CN107723311A

CN107723311A - 一种与植物种子粒重相关的TaCKX2‑3D蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN107723311A
Application number: CN201711212284.0A
Authority: CN
Inventors: 张相岐; 钟永达; 卫波; 范仁春; 王献平
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2017-11-28
Filing date: 2017-11-28
Publication date: 2018-02-23

Abstract

本发明公开了一种与植物种子粒重相关的TaCKX2‑3D蛋白及其编码基因与应用。本发明发现了一种与植物种子粒重相关的TaCKX2‑3D蛋白及其编码基因。所述TaCKX2‑3D蛋白为如下(b1)或(b2)：(b1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。将TaCKX2‑3D蛋白的编码基因转化到模式植物拟南芥中后能显著提高转基因拟南芥主根和侧根的生物量，并且能够显著增加转基因拟南芥的叶绿素含量，显著提高转基因拟南芥种子的大小和重量。本发明在小麦的分子标记辅助高产育种中有重要意义。

Description

一种与植物种子粒重相关的TaCKX2-3D蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种与植物种子粒重相关的TaCKX2-3D蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

小麦是世界上主要的粮食作物之一，全世界35-40％的人口以小麦为主粮，因此，小麦产量直接关系到全世界的粮食安全。小麦总产量由播种面积和单位面积产量两个因素构成。在有限耕地面积制约的当前形势下，提高单产是提高小麦总产的唯一途径。小麦单产由单位面积穗数、穗粒数和粒重3个因素构成。由此可见，提高粒重对于提高小麦单产具有重要意义。小麦粒重主要由籽粒大小决定，籽粒大小的相关指标主要包括粒长、粒宽和粒厚。因此挖掘控制小麦籽粒大小相关性状的优良等位变异基因，并且开发相应的功能标记对小麦分子标记辅助高产育种具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种与植物种子粒重相关的TaCKX2-3D蛋白及其编码基因与应用。

本发明提供了一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：将TaCKX2-3D蛋白的编码基因导入出发植物，得到转基因植物；所述转基因植物具有如下(a1)-(a9)中至少一种性状：

(a1)根长大于所述出发植物；

(a2)主根长大于所述出发植物；

(a3)侧根长大于所述出发植物；

(a4)细胞分裂素氧化酶活性大于所述出发植物；

(a5)叶绿素含量大于所述出发植物；

(a6)叶绿素a含量大于所述出发植物；

(a7)叶绿素b含量大于所述出发植物；

(a8)种子表面积大于所述出发植物；

(a9)种子粒重大于所述出发植物。

所述方法中，所述基因可以通过重组表达载体导入出发植物。所述重组表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用所述基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。

所述重组表达载体具体可为将pEGAD载体的EcoR I和Hind III酶切位点之间的片段替换为序列表的序列2所示的双链DNA分子得到的重组质粒。

本发明还保护一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：提高出发植物中TaCKX2-3D蛋白的表达量和/或活性，得到转基因植物；所述转基因植物具有如下(a1)-(a9)中至少一种性状：

(a1)根长大于所述出发植物；

(a2)主根长大于所述出发植物；

(a3)侧根长大于所述出发植物；

(a4)细胞分裂素氧化酶活性大于所述出发植物；

(a5)叶绿素含量大于所述出发植物；

(a6)叶绿素a含量大于所述出发植物；

(a7)叶绿素b含量大于所述出发植物；

(a8)种子表面积大于所述出发植物；

(a9)种子粒重大于所述出发植物。

以上任一所述出发植物为双子叶植物或单子叶植物。所述双子叶植物可为山柑目植物。所述山柑目植物可为十字花科植物。所述十字花科植物可为南芥族植物。所述南芥族植物可为拟南芥属植物。所述所述拟南芥属植物具体可为拟南芥，例如哥伦比亚生态型拟南芥。所述单子叶植物可为禾本目植物。所述禾本目植物可为禾本科植物。所述禾本科植物可为小麦属植物。所述小麦属植物具体可为普通小麦。

本发明还保护TaCKX2-3D蛋白的应用，为如下(d1)-(d10)中的至少一种：

(d1)调控植物根生长；

(d2)促进植物根生长；

(d3)调控植物细胞分裂素氧化酶活性；

(d4)提高植物细胞分裂素氧化酶活性；

(d5)调控植物叶绿素合成；

(d6)促进植物叶绿素合成；

(d7)调控植物种子产量；

(d8)提高植物种子产量；

(d9)提高植物种子表面积；

(d10)提高植物种子粒重。

所述叶绿素为叶绿素a和/或叶绿素b。

本发明还保护TaCKX2-3D蛋白或TaCKX2-3D蛋白的编码基因或以上任一所述方法在植物育种中的应用。

所述育种的目的是选育根长大和/或细胞分裂素氧化酶活性大和/或叶绿素含量大和/或种子表面积大和/或种子粒重大的植物。

所述叶绿素为叶绿素a和/或叶绿素b。

以上任一所述植物为双子叶植物或单子叶植物。所述双子叶植物可为山柑目植物。所述山柑目植物可为十字花科植物。所述十字花科植物可为南芥族植物。所述南芥族植物可为拟南芥属植物。所述所述拟南芥属植物具体可为拟南芥，例如哥伦比亚生态型拟南芥。所述单子叶植物可为禾本目植物。所述禾本目植物可为禾本科植物。所述禾本科植物可为小麦属植物。所述小麦属植物具体可为普通小麦。

以上任一所述TaCKX2-3D蛋白，来源于普通小麦，是如下(b1)或(b2)：

(b1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。

为了使(b1)中的TaCKX2-3D蛋白便于纯化和检测，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b2)中的TaCKX2-3D蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b2)中的TaCKX2-3D蛋白的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

以上任一所述TaCKX2-3D蛋白的编码基因为如下(c1)或(c2)或(c3)：

(c1)编码区如序列表的序列2所示的DNA分子；

(c2)在严格条件下与(c1)限定的DNA序列杂交且编码TaCKX2-3D蛋白的DNA分子；

(c3)与(c1)或(c2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码TaCKX2-3D蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

本发明发现了一种与植物种子粒重相关的TaCKX2-3D蛋白及其编码基因。将TaCKX2-3D基因转化到模式植物拟南芥中后能显著提高转基因拟南芥主根和侧根的生物量，并且能够显著增加转基因拟南芥的叶绿素含量，显著提高转基因拟南芥种子的大小和重量。本发明在小麦的分子标记辅助高产育种中有重要意义。

附图说明

图1为TaCKX2-3D基因的组织特异性表达分析及TaCKX2-3D蛋白的亚细胞定位分析。

图2为野生型和转基因植株的根长、细胞分裂素氧化酶活性及叶绿素含量测定。

图3为野生型和转基因植株的种子大小和粒重测定。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

小麦品种小偃6号：参考文献：李万隆,李振声,穆素梅.小麦品种小偃6号染色体结构变异的细胞学研究[J].Journal of Genetics and Genomics,1990(6):430-437.；公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

哥伦比亚生态型拟南芥：参考文献：李晓阳,陈慧泽,韩榕.UV-B辐射对拟南芥种子萌发和幼苗生长的影响[J].植物学报,2013,48(1):52-58.；公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

根癌农杆菌GV3101：参考文献：罗雯,刘阳.根癌农杆菌转化条件优化的研究[J].生物技术,2006,16(1):41-43.；公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

pJIT163-GFP：普如汀生物技术(北京)有限公司。

pEGAD载体：BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心/NTCC典型培养物保藏中心(BioVector NTCC Inc.)。

ER-mCherry质粒载体：Proteintech Group，Inc.。

甘露醇溶液：将1.82g甘露醇溶解于20mL双蒸水中，得到甘露醇溶液。

纤维素酶R10：北京兰博利德商贸有限公司，货号：L0012。

离析酶R10：北京兰博利德商贸有限公司，货号：L0021。

MES：北京伊诺凯科技有限公司，货号：0215245480。

酶解液：配制溶液Ⅰ，溶液Ⅰ的溶剂为MES缓冲液(20mM、pH 5.7)，含有1.5％(质量百分比)纤维素酶R10和0.4％(质量百分比)离析酶R10。将溶液Ⅰ55℃加热10min后放置至室温，再加入10mM CaCl₂、5mMβ-巯基乙醇和0.1％(质量百分比)BSA，混合后采用0.45μm滤膜过滤，得到酶解液，避光4℃保存备用。

W5溶液(pH 5.8)：溶剂为水，含有154mM NaCl、125mM CaCl₂、5mM KCl、5mM葡萄糖和0.03％(质量百分比)MES。

MMg溶液(pH5.6)：溶剂为水，含有0.4M甘露醇，15mM MgCl₂和0.1(质量百分比)MES。

PEG溶液：1g PEG-4000，0.75mlddH₂O，0.625ml 0.8M甘露醇溶液和0.25ml 1MCaCl₂溶液。

infiltration buffer：0.5×MS液体培养基(pH5.8)中含有5％(质量百分比)蔗糖和0.02％(体积百分比)Silwet L-77。

蛋白提取缓冲液：溶剂为20mM Tris-HCl(pH8.0)，含有150mM NaCl，1mM EDTA(pH8.0)，10％(体积百分比)甘油，0.2％(体积百分比)Triton X-100和1mM PMSF。

实施例1、TaCKX2-D1蛋白及其编码基因的获得

提取小麦品种小偃6号的总RNA，并将其反转录为cDNA。经过大量序列分析、表达量分析与功能验证，从cDNA中发现了一个DNA编码序列，如序列表的序列2所示，其编码的蛋白质如序列表的序列1所示。

将序列表的序列1所示的蛋白质命名为TaCKX2-3D蛋白，由546个氨基酸残基组成。将编码TaCKX2-3D蛋白的基因命名为TaCKX2-3D基因，其开放阅读框如序列表的序列2所示。

实施例2、TaCKX2-3D基因的表达模式分析

一、TaCKX2-3D基因的组织特异性表达分析

分别取小麦品种小偃6号如下时期的如下材料：

空间表达取样：小麦品种小偃6号幼苗期的根(R)、抽穗期的茎(S)、抽穗期的旗叶(FL)、抽穗期的倒二叶(TSL)、抽穗期的穗下节(FIL)和长5厘米的幼穗(YS)。

时间表达取样：开花后第1天、第3天、第4天、第6天、第8天、第10天、第12天、第14天、第16天、第18天、第20天、第22天和第24天的种子。

以上每份材料均取3个生物学重复。

提取上述材料的总RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板，采用实时定量PCR的方法检测TaCKX2-3D基因的表达情况(以β-Actin为内参基因)，

采用引物RealT-ADF和引物RealT-DR组成的引物对检测TaCKX2-3D基因的表达，采用引物Actin-F和引物Actin-R组成的引物对检测β-Actin的表达。

RealT-ADF：5’-CGGGTGGGAGAAGAAGCACTT-3’；

RealT-DR：5’-AGCTGGGCGTCGATTGATGTG-3’；

Actin-F：5’-CAACGAGCTCCGTGTCGCA-3’；

Actin-R：5’-GAGGAAGCGTGTATCCCTCATAG-3’。

结果如图1A和图1B所示。图1A为空间表达取样中各材料中TaCKX2-D1基因相对表达量。图1B为时间表达取样中各材料中TaCKX2-D1基因相对表达量。结果表明，TaCKX2-3D基因在旗叶和幼穗中表达量最高，其次是根、倒二叶和穗下节中，茎中表达量低。在开花后，TaCKX2-3D基因表达量在第三天表达量最高，之后开始表达量下降，到第12天左右，表达量达到最低。此时表达量只有第三天时的五分之一左右。12天后表达量又呈现上升趋势，在第16天表达量升高至3天时表达量的一半，之后表达量又下降直至种子成熟。

二、TaCKX2-3D亚细胞定位

1、pJIT163-GFP-TaCKX2-3D重组质粒：将序列表的序列2所示的双链DNA分子插入pJIT163-GFP载体的Hind III和BamH I酶切位点之间，得到pJIT163-GFP-TaCKX2-3D重组质粒(测序验证正确)。

2、将生长4周的哥伦比亚生态型拟南芥叶片切成纤细长条，放入酶解液中，23℃、45rpm避光酶解3h，然后采用150微目滤网过滤，将滤液(含拟南芥原生质体)100g离心2min，弃上清，得到原生质体沉淀。

3、采用预冷的W5溶液((NaCl 154mM，CaCl₂125mM，KCl 5mM,Glucose 5mM,MES0.03％(pH 5.8))冲洗步骤2得到的原生质体沉淀，100g离心1min，弃上清；加入预冷的W5溶液轻微的振荡使沉淀悬浮，冰上放置30min，然后100g离心1min，弃上清；采用预冷的MMg溶液(甘露醇0.4M，MgCl₂15mM，MES 0.1％(pH5.6))冲洗原生质体沉淀，100g离心1min，弃上清；采用预冷的MMg溶液重悬原生质体沉淀，得到原生质体溶液。

4、取步骤1得到的pJIT163-GFP-TaCKX2-3D重组质粒(15ng)和ER-mCherry质粒载体(15ng)共同加至100μL步骤3得到的原生质体提取液，混匀；再加入110μLPEG溶液，混匀，23℃温育30min进行转化；加入0.44ml W5溶液，100g离心2min，去除PEG；微微振荡，悬浮沉淀，取100μL加至W5溶液中(总体积1ml)，将溶液放入细胞培养板中，23℃培养16h，共聚焦激光扫描显微镜下观察，GFP荧光信号用488nm光激发，500-540nm光波段检测；RFP和mCherry荧光信号用543nm光激发，600-640nm光波段检测；YFP荧光信号用514nm光激发，525-565nm光波段检测。

结果如图1C-图1J所示。结果显示，TaCKX2-3D蛋白与内质网标记基因的两种荧光信号完全重合，说明TaCKX2-3D基因定位于内质网中。

实施例3、TaCKX2-D1蛋白及其编码基因的应用

一、转基因植株的获得

1、pEGAD-TaCKX2-3D重组质粒：将序列表的序列2所示的双链DNA分子插入pEGAD载体的EcoRI和Hind III酶切位点之间，得到pEGAD-TaCKX2-3D重组质粒(测序验证正确)。

2、将步骤1制备的pEGAD-TaCKX2-3D重组质粒导入根癌农杆菌GV3101中，得到重组农杆菌，将其命名为重组农杆菌GV3101/TaCKX2-3D。

3、取步骤2得到的重组农杆菌GV3101/TaCKX2-3D，用含50μg/ml卡那霉素和50μg/ml利福平的LB液体培养液培养至OD_600nm为1.0，4℃、4000rpm离心10min收集菌体沉淀，采用infiltration buffer重悬菌体沉淀，得到菌悬液，OD_600nm为0.8。

4、取茎高约3cm的哥伦比亚生态型拟南芥，去除其顶生花序，待腋生花序长出，其下部的花已有受粉现象出现时，剪去已经开放的花和荚果，小盘倒置，使花蕾在步骤3得到的菌悬液中浸泡15s，取出侧放，保湿。正常生长条件(白天22℃/夜晚18℃)暗培养24h，之后扶正植株。正常生长条件培养3至4周，待种子成熟后，收取种子(即T₀代种子)。

5、将步骤4得到的T₀代种子均匀播种于土：蛭石：珍珠岩(4：2：1)的混合土中培养(白天22℃/夜晚18℃，16小时光照/8小时黑暗)。幼苗出土1周后喷洒0.1％(质量百分比)Basta溶液，筛选可以正常生长的除草剂抗性植株(除草剂抗性植株表现为植株生长正常；非除草剂抗性植株表现为植株黄化，停止生长，一周左右枯死)，培养收获T₁代种子。由T₁代种子长成的植株为T₁代植株，由T₁代植株自交产生的种子及由它所长成的植株为T₂代。由T₂代植株自交产生的种子及由它所长成的植株为T₃代。在T₃代得到纯合转基因株系。

二、转空载体植株的获得

采用pEGAD空载体替代pEGAD-TaCKX2-3D重组质粒，按照实施例3中第一部分“转基因植株的获得”的第2-5步骤进行操作，得到转空载体植株。

三、转基因植株根长检测

待测植株为：哥伦比亚生态型拟南芥(WT)、转基因株系(TaCKX2-3D-10、TaCKX2-3D-16、TaCKX2-3D-22)的T₃植株、转空载体植株。

1、提取待测植株的总RNA，并反转录为cDNA，以cDNA为模板，采用引物CKX2F和引物CKX2R组成对的引物对进行PCR扩增，检测TaCKX2-3D基因表达情况，采用引物Actin2F和引物Actin2R组成的引物对进行PCR扩增，检测内参Actin基因表达情况。

CKX2F：5'-GGSTTCGCGTYCGTGCAGG-3'；

CKX2R：5'-ATSTCCTCGTTCTGCTCCTCCAG-3'；

Actin2F:5'-AATTACCCGATGGGCA-3'；

Actin2R:5'-TCATACTCGGCCTTGGA-3'。

结果如图2A所示。

2、将待测植株种子接种至MS固体培养基培养9天(白天22℃/夜晚18℃，16小时光照/8小时黑暗)，用扫描仪进行扫描记录，用Image J软件测量主根和侧根长度。

结果如图2B、2C和2D所示。结果表明：转基因植株的主根和侧根的长度比野生型的有显著的伸长。转空载体植株的根长与野生型无显著性差异。

四、转基因植株细胞分裂素氧化酶活性检测

1、取待0.3g测植株新叶，剪成条状，在液氮中研磨成粉，移入预冷的离心管中，加入800μL预冷的蛋白提取缓冲液，混匀后于冰上振荡30s，4℃、12,000g离心10min，吸取上清(总蛋白溶液)。

2、在600ml的反应体系中加入100μL步骤1得到的总蛋白溶液、0.15mM的异戊烯基腺嘌呤(iP)，0.5mM 2,6-二氯靛酚钠(DCIP)，75mM Tris-HCl缓冲液(pH8.5)混匀，37℃放置50min，然后加入0.3ml 40％(体积百分比)三氯乙酸水溶液终止反应，12,000g离心5min，取上清，向上清中加入0.2ml 4-氨基苯酚溶液(将4-氨基苯酚溶解于体积百分含量6％的三氯乙酸水溶液中，4-氨基苯酚在4-氨基苯酚溶液中终浓度为2mg/100ml)，用MultiskanSpectrum酶标仪(Thermo公司)测量352nm波长吸收值。

细胞分裂素氧化酶活性(U/L)＝△AV×10⁶/εvLmin

V：反应体系体积(ml)；

ε：摩尔消光系数(mol/cm)；

v：样品量(ml)；

L：比色杯光径(cm)；

△A：与空白对照吸光度变化。

结果如图2E所示。结果表明，转基因植株的细胞分裂素氧化酶酶活性比野生型的有显著的增强。转空载体植株的细胞分裂素氧化酶酶活性与野生型相比无显著差异。

五、转基因植株叶绿素含量检测

取待测植株新叶，称量鲜重后放于2ml的离心管中，加入1ml 80％(体积百分比)丙酮水溶液，将离心管用锡箔纸包裹，避光反应36小时，反应结束后取200μL加至96孔比色板中，紫外分光光度计分别测定646nm和663nm的吸光值。根据称取的重量计算叶绿素各组分的相对含量，计算公式如下：

叶绿素a(Chla)(mg/g)＝(12.21×OD_663nm-2.81×OD_646nm)/Fw(g)

叶绿素b(Chlb)(mg/g)＝(20.13×OD_646nm-5.03×OD_663nm)/Fw(g)

叶绿素总量(ChlT)(mg/g)＝Chla+Chlb。

Fw(g)：叶片鲜重。

结果如图2F、2G和2H所示。结果表明：转基因植株的叶绿素a、叶绿素b和叶绿素a+b的含量比野生型的有显著的增加。转空载体植株的叶绿素含量与野生型相比无显著差异。

六、植株种子大小和千粒重鉴定

1、取待测植株种子均匀铺在白纸上，用Canon EOS 350D DIGITAL(MACRO100mm镜头)相机进行拍照，用软件ImageJ(National Institutes of Health)设置threshold并将其转化为双值图像，然后用“Analyze particles”功能测量种子大小(种子的垂直阴影面积)。每种待测植株至少测量100粒种子，结果取平均值。

2、取待测植株种子用电子天平测量3个重复的200粒种子重量，取其平均值。

结果如图3所示。结果表明，转基因植株的种子大小比野生型的有显著的增加，且种子重量比野生型的也有显著的增加。转空载体植株的种子大小和重量与野生型相比无显著差异。

<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120> 一种与植物种子粒重相关的TaCKX2-3D蛋白及其编码基因与应用

<160> 2

<210> 1

<211> 545

<212> PRT

<213> 小麦（Triticum aestivum L.）

<400> 1

Met Thr Leu Ile Ala Ala Leu Phe Val Leu Ser Cys Leu Leu Lys Thr

1 5 10 15

Thr Thr Ser Pro Ala Thr Ser Ala Tyr Ser Gly Ala Trp Arg Pro Ala

20 25 30

Ser Ser Leu Leu His Glu Leu Cys His Leu Gly Val Arg Pro Leu Ile

35 40 45

Arg Asp Asp Ala Glu Ala Thr Ala Leu Ala Ser Ala Asp Phe Gly Asn

50 55 60

Val Ser Asp Ala Gln Pro Ala Ala Ala Ala Val Leu Tyr Pro Ser Cys

65 70 75 80

Pro Glu Asp Ile Ala Ser Leu Leu Arg Ala Ser Cys Met His Pro Ser

85 90 95

Pro Phe Pro Val Ser Ala Arg Gly Cys Gly His Ser Thr Arg Gly Gln

100 105 110

Ala Ser Ala Pro Arg Gly Val Val Val Asp Met Leu Ser Leu Gly Cys

115 120 125

Gln Val Gly Gly Ser Ala Thr Arg Leu Ser Val Ser Val Asp Gly Arg

130 135 140

Tyr Val Asp Ala Gly Gly Glu Gln Leu Trp Val Asp Val Leu Arg Ala

145 150 155 160

Ala Leu Ala His Gly Leu Thr Pro Arg Ser Trp Thr Asp Tyr Leu His

165 170 175

Leu Thr Val Gly Gly Thr Leu Ser Asn Ala Gly Ile Ser Gly Gln Ala

180 185 190

Phe Arg His Gly Pro Gln Ile Ser Asn Val Gln Glu Leu Asp Val Ile

195 200 205

Thr Gly Leu Gly Glu Met Val Thr Cys Ser Lys Glu Lys His Ala Asp

210 215 220

Leu Phe Asp Ala Val Leu Gly Gly Leu Gly Gln Phe Gly Val Ile Thr

225 230 235 240

Arg Ala Arg Ile Pro Leu Ile Pro Ala Pro Ala Arg Ala Arg Trp Val

245 250 255

Arg Leu Phe Tyr Thr Gly Ala Ala Ala Leu Thr Gly Asp Gln Glu Arg

260 265 270

Leu Ile Gly Val Asp Leu Gly Thr Thr Val Ser Gly Leu Met Asp Tyr

275 280 285

Val Glu Gly Ser Val Val Leu Ala Asp Gln Gly Gln Val Gly Ser Trp

290 295 300

Arg Ser Ser Phe Phe Ser Glu Ala Asp Ala Ala Arg Ile Ala Ala Leu

305 310 315 320

Ala Glu Glu Ala Gly Gly Val Leu Tyr Cys Leu Glu Gly Ser Leu Tyr

325 330 335

Tyr Gly Gly Ala Ala Leu Ala Gly Glu Ser Asp Val Asp Lys Arg Leu

340 345 350

Glu Val Leu Leu Arg Glu Leu Arg Tyr Ala Arg Gly Phe Ala Phe Val

355 360 365

Gln Asp Val Ser Tyr Ala Gly Phe Leu Asp Arg Val Arg Asp Gly Glu

370 375 380

Leu Lys Leu Arg Ala Ala Gly Leu Trp Asp Val Pro His Pro Trp Leu

385 390 395 400

Asn Leu Phe Leu Pro Arg Ser Arg Val Leu Asp Phe Ala Asp Gly Val

405 410 415

Phe His Gly Ile Leu Arg Arg Asp Gly Ser Thr Gly Pro Met Gly Pro

420 425 430

Ile Leu Val Tyr Pro Leu Asn Arg Asp Arg Trp Asp Gly Asp Thr Ser

435 440 445

Ala Val Phe Pro Glu Glu Glu Glu Val Phe Tyr Thr Val Gly Ile Leu

450 455 460

Arg Ser Ala Val Ser Glu Gly Asp Leu Gly Arg Leu Glu Glu Gln Asn

465 470 475 480

Glu Glu Ile Leu Arg Phe Cys Glu Glu Ala Gly Ile Pro Cys Val Gln

485 490 495

Tyr Leu Pro Tyr Tyr Ala Ala Gln Ala Gly Trp Glu Lys Lys His Phe

500 505 510

Gly Pro Ala Lys Trp Ala Arg Leu Val Glu Arg Lys Arg Lys Tyr Asp

515 520 525

Pro Lys Ala Ile Leu Ser Arg Gly Gln Arg Ile Phe Thr Ser Pro Leu

530 535 540

Ala

545

<210> 2

<211> 1638

<212> DNA

<213> 小麦（Triticum aestivum L.）

<400> 2

atgacactga tagccgctct gttcgtgctc agctgcctcc tcaagacaac gacgagcccc 60

gccacctcgg cctactcggg cgcgtggagg ccggcctcct ccttactcca cgagctctgc 120

cacctcgggg tccgcccgct gatccgtgac gatgccgagg ccaccgcgct ggcgtccgcc 180

gacttcggca acgtgtcgga tgcgcagccg gcggcggcgg ccgtgctcta cccatcgtgc 240

cccgaggaca tcgcctcgct gctccgggcc tcgtgcatgc acccctcccc gttccccgtg 300

tctgcccggg gctgcggcca ctcgacccga gggcaggcgt ccgcaccccg cggcgtcgtc 360

gtggacatgc tgtcgctcgg gtgccaagtc ggcgggtctg ctacccgcct ctccgtctcg 420

gtcgatggcc gctacgtcga cgccggcggc gagcagttgt gggtggacgt gctgcgtgct 480

gccctggcac acggcctcac cccgaggtcg tggaccgact acctccacct caccgtcggc 540

gggacgctct ccaacgccgg catcagtggc caggccttcc gccacggccc ccagatatcc 600

aacgtccaag agctcgacgt gatcaccggg ctcggggaga tggtgacatg ctcaaaggag 660

aagcacgcgg acctgttcga cgccgtgctg ggtgggctgg ggcagtttgg cgtcataacg 720

cgggcgcgca tcccgctgat cccggcgccg gcaagggcgc gctgggtgcg gctcttctac 780

acgggggccg cggcgctcac gggcgaccag gagcggctca tcggcgtcga cctcggcacc 840

actgtgtccg ggctcatgga ctacgtcgag ggctcggtgg tgctcgcgga ccagggccag 900

gtagggagct ggcgctcgtc gttcttctcg gaagccgacg cggcgcgcat cgccgcgctc 960

gctgaggagg ccggcggcgt cctttactgc ctcgagggat cgctgtacta cggcggcgct 1020

gctctcgccg gcgagtctga cgtcgacaag aggctggagg tgctgctgcg ggagctgcgg 1080

tacgcgcgtg ggttcgcgtt cgtgcaggac gtgtcgtacg cggggttcct tgaccgggtg 1140

cgcgacggcg agctcaagct ccgcgccgcc ggcctctggg acgtgcctca cccctggctc 1200

aacctcttcc tcccgcgctc ccgcgtcctc gacttcgccg acggcgtctt ccacggcatc 1260

ctccgccgcg acggcagcac cggccccatg ggccccatcc tcgtctaccc cttgaaccgg 1320

gacaggtggg acggcgacac gtccgcagtg ttcccggagg aggaggaggt gttctacacg 1380

gttgggatcc tccggtcggc ggtgtccgag ggcgaccttg ggcgtctgga ggagcagaac 1440

gaggagatct tgcgcttctg cgaggaggca gggataccgt gcgtgcagta cctgccgtac 1500

tacgccgccc aggccgggtg ggagaagaag cactttggtc cggccaagtg ggccaggtta 1560

gtggagcgga agaggaagta tgatcccaag gctatcctgt cccgtggcca gagaattttc 1620

acctccccgc tggcttga 1638

Claims

1.一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：将TaCKX2-3D蛋白的编码基因导入出发植物，得到转基因植物；所述转基因植物具有如下(a1)-(a9)中至少一种性状：

(a1)根长大于所述出发植物；

(a2)主根长大于所述出发植物；

(a3)侧根长大于所述出发植物；

(a4)细胞分裂素氧化酶活性大于所述出发植物；

(a5)叶绿素含量大于所述出发植物；

(a6)叶绿素a含量大于所述出发植物；

(a7)叶绿素b含量大于所述出发植物；

(a8)种子表面积大于所述出发植物；

(a9)种子粒重大于所述出发植物。

2.一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：提高出发植物中TaCKX2-3D蛋白的表达量和/或活性，得到转基因植物；所述转基因植物具有如下(a1)-(a9)中至少一种性状：

(a1)根长大于所述出发植物；

(a2)主根长大于所述出发植物；

(a3)侧根长大于所述出发植物；

(a4)细胞分裂素氧化酶活性大于所述出发植物；

(a5)叶绿素含量大于所述出发植物；

(a6)叶绿素a含量大于所述出发植物；

(a7)叶绿素b含量大于所述出发植物；

(a8)种子表面积大于所述出发植物；

(a9)种子粒重大于所述出发植物。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述TaCKX2-3D蛋白，是如下(b1)或(b2)：

(b1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述“TaCKX2-3D蛋白的编码基因”为如下(c1)或(c2)或(c3)：

(c1)编码区如序列表的序列2所示的DNA分子；

5.如权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述出发植物为单子叶植物或双子叶植物。

6.TaCKX2-3D蛋白的应用，为如下(d1)-(d10)中的至少一种：

(d1)调控植物根生长；

(d2)促进植物根生长；

(d3)调控植物细胞分裂素氧化酶活性；

(d4)提高植物细胞分裂素氧化酶活性；

(d5)调控植物叶绿素合成；

(d6)促进植物叶绿素合成；

(d7)调控植物种子产量；

(d8)提高植物种子产量；

(d9)提高植物种子表面积；

(d10)提高植物种子粒重。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述TaCKX2-3D蛋白，是如下(b1)或(b2)：

(b1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

8.TaCKX2-3D蛋白或TaCKX2-3D蛋白的编码基因或权利要求1-5任一所述的方法在植物育种中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述育种的目的是选育根长大和/或细胞分裂素氧化酶活性大和/或叶绿素含量大和/或种子表面积大和/或种子粒重大的植物。

10.如权利要求6-9任一所述的应用，其特征在于：所述出发植物为单子叶植物或双子叶植物。