MXPA05012565A

MXPA05012565A - Metodos para incrementar la tolerancia al estres abiotico y/o biomasa en plantas y plantas generadas de ese modo.

Info

Publication number: MXPA05012565A
Application number: MXPA05012565A
Authority: MX
Inventors: Rafael Meissner
Original assignee: Evogene Ltd
Priority date: 2003-05-22
Filing date: 2004-05-20
Publication date: 2006-05-25
Also published as: EP2365087A2; CA2978152A1; CN1823168A; EP1625199A4; EP2365087A3; BR122016024209B1; WO2004104162A2; CN100591770C; RU2005140106A; BRPI0411182A; CA2526440C; BRPI0411182B1; WO2004104162A3; ZA200509383B; EP1625199B1; RU2350653C2; RU2008143335A; CA2978152C; EP1625199A2; CN101942449A

Abstract

Se proporcionan secuencias de polinucleotidos y metodos para utilizarlos para incrementar la tolerancia de una planta a estres abiotico y/o incrementar la biomasa de una planta.

Description

METODOS PARA INCREMENTAR LA TOLERANCIA AL ESTRES ABIOTICO Y/O BIOMASA EN PLANTAS Y PLANTAS GENERADAS DE ESE MODO CAMPO ? ANTECEDENTES DE LA INVENCION La presente invención se relaciona a métodos para incrementar la tolerancia al estrés abiótico y/o biomasa en plantas y, más particularmente, a plantas que expresan genes de tolerancia al estrés abiótico exógenos . Las condiciones de estrés abiótico (también referido como "estrés ambiental") tal como la salinidad, sequía, inundación, temperatura subóptima y contaminación química tóxica, causan daño sustancial a las plantas de la agricultura. La mayoría de las plantas han desarrollado estrategias para protegerse por sí mismas, contra estas condiciones. Sin embargo, si la severidad y duración de las condiciones de estrés son demasiado grandes, los efectos sobre el desarrollo de la planta, el crecimiento y el rendimiento de la mayoría de las plantas de cultivo son intensos. Además, la mayoría de las plantas de cultivo son muy susceptibles al estrés abiótico (ABS) y así necesitan condiciones de crecimiento óptimas para rendimientos de cultivo comerciales. La exposición continua al estrés causa alteraciones mayores en el metabolismo de la planta que finalmente conducen a la muerte de la célula y consecuentemente pérdidas del rendimiento. Así, a pesar de la investigación extensiva y el uso de medidas de protección del cultivo sofisticadas e intensivas, las pérdidas debido a las condiciones de estrés abiótico permanecen en billones de dólares anualmente (1,2). El desarrollo de plantas tolerantes al estrés es una estrategia que tiene el potencial para resolver o mediar por lo menos alguno de estos problemas. Sin embargo, las estrategias de reproducción de plantas tradicionales usadas para desarrollar nuevas lineas de plantas que exhiben tolerancia al ABS son relativamente ineficientes puesto que son tediosas, consumidoras de tiempo y de efecto impredecible . Además, los recursos de germen plasma limitados para la tolerancia al estrés y la incompatibilidad en cruzas entre especies de plantas distantemente relacionadas representan problemas significantes encontrados en la reproducción convencional. Adicionalmente, los procesos celulares que conducen a la tolerancia al ABS son de naturaleza compleja e implican múltiples mecanismos de adaptación celular en numerosas rutas metabólicas (4-7). Los esfuerzos de la ingeniería genética, dirigidos en conferir tolerancia al estrés abiótico a los cultivos transgénicos, han sido descritos en la técnica previa. Los estudios por Apse y Blumwald (Curr Opin Biotechnol. 13:146-150, 2002), Quesada y colaboradores (Plant Physiol 130:951-963, 2002), Holmstróm y colaboradores (Nature 379:683-684, 1996), Xu y colaboradores (Plant Physiol 110:249-257, 1996), Pilon-Smits y Ebskamp (Plant Physiol 107:125-130, 1995) y Tarczynski y colaboradores (Science 259:508-510, 1993) todos han intentado generar plantas tolerantes al estrés. Además, varias patentes norteamericanas y solicitudes de patentes también describen polinucleótidos asociados con la tolerancia al estrés y su uso en la generación de plantas tolerantes al estrés. Las patentes norteamericanas Nos. 5,296,462 y 5,356,816 describen la transformación de plantas con polinucleótidos que codifican proteínas involucradas en la adaptación al frío en Arabidopsis thaliana, para de esta manera promover la tolerancia al frío en las plantas transformadas. La patente norteamericana No. 6,670,528 describe la transformación de plantas con polinucleótidos que codifican polipéptidos que relacionan a elementos responsivos al estrés, para de esta manera promover la tolerancia de las plantas transformadas al estrés abiótico. La patente norteamericana No. 6,720,477 describe la transformación de plantas con un polinucleótido que codifica una proteína relacionada con el estrés de transducción de señal, capaz de incrementar la tolerancia de las plantas transformadas al estrés abiótico. Las solicitudes norteamericanas Nos. de serie 09/938842 y 10/342224 describen genes relacionados con el estrés abiótico y su uso para conferir tolerancia a las plantas al estrés abiótico. La solicitud norteamericana No. de Serie 10/231035 describe la sobreexpresión de una sulfurasa de cofactor de molibdeno en plantas para de esta manera incrementar su tolerancia al estrés abiótico. Aunque los estudios descritos en lo anterior fueron por lo menos parcialmente exitosos en generar plantas tolerantes al estrés, aun permanece una necesidad por genes tolerantes al estrés que pueden ser utilizados para generar plantas tolerantes de una amplia gama de condiciones de estrés abiótico. Mientras que se somete la presente invención a la práctica, los presentes inventores han identificado a través de estudios de bioinformática y de laboratorio varios genes de tolerancia al estrés abiótico, novedosos, que pueden ser utilizados para incrementar la tolerancia al estrés abiótico y/o la biomasa en plantas. BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION De acuerdo con un aspecto de la presente invención se proporciona un método para incrementar la tolerancia de una planta a un estrés abiótico. El método incluye expresar dentro de la planta un polinucleótido exógeno por lo menos 90% homólogo a un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 1-18.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un método para incrementar la tolerancia de una planta a un estrés abiótico. El método incluye expresar dentro de la planta un polipéptido exógeno que incluye una secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 39-92. De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona un método para incrementar la biomasa de una planta. El método incluye expresar dentro de la planta un polinucleótido exógeno por lo menos 90% homólogo a un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 1-18. De acuerdo con todavía un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un método para incrementar la biomasa de una planta. El método incluye expresar dentro de la planta un polipéptido exógeno que incluye una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 39-92. De acuerdo con todavía otro aspecto de la presente invención se proporciona una célula de planta que comprende un polinucleótido exógeno por lo menos 90% homólogo a un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 1-18. De acuerdo con todavía otro aspecto de la presente invención se proporciona una célula de planta que comprende un polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 39-92. De acuerdo con todavía otro aspecto de la presente invención se proporciona una construcción de ácido nucleico, que incluye un polinucleótido por lo menos 90% homólogo a una secuencia dé nucleótidos seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 1-18 y un promotor capaz de dirigir la transcripción del polinucleótido en una célula hospedera. De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona una construcción de ácido nucleico, que incluye un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 39-92 y un promotor capaz de dirigir la transcripción del polinucleótido en una célula hospedera . De acuerdo con todavía otro aspecto de la presente invención se proporciona un polipéptido aislado, que incluye una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% homologa en la secuencia de aminoácidos codificada por un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste de la SEQ ID NOs: 1-18. De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un polipéptido aislado que incluye una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 39-92.

De acuerdo con características adicionales en modalidades preferidas de la invención descritas enseguida, la expresión se efectúa mediante (i) la transformación de una célula de la planta con el polinucleótido exógeno; (ii) la generación de una planta madura a partir de la célula; y (iii) el cultivo de la planta madura bajo condiciones adecuadas para expresar el polinucleótido exógeno dentro de la planta madura. De acuerdo con todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas la transformación se efectúa al introducir a la célula de planta una construcción de ácido nucleico que incluye el polinucleótido exógeno y por lo menos un promotor capaz de dirigir la transcripción del polinucleótido exógeno a la célula de planta. De acuerdo con todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas el por lo menos un promotor es un promotor constitutivo. De acuerdo con todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas el promotor constitutivo es el promotor 35S de CaMV. De acuerdo con todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas el promotor constitutivo es el promotor At6669. De acuerdo con todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas el por lo menos un promotor es un promotor inducible. De acuerdo con todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas el promotor inducible es un promotor inducible de estrés abiótico. De acuerdo con todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas el por lo menos un promotor es un promotor específico de tejido. De acuerdo con todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas la expresión se efectúa al infectar la planta con un virus que incluye el polinucleótido exógeno. De acuerdo con todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas el virus es un virus avirulento . De acuerdo con todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas el estrés abiótico se selecciona del grupo que consiste de salinidad, carencia de agua, temperatura baja, temperatura alta, toxicidad en metal pesado, anaerobiosis, deficiencia de nutrientes, exceso de nutrientes, contaminación atmosférica e irradiación UV. De acuerdo con todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas la planta es una planta dicotiledónea. De acuerdo con todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas la planta es una planta monocotiledónea . De acuerdo con todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas la célula de planta forma una parte de una planta. . La presente invención exitosamente se dirige a las desventajas de las configuraciones actualmente conocidas al proporcionar métodos para utilizar genes de tolerancia al estrés abiótico novedosos para incrementar la tolerancia de las plantas al estrés abiótico y/o la biomasa. BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La invención se describe en la presente, a manera de ejemplo solamente, con referencia a los dibujos acompañantes. Con referencia específica ahora a los dibujos en detalle, se acentúa que los detalles particulares mostrados son a manera de ejemplo y para propósitos de discusión ilustrativa de las modalidades preferidas de la presente invención solamente, y se presentan con el fin de proporcionar lo que se cree que es la descripción más útil y fácilmente entendida de los principios y aspectos conceptuales de la invención. A este respecto, no se hace intento para mostrar detalles estructurales de la invención en más detalle que lo que es necesario para un entendimiento fundamental de la invención, la descripción tomada con los dibujos que hace evidente para aquellos expertos en la técnica como las diversas formas de la invención pueden ser englobadas en la práctica. La FIG. 1 es un diagrama de flujo que ilustra un proceso para identificar genes de tolerancia al estrés de planta putativos a partir de bases de datos de la secuencia de ácido nucleico. Las FIGs. 2A-B son fotografías que ilustran una planta madura de Arabidopsis thaliana transgénica T2 en la etapa de floración, que expresa el transgen de luciferasa exógeno del 'promotor At6669. La misma planta se muestra bajo condiciones de luz normal (Figura 2?) y en la oscuridad (Figura 2B) . La fuerte iluminación indicativa de la expresión de luciferasa se observa en la flor y los tejidos de raíz. La FIG. 3 ilustra los pesos frescos promedio de las plantas de A. thaliana ?? transgénicas cultivadas bajo condiciones normales o de estrés (irrigadas con solución de NaCl 0 o 100 M, respectivamente) . Las plantas se transformaron con genes de tolerancia al estrés, putativos, o con el gen reportador de luciferasa (control) , posicionado bajo el control transcripcional del promotor At6669. Los promedios seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes de acuerdo con una prueba T de ANOVA de una vía. La FIG. 4A ilustra los pesos frescos promedio de plantas A. thaliana T2 cultivado bajo condiciones normales o de estrés (irrigadas con solución de NaCl 0 o 100 M, ¦ respectivamente) . Las plantas se transformaron con los genes de tolerancia al estrés putativos de la presente invención, o con el gen reportador de luciferasa (control), posicionado bajo el control transcripcional del promotor 35S. Los promedios seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes de acuerdo con una prueba T de ANOVA de una vía. La FIG. 4B ilustra los pesos frescos promedio de las plantas A. thaJiana T2 cultivadas bajo condiciones normales o de estrés (irrigadas con solución de NaCl 0 o 100 M, respectivamente) . Las plantas se transformaron con los genes de tolerancia al estrés putativos de la presente invención, o con el gen reportador de luciferasa (control) , posicionado bajo el control transcripcional del promotor At6669. Los promedios seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes de acuerdo con una prueba T de ANOVA de una vía. La FIG. 5 ilustra el peso fresco (por ciento) relativo de las plantas A. thaliana ?? transgénicas cultivadas bajo condiciones de estrés de salinidad (irrigadas con solución NaCl 100 mM) como es comparada con plantas similares cultivadas bajo condiciones normales (irrigadas con agua solamente) . Las plantas se transformaron con los genes de tolerancia al estrés putativos de la presente invención, o con el gen reportador de luciferasa (control) , posicionado bajo el control transcripcional del promotor At6669. DESCRIPCION DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS La presente invención se relaciona a métodos para incrementar la tolerancia de las plantas al estrés abiótico y/o la biomasa mediante la utilización de genes de tolerancia al estrés abiótico novedosos y de plantas que exhiben tolerancia incrementada a las condiciones de estrés y/o capacidad incrementada para acumular biomasa. Los principios y la operación de la presente invención se pueden entender mejor con referencia a los dibujos y las descripciones acompañantes. Antes de explicar por lo menos una modalidad de la invención en detalle, se va a entender que la invención no está limitada en su aplicación a los detalles de construcción y el arreglo de los componentes expuestos en la siguiente descripción o ilustrados en los dibujos. La invención es capaz de otras modalidades o de ser practicada o llevada a cabo de varias maneras. También, se va a entender que la fraseología y terminología empleadas er. la presente es para el propósito de descripción y no deben ser consideradas como limitativas . Mientras que se somete la presente invención a la práctica, los presentes inventores mientras que emplean técnicas de bioinformática, identificaron secuencias de polinucleótido que codifican proteínas de tolerancia al estrés abiótico (ABST) putativas (Ejemplo 1) . Las secuencias seleccionadas aisladas (Ejemplo 2) , se clonaron en vectores de expresión (Ejemplo 3-4) y se introdujeron en plantas de Arabidopsis thaliana (E emplo 5) . Estas plantas, que se cultivaron bajo condiciones de estrés de salinidad, o bajo condiciones normales, exhibieron biomasa significativamente más alta como es comparado con plantas similares que no portan los genes ABST exógenos (Ejemplo 6) . Asi, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un método para incrementar la tolerancia de una planta a un estrés abiótico y/o biomasa de la planta. El método incluye expresar dentro de la planta un polinucleótido exógeno por lo menos 70% homólogo, de preferencia por lo menos 80% homólogo, más de preferencia por lo menos 85% homólogo, mucho más de preferencia por lo menos 90% homólogo a un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste de la SEQ ID NOs: 1-18. Alternativamente, el polinucleótido exógeno de la presente invención codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 39-92. La frase "estrés abiótico" utilizada en la presente se refiere a cualquier efecto adverso sobre el metabolismo, crecimiento, reproducción y/o viabilidad de una planta. Por consiguiente, el estrés abiótico puede ser inducido mediante medios de crecimiento ambientales subóptimos tales como, por ejemplo, salinidad, carencia de agua, inundación, temperatura baja o alta, toxicidad de metal pesado, anaerobiosis, deficiencia de nutrientes, contaminación atmosférica o irradiación UV. La frase "tolerancia al estrés · abiótico" como se utiliza en la presente se refiere a la habilidad de una planta para resistir un estrés abiótico sin sufrir una alteración sustancial en el metabolismo, crecimiento, productividad y/o viabilidad. Una planta adecuada para el uso con el método de la presente invención puede ser cualquier planta monocotiledónea o dicotiledónea incluyendo, pero no limitada a, maíz, trigo, cebada, centeno, avena, arroz, soya, cacahuate, guisante, lenteja y alfalfa, algodón, colza, cañóla, pimiento, girasol, papa, tabaco, tomate, berenjena, eucalipto, un árbol, una planta ornamental, una hierba perenne y un cultivo de forraj e . Como se utiliza en la presente, el término "polinucleótido exógeno" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que no es naturalmente expresada dentro de la planta pero que, cuando se introduce en la planta ya sea de una manera estable o transiente, produce por lo menos un producto de polipéptido. La expresión del polinucleótido exógeno de la presente invención dentro de la planta se puede efectuar al transformar una o más células de la planta con el polinucleótido exógeno, seguido por la generación de una planta madura a partir de las células transformadas y el cultivo de la planta madura bajo condiciones adecuadas para expresar el polinucleótido exógeno dentro de la planta madura . De preferencia, la transformación se efectúa al introducir a la célula de planta una construcción de ácido nucleico que incluye el polinucleótido exógeno de la presente invención y por lo menos un promotor capaz de dirigir la transcripción del polinucleótido exógeno en la célula de planta. Detalles adicionales de procedimiento de transformación adecuados se proporcionan enseguida en la presente . Como se utiliza en la presente, el término "promotor" se refiere a una región de DNA que se encuentra corriente arriba del sitio de iniciación transcripcional de un gen al cual la RNA polimerasa enlaza para iniciar la transcripción del RNA. El promotor controla donde (por ejemplo, que porción de una planta, que órgano dentro de un planta, etc.) y/o cuando (por ejemplo, que etapa o condición en el tiempo de vida de un organismo) el gen es expresado. Cualquier secuencia de promotor adecuada puede ser utilizada por la construcción de ácido nucleico de la presente invención. De preferencia el promotor es un promotor constitutivo, un promotor especifico de tejido o un promotor inducible por estrés abiótico. Los promotores constitutivos adecuados incluyen, por ejemplo, promotor 35S de CaMV (SEQ ID NO: 19, Odell y colaboradores, Nature 313:810-812 1985); promotor At6669 de Arabidopsis (SEQ ID NO: 20), Ubi 1 de maíz (Christensen y colaboradores, Plant Sol. Biol. 18:675-689, 1992); actina de arroz (McElroy y colaboradores, Plant Cell 2:163-171, 1990); pEMÜ (Last y colaboradores, Theor. Appl . Genet. 81:581-588, 1991) ; y Super MAS sintético (Ni y colaboradores, The Plant Jornal 7:661-76, 1995). Otros promotores constitutivos incluyen aquellos en las patentes norteamericanas Nos. 5,659,026, 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5, 466,785; 5,399, 680; 5,268,453 y 5, 608,142. Los promotores específicos de tejido adecuados incluyen, pero no están limitados a, promotores específicos de hoja tal como es descrito, por ejemplo, por Yamamoto y colaboradores, Plant J. 12:255-265, 1997; Know y colaboradores, Plant Physiol. 105:357-67, 1994; Yamamoto y colaboradores, Plant Cell Physiol. 35:773-778, 1994; Gotor y colaboradores, Plant J. 3:509-18, 1993; Orozco y colaboradores, Plant. Mol. Biol. 23:1129-1138, 1993; y Matsuoka y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:9586-9590, 1993. Los promotores inducibles por estrés abiótico adecuados incluyen, pero no están limitados a, promotores inducibles por sal tal como RD29A (Yamaguchi-Shinozalei y colaboradores, Mol. Gen. Genet . 236:331-340, 1993); promotores inducibles por sequía tal como el promotor del gen rabl7 de maíz (Pía y colaboradores, Plant Mol. Biol . 21:259-266, 1993) , promotor del gen rab28 de maíz (Busk y colaboradores, Plant J. 11:128-1295, 1997) y el promotor de gen Ivr2 de maíz (Pelleschi y colaboradores, Plant Mol. Biol. 39:373-380, 1999); y los promotores inducibles por calor tal como el promotor Hsp80 de tomate por calor del tomate (patente norteamericana No. 5,187,267) . La construcción de ácido nucleico de la presente invención de preferencia además incluye un marcador seleccionable apropiado y/o un origen de replicación. De preferencia, la construcción de ácido nucleico utilizada es un vector de lanzadera, que puede propagarse tanto en E. coli (en donde la construcción comprende un marcador seleccionable apropiado y origen de replicación) y ser compatible para la propagación en células. La construcción de acuerdo con la presente invención puede ser, por ejemplo, un plásmido, un bácmido, un fagémido, un cósmido, un fago, un virus o un cromosoma artificial. La construcción de ácido' nucleico de la presente invención se puede utilizar para transformar establemente o transientemente células de plantas. En la transformación estable, el polinucleótido exógeno de la presente invención es integrado en el genoma de la planta y como tal representa un atributo estable y heredado. En la transformación transiente, el polinucleótido exógeno es expresado por la célula transformada pero no es integrado en el genoma y como tal representa un atributo transiente. Existen varios métodos para introducir genes foráneos en plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas (Potrykus, I., Annu. Rev. Plant. Physiol., Plant. Mol. Biol. (1991) 42:205-225; Shimamoto y colaboradores, Nature (1989) 338:274-276). Los métodos de principio para causar la integración estable del DNA exógeno en el DNA genómico de la planta incluyen dos principales procedimientos: (i) Transferencia de gen mediada por Agrojacterium; Klee y colaboradores (1987) Annu. Rev. Plant Physiol. 38:467-486; Klee y Rogers in Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol . 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, eds. Schell, J., y Vasil, L. K. , Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p. 2-25; Gatenby, in Plant Biotechnology, eds. ung S. y Arntzen, C. J., Butterworth Publishers, Boston, Mass (1989) p. 93-112. (ii) Captación de DNA directa: Paszkowski y colaboradores, en Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes eds.

Schell, J., and Vasil, L. K., Academia Publishers, San Diego, Calif . (1989) p. 52-68/ incluyendo métodos para la captación directa de DNA en protoplastos, Toriyama, K. y colaboradores (1988) Bio/Technology 6:1072-1074. La captación de DNA inducida por el choque eléctrico breve de células de planta: Zhang y colaboradores. Plant Cell Reg. (1988) 7:379-384. Fromm y colaboradores Nature (1986) 319:791-793. La inyección de DNA en células de planta o tejidos mediante el bombardeo de partículas, Klein y colaboradores Bio/Technology (1988) 6:559-563; McCabe y colaboradores Bio/Technology (1988) 6:923-926; Sanford, Physiol. Plant. (1990) 79:206-209; mediante el uso de sistemas de micropipeta: Neuhaus y colaboradores, Theor. Appl. Genet. (1987) 75:30-36; Neuhaus y Spangenberg, Physiol. Plant. (1990) 79:213-217; fibras de vidrio o la transformación whisker de carburo de silicio de cultivos de células, embriones o tejido de callo, patente norteamericana No. 5,464,765 o mediante la incubación directa del DNA con el polen germinante, De et y colaboradores in Experimental Manipulation of Ovule Tissue, eds. Chapman, G.P. y Mantell, S. H. y Danields. W. Longman, London, (1985) p. 197-209; y Ohta, Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1986) 83:715-719. El sistema Agrobacterium incluye el uso de vectores de plásmido que contienen segmentos de DNA definidos que se integran el DNA genómico de la planta. Los métodos de inoculación del tejido de planta varian dependiendo de la especie de la planta y el sistema de suministro de Agrobacterium. Un procedimiento ampliamente utilizado es el procedimiento de disco de hoja que puede ser realizado con cualquier explanta de tejido que proporciona una buena fuente para la iniciación de la diferenciación de la planta entera. Horsch y colaboradores in Plant Molecular Biology Manual A5, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988) p. 1-9. Un procedimiento suplementario emplea el sistema de suministro Agrobacterium en combinación con la infiltración al vacio. El sistema Agrobacterium es especialmente viable en la creación de plantas dicotiledóneas transgénicas . Existen varios métodos de transferencia de DNA directa en células de plantas. En la electroporación, los protoplastos son brevemente expuestos a un fuerte campo eléctrico . En la microinyección, el DNA es mecánicamente inyectado directamente en las células usando micropipetas muy pequeñas. En el bombardeo de micropartículas, el DNA es absorbido sobre microproyectiles tales como cristales de sulfato de calcio y partículas de tungsteno, y los microproyectiles son físicamente acelerados en células o tejidos de plantas. Después de la transformación estable se ejecuta la propagación de la planta. El método más común de propagación de planta es mediante semilla. La regeneración mediante propagación de semilla, sin embargo, tiene la deficiencia que debido a la heterocigocidad hay una carencia de uniformidad en el cultivo, puesto que las semillas son producidas por plantas de acuerdo con las variantes genéticas gobernadas por las reglas Mendelianas. Básicamente, cada semilla es genéticamente diferente y cada una crecerá con sus propios atributos específicos. Por lo tanto, se prefiere que la planta transformada sea producida de tal manera que la planta regenerada tenga los atributos idénticos y características de la planta transgénica de origen. Por lo tanto, se prefiere que la planta transformada sea regenerada mediante micropropagación que proporciona una reproducción rápida, consistente de las plantas transformadas. La micropropagación es un proceso de cultivo de plantas de nueva generación a partir de una pieza individual de tejido que se ha extirpado de una planta o variedad de cultivo de origen seleccionado. Este proceso permite la reproducción en masa de plantas que tienen el tejido preferido que expresa la proteína de fusión, las plantas de nueva generación que son producidas son genéticamente idénticas a, y tienen todas las características de, la planta original. La micropropagación permite la producción en masa de material de planta de calidad en un período de tiempo corto y ofrece una multiplicación rápida de las variedades de cultivo seleccionadas en la preservación de las características de la planta transgénica o transformada original. Las ventajas de clonar plantas son la velocidad de la multiplicación de la planta y la calidad de uniformidad de las plantas producidas. La micropropagación es un procedimiento de multietapas que requieren la alteración del medio de cultivo o las condiciones de crecimiento entre las etapas. Así, el proceso de micropropagación implica cuatro etapas básicas: Etapa uno, cultivo de tejido inicial; etapa dos, multiplicación del cultivo de tejido; etapa tres, diferenciación y formación de la planta; y etapa cuatro, cultivo en invernadero y endurecimiento. Durante la etapa 1, el cultivo de tejido inicial, el cultivo de tejido es establecido y certificado libre de contaminantes. Durante la etapa dos, el cultivo de tejido inicial es multiplicado hasta que un número suficiente de muestras de tejido son producidas para cumplir con los objetivos de producción. Durante la etapa tres, las muestras de tejido cultivadas en la etapa dos son divididas y cultivadas en plantitas individuales. En la etapa cuatro, las plantitas transformadas son transferidas a un invernadero para el endurecimiento donde la tolerancia de las plantas a la luz es gradualmente incrementada de modo que pueden ser cultivadas en el medio ambiente natural. De preferencia, las plantas transformadas maduras generadas como es descrito en lo anterior son además seleccionadas para la tolerancia al estrés abiótico. Por consiguiente, las plantas transformadas y no transformadas (tipo silvestre) se exponen a una condición de estrés abiótico, tal como la carencia de agua, temperatura subóptima, deficiencia de nutrientes, o de preferencia una condición de estrés por sal. El estrés por sal se puede efectuar de muchas maneras tales como, por ejemplo, al irrigar las plantas con una solución hiperosmótica, al cultivar las plantas hidropónicamente en una solución de crecimiento hiperosmótico (por ejemplo, solución de Hoagland) , o al cultivar las plantas en un medio de crecimiento hiperosmótico (por ejemplo, medio MS) . Puesto que diferentes plantas varían considerablemente en su tolerancia a la salinidad, la concentración de sal en el agua de irrigación, la solución del crecimiento o el medio de crecimiento de preferencia se ajusta de acuerdo con las características específicas de la variedad de cultivo o variedad de planta específica, para inflingir un efecto leve o moderado en la fisiología y/o morfología de las plantas (para guías en cuanto a la concentración apropiada por favor ver, Bernstein y Kafkafi, Root Growth Under Salinity Stress In: Plant Roots, The Hidden Half 3rd ed. Waisel Y, Est er A y Kafkafi U. (editores) Marcel Dekker Inc., New York, 2002, y referencia en la misma) . Después de la exposición a la condición de estrés las plantas son frecuentemente monitoreadas hasta que aparecen los efectos fisiológicos y/o morfológicos sustanciales en las plantas de tipo silvestre. Subsecuentemente, las plantas transformadas que no exhiben efectos fisiológicos y/o morfológicos sustanciales, o que exhiben biomasa más alta que las plantas de tipo silvestre, son identificadas como plantas tolerantes al estrés abiótico. Aunque la transformación estable es actualmente preferida, la transformación transiente de células de hoja, células meristemáticas o la planta completa también es contemplada por la presente invención. La transformación transiente se puede efectuar mediante cualquiera de los métodos de transferencia de DNA descritos anteriormente o mediante la infección viral usando virus de plantas modificados . Los virus que se han mostrado que son útiles para la transformación de hospederos de plantas incluyen CaMV, TMV y BV. La transformación de plantas usando virus de plantas es descrito en la patente norteamericana No. 4,855,237 (BGV) , ??-? 67,553 (TMV), solicitud publicada japonesa No. 63-14693 (TMV), EPAS 194, 809 (BV) , EPA 278, 667 (BV) ; y Gluzman, Y. y colaboradores, Communications in Molecular Biology: Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, pp. 172-189 (1988) . Las partículas de pseudosvirus para el uso en la expresión del DNA foráneo en muchos hospederos, incluyendo plantas, es descrito en WO 87/06261.

De preferencia, el virus de la presente invención es avirulento y asi es incapaz de causar severos síntomas tal como la proporción de crecimiento reducido, mosaico, manchas anulares, enrollamiento de la hoja, amarillamiento, ralladura, formación de pox, formación de tumor y picadura. Un virus avirulento adecuado puede ser un virus avirulento que ocurre de manera natural o un virus artificialmente atenuado. La atenuación del virus se puede efectuar al usar métodos bien conocidos en la técnica incluyendo, pero no limitados, al calentamiento sub-letal, tratamiento químico o mediante técnicas de mutagénesis dirigida tal como es descrito, por ejemplo, por Kurihara y Watanabe (Molecular Plant Pathology 4:259-269, 2003), Gal-on y colaboradores (1992) , Atreya y colaboradores (1992) y Huet y colaboradores (1994) . Las cepas de virus adecuadas se pueden obtener de fuentes adecuadas tales como, por ejemplo, la American Type culture Collection (ATCC) o mediante el aislamiento de plantas infectadas. El aislamiento de virus de tejidos de plantas infectadas se puede efectuar por técnicas bien conocidas en el arte como es descrito, por ejemplo por Foster y Taylor, Eds . "Plant Virology Protocols: From Virus Isolation to Transgenic Resistance (Methods in Molecular Biology (Humana Pr) , Vol 81)", Humana Press, 1988. Brevemente, los tejidos de una planta infectada se cree que contienen alta concentración de virus adecuados, de preferencia hojas jóvenes y pétalos 'de flor, son cultivados en una solución reguladora (por ejemplo, solución reguladora de fosfato) para producir una savia infectada con virus que pueden ser usado en inoculaciones subsecuentes. La construcción de virus de RNA de plantas para la introducción y expresión de secuencias de polinucleótido exógenas no virales en plantas es demostrado por las referencias anteriores asi como por Dawson, W. 0. y colaboradores, Virology (1989) 172:235-292; Takamatsu y colaboradores. EMBO J. (1987) 6:307-311; Frenen y colaboradores. Science (1986) 231:1294-1297; y Takamatsu y colaboradores FEBS Letters (1990) 269:73-76. Cuando el virus es un virus de DNA, modificaciones adecuadas se pueden hacer al virus mismo. Alternativamente, el virus puede ser primero clonado en un plásmido bacteriano para facilidad de construcción del vector viral deseado con el DNA foráneo. El virus luego puede ser extirpado del plásmido. Si el virus es un virus de DNA, un origen bacteriano de replicación puede ser unido al DNA viral, que luego es replicado por las bacterias. La transcripción y traducción de este DNA producirá la proteina de recubrimiento que encapsidará el DNA viral. Si el virus es un virus de RNA, el virus es generalmente clonado como un cDNA e insertado en un plásmido. El plásmido luego es utilizado para hacer todas las construcciones. El virus de RNA luego es producido al transcribir la secuencia viral del plásmido y la traducción de los genes virales para producir la (s) proteina (s) de recubrimiento gue encapsidará el RNA viral. La construcción de virus de RNA de plantas para la introducción y expresión en plantas de secuencias de polinucleótido exógenas no virales tales como agüellas incluida en la construcción de la presente invención es demostrado por las referencias anteriores asi como la patente norteamericana No. 5,316,931. En una modalidad, se proporciona un polinucleótido viral de planta en el cual la secuencia de codificación de la proteina de recubrimiento nativa se ha suprimido de un polinucleótido viral, una secuencia de codificación de proteina de recubrimiento viral de planta no nativa y un promotor no nativo, de preferencia el promotor subgenómico de la secuencia de codificación de proteina de recubrimiento no nativa, capaz de la expresión en el hospedero de planta, empaquetamiento del polinucleótido viral de planta recombinante, de aseguramiento de una infección sistémica del hospedero por el polinucleótido viral de planta recombinante, que se ha insertado. Alternativamente, el gen de proteina de recubrimiento puede ser inactivado mediante la inserción de la secuencia de polinucleótido no nativa dentro de éste, tal que se produce una proteina. El polinucleótido viral de planta recombinante puede contener uno o más promotores subgenómicos no nativos adicionales. Cada promotor subgenómico no nativo es capaz de transcribir o expresar genes adyacentes o secuencias de polinucleótido en el hospedero de planta e incapaz de la recombinación entre si y con promotores subgenómicos nativos. Las secuencias de polinucleótido no nativas (foráneas) pueden ser insertadas adyacentes al promotor subgenómico viral de planta nativo o los promotores subgenómicos virales de plantas nativos y no nativos sin más de una secuencia de polinucleótidos incluida. La secuencia de polinucleótido no nativas son transcritas o expresadas en la planta hospedera bajo el control del promotor subgenómico para producir los productos deseados. En una segunda modalidad, un polinucleótido viral de planta recombinante se proporciona como la primera modalidad excepto que la secuencia de codificación de proteina de recubrimiento nativa se coloca adyacente a uno de los promotores subgenómicos de proteina de recubrimiento no nativa en lugar de una secuencia de codificación de proteina de recubrimiento no nativa. En una tercera modalidad, un polinucleótido viral de planta recombinante se proporciona en el cual el gen de proteina de recubrimiento nativa está adyacente a su promotor subgenómico y uno o más promotores subgenómicos no nativos se han insertado en el polinucleótido viral. Los promotores subgenómicos no nativos insertados son capaces de transcribir o expresar genes adyacentes en un hospedero de planta y son incapaces de la recombinación entre si y con los promotores subgenómicos nativos. Las secuencias ce polinucleótidos no nativas pueden ser insertadas adyacentes a los promotores virales de planta subgenómica no nativa tal que las secuencias son transcritas o expresadas en la planta hospedera bajo control de los promotores subgenómicos para producir el producto deseado. En una cuarta modalidad, un polinucleótido viral de planta recombinante se proporciona como la tercera modalidad excepto que la secuencia de codificación de proteina de recubrimiento nativa es reemplazada por una secuencia de codificación de proteina de recubrimiento no nativa. Los vectores virales son encapsidados por las proteínas de recubrimiento codificadas por el polinucleótido viral de planta recombinante para producir un virus de planta recombinante. El polinucleótido viral de planta recombinante o virus de planta recombinante se usa para infectar las plantas hospederas apropiadas . El polinucleótido viral de planta recombinante es capaz de la replicación en el hospedero, la dispersión sistémica en el hospedero y la transcripción o expresión de gen (es) foráneo (s) (polinucleótido exógeno) en el hospedero para producir la proteína deseada.

Las técnicas para inoculación de virus a plantas se pueden encontrar en Foster y Taylor, eds. "Plant Virology Protocols: From Virus Isolation to Transgenic Resistance (Methods in Molecular Biology (Humana Pr) , Vol. 81)", Huamana Press, 1998; Maramorosh y Koprowski, eds. "Methods in Virology" 7 vols, Academic Press, New York 1967-1984; Hill, S.A. "Methods in Plant Virology", Blackwell, Oxford, 1984; Walkey, D.G.A. "Applied Plant Virology", Wiley, New York, 1985; y Kado y Agrawa, eds. "Principies and Techniques in Plant Virology", Van Nostrand-Reinhold, New York. Además de lo anterior, el polinucleótido de la presente invención también se puede introducir en un genoma de cloroplasto para de esta manera habilitar la expresión del cloroplasto. Una técnica para introducir secuencias de polinucleótido exógenas al genoma de los cloroplastos es conocida. Esta técnica involucra los siguientes procedimientos. Primero, las células de planta son químicamente tratadas para reducir el número de cloroplastos por célula a aproximadamente una. Luego, el polinucleótido exógeno es introducido por la vía de bombardeo de partículas en las células con el objetivo de introducir por lo menos una molécula de polinucleótido exógena en los cloroplastos. Los polinucleótidos exógenos son seleccionados tal que es integrable en el genoma de cloroplasto por la vía de la recombinación homologa que es fácilmente efectuada por enzimas inherentes al cloroplasto. Con este fin, el polinucleótido exógeno incluye, además de un gen de interés, por lo menos un estiramiento de polinucleótido que es derivado del genoma del cloroplasto. Además, el polinucleótido exógeno incluye un marcados seleccionable, que sirve mediante procedimientos de selección secuenciales para averiguar que toda o sustancialmente todas las copias de los genomas de cloroplastos después de tal selección incluirán el polinucleótido exógeno. Detalles adicionales relacionados con esta técnica se encuentran en las patentes norteamericanas Nos. 4,945,050; y 5,693,507 que son incorporados en la presente por referencia. Un polipéptido asi puede ser producido mediante el sistema de expresión de proteína del cloroplasto y llegar a ser integrado en la membrana interna del cloroplasto. Puesto que la tolerancia al estrés abiótico en plantas puede involucrar múltiples genes que actúan aditivamente o en sinergia (ver, por ejemplo, en Quesda y colaboradores, Plant Physiol. 130:951-063, 2002), la presente invención también contempla la expresión de una pluralidad de polinucleótidos exógenos en una planta hospedera individual para de esta manera lograr la tolerancia al estrés abiótico superior . La expresión de una pluralidad de polinucleótidos exógenos en una planta hospedera individual puede ser efectuada al co-introducir construcciones de ácido nucleico múltiples, cada una que incluye un polinucleótido exógeno diferente, en una célula de planta individual. La célula transformada luego puede ser regenerada en una planta madura usando los métodos descritos anteriormente en la presente. Alternativamente, la expresión de una pluralidad de pluralidad de polinucleótidos exógenos en una planta hospedera individual se puede efectuar al co-introducir en una célula de planta individual una construcción de ácido nucleico individual que incluye una pluralidad de diferentes polinucleótidos exógenos. Tal construcción puede ser diseñada en una secuencia de promotor individual se puede transcribir un mensaje policistrónicó incluyendo todas las diferentes secuencias de polinucleótido exógenas. Para permitir la co-traducción de los polipéptidos diferentes codificados por el mensaje policistrónicó, las secuencias de polinucleótido pueden ser entrelazadas por la vía de una secuencia de sitio de entrada de ribosoma interna (IRES) que facilita la traducción de las secuencias de polinucleótido posicionadas corriente debajo de la secuencia IRES. En este caso, una molécula de RNA policistrónica transcrita que codifica los diferentes polipéptidos descritos anteriormente será traducida de tanto el extremo ' de extremo y las dos secuencias IRES internas de la molécula de RNA policistrónica para de esta manera producir en la célula todos los diferentes polipéptidos . Alternativamente, la construcción puede incluir varias secuencias de promotor cada una enlazada a una diferente secuencia de polinucleótido exógena. La célula de planta transformada con la construcción incluyendo una pluralidad de diferentes polinucleótidos exógenos, puede ser regenerada en una planta madura, usando los métodos descritos anteriormente en la presente . Alternativamente, la expresión de una pluralidad de polinucleótidos exógenos en una planta hospedera individual se puede efectuar al introducir diferentes construcciones de ácido nucleico, incluyendo diferentes polinucleótidos exógenos, en una pluralidad de plantas. Las plantas transformadas regeneradas luego pueden ser cruzadas endogamicamenté y la progenie resultante seleccionada para la tolerancia del estrés abiótico superior y/o atributos de biomasa, usando técnicas de reducción de plantas convencionales . Por consiguiente, la presente solicitud proporciona métodos para utilizar genes de tolerancia al estrés abiótico novedosos para incrementar la tolerancia al estrés abiótico y/o la biomasa en una amplia gama de plantas económicas de manera segura y efectivo- en costo. Los objetos, ventajas y características novedosas adicionales de la presente invención llegarán a ser evidentes para un experto ordinario en la técnica en el examen de los siguientes ejemplos, que no se proponen para ser limitativos. Adicionalmente, cada una de las diversas modalidades y aspectos de la presente invención como son delineados anteriormente en la presente y como son reivindicados en la sección de reivindicaciones enseguida encuentra soporte experimental en los siguientes ejemplos. EJEMPLOS La referencia ahora se hace a los siguientes ejemplos, que junto con las descripciones anteriores, ilustran la invención en un aspecto no limitativo. Generalmente, la nomenclatura utilizada en la presente y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invención incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de DNA recombinante . Tales técnicas son explicadas completamente en la literatura. Ver, por ejemplo, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Sambrook y colaboradores (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumen I-III Ausubel, R. M., ed. (1994), Ausubel y colaboradores, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989) ; Perbal, " Practical Guide To Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988) ; Watson y colaboradores, "Reco binant DNA", Scientific American Books, New York; Birren y colaboradores (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); met odologies as set forth in U.S. Pat. Nos. 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 y 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E . , ed. (1994); Stites y colaboradores (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8a Edition) , Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell y Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman y Co., New York (1980) ; inmunoensayos disponibles son extensivamente descritos en la literatura de patentes y científica, ver, por ejemplo, las patentes norteamericanas Nos. 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3, 879,262; 3,901, 654; 3, 935, 074; 3,984,533; 3,966,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 y 5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hibridi ation" Hames, B. D., y Higgins S. J., eds. (1985) ; "Transcríption and Translation" Hames, B. D. y Higgins S. J. eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, .

I., ed. (1986); "Immobilized Cells ana Enzymes" IRL Press, (1986) ; "A Practical Guide To Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) y "Methods in Enzymology" Vol . 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990) ; Marshak y colaboradores, "Strategies for Protein Purifiction and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996) ; todas las cuales son incorporadas por referencia como si se expusieran completamente en la presente. Otras referencias generales se proporcionan por todo este documento. Los procedimientos en las mismas se cree que son bien conocidos en la técnica y se proporcionan para la conveniencia del lector. ? menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tiene el mismo significado como es entendido comúnmente por un experto ordinario en la técnica a la cual esta invención pertenece. Aunque métodos y materiales similares equivalentes a aquellos descritos en la presente pueden ser utilizados en la práctica o la prueba de la presente invención, métodos y materiales adecuados son descritos enseguida. EJEMPLO 1 Identificación de genes de tolerancia al estrés abíótico putativos Los genes de tolerancia al estrés abiótico (ABST) putativos se seleccionaron de bases de datos de NCBI de residuos de secuencia expresados de tomate (ESTs) y cDNAs . Las secuencias de bases de datos se agruparon y se ensamblaron usando el software LEADS™ (Compugen) . La agrupación dio por resultado más de 20,000 agrupaciones, cada una que representa un gen diferente. Un resumen del perfil de expresión fue compilado para cada agrupación al acumular todas las palabras claves incluidas en los registros de secuencias que comprenden la agrupación. Las agrupaciones luego se clasificaron para incluir polinucleótidos que se originan de librerías identificadas por palabras claves relacionadas con ABST. Las agrupaciones seleccionadas se filtraron adicionalmente para excluir cualquier agrupación que incluyó más de 100 ESTs por agrupación y/o cualquier agrupación en la cual menos de 50% de las secuencias son anotadas por palabras claves relacionadas con ABST. Los genes de plantas ABST de la técnica previa se identificaron a partir de las publicaciones de Quesada y colaboradores (Plant Physiol. 130:951-963, 2002); Apse and Blumwald (Curr Opin Biotechnol. 13:146-150, 2002); Rontein y colaboradores (Metab Eng 4:49-56, 2002); y referencias en las mismas. Los genes ABST de plantas conocidas se alinearon con las secuencias de ácido nucleico de tomate agrupadas, usando el programa BLAST. Las secuencias de tomate que tienen un valor de registro de menor que 5 fueron identificados como ortólogos ABST. Los genes ABST de tomate a la técnica previa, adicionales se identificaron al buscar los registros de secuencias de tomate agrupados usando las palabras claves ¦"raíz", "agalla de coronas", "nutriente", "callo", "enfermedad", "patógeno", "deducidor" y "pseudomcnas" .

Finalmente, todos los genes ABST de la técnica previa identificados se igualaron (mediante la alineación de secuencia usando el software BLAST) con el conjunto de salida de agrupaciones de gen de tomate, seleccionados como es descrito en lo anterior. Consecuentemente, aproximadamente 40% de los genes seleccionados en el conjunto de salida de agrupaciones que igualaron con los genes ABST de la técnica previa se probaron que son genes ABST conocidos, indicando que los genes restantes de las agrupaciones seleccionadas son potencialmente capaces de incrementar la tolerancia al estrés abiótico en plantas. Las secuencias de polinucleótidos seleccionadas (Tabla la) , se analizaron para la presencia de ORFs usando el Vector NTI suite (InforMax, U.K.) versión 6 (Hasting Software, Inc: HHH^i¾¾B£EHHiSE^=2ñ¿' · Las ORFs identificadas en cada una de estas secuencias de polinucleótido se compararon con las secuencias de base de datos de Genbank usando Blast (¾¾ ,R¾bi.nla¾.nih .gov/BIJST/) ; la ORF que exhibe la homología más alta a una secuencia o secuencias de GenBank, ' se mapeó con el fin de identificar un codón de inicio ART. La posición del codón de inicio ATG de esta ORF luego se comparó con aquella de la secuencia de polinucleótido identificada con el fin de verificar que cada una de las dieciocho secuencias descritas en la presente incluyen una ORF de longitud completa y un codón de inicio ATG (así califica como un "gen ABST putativo") . Tabla la Genes ABST Putativos Los homólogos de polipéptido ABST se han identificado de las bases de datos de NCBI usando el software BLAST (Tabla Ib) .

Tabla Ib Homólogos ABST Gen Putativo Homólogo de Homólogo de ABST Polipéptido ABST Polipéptido ABST SEQ ID No. NCBI Acceso No. SEQ ID No. Homología (%) 1 ???96366 39 98 1 AAS47510 40 98 ¦ 1 NP_567151 41 97 1 NP_567104 42 96 1 A7AK55664 43 96 1 P46298 44 97 1 T01338 45 96 1 T47888 46 95 1 BAD09465 47 92 1 Q05761 48 91 1 BAD09464 49 88 1 CAA79496 50 84 1 EAJ94592 51 85 4 NP_188036 52 76 4 NP 035977 53 70 4 XP_342608 54 69 4 T09295 55 60 4 NP_564717 56 59 4 7???63624 57 59 9 P37707 58 93 9 CAD37200 59 81 9 CA7A04664 60 78 9 A7AM64572 61 77 9 NP_189345 62 77 9 NP_97 979 63 60 13 AAC49992 64 88 13 T10804 65 87 13 AAL38357 66 87 13 NP_188245 67 87 13 NP_193465 68 87 13 AAG44945 69 86 13 T07819 70 86 13 T12632 71 86 13 CAC39073 72 86 13 T01648 73 86 13 AAF90121 74 86 13 S48116 75 86 13 AAO86710 76 86 13 T14002 77 85 13 T14001 78 85 13 T48886 79 85 13 T14314 80 85 13 P33560 81 85 13 P21653 82 85 13 T14000 83 85 13 T48884 84 85 13 P24422 85 85 13 AAB53329 86 85 14 NP 200279 87 67 14 AAM64276 88 67 14 AA072577 89 66 14 NP_175518 90 64 14 BAC78588 91 64 14 BAD03011 92 62 EJEMPLO 2 Aislamiento de genes de tolerancia ABS putativos El RNA se extrajo de tejidos de raíz y hoj tomate de 4 semanas de edad usando el Trl Reagent (Molecular Research Center, Inc) , siguiendo el protocolo proporcionado por el fabricante {w ..J®. ]~Th$..?,^^/^ ^^ - Las moléculas de DNA complementarias se produjeron del mRNA extraído usando la enzima transcriptasa inversa (RT) M-MuLV (Roche) y el cebador de DNA T16NN, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las secuencias de cDNA expuestas en la SEQ ID NOs : 1,4,8-9 y 12-14, se amplificaron mediante PCR usando los cebadores descritos en la Tabla 2 enseguida, con la enzima de DNA de polimerasa de lectura de prueba PFU (Promega- , roraega ^ 9 Í^9Í^¿§.?/2^ - 9,7/?38.1 07. tral ) , siguiendo el protocolo proporcionado por el fabricante. Los sitios de endonucleasas de restricción adicionales se adicionaron al extremo 5' prima de cada cebador para facilitar la clonación de los genes de tolerancia ABS putativos en vectores binarios . Tabla 2 Cebadores de PCR usados para amplificar los genes de tolerancia ABS (ABST) putativos EJEMPLO 3 Clonación de los genes ABST putativos s productos de extremo despuntado resultante se purificaron usando el equipo de purificación PCR (Qiagen, Alemania) , se digirieron con las enzimas de restricción apropiadas (Roche) y luego se insertaron en el vector de plásmido binario pPI . El pPI de plásmido se construyó al insertar una secuencia de señal poli- (A) sintética que se origina del vector de plásmido básico pGL3 (Promega, Acc No U47295; bp 4658-4811) en el sitio de restricción HindIII del vector binario pBI101.3 (Clontech, Acc. No. U12640) . El plásmido pPI resultante se digirió con las enzimas de restricción [BairíHI y SacI; MBI Fermentas) y se purificó usando el equipo de Purificación de PCR (Qiagen, Alemania) . La construcción pPI abierta luego se ligó con cada uno de los siete productos de PCR descritos anteriormente en la presente. La ligación se efectuó usando una mezcla de ligación que contiene enzima T4 DNA ligasa (Roche) y se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las construcciones pPI que albergan genes ABST putativos se introdujeron a células competentes DH5 de E. coli mediante electroporación, usando un electroporador MicroPulser (Biorad) , probetas de 0.2 cm (Biorad) y programa de electroporación EC-2 (Biorad) . Las células tratadas se cultivaron en el medio liquido LB a 37 °C durante 1 hr, luego se colocaron sobre agar LB complementario con canamicina (50 mg/L; Sigma) y se incubaron a 37 °C durante 16 hrs. Las colonias que se desarrollaron en medios selectivos se analizaron mediante PCR usando el conjunto de cebadores expuesto en la SEQ ID NOs : 35-36, que se diseñaron para extender la secuencia insertada en el plásmido pPI . Los productos de PCR resultantes se separaron en geles de agarosa al 1.5% y el fragnento de DNA que tiene el tamaño predicho se aislaron y se secuenciaron usando el secuenciador ABI 377 (Amersham Biosciences Inc) con el fin de verificar que las secuencias de DNA correctas se introdujeron apropiadamente en las células de E. coli . EJEMPLO 4 Generación de vectores binarios que comprenden genes ABST putativos y promotores de plantas operablemente enlazadas a los mismos Generación de vectores binarios que comprenden el promotor 35S de Virus de Mosaico de Coliflor: La secuencia de promotor 35S de Virus de Mosaico de Coliflor expuesto en la SEQ ID NO: 19) se insertó corriente arriba del gen ABST putativo en cada una de las construcciones pPI descritos en lo anterior. El promotor se aisló del plásmido pBI121 (Clontech, Acceso No. AF485783) usando las endonucleasas de restricción HindIII y Bamñl (Roche) . El promotor aislado se ligó en las construcciones pPI digeridas con las mismas enzimas. Con untamente, se generaron siete construcciones de pPI, cada una que comprende el promotor 35S de CaMV posicionado corriente arriba de un gen ABST putativo que tiene una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1,4,8,9,12,13 o 14. Generación de vectores binarios que comprenden el promotor At6669. La secuencia de promotor At6669 (expuesta en la SEQ ID NO: 20) se insertó corriente arriba del gen ABST putativo en cada una de las construcciones binarias pPI descritas anteriormente. El promotor se aisló del DNA genómico ColO var de Arabidopsis thaliana mediante la amplificación de PCR usando los cebadores expuestos en la SEQ ID Nos: 37-38. El producto de PCR se purificó (Qiagen, Alemania) y se digirió con las endonucleasas de restricción HindIIl y Bairi I (Roche) . La secuencia del promotor resultante se introdujo en las construcciones binarias abiertas digeridas con las mismas enzimas. con untamente, siete construcciones pPI se generaron, cada una que comprende el kit promotor At6669 posicionado corriente arriba de un gen ABST putativo que tiene una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1,4,8,9,12,13 o 14. EJEMPLO 5 Confirmación de la actividad del promotor At6669 en Arabidopsis thaliana transgénica La capacidad del promotor At-6669 para regular la transcripción de genes llevados por el vector pPI en plantas se probó. Por consiguiente, el promotor At6669 se insertó en el vector binario pPI corriente arriba de un gen reportador de Luciferasa. El vector binario se introdujo a plantas de Arabidopsis thaliana usando el procedimiento como es descrito en el Ejemplo 6 enseguida. Las plantas de Arabidopsis T2 transformadas maduras se analizaron para la bio-iluminación en un cuarto oscuro usando una cámara de detección de luz ultra baja (Princeton Instruments Inc., USA) usando el procedimiento descrito por Meissner y colaboradores (Plant J. 22:265, 2000) . La iluminación que indica la actividad de Luciferasa positiva se observó en la flor y los tejidos de meristema de la raíz de las plantas transformadas (Figura 2) . EJEMPLO 6 Transformación de células de AgroJbacterium tumefaciens con vectores binarlos que albergan genes ABST putativos Cada uno de los vectores binarios descritos en el Ejemplo 4 anterior, se usaron para transformar células dé Agrobacterium. Dos construcciones binarias adicionales, que tienen el gen reportador de Luciferasa que reemplaza un gen ABST (posicionado corriente abajo del promotor 35S o At6669) , se usaron como controles negativos. Los vectores binarios se introdujeron a Agrobacterium tumefaciens GV301, o células competentes LB4404 (aproximadamente 109 células/mL) mediante electroporación. La electroporación se efectuó al usar un electroporador MicroPulser (Biorad) , probetas de 0.2 cm (Biorad) y programa de electroporación EC-2 (Biorad) . Las células tratadas se cultivaron en el medio liquido LB a 28°C durante 3 hr, luego se colocaron sobre agar LB complementado con gentamicina (50 mg/L; para las cepas GV 301 de Agrobacterium) o estreptomicina (300 mg/L; para la cepa LB4404 de Agrobacterium) y canamicina (50 mg/1) a 28 °C durante 48 rs . Colonias de Agrobacterium que se desarrollaron en el medio selectivo se analizaron por PCR usando los cebadores expuestos en la SEQ ID NOs : 35-36, que se diseñaron para abarcar la secuencia insertada en el plásmido pPI. Los productos de PCR resultantes se aislaron y se secuenciaron como es descrito en el ejemplo 4 anterior, para verificar que las secuencias ABST correctas fueron introducidas apropiadamente a las células de Agrobacterium. EJEMPXO 7 Transformación de plantas de Arbidopsis thaliana con genes ABST putativos Plantas Columbra de Arábidopsis thaliana (plantas T0) se transformaron usando el procedimiento Floral Dip descrito por Clough y Bent (10) y por Desfeux y colaboradores (11), con modificaciones menores. Brevemente, las Plantas T0 se sembraron en macetas de 250 mi llenas con una mezcla de crecimiento basado en turba húmeda. Las macetas se cubrieron con lámina delgada de aluminio y un domo de plástico, se conservaron a 4°C durante 3-4 dias, luego se descubrieron y se incubaron en una cámara de crecimiento a 18-2 °C bajo ciclos de luz/oscuridad 16/8 hr. Las plantas T0 estuvieron listos para la transformación seis días antes de la antesis. Colonias individuales de Agrobacterium que llevan las construcciones binarias, generadas como es descrito en el Ejemplo 6 anterior, se cultivaron en el medio LB complementado con canamicina (50 mg/L) y gentamicina (50 mg/L) . Los cultivos se incubaron a 28 °C durante 48 hrs . bajo agitación vigorosa y luego se centrifugaron a 4000 rpm durante 5 minutos. Las pelotillas que comprenden células de Agrohacterium se resuspendieron en un medio de transformación que contiene Murashig-Skoog (Duchefa) de mediana concentración (2.15 g/L) / bencilamino purina 0.044 uM (Sigma) ; 112 pg/L de vitaminas B5 Gambourg (Sigma) ; sacarosa al 5% y 0.2 ml/L de Silwet L-77 (OSI Specialists, CT) en agua doblemente destilada, a pH de 5.7. La transformación de las plantas T0 se efectuó al invertir cada planta en una suspensión de Agrohacterium, tal que el tejido de planta arriba de la tierra de sumergió durante 3-5 segundos. Cada planta T0 inoculada se colocó inmediatamente en una charola de plástico, luego se cubrió con el domo de plástico claro para mantener la humedad y se conservó en la oscuridad a temperatura ambiente durante 18 hrs, para facilitar la infección y transformación. Las plantas transformadas (transgénicas) luego fueron descubiertas y transferidas en un invernadero para la recuperación y la maduración. Las plantas T0 transgénicas se cultivaron en el invernadero durante 3-5 semanas hasta que las siliculas se pudieron cafés y secas. Las semillas se cosecharon de las plantas y se conservaron a temperatura ambiente hasta el sembrado. Para la generación de plantas transgénicas Ti y ?2 que albergan los genes, las semillas recolectadas de plantas To transgénicas se esterilizaron en la superficie mediante el empapamiento de etanol al 70% durante 1 minuto, seguido por el empapamiento en hipocloruro de sodio al 5% y tritón al 0.05% durante 5 minutos. Las semillas esterilizadas en la superficie se lavaron completamente en agua destilada estéril y luego se colocaron sobre placas de cultivo que contienen Murashig-Skoog de mediana concentración (Duchefa) ; sacarosa al 2%; agar de planta al 0.8%; canamicina 50 mM; y carbenicilina 200 mM (Duchefa) . Las placas se cultivo se incubaron a 4°C durante 48 horas luego se transfirieron a un cuarto de crecimiento a 25°C durante una semana adicional de incubación. Las plantas de Arabidopsis Ti vitales se transfirieron a placas de cultivo frescas para otra semana de incubación. Después de la incubación las plantas Ti se removieron de las placas de cultivo y se plantaron en la mezcla de crecimiento contenida en macetas de 250 mi. Las plantas transgénicas se dejaron crecer en un invernadero hasta la madurez. Las semillas cosechadas de plantas i se cultivaron y se desarrollaron hasta la madurez como plantas T2 bajo las mismas condiciones como se utilizaron para el cultivo y el crecimiento de las plantas i.

EJEMPLO 8 Evaluación del crecimiento de plantas transgénlcas cultivadas bajo condiciones de estrés abiótico Métodos: Plantas transgénicas Ti o T2 generadas como es descrito anteriormente se transplantaron individualmente en macetas que contienen una mezcla de crecimiento de turba y vermiculita (relación en volumen 3:2, respectivamente) . Las macetas se cubrieron durante un periodo de 24 hr para el endurecimiento, luego se colocaron en el invernadero en orden aleatorio completo y se regaron con agua potable (proporcionados desde el fondo de la maceta cada 3-5 días) durante 7 días. Después la mitad de las plantas se irrigaron con una solución de sal (NaCl 100 inM y CaCl2 5 mM) para inducir el estrés de salinidad (condiciones de estrés) . La otra mitad de las plantas se continuaron irrigando con agua potable (condiciones normales) . Todas las plantas se cultivaron en el invernadero en 100% de H durante 28 días, luego se cosecharon (el tejido de la tierra arriba) y se pesaron (inmediatamente o después del secado en un horno a 50°C durante 24 hr) . Resultados: No se observaron diferencias significantes en los pesos frescos de plantas entre las plantas i transformadas con 3 diferentes genes ABST y plantas transformadas con el gen reportador de Luciferasa, cultivadas bajo condiciones normales o de estrés (Figura 3 y Tabla 3 enseguida) . Aun, las plantas Ti transformadas con la SEQ ID NO: 1 posicionada bajo el control regulatorio del promotor At6669 mantuvieron 71% de su peso fresco cuando se expusieron a condiciones de estrés, mientras gue las plantas de control (gue llevan el gen Luciferasa posicionado bajo el control regulatorio del promotor AT6669) mantuvieron solamente 61% de su peso fresco bajo condiciones de estrés similares. Tabla 3 Peso fresco de plantas de Arabidopsis transgénicas ± irrigadas con agua o solución de sal Hileras representa el número de plantas evidencia de transformación independientes medidas . Para cada transgen, 3-5 evidencias de transformación independientes con 1-3 plantas por una evidencia de transformación individual se utilizaron. Plantas T2 transformadas con la SEQ ID NOs: 7 o 14 posicionadas bajo el control regulatorio del promotor 35S acumularon significativamente más alta biomasa que las plantas de control, sin considerar las condiciones de crecimiento. Como se muestra en la Figura 4A y la Tabla 4 enseguida, el peso fresco por medio de plantas transformadas con la SEQ ID NOs: 7 y 14, cultivadas bajo condiciones de estrés, fueron de 15% y 24%, respectivamente, más alto que el peso fresco promedio de las plantas de control cultivadas bajo condiciones de estrés similares. De manera similar, el peso fresco promedio de las plantas transformadas con SEQ ID NOs: 7 o 14, cultivadas bajo condiciones normales, fueron 21% y 27%, respectivamente, más alto que el peso fresco promedio de las plantas de control cultivadas bajo condiciones normales similares. Un fenómeno similar se observó con las plantas T2 transformadas con la SEQ ID NO: 4 posicionada bajo el control regulatorio del promotor 35S. Por consiguiente, como se muestra en la Figura 4A y la Tabla 4 enseguida, el peso fresco promedio de las plantas transformadas cultivadas bajo condiciones de estrés y normales, respectivamente. De manera similar, las plantas ?? transformadas con la SEQ ID NO: 4 posicionadas bajo el control regulatorio del promotor At6669 exhibieron 1.3 y 5% de biomasa más alta que las plantas de control cultivadas bajo condiciones de estrés y normales, respectivamente. Sin embargo, estas diferencias no se encontraron estadísticamente diferentes bajo las condiciones experimentales . Tabla 4 Peso fresco de las plantas de Arabídopsis transgénicas Irrigadas con agua o solución de sal Transgen Promotor Solución de (SEQ ID NO) N Irrigación Error Hileras (NaCl mM) Promedio (g) Estándar Luciferasa CaMV-35S 11 0 0.352727 0.011208 Luciferasa CaMV-35S 11 100 0.280909 0.010484 9 CaMV-35S 11 0 0.426364 0.019599 9 CaMV-35S 11 100 0.322727 0.027306 12 CaMV-35S 11 0 0.374545 0.015746 12 CaMV-35S 11 100 0.249091 0.020647 1 CaMV-35S 8 0 0.36625 0.034171 1 CaMV-35S 8 100 0.265 0.031225 13 CaMV-35S 11 0 0.349091 0.013515 13 CaMV-35S 11 100 0.293636 0.019921 14 CaMV-35S 11 0 0.446364 0.025558 14 CaMV-35S 11 100 0.348182 0.023772 8 CaMV-35S 11 0 0.310909 0.015223 8 CaMV-35S 11 100 0.253636 0.01539 4 CaMV-35S 11 0 0.379091 0.010992 4 CaMV-35S 11 100 0.318182 0.013336 """N Hileras representa el número de plantas de evidencia de transformación independiente medidas. Para cada transgen, 3-5 evidencias de transformación independientes con 1-3 plantas por una evidencia de transformación individual se utilizaron. Las plantas T2 transformadas con SEQ ID NOs : 1 y 13 posicionadas bajo el control regulatorio del promotor At6669 y cultivadas bajo condiciones de estrés, exhibieron significativamente más alta biomasa que las plantas de control cultivadas bajo condiciones de estrés similares. El peso fresco promedio de las plantas T2 transformadas con SEQ ID NOs: 1 y 13 posicionadas bajo el control regulatorio del promotor At6669, y cultivada bajo condiciones de estrés, fueron 37% y 21%, respectivamente, más alto que el peso fresco por medio de las plantas de control cultivadas bajo condiciones de estrés similares (Figura 4B y Tabla 5 enseguida) . No se observó incremento significante en la biomasa sobre el control cuando estas plantas transgénicas (que llevan SEQ ID NOs: 1 y 13 reguladas bajo el promotor At6669) donde se cultivaron bajo condiciones normales. Tabla 5 Peso fresco de plantas de Arabidopsis transgénicas T2 Irrigadas con agua o solución de sal ¼ Hileras representa número de plantas de evidencia de transformación independiente medidas. Para cada transgen, 3-5 evidencias de transformación independientes con 1-3 plantas por una evidencia de transformación individual se utilizaron. Los resultados ilustran que los genes ABST putativos aislados, expuestos en la SEQ ID NOs: 1 y 13, son capaces de incrementar la tolerancia de la planta al estrés abiótico, tal como un estrés de salinidad. Además, los genes ABST putativos aislados expuestos en la SEQ ID NOs : 7, 14 (y posiblemente también 4) , son capaces de promover sustancialmente la biomasa en plantas cultivadas bajo estrés, asi como bajo condiciones normales. Por consiguiente, los resultados claramente indican que los genes de tolerancia al estrés abiótico putativos descritos en la presente se pueden aislar fácilmente y utilizar para incrementar adicionalmente la tolerancia al estrés abiótico y/o biomasa en plantas. Es apreciado que ciertas características de la invención, que son, por claridad, descritas en el contexto de modalidades separadas, también pueden ser proporcionadas en combinación con una sola modalidad. A la inversa, varias características de la invención, que son descritas, por brevedad, en el contexto de una sola modalidad, también se pueden proporcionar por separado o en cualquier subcombinación adecuada. Aunque la invención se ha descrito en conjunción con modalidades específicas de la misma, es evidente que muchas alternativas, modificaciones y variaciones serán evidentes para aquellos expertos en la técnica. Por consiguiente, se propone comprender todas de tales alternativas, modificaciones y variaciones que caen dentro del espíritu y alcance amplio de las reivindicaciones adjuntas. Toda las publicaciones, patentes, solicitudes de patentes y secuencias identificadas por sus números de acceso mencionadas en esta especificación son incorporadas en la presente en su totalidad por referencia en la especificación, al mismo grado como si cada publicación individual, patente, solicitud de patente o secuencia identificada por su número de acceso fuera específicamente e individualmente indicada que es incorporada en la presente por referencia. Además, la cita o identificación de cualquier referencia en esta solicitud no debe ser considerada como una admisión de que tal referencia está disponible como la técnica previa para la presente invención. REFERENCIAS CITADAS (Referencias adicionales están citadas anteriormente en la presente) 2. ¾^¾n¾' . ¾o . org/'ag/agl 3. McCue KF, Hanson AD (1990) . Drought and salt tolerance: towards understanding and application. Trends Biotechnol 8: 358-362. 4. Flowers TJ, Yeo Ar (1995) . Breeding for salinity resistance in crop plants: where next? Aust J Plant Physiol 22:875-884. 5. Nguyen BD, Brar DS, Bui BC, Nguyen TV, Pham LN, Nguyen HT (2003) . Identification and mapping of the QTL for aluminum tolerance introgressed from the new source, ORYZA RUFIPOGON Griff., into indica rice (Oryza sativa L . ) · Theor Appl Genet. 106:583-93. Sánchez AC, Subudhi P , Rosenow DT, Nguyen HT (2002) . Mapping QTLs associated with drought resistance in sorghum (Sorghum bicolor L. Moench) . Plant Mol Biol. 48 :713-26. Quesada V, García-Martinez S, Piqueras P, Ponce MR, Micol JL (2002) . Genetic architecture of NaCl tolerance in Arabidopsis. Plant Physiol. 130:951-963. Apse MP, Blumwald E (2002) . Engineering salt tolerance in plants. Curr Opin Biotechnol. 13:146-150. Rontein D, Basset G, Hanson AD (2002) . Metabolic engineering of osmoprotectant accumulation in plants. Metab Eng 4 : 49-56 Clough SJ, Bent AF (1998) . Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J 16:735-43. Desfeux C, Clough SJ, Bent AF (2000) . Female reproductive tissues are the primary target of Agrobacterium-mediated transformation by the Arabidopsis floral-dip method. Plant Physiol 123:895-904.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un método para incrementar la tolerancia de una planta a un estrés abiótico, caracterizado porque comprende expresar dentro de la planta un polinucleótido exógeno por lo menos 90% homólogo a un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 1-18, para de esta manera incrementar la tolerancia de la planta al estrés abiótico.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la expresión se efectúa mediante: (a) la transformación de una célula de la planta con el polinucleótido exógeno; (t>) la generación de una planta madura a partir de la célula; y (c) el cultivo de la planta madura bajo condiciones adecuadas para expresar el polinucleótido exógeno dentro de la planta madura.
3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la transformación se efectúa al introducir a la célula de planta una construcción de ácido nucleico que incluye el polinucleótido exógeno y por lo menos un promotor capaz de dirigir la transcripción del polinucleótido exógeno en la célula de planta.
4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el por lo menos un promotor es un promotor constitutivo .
5. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el promotor constitutivo es el promotor 35S de CaMV.
6. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el promotor constitutivo es el promotor At6669.
7. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el por lo menos un promotor es un promotor inducible .
8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el promotor inducible es un promotor inducible por estrés abiótico.
9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la expresión se efectúa al infectar la planta con un virus que incluye el polinucleótido exógeno.
10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el virus es un virus avirulento.
11. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el estrés abiótico se selecciona del grupo que consiste de salinidad, carencia de agua, temperatura baja, tempera alta, toxicidad por metal pesado, anaerobiosis, deficiencia de nutrientes, exceso de nutrientes, contaminación atmosférica e irradiación UV.
12. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la planta es una planta dicotiledónea.
13. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la planta es una planta monocotiledónea .
14. Un método para incrementar la biomasa de una planta, caracterizado porque comprende expresar dentro de la planta un polinucleotido de exógeno por lo menos 90% homólogo a un polinucleotido seleccionado al grupo que consiste de SEQ ID NOs : 1-18, para de esta manera incrementar la biomasa de la planta.
15. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la expresión se efectúa mediante: (a) la transformación de una célula de la planta con el polinucleotido exógeno; (b) la generación de una planta madura a partir de la célula; y (c) el cultivo de la planta madura bajo condiciones adecuadas para expresar el polinucleotido exógeno dentro de la planta madura.
16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la transformación se efectúa al introducir a la célula de planta una construcción de ácido nucleico que incluye el polinucleotido exógeno y por lo menos un promotor capaz de dirigir la transcripción del polinucleotido exógeno en la célula de planta.
17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el por lo menos un promotor es un promotor constitutivo.
18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el promotor constitutivo es el promotor 35S de CaMV.
19. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el promotor constitutivo es el promotor At6669.
20. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el por lo menos un promotor es un promotor inducible.
21. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la expresión se efectúa al infectar la planta con un virus que incluye el polinucleótido exógeno.
22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el virus es un virus avirulento.
23. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la planta es una planta dicotiledónea.
24. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la planta es una planta monocotiledónea .
25. Una construcción de ácido nucleico, caracterizada porque comprende un polinucleótido por lo menos 90% homólogo a una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 1-18 y un promotor capaz de dirigir la transcripción del polinucleótido en una célula hospedera .
26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el promotor es un promotor constitutivo.
27. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el promotor constitutivo es el promotor 35S de CaMV.
28. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el promotor constitutivo es el promotor At6669.
29. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el por lo menos un promotor es un promotor inducible .
30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el promotor inducible es un promotor inducible por estrés abiótico.
31. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la célula hospedera es una célula de planta .
32. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la célula de planta forma una parte de una célula de planta dicotiledónea.
33. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la célula de planta forma una parte de una célula de planta monocotiledónea .
34. Un polipéptido aislado, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% homologa a la secuencia de aminoácidos codificada por un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 1-18.
35. Una célula de planta, caracterizada porque comprende un polinucleótido exógeno por lo menos 90% homólogo a un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 1-18.
36. La célula de planta de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque la célula de planta forma una parte de una planta.