所示，AtSWEET8蛋白质的除了同源性低的区域和跨膜结构域以外的区域与由上述7种同源核酸编码的蛋白质的除了跨膜结构域以外的区域之间有37％以上的一致度。另外，如表4所示，来自番茄的SWEET蛋白质(XP004230255)的除了同源性低的区域和跨膜结构域以外的区域与AtSWEET8蛋白质的除了同源性低的区域和跨膜结构域以外的区域以及由其他6种同源核酸编码的蛋白质的除了同源性低的区域和跨膜结构域以外的区域之间有40％以上的一致度。进而，如表4所示，来自小立碗藓的SWEET蛋白质(EDQ64580)的除了同源性低的区域和跨膜结构域以外的区域与AtSWEET8蛋白质的除了同源性低的区域和跨膜结构域以外的区域以及由其他6种同源核酸编码的蛋白质的除了同源性低的区域和跨膜结构域以外的区域之间有39％以上的一致度。
由表4所示的结果，作为上述“编码特定的参与糖运输的转运蛋白蛋白质的核酸”，也可以是编码包含相对于序列号2所示的氨基酸序列中的第33～213位的氨基酸序列有37％以上的一致度的氨基酸序列、相对于序列号5所示的氨基酸序列中的第30～205位的氨基酸序列有40％以上的一致度的氨基酸序列、或相对于序列号7所示的氨基酸序列中的第18～195位的氨基酸序列有39％以上的一致度的氨基酸序列作为除了同源性低的区域和跨膜结构域以外的区域、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质的核酸。
此外，由图2-1～2-2所示的多重比对分析的结果，可导出以下的氨基酸序列作为由7种同源核酸编码的蛋白质和AtSWEET8蛋白质的共有序列1。即，从N末端至C末端，以下的氨基酸序列：(N/S)(V/I)xxxxxFx(S/A)(1-3aa)TFxxI(V/F/M)Kx(K/R)(S/K/T)(V/T)x(D/E)(F/Y)(S/K)x(I/V/M)PY(V/I/L)x(T/A)x(L/M)(N/S)xxLW(V/T)(V/F/L)YGL(0-2aa)(V/I/F/L)xxxxxLVx(T/S)(I/V)N(A/G)xGxx(I/L)(E/H)(L/F/M/I)xY(L/I/V)x(L/I/V)(Y/F)Lxx(A/S/C)(2-4aa)(S/K/N)x(R/Q)(1-2aa)(V/I/M)xxxxxxx(L/V/I)xx(F/V/L)xx(V/I/M)xx(L/I/V)(V/T)(L/F)xx(V/I)(H/D/K)(D/S/N/G)(2-3aa)(R/K)xx(I/V/L/F)(I/V/L)Gx(L/M/I)xxx(F/L)xxxMYx(S/A)Pxx(V/A)xxxV(I/V)xx(R/K)S(V/T)(E/K)(Y/F)MPF(L/F)LS(L/F)(F/V)xF(I/L/V)N(G/A/S)xxWxxY(A/S)x(F/I/V/L)(2-3aa)Dx(F/Y)(I/V)xx(P/S)Nx(L/I)Gx(L/F/I)x(G/A)x(A/T/S)QLx(L/V)Yxx(Y/F)xx(A/S)(T/S)P成为共有序列1。
在上述氨基酸序列中，x表示任意的氨基酸残基。该氨基酸序列中，由以-连接的2个数值与aa组成的标记，表示其位置是由任意的氨基酸组成的序列，其序列由该2个数值所夹的范围的氨基酸残基数组成。在该氨基酸序列中，在括号内将多个氨基酸用/分开显示的标记，表示其位置是该多个氨基酸中的任一氨基酸。此外，对于本说明书所记载的氨基酸序列采用本标记方法。
另外，对于上述共有序列1，可以换个说法说成是从N末端到C末端由序列号44的氨基酸序列、1～3个任意的氨基酸残基、序列号45的氨基酸序列、0～2个任意的氨基酸残基、序列号46的氨基酸序列、2～4个任意的氨基酸残基、序列号47的氨基酸序列、1～2个任意的氨基酸残基、序列号48的氨基酸序列、2～3个任意的氨基酸残基、序列号49的氨基酸序列、2～3个任意的氨基酸残基、序列号50的氨基酸序列依次连接而成的氨基酸序列。
该共有序列1是对以由图2-1～2-2所示的7种同源核酸编码的蛋白质和tSWEET8蛋白质组成的组赋予特征的序列，是成为与其他参与糖运输的转运蛋白蛋白质的明确区别基准的序列。
即，在本发明中，作为上述“编码特定的参与糖运输的转运蛋白蛋白质的核酸”，也包含编码具有共有序列1的氨基酸序列的蛋白质的核酸。
另外，判断这些之中的来自拟南芥的SWEET蛋白质(XP_002870717)和来自荠菜的SWEET蛋白质(EOA19049)，如图1-1～1-3所示，具有相对于AtSWEET8蛋白质的氨基酸序列一致度更高的氨基酸序列。对于这些来自拟南芥的SWEET蛋白质(XP_002870717)和来自荠菜的SWEET蛋白质(EOA19049)以及AtSWEET8蛋白质的氨基酸序列，将多重比对分析的结果示于图3。如图3所示，可以说来自拟南芥的SWEET蛋白质(XP_002870717)和来自荠菜的SWEET蛋白质(EOA19049)在植物体中具有与AtSWEET8蛋白质同样的功能(参与糖运输的转运蛋白活性)的概率非常高。
此外，由图3所示的多重比对分析结果，可导出以下的氨基酸序列作为来自拟南芥的SWEET蛋白质(XP_002870717)、来自荠菜的SWEET蛋白质(EOA19049)与AtSWEET8蛋白质的共有序列2。即，从N末端到C末端，以下的氨基酸序列：MVDAKQVRFIIGVIGNVISFGLFAAPAKTFWRIFKKKSVEEFSYVPYVAT(V/I)MNCMLWVFYGLPVVHKDSxLVSTINGVGLVIE(L/I)FYV(G/A)(V/L)YLxYCGHK(Q/K)NxR(K/R)(K/N)ILx(Y/F)LxxEV(V/I)xV(A/V)xI(V/I)L(V/I)TLF(V/A)(I/L)K(N/G)DFxKQTFVG(V/I)ICD(V/I)FNIAMY(A/G)(S/A)PSLAI(I/F)(T/K)VV(K/R)TKS(V/T)EYMPFLLSLVCFVNA(A/G)IWT(S/T)YSLIFKIDxYVLASNGIGT(F/L)LALSQLIVYFMYYKSTPK(0-1aa)(E/D)KTVKPSEVEI(P/S)(A/G)T(N/E/D)RV成为共有序列2。
另外，对于上述共有序列2，可以换个说法说成是从N末端到C末端由序列号51的氨基酸序列、0～1个任意的氨基酸残基、序列号52的氨基酸序列依次连接而成的氨基酸序列。
该共有序列2是对由图3所示的2种同源核酸编码的蛋白质和AtSWEET8蛋白质组成的组赋予特征的序列，是成为与其他参与糖运输的转运蛋白蛋白质的明确区别基准的序列。
即，本发明中，作为上述“编码特定的参与糖运输的转运蛋白蛋白质的核酸”，也包含编码具有共有序列2的氨基酸序列的蛋白质的核酸。
其中，在上述共有序列1中，规定的位置所能够取的氨基酸残基的变化根据以下的理由。如参考文献(1)(《マッキー生化学》第3版第5章アミノ酸·ペプチド·タンパク質5.1アミノ酸，主编：市川厚，主译：福冈伸一，出版人：曾根良介，出版社：(株)化学同人、ISBN4-7598-0944-9)中也记载的那样，氨基酸按照具有同样的性质(化学性质、物理大小)的侧链分类是公知的。另外，在保持蛋白质的活性的前提下，分类于规定的组的氨基酸残基之间的分子进化上的替换高频率发生也是公知的。基于该考虑，参考文献(2)：Henikoff S.,Henikoff J.G.,Amino-acid substitution matrices from protein blocks,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,10915-10919(1992)中的Fig.2提倡了氨基酸残基的替换变异的得分矩阵(BLOSUM)，被广泛使用。在参考文献(2)中，侧链的化学性质相似的氨基酸彼此的替换是基于带给蛋白质整体的结构、功能变化少这样的见解。根据上述参考文献(1)和(2)，在多重比对中考虑的氨基酸的侧链的组可以以化学性质、物理大小等指标为基础考虑。这显示为在参考文献(2)所公开的得分矩阵(BLOSUM)中具有得分为0以上的值的氨基酸、优选为具有1以上的值的氨基酸的组。作为代表性的组，可列举下述8组。其他细的分组可以是该得分的值彼此为0以上的氨基酸组、优选彼此为1以上的氨基酸组、进一步优选为2以上的氨基酸组。
1)脂肪族疏水性氨基酸组(ILMV组)
该组是上述参考文献(1)所示的中性非极性氨基酸中具有脂肪属性的疏水性侧链的氨基酸的组，由V(Val、缬氨酸)、L(Leu、亮氨酸)、I(Ile、异亮氨酸)和M(Met、甲硫氨酸)构成。根据参考文献(1)分类为中性非极性氨基酸的氨基酸中FGACWP由于以下理由而不包含在该“脂肪族疏水性氨基酸组”中。G(Gly、甘氨酸)、A(Ala、丙氨酸)是因为由于侧链为甲基以下的大小而非极性的效果弱。C(Cys、半胱氨酸)是因为有时S-S键承担重要的作用，另外，具有与氧原子、氮原子形成氢键的特性。F(Phe、苯丙氨酸)、W(Trp、色氨酸)是因为侧链具有特别大的分子量，且芳香族的效果强。P(Pro、脯氨酸)是因为亚氨基酸效果强、固定了多肽的主链的角度。
2)具有羟基亚甲基的组(ST组)
该组是中性极性氨基酸中侧链具有羟基亚甲基的氨基酸的组，由S(Ser、丝氨酸)和T(Thr、苏氨酸)构成。存在于S和T的侧链的羟基是糖的结合部位，因而多是对于某种多肽(蛋白质)具有特定的活性重要的部位。
3)酸性氨基酸(DE组)
该组是侧链具有为酸性的羧基的氨基酸的组，由D(Asp、天冬氨酸)和E(Glu、谷氨酸)构成。
4)碱性氨基酸(KR组)
该组是碱性氨基酸的组，由K(Lys、赖氨酸)和R(Arg、精氨酸)构成。该K和R在广泛的pH范围内带正电，具有碱性的性质。另一方面，被分类为碱性氨基酸的H(His、组氨酸)在pH7基本不离子化，所以不分类到该组。
5)亚甲基＝极性基(DHN组)
该组全部具有在α位碳元素上作为侧链结合了亚甲基并且在亚甲基前面具有极性基这样的特征。具有作为非极性基的亚甲基的物理大小酷似的特征，由N(Asn、天冬酰胺、极性基为酰胺基)、D(Asp、天冬氨酸、极性基为羧基)和H(His、组氨酸、极性基为咪唑基)构成。
6)二亚甲基＝极性基(EKQR组)
该组全部具有在α位碳元素上作为侧链结合了二亚甲基以上的直链烃并在直链烃的前面具有极性基这样的特征。具有作为非极性基的二亚甲基的物理大小酷似的特征。由E(Glu、谷氨酸、极性基为羧基)、K(Lys、赖氨酸、极性基为氨基)、Q(Gln、谷氨酰胺、极性基为酰胺基)、R(Arg、精氨酸、极性基为亚氨基和氨基)构成。
7)芳香族(FYW组)
该组是侧链具有苯核的芳香族氨基酸，以具有芳香族特有的化学性质为特征。由F(Phe、苯丙氨酸)、Y(Tyr、酪氨酸)、W(Trp、色氨酸)构成。
8)环状&极性(HY组)
该组是侧链具有环状结构并同时具有极性的氨基酸，由H(H、组氨酸、环状结构和极性基都是咪唑基)、Y(Tyr、酪氨酸、环状结构为苯核、极性基为羟基)构成。
基于上述氨基酸组，能够容易地预想即使将具有某功能的蛋白质的氨基酸序列中某一氨基酸残基替换成属于同一组的氨基酸残基也能得到具有同样的功能的新蛋白质。例如基于上述“1)脂肪族疏水性氨基酸组(ILMV组)”，能够容易地预想即使将具有某功能的蛋白质的氨基酸序列中的异亮氨酸残基替换成亮氨酸残基也能得到具有同样的功能的新蛋白质。在具有某功能的蛋白质存在多种的情况下，也有时作为共有序列而记载氨基酸序列，但即使在这种情况下，也能够容易地预想即使将某一氨基酸残基替换成属于同一组的氨基酸残基也能得到具有同样的功能的新蛋白质。例如，当具有某功能的蛋白质存在多种，由此算出的共有序列中的氨基酸残基为异亮氨酸或亮氨酸(L/I)的时，基于上述“1)脂肪族疏水性氨基酸组(ILMV组)”，能够容易地预想即使将异亮氨酸或亮氨酸残基替换成甲硫氨酸或缬氨酸残基也能得到具有同样的功能的新蛋白质。
应用本发明的植物，通过将编码如上所述定义的“特定的参与糖运输的转运蛋白蛋白质”的核酸导入细胞内，或者强化由该核酸编码的蛋白质的表达，从而能够产生高糖浓度的溢泌物(例如排水液)。作为将该编码参与糖运输的转运蛋白的核酸导入细胞内的方法，可列举例如，将以能够表达编码参与糖运输的转运蛋白的DNA的方式配置的表达载体导入细胞内的方法。另外，作为强化编码参与糖运输的转运蛋白的核酸的表达的方法，可列举改变位于作为对象的植物体中的编码参与糖运输的转运蛋白的DNA附近的转录启动子的方法。特别优选将以在能够恒常表达的启动子的控制下表达上述的编码参与糖运输的转运蛋白的DNA的方式配置的表达载体导入对象植物的细胞的方法。
表达载体
表达载体以包含具有能够恒常表达的启动子碱基序列的核酸、和编码上述参与糖运输的转运蛋白的核酸的方式构建。作为成为表达载体的母体的载体，可以使用现有公知的各种载体。例如，可以使用质粒、噬菌体、或粘粒等，可以根据所导入的植物细胞、导入方法适宜选择。具体地，可列举例如，pBR322、pBR325、pUC19、pUC119、pBluescript、pBluescriptSK、pBI系列的载体等。特别是在向植物细胞导入载体的导入法是使用农杆菌的方法时，优选使用pBI系列的双元载体。作为pBI系列的双元载体，具体可列举例如，pBIG、pBIN19、pBI101、pBI121、pBI221等。
启动子只要是能在植物体内表达编码参与糖运输的转运蛋白的核酸的启动子就不特别限定，优选使用公知的启动子。作为该启动子，可列举例如，花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)、各种肌动蛋白基因启动子、各种遍在蛋白基因启动子、胭脂碱合成酶基因的启动子、烟草的PR1a基因启动子、番茄的核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基基因启动子、Napin(油菜贮藏蛋白)基因启动子、油质蛋白基因启动子等。其中，更优选使用花椰菜花叶病毒35S启动子、肌动蛋白基因启动子或遍在蛋白基因启动子。如果使用上述各启动子，则能够使任意的核酸在被导入植物细胞内时增强表达。
另外，作为启动子，还可以使用具有使核酸在植物中部位特异性地表达的功能的启动子。作为这样的启动子，可以使用现有公知的任何启动子。通过使用这样的启动子，部位特异性地导入上述编码参与糖运输的转运蛋白的核酸，从而能够提高由导入了该核酸的细胞形成的植物器官、植物组织产生的溢泌物所含的糖含量。
此外，表达载体除了启动子和上述编码参与糖运输的转运蛋白的核酸之外，还可以包含具有其他片段序列的核酸。对该具有其他片段序列的核酸不特别限定，可列举具有终止子碱基序列的核酸、具有转化体筛选标志物碱基序列的核酸、具有增强子碱基序列的核酸、具有用于提高翻译效率的碱基序列的核酸等。另外，上述重组表达载体还可以具有T-DNA区域。T-DNA区域特别是在使用农杆菌将具有上述重组表达载体中的碱基序列的核酸导入植物细胞时能够提高核酸导入的效率。
具有终止子碱基序列的核酸只要具有作为转录终止部位的功能即可，不特别限定，可以是公知的终止子。例如，具体来说，优选使用胭脂碱合成酶基因的转录终止区(Nos终止子)、花椰菜花叶病毒35S的转录终止区(CaMV35S终止子)等。其中更优选使用Nos终止子。在上述重组载体中，可以通过将终止子配置在适当的位置，从而防止发生在导入植物细胞之后合成不必要的长转录物这样的现象。
作为具有转化体筛选标志物碱基序列的核酸，例如，可以使用包含耐药性基因的核酸。作为所述耐药性基因的具体例子，可列举例如，包含针对潮霉素、博来霉素、卡那霉素、庆大霉素、氯霉素等的耐药性基因的核酸。由此，通过选择在含有上述抗生素的培养基中生长的植物体，可以容易地筛选出被转化的植物体。
作为具有用于提高翻译效率的碱基序列的核酸，可列举例如具有来自烟草花叶病毒的omega序列的核酸。通过将该具有omega序列的核酸配置在蛋白质编码区上游的非翻译区(5’UTR)，能够提高上述编码参与糖运输的转运蛋白的核酸的表达效率。这样，上述重组表达载体中，根据其目的可以包含具有各种DNA片段序列的核酸。
对于重组表达载体的构建方法不特别限定，可以在适宜选择的成为母体的载体中以规定的顺序导入上述具有启动子碱基序列的核酸、上述编码参与糖运输的转运蛋白的核酸和根据需要的上述具有其他DNA片段序列的核酸。例如，可以将上述编码参与糖运输的转运蛋白的核酸、具有启动子碱基序列的核酸和(根据需要的具有终止子碱基序列的核酸等)连接，将连接产物导入载体中。
另外，对上述重组表达载体的增殖方法(生产方法)也不特别限定，可以使用现有公知的方法。一般可以以大肠杆菌为宿主使其在该大肠杆菌内增殖。这时，可以根据载体的种类来选择优选的大肠杆菌的种类。
转化
上述表达载体可通过一般的转化方法导入对象植物细胞。对将表达载体导入植物细胞的方法(转化方法)不特别限制，可以根据植物细胞而使用适当的现有公知的方法。具体地说，例如，可以使用利用农杆菌的方法、直接导入植物细胞的方法。作为利用农杆菌的方法，例如，可以使用Bechtold,E.,Ellis,J.和Pelletier,G.(1993)In PlantaAgrobacterium-mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsisplants.C.R.Acad.Sci.Paris Sci.Vie,316,1194-1199.或Zyprian E,Kado Cl,Agrobacterium-mediated plant transformation by novel mini-T vectors inconjunction with a high-copy vir region helper plasmid.Plant MolecularBiology,1990,15(2),245-256.所记载的方法。
作为将表达载体直接导入植物细胞的方法，例如，可以使用微注射法、电穿孔法、聚乙二醇法、基因枪法、原生质体融合法、磷酸钙法等。
另外，如果采用将上述编码参与糖运输的转运蛋白的核酸直接导入植物细胞的方法，则只要是包含编码作为对象的转运蛋白的核酸表达所需的转录单元、例如具有启动子碱基序列的核酸、具有转录终止子碱基序列的核酸和编码作为对象的转运蛋白的核酸的核酸就足够了，载体功能并不是必须的。进而，即使是不具有转录单元的仅包含上述编码参与糖运输的转运蛋白的核酸的蛋白质编码区的核酸，只要能够整合到宿主基因组中的转录单元内、能够表达成为对象的基因即可。另外，即使在不整合到宿主基因组中的情况下，只要上述编码参与糖运输的转运蛋白的核酸能够在细胞内被转录且/或翻译就足够了。
作为导入上述表达载体、不含表达载体的成为对象的编码参与糖运输的转运蛋白的核酸的植物细胞，可列举例如，花、叶、根等植物器官中的各组织的细胞、愈伤组织、悬浮培养细胞等。这里，表达载体既可以根据要生产的植物体的种类来适宜构建适当载体，也可以预先构建通用的表达载体，将其导入植物细胞。
作为由成为表达载体的导入对象的细胞形成的植物，不特别限定。即，通过导入上述编码参与糖运输的转运蛋白的核酸，能够对于所有植物体提高排水液等溢泌物所含的糖浓度。作为成为对象的植物，例如，优选为显花植物，在显花植物中更优选为被子植物。作为成为对象的被子植物，可列举例如，双子叶植物、单子叶植物，属于例如十字花科、禾本科、茄科、豆科、杨柳科等的植物(参照下述)，但不限于这些植物。
十字花科：拟南芥(Arabidopsis thaliana)、深山旗竿(玉山筷子芥)(Arabidopsis lyrata)、油菜(Brassica rapa、Brassica napus、Brassica campestris)、卷心菜(Brassica oleracea var.capitata)、白菜(Brassica rapa var.pekinensis)、青菜(Brassica rapa var.chinensis)、芜青(Brassica rapa var.rapa)、野泽菜(Brassicarapa var.hakabura)、日本芜青(Brassica rapa var.lancinifolia)、小松菜(Brassicarapa var.peruviridis)、小白菜(パクチョイ，Brassica rapa var.chinensis)、萝卜(Brassica Raphanus sativus)、山葵(Wasabia japonica)、荠菜(Capsella rubella)等。
藜科：甜菜(Beta vulgaris)
槭树科：糖枫(Acer saccharum)
大戟科：蓖麻(Ricinus communis)
茄科：烟草(Nicotiana tabacum)、茄子(Solanum melongena)、马铃薯(Solaneumtuberosum)、番茄(Solanum lycopersicum)、辣椒(Capsicum annuum)、矮牵牛(Petuniahybrida)等。
豆科：大豆(Glycine max)、豌豆(Pisum sativum)、蚕豆(Vicia faba)、多花紫藤(Wisteria floribunda)、花生(Arachis.hypogaea)、日本百脉根(Lotus japonicus)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、赤小豆(Vigna angularis)、金合欢(Acacia)、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)、鹰嘴豆(Cicer arietinum)等。
菊科：菊(Chrysanthemum morifolium)、向日葵(Helianthus annuus)等。
棕榈科：油棕(非洲油棕(Elaeis guineensis)、美洲油棕(Elaeis oleifera))、椰子(Cocos nucifera)、海枣(Phoenix dactylifera)、巴西棕榈(Copernicia)等。
漆树科：野漆树(Rhus succedanea)、腰果(Anacardium occidentale)、漆树(Toxicodendron vernicifluum)、芒果(Mangifera indica)、阿月浑子(Pistacia vera)等。
葫芦科：南瓜(笋瓜(Cucurbita maxima)、中国南瓜(Cucurbitamoschata)、美洲南瓜(Cucurbita pepo))、黄瓜(Cucumis sativus)、王瓜(Trichosanthes cucumeroides)、葫芦(Lagenaria siceraria var.gourda)等。
蔷薇科：扁桃(Amygdalus communis)、玫瑰(Rosa)、草莓(Fragaria vesca)、樱(Prunus)、苹果(Malus pumila var.domestica)、桃(Prunus persica)等。
葡萄科：葡萄(Vitis vinifera)
石竹科：康乃馨(Dianthus caryophyllus)等。
杨柳科：杨(毛果杨(Populus trichocarpa)、黑杨(Populus nigra)、欧洲山杨(Populus tremula))等。
禾本科：玉米(Zea mays)、稻(Oryza sativa)、大麦(Hordeum vulgare)、小麦(Triticum aestivum)、乌拉尔图小麦(Triticum urartu)、节节麦(Aegilops tauschii)、二穗短柄草(Brachypodium distachyon)、毛竹属(Phyllostachys)、甘蔗(Saccharumofficinarum)、象草(Pennisetum pupureum)、沙生蔗茅(Erianthus ravenae)、芒(Miscanthus virgatum)、高粱(Sorghum bicolor)、黍属(Panicum)等。
百合科：郁金香属(Tulipa)、百合属(Lilium)等。
其中，优选以甘蔗、玉米、稻、高粱、小麦、甜菜、糖枫这样的比较多地产生溢泌物、且糖、淀粉的产生能力高的植物作为对象。因为详细如后所述，可以使用从这些植物采集的溢泌物作为生物燃料、生物塑料的原料。
另外，如上所述，本发明中能够使用的编码参与糖运输的转运蛋白的核酸可以从各种植物分离而使用，可以根据对象植物的种类适宜选择而使用。即，在对象植物细胞来自单子叶植物的情况下，作为编码参与糖运输的转运蛋白的核酸，可以导入从单子叶植物分离的核酸。另外，在对象植物细胞来自双子叶植物的情况下，作为编码参与糖运输的转运蛋白的核酸，可以导入从双子叶植物分离的核酸。即使对象植物细胞来自单子叶植物，也可以导入来自双子叶植物的编码参与糖运输的转运蛋白的核酸。作为来自双子叶植物拟南芥的编码参与糖运输的转运蛋白的核酸的、编码AtSWEET8蛋白质的核酸，即使对象植物是稻等单子叶植物，也能够显著提高溢泌物所含的糖量。
其他工序、其他方法
在上述的转化处理后，通过现有公知的方法进行从植物体中筛选适当的转化体的筛选工序。对筛选的方法不特别限定，例如，可以以潮霉素耐性等耐药性为基准进行筛选，也可以在育成转化体后从植物体采集溢泌物，测定采集的溢泌物所含的糖分，筛选与野生型相比糖浓度有意义地提高了的植株。另外，采集的溢泌物所含的糖分测定也可以采用不是定量而是定性地测定的方法，例如可以通过使用与糖反应而显色的试纸的显色法来测定。
另外，可以从转化处理所得的转化植物按照常规方法获得后代植物。对于保持了上述编码参与糖运输的转运蛋白的核酸的表达量与野生型有意义地提高这样的性状的后代植物，以其溢泌物所含的糖量作为基准进行筛选，从而能够通过具有上述性状而制作出溢泌物所含的糖量增加了的稳定的植物系统。此外，可以从转化植物、其后代获得植物细胞、种子、果实、植株、愈伤组织、块茎、扦插枝、块等繁殖材料，基于这些通过具有上述性状而量产溢泌物所含的糖量增加了的稳定的植物系统。
如以上说明的那样，根据本发明，通过将上述编码特定的参与糖运输的转运蛋白的核酸导入细胞，或者强化该核酸的表达，与野生型的植物体相比，能够有意义地提高溢泌物所含的糖浓度。其中，作为溢泌物所含的糖成分，是包含葡萄糖、半乳糖、甘露糖和果糖这样的单糖类、蔗糖、乳糖和麦芽糖这样的二糖类的含义。即，通过将上述编码特定的参与糖运输的转运蛋白的核酸导入细胞，或者强化内源性的该基因的表达，能够提高溢泌物所含的葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、蔗糖、乳糖和麦芽糖等糖成分中的任意1种以上的浓度。特别是根据本发明，能够大幅提高溢泌物中的葡萄糖、果糖和蔗糖的浓度。
特别是采集从排水组织产生的排水液作为溢泌物时，优选将细胞中导入了上述编码特定的参与糖运输的转运蛋白的核酸、或强化了该核酸的表达的植物在防止所产生的排水液蒸腾这样的条件下进行栽培。进而，更优选将该植物在排水液的产生量这样的条件下进行培养。例如，可以通过使栽培该植物时的栽培条件为湿度80％RH以上、更优选为90％RH以上的密闭空间，来防止排水液的蒸腾、并增大排水液的产生量。
例如，野生型拟南芥的排水液所含的糖浓度为约2.0μM(平均值、单糖当量)，与此相对，在导入了编码AtSWEET8蛋白质的核酸的情况下，糖浓度增加到约2400μM。另外，野生型稻的排水液所含的糖浓度为约1.3μM(平均值、单糖当量)，与此相对，在导入了编码AtSWEET8蛋白质的核酸的转化稻中，能够大幅提高排水液中的糖浓度。
如上，根据本发明，能够采集高糖浓度的溢泌物。采集的溢泌物能够在醇和/或有机酸的发酵生产中使用。即，能够利用溢泌物所含的高浓度的糖成分作为醇发酵、有机酸发酵的底物。此时，例如在作为溢泌物利用排水液的情况下，可以将从导入了上述特定的参与糖运输的转运蛋白蛋白质基因、或强化了内源性的该基因的表达的植物采集的排水液直接在醇发酵、有机酸发酵的反应体系中利用。或者，可以将从该植物采集的排水液进行浓缩处理、添加其他碳源、氮源等的处理之后，在醇发酵、有机酸发酵的反应体系中利用。
实施例
以下，使用实施例更详细地说明本发明，但本发明的技术的范围不限于这些实施例。
1.拟南芥转化用DNA构建体的制作
1.1通过PCR获得编码AtSWEET蛋白质的DNA
1.1.1编码AtSWEET蛋白质的DNA的扩增
以从拟南芥制备的cDNA作为模板，通过PCR进行评价用的编码AtSWEET1、AtSWEET2、AtSWEET3、AtSWEET4、AtSWEET5、AtSWEET6、AtSWEET7、AtSWEET9、AtSWEET11、AtSWEET12、AtSWEET13、AtSWEET15和AtSWEET17蛋白质的DNA的扩增。为了将评价用DNA插入pRI201AN载体(タカラバイオ社制、#3264)中，设计在5’末端添加了Sal I限制性酶识别序列的正向引物，以及在3’末端添加了Sac I或Pst I限制性酶识别序列的反向引物(表5)。
表5
然后，使用这些引物和PrimeSTAR GXL DNA聚合酶(TaKaRa、#R050A)进行PCR扩增。反应液组成示于表6，反应条件示于表7。
表6
组成 (μl)
模板DNA(100ng/μl) 1μl
5×Prime Star GXL缓冲液 4μl
dNTP混合物(25mM) 1.6μl
正向引物(10ng/μl) 0.4μl
反相引物(10ng/μl) 0.4μl
Prime Star GXL(1u/μl) 0.8μl
灭菌水 12.6μl
总量 20μl
表7
接着，为了将上述PCR扩增所得的DNA片段插入pCR2.1-TOPO载体DNA(Invitrogen、#K4500-01)中，进行以下的处理，在5’末端和3’末端添加腺嘌呤(Adenine)。反应液组成示于表8。使表8所示的反应液在70℃反应15分钟。
表8
组成
PCR反应液 15μl
10×ExTaq缓冲液 3μl
dNTP混合物(25mM) 2μl
Ex Taq(0.5u/μl) 0.1μl
灭菌水 9.9μl
总量 30μl
1.1.2扩增DNA片段的切下和纯化
将PCR扩增而得的各DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳后，使用MagExtractor-PCR&GelClean up试剂盒(TOYOBO、#NPK-601)进行切下纯化。此外，切下纯化按照试剂盒附带的操作说明书进行。
1.1.3扩增DNA片段的转化
将纯化而得的扩增DNA片段使用TOPO TA Cloning(Invitrogen、#K4500-01)导入pCR2.1-TOPO载体中。反应液组成示于表9。使表9所示的反应液在室温反应5分钟。
表9
组成 (μl)
切下纯化物(SWEET序列扩增) 2μl
盐溶液 0.5μl
pCR2.1-topO载体 0.5μl
总量 3μl
接着，将该反应液2μl添加到大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞(TOYOBO、#DNA-903)中，进行转化。在冰浴上放置30分钟后，在42℃进行30秒热处理。然后，在冰浴上骤冷，添加500μl的SOC培养基(Invitrogen、#15544-034)，以37℃、180rpm振荡培养1小时。在添加了终浓度50μg/ml的卡那霉素的LB琼脂平板上涂布溶解在DMF(N，N-二甲基甲酰胺)中的40mg/ml X-gal 40μl、100mM IPTG 40μl后，再涂布培养液100-200μl，在37℃培养一晚，第二天早晨获得菌落。
1.1.4通过菌落PCR来进行转化的检查和阳性克隆的筛选
转化的结果得到多个菌落。为了对于各菌落确认有无插入DNA，使用M13-F：5’-GTAAAA CGA CCA GTC TTA AG-3’(序列号36)和M13-R：5’-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3’(序列号37)进行菌落PCR。菌落PCR的反应液组成示于表10，PCR条件示于表11。
表10
组成 (μl)
模板DNA 菌落
Amprltaq Gold 360 Master Mix(ABI、#4398881) 10μl
正向引物(M13-F)(10ng/μl) 0.4μl
反向引物(M13-R)(10ng/μl) 0.4μl
灭菌水 9.2μl
总量 20μl
表11
1.1.5来自阳性克隆的质粒DNA纯化
从能够确认插入DNA的克隆纯化质粒DNA。质粒DNA的纯化使用QIAprep SpinMiniprep Kit(QIAGEN、#27106)，按照附带的方案进行。
1.1.6阳性克隆的碱基序列确定
以1.1.5中得到的质粒DNA作为模板，使用M13-F和M13-R引物进行PCR扩增，通过双脱氧法(桑格尔法)来确定DNA片段的碱基序列。
1.2通过化学合成来获得编码AtSWEET蛋白质的DNA
对于编码AtSWEET8、AtSWEET10、AtSWEET14、AtSWEET16蛋白质的DNA，以在5’末端添加Pst I限制性酶识别序列、在3’末端添加Sal I限制性酶识别序列的方式设计碱基序列，进行化学全合成。其结果能够获得插入了pEX-A载体(オペロンバィオテクノロジ一)中的编码AtSWEET8和AtSWEET14蛋白质的DNA、插入了pCR2.1-TOPO载体中的编码AtSWEET10和AtSWEET16蛋白质的DNA。
1.3通过限制性酶反应来进行编码AtSWEET蛋白质的DNA的切下和纯化
为了从1.1.5和1.2中得到的质粒DNA取出编码AtSWEET蛋白质的DNA片段，进行两次的限制性酶处理。针对各DNA的限制性酶的组合记于表12。
表12
1.3.1扩增DNA片段的Sac I、Nde I或Sal I限制性酶反应(第一次)
使用Sac I(TaKaRa、#1078A)、Nde I(TaKaRa、#1161A)或Sal I(TaKaRa、#1080A)制作以下的反应液，在37℃反应一晚，切断1.1.5或1.2中得到的质粒。Sac I的反应液组成示于表13，Nde I的反应液组成示于表14，Sal I的反应液组成示于表15。
表13
组成 (μl)
质粒 45μl
10×L缓冲液 10μl
Sac I 1μl
DW 44μl
总量 100μl
表14
组成 (μl)
质粒 45μl
10×H缓冲液 10μl
Nde I 1μl
DW 44μl
总量 100μl
表15
组成 (μl)
质粒 45μl
10×H缓冲液 10μl
Sal I 1μl
DW 44μl
总量 100μl
1.3.2通过限制性酶反应切断的DNA片段的纯化
接着，为了纯化DNA，进行PCI(苯酚∶氯仿∶异戊醇＝24∶24∶1)提取和乙醇沉淀。在反应液中加入等量的PCI进行搅拌，在以5分钟、15000rpm离心回收的上层中加入等量的氯仿，同样离心而回收上层。在回收的上层中加入二倍量的乙醇，使用Pellet Paint NF Co-Precipitant(メルクバイオインサイト、#70748)进行乙醇沉淀。干燥后，将所得的DNA溶解在灭菌水44μl中。
1.3.3扩增DNA片段的Sal I、Xba I和Sac I限制性酶反应(第二次)
接着，使用Sal I(TaKaRa、#1080A)、Xba I(TaKaRa、#1093A)或Sac I(TaKaRa、#1078A)制作以下的反应液，在37℃反应一晚，切断1.3.2中得到的质粒。Sal I的反应液组成示于表16，Xba I的反应液组成示于表17，Sac I的反应液组成示于表18。
表16
组成 (μl)
Pellet
10×H缓冲液 5μl
Sal I 1μl
DW 44μl
总量 50μl
表17
组成 (μl)
Pellet
10×M缓冲液 5μl
100×BSA 0.5μl
Xba I 1μl
DW 43.5μl
总量 50μl
表18
组成 (μl)
Pellet
10×L缓冲液 5μl
Sac I 1μl
DW 44μl
总量 50μl
1.3.4通过限制性酶反应切断的DNA片段的纯化
将1.3.3中得到的反应液与1.1.2的步骤同样地进行琼脂糖凝胶电泳后，使用MagExtractor-PCR&Gel Clean up试剂盒进行切下纯化。
1.4通过限制性酶反应来进行pRI201AN载体的切下和纯化
为了与1.3中得到的编码AtSWEET蛋白质的DNA片段进行连接，将pRI201AN载体用与1.3同样的步骤进行限制性酶处理。
1.5连接
1.5.1连接反应
为了将1.3中得到的编码AtSWEET蛋白质的DNA片段插入1.4中得到的pRI201AN载体中，进行连接反应。反应使用DNA Ligation Kit Ver.2.1(タカラバイオ、#6022)，在16℃反应一晚。
1.5.2连接反应产物的转化
上述连接反应结束后，使用反应液2μl通过与1.1.3同样的方法进行转化。
1.5.3通过菌落PCR检查连接反应
通过将在菌落PCR中扩增的DNA片段的长度用琼脂糖凝胶电泳进行可视化，来确认编码AtSWEET蛋白质的DNA是否插入载体。
1.5.4通过连接反应获得的DNA构建体的制备
从能够确认插入DNA的菌落进行质粒DNA的纯化，得到插入了目的DNA片段的克隆。质粒DNA的纯化使用QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN、#27106)按照附带的方案进行。所得的DNA构建体(AtSWEET/pRI201AN)的物理图谱示于图4。在图4中，LB表示左边框(leftborder)，RB表示右边框(right border)，TNOS表示来自根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的Ti质粒的胭脂碱合成酶基因NOS的转录终止子，NPTII表示来自大肠杆菌(Escherichia coli)的新霉素磷酸转移酶II(neomycin phosphotransferaseII)基因，Pnos表示来自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的Ti质粒的胭脂碱合成酶基因NOS的转录启动子,THSP表示来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的热休克蛋白(heatshock protein)基因HSP的转录终止子，AtSWEET表示编码来自拟南芥(Arabidopsisthaliana)的SWEET蛋白质的DNA，P35S表示花椰菜花叶病毒35S转录启动子，AtADH 5’-UTR表示来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase)基因ADH的翻译增强子，ColE1ori表示大肠杆菌(Escherichia coli)的复制起点，Ri ori表示发根农杆菌(Agrobacterium rhizogene)S的复制起点。
1.6.1通过化学合成获得编码OsSWEET蛋白质的DNA以及构建体的制作
如下进行设计：在参考拟南芥的密码子频率而以氨基酸序列不改变的方式重新进行了序列设计的编码OsSWEET5、OsSWEET11、OsSWEET12、OsSWEET13、OsSWEET14和OsSWEET15蛋白质的DNA的起始密码子侧添加Nde I限制性酶识别序列，在终止密码子侧添加Sac I限制性酶识别序列。然后，将设计的DNA进行化学全合成，通过插入pRI201AN载体而获得各DNA构建体。此外，使添加在5’末端的Nde I限制性酶识别序列(5’CATATG3’)所含的ATG与编码SWEET蛋白质的DNA的起始密码子一致。
1.6.2通过化学合成获得编码SlSWEET8和PpSWEET8的DNA以及构建体的制作
作为编码序列号5所示的来自番茄的SWEET蛋白质(XP004230255、以下称为SlSWEET8)的氨基酸序列的碱基序列设计序列号40，作为编码序列号7所示的来自小立碗藓的SWEET蛋白质(EDQ64580、以下称为PpSWEET8)的碱基序列设计序列号42。然后设计使得这些序列号40和42中的起始密码子侧添加Nde I限制性酶识别序列，终止密码子侧添加SacI限制性酶识别序列。然后，将设计的DNA进行化学全合成，通过插入pRI201AN载体而获得2种DNA构建体。此外，使添加在5’末端的Nde I限制性酶识别序列(5’CATATG3’)所含的ATG与序列号40和42的起始密码子一致。
1.7向拟南芥的转化
将1.5和1.6.1以及1.6.2中制作的植物表达用载体通过电穿孔法(PlantMolecular Biology Mannal,Second Edition,B.G.Stanton and A.S.Robbert,KluwerAcdemic Publishers 1994)导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)C58C1株。接下来将导入了植物表达用载体的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)通过Clough等所记载的浸润法(Steven J.Clough and Andrew F.Bent,1998,The Plant Journal 16,735-743)导入野生型拟南芥生态型Col-0中，回收T1(转化(transformant)第一代)种子。将回收的T1种子在包含卡那霉素(50mg/L)、羧苄青霉素(100mg/L)和苯菌灵(Benlate)水合剂(10mg/L：住友化学社制)的MS琼脂培养基(琼脂浓度为0.8％))中进行无菌播种，培养约2周，筛选转化体。将筛选的转化体移植在新的上述MS琼脂培养基中，再栽培约1周后，移植在加入了蛭石与土壤混合物(Soil Mix)(サカタのタネ)以体积比1:1混合而得的土的盆中，获得T2(转化第二代)种子。
1.8拟南芥排水液的获得
将通过编码AtSWEET、OsSWEET、SlSWEET8和PpSWEET8蛋白质的DNA转化而得的拟南芥的T1或T2植物体在18L/6D(18小时光条件之后6小时暗条件的24小时光循环条件)、22℃下进行栽培。对驯化后经过1～2周的植物体给予1/1000花宝(HYPONeX)，用缠绕膜(旭化成制、サランラップ)包裹植物使湿度为80％以上优选为90％以上，使排水液排出(图5)。主要回收附着于叶里的排水液，分析排水液中的糖浓度。此外，将使野生型拟南芥感染农杆菌栽培而收获的种子定义为T1种子，将T1种子通过药剂筛选或PCR等方法确认细胞中导入了DNA的植物体定义为T1植物，将栽培T1植物而收获的种子定义为T2种子。
2.稻转化用DNA构建体的制作
2.1编码AtSWEET蛋白质的DNA的扩增
以上述1.5.4中制备的拟南芥转化用DNA构建体(编码AtSWEET8蛋白质的DNA、编码AtSWEET11蛋白质的DNA和编码AtSWEET12蛋白质的DNA)作为模板，通过PCR分别扩增编码AtSWEET8蛋白质的DNA、编码AtSWEET11蛋白质的DNA和编码AtSWEET12蛋白质的DNA。此外，为了将扩增产物导入pENTR/D-TOPO载体，在5’端添加了CACC序列。
2.2使用扩增DNA片段的转化
将所得的反应液的一部分进行琼脂糖凝胶电泳，确认了存在预定大小的扩增产物，然后使用pENTER Directional TOPO Cloning试剂盒(インビトロジェン)导入pENTR/D-TOPO载体中。
接着，将反应液总量添加到大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞(タカラバイオ)中，进行转化。在冰浴上放置30分钟后，在42℃进行45秒的热处理。然后，在冰浴中骤冷，添加300μl的SOC培养基(タカラバイオ)，以37℃、180rpm振荡培养1小时。将该培养液涂布在添加了终浓度50μg/ml的卡那霉素的LB琼脂平板上，在37℃过夜培养，第二天早晨获得菌落。
2.3通过菌落PCR来进行转化的检查和阳性克隆的筛选
通过将菌落PCR中扩增的DNA片段的长度用琼脂糖凝胶电泳进行可视化，确认编码AtSWEET蛋白质的DNA插入了载体中。
2.4从阳性克隆纯化质粒DNA
从能够确认插入DNA的克隆进行质粒DNA的纯化。质粒DNA的纯化使用QIAprepSpin Miniprep Kit(QIAGEN、#27106)按照附带的方案进行。
2.5阳性克隆的碱基序列确定
以2.4中纯化的质粒DNA作为模板，使用M13-F和M13-R引物，通过DNA测序仪(ベックマンコールターCEQ8000)进行DNA片段的碱基序列的确定。
2.6LR反应和转化
使用插入了2.4中得到的编码AtSWEET8蛋白质的DNA、编码AtSWEET11蛋白质的DNA、编码AtSWEET12蛋白质的DNA的pENTR/D-TOPO质粒DNA和稻转化用载体(pZH2B_GWOx)进行Gateway LR反应，如图6所示，构建了用于在稻植物体内过表达的构建体。
接着，将反应液总量添加到大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞(タカラバイオ)中进行转化。在冰浴上放置30分钟后，以42℃进行45秒的热处理。然后，在冰浴中骤冷，添加300μl的SOC培养基(タカラバイオ)，以37℃、180rpm振荡培养1小时。将该培养液涂布在添加了终浓度50μg/ml的奇霉素(spectinomycin)的LB琼脂平板上，在37℃过夜培养，第二天早晨获得菌落。
2.7通过菌落PCR进行转化的检查和阳性克隆的筛选
通过将在菌落PCR中扩增的DNA片段的长度用琼脂糖凝胶电泳进行可视化，确认编码AtSWEET蛋白质的DNA插入了载体。
2.8从阳性克隆纯化质粒DNA
从能够确认插入DNA的克隆进行质粒DNA的纯化。质粒DNA的纯化使用QIAprepSpin Miniprep Kit(QIAGEN、#27106)按照附带的方案进行。
2.9阳性克隆的碱基序列确定
以2.8中纯化的质粒DNA作为模板，使用以下的引物通过DNA测序仪(ベックマンコールターCEQ8000)进行DNA片段的碱基序列的确定。
Ubi3’F:5’-TGC TGT ACT TGC TTG GTA TTG-3’(序列号38)
UbiTseq3:5’-GGA CCA GAC CAG ACA ACC-3’(序列号39)
2.10.1通过化学合成来获得编码OsSWEET蛋白质的DNA
对编码OsSWEET13、OsSWEET14或者OsSWEET15蛋白质的DNA，为了导入pENTR/D-TOPO载体中而设计成在5’端添加了CACC序列。将设计的DNA进行化学全合成，插入pENTR/D-TOPO载体中。
2.10.2通过化学合成来获得编码SlSWEET8和PpSWEET8的DNA
其中，作为编码SlSWEET8的碱基序列设计序列号41，作为编码PpSWEET8的碱基序列设计序列号43。并且，对这些序列号41和43，为了导入pENTR/D-TOPO载体中而设计成在5’端添加了CACC序列。将设计的DNA进行化学全合成，插入pENTR/D-TOPO载体中。
2.11编码OsSWEET、SlSWEET8或PpSWEET8蛋白质的DNA的构建体的制作
使用2.10.1和2.10.2中合成的DNA，与上述2.6～2.9同样地构建稻转化用载体。
2.12向稻中的转化
使用上述2.9和2.11中制作的植物表达用载体，按照The Plant Journal(2006)47,969-976所记载的方法，将编码AtSWEET、OsSWEET、SlSWEET8和PpSWEET8蛋白质的DNA导入稻(日本晴)中。
2.13稻排水液的获得
将导入了编码AtSWEET、OsSWEET、SlSWEET8和PpSWEET8蛋白质的DNA的稻的转化第一代，移植到加入了8分左右的蛭石的直径6cm壶中进行驯化。此外稻的栽培在18L(30℃)/6D(25℃)(18小时30℃明条件之后6小时25℃暗条件的24小时光循环条件)下进行。对驯化后经过1～2周的植物体充分给予1/1000花宝(HYPONeX)，用缠绕膜(旭化成社制、サランラップ)包裹植物使湿度为80％以上优选为90％以上，使排水液从稻的排水组织中排出(图7)。回收附着于叶的排水液，分析糖浓度。
3.排水液中的糖浓度分析
3.1排水液样品的稀释
使用移液器测定1.8中得到的拟南芥的排水液、2.13中得到的稻的排水液的体积，加入纯水定容至0.35ml。接着，进行10000×G、10分钟的离心分离，然后将上清0.3mL移至自动取样器瓶中用于HPLC分析。
3.2通过HPLC进行的糖浓度的分析
糖浓度的分析在以下的条件下使用HPLC进行。此时作为标准物质使用葡萄糖、果糖、蔗糖各50μM混合而成的标准液。
分析柱：CarboPac PA1(ダイオネクス)
洗脱液：100mM NaOH
流量：1ml/min
进样量：25μl
检测器：脉冲安培检测器(ダイオネクスED40)
4.分析结果
将对于1.8中得到的拟南芥的排水液、2.13中得到稻的排水液测定糖浓度而得的结果示于表19和20。
表19
表20
从表19和20可判定，以强表达编码AtSWEET8蛋白质的DNA的方式进行了转化的拟南芥，排水液中的糖浓度大幅提高。特别是从表19和20可判定，在导入了编码SWEET蛋白质的DNA中被分类为进化枝III的编码AtSWEET9、AtSWEET10、AtSWEET11、AtSWEET12、AtSWEET13、AtSWEET14、AtSWEET15蛋白质的DNA的植物体中，排水液中的糖浓度大幅提高，被分类为进化枝II的蛋白质中仅编码AtSWEET8蛋白质、其同源蛋白质的DNA，虽然不是被分类为进化枝III的DNA，但能够更大幅地提高排水液中的糖浓度。
在野生型植物中，也有时根据个体不同而稀少地在排出液中检测到50μM左右的糖。但是如本实施例所示，导入编码AtSWEET8蛋白质蛋白质的核酸的效果，明显远高于在野生型植物中检测到的最大浓度。

Claims (27)

1.转化植物或转化植物细胞，其中，导入了编码AtSWEET8蛋白质的核酸或该核酸的同源核酸，和/或强化了由该核酸或该同源核酸编码的蛋白质的表达。
2.根据权利要求1所述的转化植物或转化植物细胞，其特征在于，所述编码AtSWEET8蛋白质的核酸是编码以下(a)～(c)的任一蛋白质的核酸，(a)包含序列号2的氨基酸序列的蛋白质，
(b)包含与序列号2的氨基酸序列有90％以上的同一性的氨基酸序列、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质，
(c)包含由能够与包含序列号1的碱基序列的多核苷酸的全部或一部分在严格条件下杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质。
3.根据权利要求1所述的转化植物或转化植物细胞，其特征在于，所述同源核酸是编码以下(a)～(c)的任一蛋白质的核酸，
(a)包含序列号5或7的氨基酸序列的蛋白质，
(b)包含与序列号5或7的氨基酸序列有90％以上的同一性的氨基酸序列、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质，
(c)包含由能够与包含序列号40～43的任一碱基序列的多核苷酸的全部或一部分在严格条件下杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质。
4.根据权利要求1所述的转化植物或转化植物细胞，其特征在于，所述同源核酸是编码以下(a)或(b)的蛋白质的核酸，
(a)包含序列号3、4、6、8和9的任一氨基酸序列的蛋白质，
(b)包含与序列号3、4、6、8和9的任一氨基酸序列有90％以上的同一性的氨基酸序列、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质。
5.根据权利要求1所述的转化植物或转化植物细胞，其特征在于，所述同源核酸是编码以下(a)～(c)的任一蛋白质的核酸，
(a)包含与序列号2记载的氨基酸序列有33％以上的一致度的氨基酸序列、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质，
(b)包含与序列号2记载的氨基酸序列中的从N末端至第213位的氨基酸序列有35％以上的一致度的氨基酸序列作为除了跨膜结构域以外的区域、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质，
(c)包含与序列号2记载的氨基酸序列中的第33～213位的氨基酸序列有37％以上的一致度的氨基酸序列作为除了同源性低的区域和跨膜结构域以外的区域、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质。
6.根据权利要求1所述的转化植物或转化植物细胞，其特征在于，所述同源核酸是编码以下(a)～(c)的任一蛋白质的核酸，
(a)包含与序列号5记载的氨基酸序列有29％以上的一致度的氨基酸序列、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质，
(b)包含与序列号5记载的氨基酸序列中的从N末端至第205位的氨基酸序列有39％以上的一致度的氨基酸序列作为除了跨膜结构域以外的区域、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质，
(c)包含与序列号5记载的氨基酸序列中的第30～205位的氨基酸序列有40％以上的一致度的氨基酸序列作为除了同源性低的区域和跨膜结构域以外的区域、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质。
7.根据权利要求1所述的转化植物或转化植物细胞，其特征在于，所述同源核酸是编码以下(a)～(c)的任一蛋白质的核酸，
(a)包含与序列号7记载的氨基酸序列有30％以上的一致度的氨基酸序列、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质，
(b)包含与序列号7记载的氨基酸序列中的从N末端至第195位的氨基酸序列有37％以上的一致度的氨基酸序列作为除了跨膜结构域以外的区域、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质，
(c)包含与序列号5记载的氨基酸序列中的第18～195位的氨基酸序列有39％以上的一致度的氨基酸序列作为除了同源性低的区域和跨膜结构域以外的区域、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质。
8.转化植物或转化植物细胞，其中，导入了编码具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质的核酸，和/或强化了该蛋白质的表达，所述具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质具有共有序列，所述共有序列包含以下的氨基酸序列：
(N/S)(V/I)xxxxxFx(S/A)(1-3aa)TFxxI(V/F/M)Kx(K/R)(S/K/T)(V/T)x(D/E)(F/Y)(S/K)x(I/V/M)PY(V/I/L)x(T/A)x(L/M)(N/S)xxLW(V/T)(V/F/L)YGL(0-2aa)(V/I/F/L)xxxxxLVx(T/S)(I/V)N(A/G)xGxx(I/L)(E/H)(L/F/M/I)xY(L/I/V)x(L/I/V)(Y/F)Lxx(A/S/C)(2-4aa)(S/K/N)x(R/Q)(1-2aa)(V/I/M)xxxxxxx(L/V/I)xx(F/V/L)xx(V/I/M)xx(L/I/V)(V/T)(L/F)xx(V/I)(H/D/K)(D/S/N/G)(2-3aa)(R/K)xx(I/V/L/F)(I/V/L)Gx(L/M/I)xxx(F/L)xxxMYx(S/A)Pxx(V/A)xxxV(I/V)xx(R/K)S(V/T)(E/K)(Y/F)MPF(L/F)LS(L/F)(F/V)xF(I/L/V)N(G/A/S)xxWxxY(A/S)x(F/I/V/L)(2-3aa)Dx(F/Y)(I/V)xx(P/S)Nx(L/I)Gx(L/F/I)x(G/A)x(A/T/S)QLx(L/V)Yxx(Y/F)xx(A/S)(T/S)P。
9.根据权利要求8所述的转化植物或转化植物细胞，其特征在于，所述共有序列包含：
MVDAKQVRFIIGVIGNVISFGLFAAPAKTFWRIFKKKSVEEFSYVPYVAT(V/I)MNCMLWVFYGLPVVHKDSxLVSTINGVGLVIE(L/I)FYV(G/A)(V/L)YLxYCGHK(Q/K)NxR(K/R)(K/N)ILx(Y/F)LxxEV(V/I)xV(A/V)xI(V/I)L(V/I)TLF(V/A)(I/L)K(N/G)DFxKQTFVG(V/I)ICD(V/I)FNIAMY(A/G)(S/A)PSLAI(I/F)(T/K)VV(K/R)TKS(V/T)EYMPFLLSLVCFVNA(A/G)IWT(S/T)YSLIFKIDxYVLASNGIGT(F/L)LALSQLIVYFMYYKSTPK(0-1aa)(E/D)KTVKPSEVEI(P/S)(A/G)T(N/E/D)RV。
10.根据权利要求8所述的转化植物或转化植物细胞，其特征在于，所述具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质是AtSWEET8蛋白质或由编码AtSWEET8蛋白质的核酸的同源核酸编码的蛋白质。
11.根据权利要求10所述的转化植物或转化植物细胞，其特征在于，所述AtSWEET8蛋白质是以下(a)～(c)的任一蛋白质，
(a)包含序列号2的氨基酸序列的蛋白质，
(b)包含与序列号2的氨基酸序列有90％以上的同一性的氨基酸序列、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质，
(c)包含由能够与包含序列号1的碱基序列的多核苷酸的全部或一部分在严格条件下杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质。
12.根据权利要求10所述的转化植物或转化植物细胞，其特征在于，所述同源核酸是编码以下(a)～(c)的任一蛋白质的核酸，
(a)包含序列号5或7的氨基酸序列的蛋白质，
(b)包含与序列号5或7的氨基酸序列有90％以上的同一性的氨基酸序列、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质，
(c)包含由能够与包含序列号40～43的任一碱基序列的多核苷酸的全部或一部分在严格条件杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质。
13.根据权利要求10所述的转化植物或转化植物细胞，其特征在于，所述同源核酸是编码以下(a)或(b)的蛋白质的核酸，
(a)包含序列号3、4、6、8和9的任一氨基酸序列的蛋白质，
(b)包含与序列号3、4、6、8和9的任一氨基酸序列有90％以上的同一性的氨基酸序列、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质。
14.根据权利要求10所述的转化植物或转化植物细胞，其特征在于，所述同源核酸是编码以下(a)～(c)的任一蛋白质的核酸，
(a)包含与序列号2记载的氨基酸序列有33％以上的一致度的氨基酸序列、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质，
(b)包含与序列号2记载的氨基酸序列中的从N末端至第213位的氨基酸序列有35％以上的一致度的氨基酸序列作为除了跨膜结构域以外的区域、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质，
(c)包含与序列号2记载的氨基酸序列中的第33～213位的氨基酸序列有37％以上的一致度的氨基酸序列作为除了同源性低的区域和跨膜结构域以外的区域、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质。
15.根据权利要求10所述的转化植物或转化植物细胞，其特征在于，所述同源核酸是编码以下(a)～(c)的任一蛋白质的核酸，
(a)包含与序列号5记载的氨基酸序列有29％以上的一致度的氨基酸序列、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质，
(b)包含与序列号5记载的氨基酸序列中的从N末端至第205位的氨基酸序列有39％以上的一致度的氨基酸序列作为除了跨膜结构域以外的区域、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质，
(c)包含与序列号5记载的氨基酸序列中的第30～205位的氨基酸序列有40％以上的一致度的氨基酸序列作为除了同源性低的区域和跨膜结构域以外的区域、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质。
16.根据权利要求10所述的转化植物或转化植物细胞，其特征在于，所述同源核酸是编码以下(a)～(c)的任一蛋白质的核酸，
(a)包含与序列号7记载的氨基酸序列有30％以上的一致度的氨基酸序列、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质，
(b)包含与序列号7记载的氨基酸序列中的从N末端至第195位的氨基酸序列有37％以上的一致度的氨基酸序列作为除了跨膜结构域以外的区域、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质，
(c)包含与序列号7记载的氨基酸序列中的第18～195位的氨基酸序列有39％以上的一致度的氨基酸序列作为除了同源性低的区域和跨膜结构域以外的区域、且具有参与糖运输的转运蛋白活性的蛋白质。
17.根据权利要求1或8所述的转化植物或转化植物细胞，其特征在于，是显花植物或来自显花植物。
18.根据权利要求17所述的转化植物或转化植物细胞，其特征在于，所述显花植物是被子植物。
19.根据权利要求18所述的转化植物或转化植物细胞，其特征在于，所述被子植物是单子叶植物。
20.根据权利要求19所述的转化植物或转化植物细胞，其特征在于，所述单子叶植物是禾本科植物。
21.根据权利要求20所述的转化植物或转化植物细胞，其特征在于，所述禾本科植物是稻属(Oryza)植物。
22.根据权利要求18所述的转化植物或转化植物细胞，其特征在于，所述被子植物是双子叶植物。
23.根据权利要求22所述的转化植物或转化植物细胞，其特征在于，所述双子叶植物是十字花科植物。
24.根据权利要求23所述的转化植物或转化植物细胞，其特征在于，所述十字花科植物是拟南芥属(Arabidopsis)植物。
25.溢泌物的制造方法，包括栽培或培养权利要求1～24的任一项所述的转化植物或转化植物细胞，从该转化植物或转化植物细胞采集溢泌物的工序。
26.根据权利要求25所述的溢泌物的制造方法，其特征在于，将栽培或培养所述转化植物或转化植物细胞的条件设置为相对湿度80％RH以上。
27.根据权利要求25所述的溢泌物的制造方法，其特征在于，所述溢泌物是排水液。
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