CN103254298B - 植物生物产量相关蛋白BrSTON1及其编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物生物产量相关蛋白BrSTON1及其编码基因与应用。所述蛋白质是如下a)或b)的蛋白质：a)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将SEQ ID NO：1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与如下至少一种植物性状相关的由(a)衍生的蛋白质：生物产量、器官大小、器官数目。该蛋白的编码基因为SEQ ID NO：2所示的DNA分子。实验证明，将含有SEQ ID NO：2所示DNA分子的重组载体转化拟南芥得到的T3代纯合转基因植株，与野生型相比，基生叶数目增多，第6片真叶的叶片面积明显增加，角果长度及种子大小和千粒重均显著增加。本发明在提高植物器官大小和数目以及种子千粒重、进而提高植物生物产量方面具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物生物产量相关蛋白BrSTON1及其编码基因与应用，该蛋白质BrSTON1来源于油菜，具有提高植物生物产量的能力。
背景技术
随着人口的不断增加，耕地的逐渐减少，如何提高作物产量已经成为一个世界性的、汲待解决的重大问题。植物器官大小直接关系到植物的产量。器官大小不仅受环境因素影响，还受内源基因的调控。所以，研究植物体如何实现自身对器官大小的控制已经成为提高作物产量的重要策略之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物生物产量相关蛋白BrSTON1及其编码基因与应用。
本发明所提供的与植物生物产量相关的蛋白质，来源于油菜，名称为BrSTON1，该蛋白质是如下a)或b)的蛋白质：
a)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b)将SEQ ID NO：1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与如下至少一种植物性状相关的由(a)衍生的蛋白质：生物产量、器官大小、器官数目。
SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列由265个氨基酸残基组成。
为了使上述(a)中的蛋白便于纯化，可在由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
| Poly-His | 2-10(通常为6个) | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
上述(b)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白的编码基因可通过将SEQ ID NO：2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
编码所述蛋白质的基因也属于本发明的保护范围。
编码所述蛋白质的基因为如下1)或2)或3)的基因：
1)其核苷酸序列是SEQ ID NO：2所示的DNA分子；
2)与1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码所述蛋白质的DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子。
SEQ ID NO：2由798个脱氧核苷酸组成，是油菜BrSTON1的编码序列。
所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
含有所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒也属于本发明的保护范围。
可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pROKII、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子(如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin))、组成型启动子或组织特异表达启动子(如种子特异表达的启动子)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。
含有所述基因的重组载体具体可为35S:BrSTON1。所述重组载体35S:BrSTON1为将所述基因插入载体35SpGreen得到表达所述蛋白质的编码基因的重组表达载体。
本发明所提供的蛋白质及基因可用于调控目的植物的生物产量和/或器官大小和/或器官数目，或调节所述蛋白质表达量的物质可用于调控目的植物的生物产量和/或器官大小和/或器官数目。
本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。
本发明所述的培育转基因植物的方法是将所述基因导入目的植物中，得到如下4)-6)中至少一种表型的转基因植物：
4)生物产量高于所述目的植物；
5)器官大小大于所述目的植物；
6)器官数目多于所述目的植物。
在上述方法或应用中，所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物。
在上述方法或应用中，所述双子叶植物具体可为拟南芥。
在上述方法中，当所述目的植物为拟南芥时，所述转基因植物的生物产量高于所述目的植物体现为所述转基因植物的种子千粒重高于所述目的植物；所述转基因植物的器官大小大于所述目的植物体现为所述转基因植物的叶片面积和/或种子面积和/或角果长度大于所述目的植物；所述转基因植物的器官数目多于所述目的植物体现为所述转基因植物的基生叶数目多于所述目的植物。
实验证明，将含有SEQ ID NO：2所示DNA分子的重组表达载体35S:BrSTON1转化拟南芥得到的T3代纯合转基因植株，与相同条件下的野生型和转空载体植株相比，基生叶数目增多，第6片真叶的叶片面积明显增加，角果长度及种子大小和千粒重均显著增加。本发明在提高植物器官大小和数目以及种子千粒重、进而提高植物生物产量方面具有重要意义。
附图说明
图1为PCR鉴定转基因拟南芥植株的电泳图。其中，从左至右的泳道依次为野生型拟南芥对照、4个转基因拟南芥植株和质粒35S:BrSTON1阳性对照。
图2为转基因拟南芥植株的表型照片及统计结果图。其中，I为野生型，II为转基因株系，**代表P＜0.01水平差异显著，A为拟南芥植株的基生叶，B为主茎上的第5个角果，C为第6片真叶叶片面积统计的柱形图，D为角果长度统计柱形图，E为1000粒种子重量统计柱形图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、油菜BrSTON1基因的克隆
1、总RNA提取及反转录
在液氮中研碎新鲜的油菜芥头2号(文献“Li，S.，Song，L.，Yin，W.，Chen，Y.，Chen，L.，Li，J.，Wang，R.，and Hu，Z.Isolation and Functional Characterisationof the Genes Encoding Δ8-Sphingolipid Desaturase from Brassica rapa.J GenetGenomics.2012 Jan；39(1)：47-59中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得)的幼苗(萌发后生长7天)，以植物RNA提取试剂盒(DP432，天根生化科技有限公司)提取总RNA，用分光光度计检测样品浓度。取5μg总RNA，用反转录试剂盒(FSK-100，TOYOBO)进行反转录得到cDNA。
2、BrSTON1编码基因的克隆
以步骤1得到的cDNA为模板，用引物对BrSTON1CDS-F/BrSTON1CDS-R进行PCR扩增：BrSTON1CDS-F：5’-CCCAAGCTTATGGCTTCTACTTCATGCAGTGTC(划线部分为HindIII识别序列)；BrSTON1CDS-R：5’-GGCTGCAGTTAGAAAGCTAAACAACAAGGA(划线部分为Pst I识别序列)。
PCR反应体系(50μl)：5μl KOD plus buffer、2μl MgSO4、5μl dNTP混合物、0.2μM引物BrSTON1CDS-F和0.2μM引物BrSTON1CDS-R、2μlcDNA模板，1μl的KOD plus聚合酶(TOYOBO，日本)。
PCR反应条件：94℃预变性2分钟；再94℃ 15秒，55℃ 30秒，68℃ 1分钟，共32个循环；最后68℃ 10分钟。反应结束后加入0.2μl rTaq(宝生物(大连)有限公司)，72℃反应30分钟添加碱基A。
在1％的琼脂糖凝胶中电泳上述PCR扩增产物，回收约800bp的片段，连接到pGEM Teasy克隆载体(Promega)上，将得到的重组载体命名为BrSTON1-T，对该载体上连接的DNA片段进行测序验证。
测序结果表明，重组载体BrSTON1-T在载体pGEM T easy中插入了SEQ ID NO：2所示798bp的DNA片段，该片段为BrSTON1基因的编码序列，编码如SEQ ID NO：1所示的由265个氨基酸残基组成的蛋白。
实施例2、重组植物表达载体35S:BrSTON1的构建
35SpGreen载体和农杆菌GV3101在文献“Li，Y.，Zheng，L.，Corke，F.，Smith，C.，and Bevan，M.W.(2008).Control of final seed and organ size by the DA1gene family in Arabidopsis thaliana.Genes Dev 22，1331-1336”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
将重组载体BrSTON1-T和35SpGreen分别用Hind III和Pst I进行双酶切。分别回收800bp左右的目的片段和线性化的35SpGreen载体，用T4连接酶(NEB公司)连接。连接产物热击转化DH10B感受态细胞，提取质粒，进行Hind III和Pst I酶切验证，获得正确的重组表达载体，命名为35S:BrSTON1。将重组表达载体35S:BrSTON1进行测序验证，结果表明，在35SpGreen的多克隆位点间插入的基因序列如SEQ ID NO：2所示。
实施例3、BrSTON1基因的植物转化
1、重组农杆菌的构建
用电击仪Micropuler(Bio-RAD)将重组植物表达载体35S:BrSTON1按照电击法转入根癌农杆菌GV3101中，取菌液在含有50g/L卡那霉素、40g/L庆大霉素和12.5g/L利福平YEP固体培养基中进行筛选培养，获得的阳性克隆即为含有载体35S:BrSTON1的重组根癌农杆菌，命名为GV3101/35S:BrSTON1。
YEP固体培养基：酵母提取物(OXOID)10g/L，大豆蛋白胨(北京双旋微生物生物培养基制品厂)10g/L，NaCl 5g/L，其余为水，调PH值至7.0，添加15g/L琼脂(请您指明琼脂的添加量)，制成YEP固体培养基。
2、侵染液制备
将挑取步骤1获得的阳性克隆GV3101/35S:BrSTON1用5ml的含有50g/L卡那霉素、40g/L庆大霉素和12.5g/L利福平YEP液体培养基28℃摇床培养过夜，再以1∶100的大小比扩大培养至OD600为1.2-1.4。然后，14℃、4000转离心10分钟收集菌体，用转化缓冲液重悬，得到侵染液。
转化缓冲液：将蔗糖、silwet L-77(LEHLE SEEDS，货号：VIS-02)和1/2MS培养基以5mg∶0.04ml∶1ml的比例混合，调PH至5.7。
3、拟南芥的基因转化
转化当代植株上所结的种子记为T1代种子，T1代种子长成的植株记为T1代植株，T1代植株上所结的种子记为T2代种子，T2代种子长成的植株记为T2代植株，T2代植株上所结的种子记为T3代种子，T3代种子长成的植株记为T3代植株。
利用浸泡花序法将35S:BrSTON1转化野生型拟南芥Col-0(在文献“Li，Y.，Zheng，L.，Corke，F.，Smith，C.，and Bevan，M.W.(2008).Control of final seed andorgan size by the DA1 gene family in Arabidopsis thaliana.Genes Dev 22，1331-1336”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得)，具体操作方法如下：
1)拟南芥植株的培养
拟南芥Col-0的野生型种子用70％乙醇表面消毒1分钟，再用5％次氯酸钠溶液消毒10分钟，无菌水洗涤5遍。4℃冰箱春化3天后，播种于1/2MS固体培养基上，置于培养间，22℃、16小时光照/8小时黑暗条件下培养，7天后将幼苗移至培养介质(蛭石和草炭土的体积比为2∶1混匀)中，培养至得到带有花序的拟南芥植株。
2)转基因植株的获得
当拟南芥植株主枝长5-15cm时，用步骤2得到的侵染液进行侵染。将待转化的拟南芥花序浸泡在菌液中10秒钟，避光保湿24h后，再培养一个月左右收种，即为T1代转基因拟南芥种子。所得T1代转基因拟南芥种子春化后播种在卡那霉素抗性筛选培养基上筛选培养10天，将获得的抗性T1代转基因拟南芥植株移栽到培养介质(按2∶1体积混匀的蛭石和营养土)中，16小时光照/8小时黑暗，光照强度4000Lux，温度22℃，湿度60-80％进行培养。共筛选到30个T1代转基因拟南芥植株，与野生型相比多数具有较多的叶片、较长的角果。
卡那霉素素抗性筛选培养基组成：由葡萄糖、卡那霉素和1/2MS固体培养基组成，葡萄糖、卡那霉素和1/2MS固体培养基的配比为10g葡萄糖∶50mg卡那霉素∶1L 1/2MS固体培养基。
同时相同的方法转化空载体35SpGreen作为空载体对照，共筛选得到10个T1代转空载体的对照拟南芥植株，其表型与野生型相同。
4、转基因植株的鉴定
1)基因组DNA的提取
剪取4-8cm2步骤3的抗性T1代转基因拟南芥植株的叶片和野生型拟南芥Col-0的叶片，加入100μl REB(50mM Tris-HCl(pH8.0)，25mM EDTA，250mM NaCl，0.5％SDS，其余为水)后玻璃棒研碎，加入等体积的苯酚/氯仿，离心10分钟；取上清，加入2倍体积的无水乙醇；离心10分钟，弃上清，以70％乙醇洗沉淀，晾干后加入80μl无菌水。
2)PCR鉴定
以BrSTON1CDS-F和BrSTON1CDS-R为引物，分别以野生型拟南芥Col-0和T1代转基因拟南芥的基因组DNA为模板，进行PCR反应。
PCR反应体系(20μl)：2μl rTaq buffer、2μl dNTP混合物、0.2μM引物BrSTON1CDS-F和0.2μM引物BrSTON1CDS-R、2μlcDNA模板，0.2μl的rTaq聚合酶(宝生物(大连)有限公司)。
PCR反应条件：94℃预变性2分钟；再94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 1分钟，共40个循环；最后72℃ 10分钟。
结果如图1所示，30个T1代转基因拟南芥均可得到800bp左右的条带(经测序验证该片段含有SEQ ID NO：2所示的798bp核苷酸序列)，而野生型拟南芥无此条带，说明30个T1代转基因拟南芥植株全部为阳性。空载体对照与野生型的结果一致。
实施例4、转基因拟南芥的表型分析
农杆菌转化多形成单拷贝的T-DNA插入，在单拷贝插入的转基因植株中，T1代为转基因杂合体，T1代植株的表型变化可反应出转化目的基因的效果；T1代转基因植株自交得到的T2代会发生杂合体、纯合体和非转基因体的分离，通过对单株T2代植株自交得到的T3代的分离情况，可以判断T2代转基因植株插入纯合情况，即由某个T2代植株所结的T3代种子若全部呈抗性(本发明中为卡那霉素抗性)，则该T2代植株为纯合体，若部分呈抗性(本发明中为卡那霉素抗性)，且符合3∶1的分离比，则该T2代植株为杂合体，若全部不抗或死亡，则该T2代植株为非转基因体。
选取实施例3获得的表型变化显著的10株T1代转基因拟南芥植株，按单株收取其上自交的T2代转基因拟南芥种子，再按单株收取T2代上自交的T3代种子，将各T2代单株的T3代种子按照步骤3中2)的方法进行卡那霉素抗性筛选，分离出纯合转基因株系(共4个)，即同一T2代单株上所结的T3代抗性种子长成的T3代抗性植株群体，并对纯合转基因株系进行表型分析。
在相同且正常的条件下，种植24株野生型拟南芥和24株T3代纯合转基因植株，按单株统计叶片、角果、种子等指标，具体统计方法及结果如下：
1、基生叶数目及叶片面积
与野生型对照相比，生长40天的转基因植株的基生叶数目增多(如表2和图2中的A所示)，第6片真叶的叶片面积明显增加(如表2和图2中的C所示)。
第6片真叶的叶片面积的测量方法：从生长40天的植株上取下第6片真叶，展平后拍照，用Image J1.41软件测量大小。
2、角果长度
取主茎上第3至第7个角果，放在体式镜(LEICA S8APO，德国)下观察并拍照(LEICADFC420，德国)。用Image J1.41软件测量角果的长度，利用EXCEL进行统计分析，结果如表2和图2中的B、D所示。
3、种子透射面积
收获主茎上第3至第10个角果的种子，室温放置1个月后在体式镜下拍照，ImageJ1.41软件测量种子面积，EXCEL统计分析，结果如表2所示。
4、种子千粒重
精确数出1000粒种子，在天平上测量种子重量(METTLER TOLEDO AL104，中国)，共5次重复，结果如表2及图2中的E所示。
表2.转基因植物的表型统计结果
| 野生型(平均值±标准差) | 转基因植株(平均值±标准差) | |
| 第6片真叶面积(cm2) | 1.89±0.02 | 2.00±0.03** |
| 基生叶数目 | 11.4±0.3 | 13.0±0.2** |
| 角果长度(mm) | 14.3±0.1 | 15.3±0.1** |
| 种子千粒重(mg) | 20±0.1 | 21.4±0.1** |
| 种子透射面积(mm2) | 0.102±0.001 | 0.112±0.001** |
注：**代表P＜0.01水平差异显著。
结果表明，与野生型对照相比，转基因植株的第6片真叶面积、基生叶数目、角果长度、种子千粒重和种子透射面积均显著增加。空载体对照与野生型拟南芥结果一致。
上述结果证明，BrSTON1基因及其表达的蛋白与植物的生物产量、器官大小和器官数目正相关，将SEQ ID NO：2所示序列的BrSTON1基因转入目的植物中表达后，可增加目的植物的生物产量、器官大小和器官数目。
Claims (9)
1.一种蛋白质，是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白质的编码基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述蛋白质的编码基因为其核苷酸序列是SEQ ID NO：2所示的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。
5.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的基因在调控目的植物的生物产量和/或器官大小和/或器官数目中的应用。
6.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述基因导入目的植物中，得到如下4）-6）中至少一种表型的转基因植物：
4）生物产量高于所述目的植物；
5）器官大小大于所述目的植物；
6）器官数目多于所述目的植物。
7.根据权利要求5或6所述的应用或方法，其特征在于：所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。
8.根据权利要求7所述的应用或方法，其特征在于：所述双子叶植物为拟南芥。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述转基因植物的生物产量高于所述目的植物体现为所述转基因植物的种子千粒重高于所述目的植物；所述转基因植物的器官大小大于所述目的植物体现为所述转基因植物的叶片面积和/或种子面积和/或角果长度大于所述目的植物；所述转基因植物的器官数目多于所述目的植物体现为所述转基因植物的基生叶数目多于所述目的植物。
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| 转基因技术对全球作物产量和价格的影响;朱贝贝等;《大豆科技》;20100925(第5期);第44-46页 * |
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| CN103254298A (zh) | 2013-08-21 |
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