JP2011092122A - 植物に環境ストレス耐性を付与する遺伝子及びその利用方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】植物に対して環境ストレス耐性を付与する或いは植物の環境ストレス耐性を向上させる技術を提供する。
【解決手段】Ag2g33080を含む第１グループから選ばれるLRR-RLP遺伝子、Ag1g69990を含む第２グループから選ばれるLRR-RLK遺伝子及びAg5g39390を含む第３グループから選ばれるLRR-RLK遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を導入する、又は内在する当該遺伝子の発現制御領域を改変する。
【選択図】図１
【解決手段】Ag2g33080を含む第１グループから選ばれるLRR-RLP遺伝子、Ag1g69990を含む第２グループから選ばれるLRR-RLK遺伝子及びAg5g39390を含む第３グループから選ばれるLRR-RLK遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を導入する、又は内在する当該遺伝子の発現制御領域を改変する。
【選択図】図１
Description
本発明は、所定の遺伝子を導入した、又は内在する当該遺伝子の発現制御領域を改変した植物体、及び所定の遺伝子を導入する、又は内在する当該遺伝子の発現制御領域を改変することによる植物に環境ストレス耐性を付与する方法、環境ストレス耐性が付与された植物体の製造方法に関する。
植物の生育可能性は、温度や湿度、土壌に含まれる塩濃度といった様々な環境要因に依存する。これら要因によって特徴づけられる環境が、ある植物にとっては適合するが、他の植物にとっては適合しないこともある。一般に、植物の生育に影響するような上記要因は環境ストレスと呼ばれる。所定の環境ストレスを有する環境において、所定の植物が生育不可能若しくは致死的である場合、当該植物は環境ストレス耐性がないと説明される。逆に、所定の環境ストレスを有する環境においても生育可能である植物は、環境ストレス耐性を有すると説明される。
一方、植物は、その一部の組織自体（種子、根、葉茎など）を目的として栽培されたり、油脂などの種々の物質生産を目的として栽培されたりする。例えば、植物が生産する油脂としては、大豆油、ごま油、オリーブ油、椰子油、米油、綿実油、ひまわり油、コーン油、べに花油、パーム油及び菜種油等が古来より知られており、家庭用途や工業用途に広く利用されている。また、植物が生産する油脂は、バイオディーゼル燃料やバイオプラスチックの原料としても使用され、石油代替エネルギーとして適用性が広がっている。
植物に環境ストレス耐性を付与することができれば、当該植物の栽培可能地域を拡張することができ、有限の大地を有効に利用することができる。特に、サトウキビなどのエネルギー作物は、バイオ燃料の原料となるため、種々の環境ストレスに対する耐性を獲得することが望まれている。すなわち、上述したエネルギー作物に環境ストレス耐性を付与できれば、上述した環境要因に起因して栽培不可能であった地域においても当該エネルギー作物を栽培できるようになる。
植物に環境ストレス耐性を付与する技術として特許文献１及び２並びに非特許文献１を挙げることができる。特許文献１では、浸透圧調節物質であるグリシンベタイン合成に関与する遺伝子を導入することにより、植物に塩ストレス耐性を付与する方法が開示されている。特許文献２及び非特許文献１には、タバコ由来の受容体様タンパク質をコードする遺伝子を導入することにより、植物に環境ストレス耐性を付与する方法が開示されている。
また、特許文献２及び非特許文献１では、受容体様タンパク質をコードする遺伝子を導入しているが、ロイシンリッチリピート構造を有する受容体様タンパク質をコードする遺伝子や、ロイシンリッチリピート構造を有する受容体様タンパク質キナーゼをコードする遺伝子を導入する例は開示されていない。なお、非特許文献２及び３には、ロイシンリッチリピート構造を有する受容体様タンパク質キナーゼがストレスに対する反応に重要な役割を果たしていることを報告している。
Plant Physiology, February 2003, Vol. 131, pp. 454-462
Plant Physiology, April 2007, Vol. 113, pp. 1203-1212
Plant Cell, April 2005, Vol. 17(4), pp. 1105-1119
しかしながら、ロイシンリッチリピート構造を有する受容体様タンパク質をコードする遺伝子や、ロイシンリッチリピート構造を有する受容体様タンパク質キナーゼをコードする遺伝子を植物体に導入することで、植物に環境ストレス耐性を付与できていないのが現状である。
そこで、上述したような実情に鑑み、植物に対して環境ストレス耐性を付与する或いは植物における環境ストレス耐性を向上させる新規な機能を有する遺伝子を探索し、植物に対して環境ストレス耐性を付与する或いは植物における環境ストレス耐性を向上させる技術を提供することを目的とする。
上述した目的を達成するため、本発明者らが、ロイシンリッチリピート構造を有する数多くのタンパク質について解析し、ロイシンリッチリピート構造を有する受容体様タンパク質をコードする特定の遺伝子、或いはロイシンリッチリピート構造を有する受容体様タンパク質キナーゼをコードする特定の遺伝子を植物体内に導入する、又は内在する当該遺伝子の発現制御領域を改変することにより植物体に環境ストレス耐性を付与できるといった新規知見を見いだし、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明に係る植物体は、At5g40170、At2g25440、At2g32680、At3g24900、At3g25020、At3g25010、At2g33020、At2g33080、At2g32660、At2g33050及びAt2g33060を含む第１グループから選ばれるロイシンリッチリピート構造を有する受容体様タンパク質をコードする遺伝子、At3g28450、At1g27190及びAt1g69990を含む第２グループから選ばれるロイシンリッチリピート構造を有する受容体様キナーゼをコードする遺伝子、及びAt3g47570、At3g47580、At3g47090、At3g47110、At5g20480及びAt5g39390を含む第３グループから選ばれるロイシンリッチリピート構造を有する受容体様キナーゼをコードする遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を導入した、又は内在する当該遺伝子の発現制御領域を改変した植物体である。
また、本発明に係る植物体に環境ストレス耐性を付与する方法は、At5g40170、At2g25440、At2g32680、At3g24900、At3g25020、At3g25010、At2g33020、At2g33080、At2g32660、At2g33050及びAt2g33060を含む第１グループから選ばれるロイシンリッチリピート構造を有する受容体様タンパク質をコードする遺伝子、At3g28450、At1g27190及びAt1g69990を含む第２グループから選ばれるロイシンリッチリピート構造を有する受容体様キナーゼをコードする遺伝子、及びAt3g47570、At3g47580、At3g47090、At3g47110、At5g20480及びAt5g39390を含む第３グループから選ばれるロイシンリッチリピート構造を有する受容体様キナーゼをコードする遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を導入する、又は内在する当該遺伝子の発現制御領域を改変する方法である。
さらに、本発明に係る植物体の製造方法は、At5g40170、At2g25440、At2g32680、At3g24900、At3g25020、At3g25010、At2g33020、At2g33080、At2g32660、At2g33050及びAt2g33060を含む第１グループから選ばれるロイシンリッチリピート構造を有する受容体様タンパク質をコードする遺伝子、At3g28450、At1g27190及びAt1g69990を含む第２グループから選ばれるロイシンリッチリピート構造を有する受容体様キナーゼをコードする遺伝子、及びAt3g47570、At3g47580、At3g47090、At3g47110、At5g20480及びAt5g39390を含む第３グループから選ばれるロイシンリッチリピート構造を有する受容体様キナーゼをコードする遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を導入した、又は内在する当該遺伝子の発現制御領域を改変した形質転換植物を準備する工程と、前記形質転換植物の後代植物の環境ストレス耐性を評価し、当該環境ストレス耐性が有意に向上した系統を選抜する工程とを含む方法である。
ここで、第１グループから選ばれるロイシンリッチリピート構造を有する受容体様タンパク質をコードする遺伝子としては、At5g40170、At2g25440、At2g32680、At3g24900、At3g25020、At3g25010、At2g33020、At2g33080、At2g32660、At2g33050及びAt2g33060で特定される遺伝子並びに当該遺伝子に機能的に等価な遺伝子を挙げることができる。なかでも、第１グループから選ばれる遺伝子としては、At2g25440、At2g32680、At3g24900、At3g25020、At3g25010、At2g33020及びAt2g33080で特定される遺伝子並びに当該遺伝子に機能的に等価な遺伝子からなる群から選ばれる遺伝子であることが好ましい。さらに、第１グループから選ばれる遺伝子としては、At2g33020及びAt2g33080で特定される遺伝子並びに当該遺伝子に機能的に等価な遺伝子からなる群から選ばれる遺伝子であることがより好ましい。
特に、第１グループから選ばれるロイシンリッチリピート構造を有する受容体様タンパク質をコードする遺伝子は、以下の（a）〜（c）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子であることが好ましい。
（a）配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質
（b）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み、ロイシンリッチリピート構造を有し、受容体様活性を有するタンパク質
（c）配列番号１に示す塩基配列の相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、ロイシンリッチリピート構造を有し、受容体様活性を有するタンパク質
（a）配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質
（b）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み、ロイシンリッチリピート構造を有し、受容体様活性を有するタンパク質
（c）配列番号１に示す塩基配列の相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、ロイシンリッチリピート構造を有し、受容体様活性を有するタンパク質
また、第２グループから選ばれるロイシンリッチリピート構造を有する受容体様キナーゼをコードする遺伝子としては、At3g28450、At1g27190及びAt1g69990で特定される遺伝子並びに当該遺伝子に機能的に等価な遺伝子を挙げることができる。なかでも、第２グループから選ばれる遺伝子としては、At1g27190及びAt1g69990で特定される遺伝子並びに当該遺伝子に機能的に等価な遺伝子からなる群から選ばれる遺伝子であることが好ましい。
特に、第２グループから選ばれるロイシンリッチリピート構造を有する受容体様キナーゼをコードする遺伝子は、以下の（a）〜（c）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子であることが好ましい。
（a）配列番号４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質
（b）配列番号４に示すアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み、ロイシンリッチリピート構造を有し、受容体様キナーゼ活性を有するタンパク質
（c）配列番号３に示す塩基配列の相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、ロイシンリッチリピート構造を有し、受容体様キナーゼ活性を有するタンパク質
（a）配列番号４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質
（b）配列番号４に示すアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み、ロイシンリッチリピート構造を有し、受容体様キナーゼ活性を有するタンパク質
（c）配列番号３に示す塩基配列の相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、ロイシンリッチリピート構造を有し、受容体様キナーゼ活性を有するタンパク質
さらに、第３グループから選ばれるロイシンリッチリピート構造を有する受容体様キナーゼをコードする遺伝子としては、At3g47570、At3g47580、At3g47090、At3g47110、At5g20480及びAt5g39390で特定される遺伝子並びに当該遺伝子に機能的に等価な遺伝子を挙げることができる。なかでも、第３グループから選ばれる遺伝子としては、At3g47110、At5g20480及びAt5g39390で特定される遺伝子並びに当該遺伝子に機能的に等価な遺伝子であることが好ましい。さらに、第３グループから選ばれる遺伝子としては、At5g20480及びAt5g39390で特定される遺伝子並びに当該遺伝子に機能的に等価な遺伝子であることがより好ましい。
特に、第３グループから選ばれるロイシンリッチリピート構造を有する受容体様キナーゼをコードする遺伝子は、以下の（a）〜（c）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子であることがこのましい。
（a）配列番号６に示すアミノ酸配列を含むタンパク質
（b）配列番号６に示すアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み、ロイシンリッチリピート構造を有し、受容体様キナーゼ活性を有するタンパク質
（c）配列番号５に示す塩基配列の相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、ロイシンリッチリピート構造を有し、受容体様キナーゼ活性を有するタンパク質
（a）配列番号６に示すアミノ酸配列を含むタンパク質
（b）配列番号６に示すアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み、ロイシンリッチリピート構造を有し、受容体様キナーゼ活性を有するタンパク質
（c）配列番号５に示す塩基配列の相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、ロイシンリッチリピート構造を有し、受容体様キナーゼ活性を有するタンパク質
本発明において対象とする植物は、双子葉植物、例えばアブラナ科植物、アブラナ科植物の中でもシロイヌナズナやアブラナを挙げることができる。一方、本発明において対象とする植物は、単子葉植物、例えばイネ科植物、イネ科植物の中でもイネやサトウキビを挙げることができる。
本発明に係る植物体は、野生型と比較して塩ストレスといった環境ストレスに対する耐性が有意に向上したものとなる。また、本発明に係る環境ストレスの付与方法は、対象とする植物の野生型と比較して大幅に環境ストレスに対する耐性を向上することができる。さらに、本発明に係る植物体の製造方法は、野生型と比較して環境ストレスに対する耐性が大幅に向上した植物体を製造することができる。したがって、本発明を適用することによって、例えば、植物の栽培条件を大幅に緩和することができ、植物自体を生産物としたときの生産量の向上を達成することができ、低コスト化を達成することができる
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る植物体は、ロイシンリッチリピート構造を有する受容体様タンパク質（以下、LRR-RLPと略称する）をコードする遺伝子、ロイシンリッチリピート構造を有する受容体様キナーゼ（以下、LRR-RLKと略称する）をコードする遺伝子若しくはこれらLRR-RLP遺伝子又はLRR-RLK遺伝子に機能的に等価な遺伝子を導入したもの、又は内在する遺伝子の発現制御領域を改変したものであり、野生型と比較して環境ストレス耐性が向上したものである。ここで、環境ストレスとは、塩ストレス、高温ストレス及び乾燥ストレス等を含む意味である。特に、本発明に係る植物体において、環境ストレス耐性としては塩ストレス耐性を対象とすることが好ましい。すなわち、本発明に係る植物体は、野生型と比較して塩ストレス耐性が向上したものであることが好ましい。塩ストレス等の環境ストレス耐性が向上するとは、野生型の生育が不可能或いは困難な環境ストレス付加条件下において生育が可能であることを意味する。
本発明に係る植物体は、ロイシンリッチリピート構造を有する受容体様タンパク質（以下、LRR-RLPと略称する）をコードする遺伝子、ロイシンリッチリピート構造を有する受容体様キナーゼ（以下、LRR-RLKと略称する）をコードする遺伝子若しくはこれらLRR-RLP遺伝子又はLRR-RLK遺伝子に機能的に等価な遺伝子を導入したもの、又は内在する遺伝子の発現制御領域を改変したものであり、野生型と比較して環境ストレス耐性が向上したものである。ここで、環境ストレスとは、塩ストレス、高温ストレス及び乾燥ストレス等を含む意味である。特に、本発明に係る植物体において、環境ストレス耐性としては塩ストレス耐性を対象とすることが好ましい。すなわち、本発明に係る植物体は、野生型と比較して塩ストレス耐性が向上したものであることが好ましい。塩ストレス等の環境ストレス耐性が向上するとは、野生型の生育が不可能或いは困難な環境ストレス付加条件下において生育が可能であることを意味する。
対象とする遺伝子を外来的に植物体内に導入するか、内在する遺伝子の発現制御領域を改変することによって、対象とする遺伝子の発現量を野生型における発現量と比較して有意に大とすることができる。また、本発明に係る植物体としては、上記LRR-RLP遺伝子や上記LRR-RLK遺伝子等を植物組織の全体に亘って発現させたものであっても良いが、植物組織の少なくとも一部において発現させたものであっても良い。ここで植物組織とは、葉、茎、種子、根及び花等の植物器官を含む意味である。
また、発現制御領域とは、RNAポリメラーゼが結合するプロモーター領域及びその他の転写因子が結合する領域を含む意味である。転写制御領域の改変としては、内在する転写制御領域のうち例えばプロモーター領域を、より高発現が可能なプロモーター領域に置換することが好ましい。
LRR-RLP遺伝子
本発明においてLRR-RLP遺伝子は、ロイシンリッチリピート構造を有する受容体様タンパク質をコードする遺伝子からなり、At5g40170で特定される遺伝子（At5g40170遺伝子と略称する。以下同様。）、At2g25440遺伝子、At2g32680遺伝子、At3g24900遺伝子、At3g25020遺伝子、At3g25010遺伝子、At2g33020遺伝子、At2g33080遺伝子、At2g32660遺伝子、At2g33050遺伝子及びAt2g33060遺伝子を含む第１グループから選ばれる。ここで、第１グループとは、後述する実施例で示すように、植物に導入することで当該植物の塩ストレス耐性を向上できたAt2g33080遺伝子に対して機能的に等価若しくは同等であると評価される遺伝子群から構成されるグループを意味する。At2g33080遺伝子に対して機能的に等価、若しくは同等であると評価される遺伝子群は、例えば、SALAD Databaseを使用することによって検索・同定することができる。
本発明においてLRR-RLP遺伝子は、ロイシンリッチリピート構造を有する受容体様タンパク質をコードする遺伝子からなり、At5g40170で特定される遺伝子（At5g40170遺伝子と略称する。以下同様。）、At2g25440遺伝子、At2g32680遺伝子、At3g24900遺伝子、At3g25020遺伝子、At3g25010遺伝子、At2g33020遺伝子、At2g33080遺伝子、At2g32660遺伝子、At2g33050遺伝子及びAt2g33060遺伝子を含む第１グループから選ばれる。ここで、第１グループとは、後述する実施例で示すように、植物に導入することで当該植物の塩ストレス耐性を向上できたAt2g33080遺伝子に対して機能的に等価若しくは同等であると評価される遺伝子群から構成されるグループを意味する。At2g33080遺伝子に対して機能的に等価、若しくは同等であると評価される遺伝子群は、例えば、SALAD Databaseを使用することによって検索・同定することができる。
より具体的に、シロイヌナズナにおいて、第１グループに含まれるLRR-RLP遺伝子としては、At5g40170遺伝子、At2g25440遺伝子、At2g32680遺伝子、At3g24900遺伝子、At3g25020遺伝子、At3g25010遺伝子、At2g33020遺伝子、At2g33080遺伝子、At2g32660遺伝子、At2g33050遺伝子及びAt2g33060遺伝子が挙げられ、本発明ではこれら遺伝子群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子を導入するか、内在する遺伝子の発現制御領域を改変する。なかでも、本発明における導入対象又は発現制御領域の改変対象とする遺伝子としては、At2g25440遺伝子、At2g32680遺伝子、At3g24900遺伝子、At3g25020遺伝子、At3g25010遺伝子、At2g33020遺伝子又はAt2g33080遺伝子が好ましく、At2g33020遺伝子又はAt2g33080遺伝子がより好ましい。特に本発明においては、At2g33080遺伝子を導入するか、内在するAt2g33080遺伝子の発現制御領域を改変することがより好ましい。
一例として、At2g33080遺伝子のコーディング領域の塩基配列を配列番号１に示し、At2g33080遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。また、At5g40170遺伝子、At2g25440遺伝子、At2g32680遺伝子、At3g24900遺伝子、At3g25020遺伝子、At3g25010遺伝子、At2g33020遺伝子、At2g32660遺伝子、At2g33050遺伝子及びAt2g33060遺伝子のコーディング領域の塩基配列をそれぞれ配列番号２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２に示し、コードされるタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１及び４３に示す。
また、本発明においては、上述したシロイヌナズナ由来のLRR-RLP遺伝子、例えばAt2g33080遺伝子と機能的に等価な遺伝子を導入するか、内在する遺伝子の発現制御領域を改変しても良い。ここで機能的に等価な遺伝子とは、例えばシロイヌナズナ以外の生物由来であって、第１グループに含まれるLRR-RLPをコードする遺伝子を意味する。
上記機能的に等価な遺伝子は、特に限定されず、種々の生物に関する遺伝子配列を格納したデータベースを検索することで特定することができる。すなわち、配列番号１に示した塩基配列又は配列番号２に示したアミノ酸配列をクエリー配列として、例えばDDBJ/EMBL/GenBank国際塩基配列データベースやSWISS-PROTデータベースを検索し、公知のデータベースから容易に検索・同定することができる。
ここで、シロイヌナズナ以外の生物としては、何ら限定されないが、例えばイネを挙げることができる。すなわち、機能的に等価な遺伝子としては、イネにおけるOs01g0132100遺伝子を挙げることができる。また、シロイヌナズナ及びイネ以外の植物由来であって、上記機能的に等価な遺伝子としては、キャベツ（Brassica oleracea）由来の遺伝子（UniProt データベース アクセッション番号ACB59218）を挙げることができる。Os01g0132100遺伝子のコーディング領域の塩基配列を配列番号７に示し、当該遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号８に示す。ACB59218遺伝子のコーディング領域の塩基配列を配列番号９に示し、当該遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１０に示す。
なお、本発明において、LRR-RLP遺伝子としては、上述したような配列番号１、７、９、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２に示した塩基配列からなり、配列番号２、８、１０、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１及び４３に示したアミノ酸配列をコードするLRR-RLP遺伝子に限定されるものではない。すなわち、LRR-RLP遺伝子としては、配列番号２、８、１０、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１及び４３に示したアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸配列が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み、且つ、LRR-RLPとして機能するものであっても良い。ここで、複数個のアミノ酸としては、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１個から５個、特に好ましくは１個から３個を意味する。なお、アミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、上記LRR-RLP遺伝子をコードする塩基配列を、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。塩基配列に変異を導入するには、Kunkel法またはGapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-KやMutant-G（何れも商品名、TAKARA Bio社製））等を用いて、あるいはLA PCR in vitro Mutagenesisシリーズキット（商品名、TAKARA Bio社製）を用いて変異が導入される。また、変異導入方法としては、EMS（エチルメタンスルホン酸）、5-ブロモウラシル、2-アミノプリン、ヒドロキシルアミン、N-メチル-N’-ニトロ-Nニトロソグアニジン、その他の発ガン性化合物に代表されるような化学的変異剤を使用する方法でも良いし、X線、アルファ線、ベータ線、ガンマ線、イオンビームに代表されるような放射線処理や紫外線処理による方法でも良い。
また、LRR-RLP遺伝子としては、配列番号１、７及び９に示した塩基配列からなり、配列番号２、８、１０、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１及び４３に示したアミノ酸配列をコードするLRR-RLP遺伝子の相同遺伝子であってもよい。ここで、相同遺伝子とは、一般的に、共通の祖先遺伝子から進化分岐した遺伝子を意味しており、２種類の種の相同遺伝子（オルソログ（ortholog)）及び同一種内で重複分岐により生じた相同遺伝子（パラログ(paralog)）を含む意味である。換言すると、上述した「機能的に等価な遺伝子」にはオルソログやパラログといった相同遺伝子を含む意味である。但し、上述した「機能的に等価な遺伝子」とは、共通遺伝子から進化せず、単に類似した機能を有する遺伝子も含む意味となる。
配列番号１、７、９、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２に示した塩基配列からなり、配列番号２、８、１０、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１及び４３に示したアミノ酸配列をコードするLRR-RLP遺伝子に類似した機能を有する遺伝子としては、これらアミノ酸配列に対する類似度(Similarity)が例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上であるアミノ酸配列を有し、LRR-RLP活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を挙げることができる。ここで、類似度の値は、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）プログラムを実装したコンピュータプログラム及び遺伝子配列情報を格納したデータベースを用いてデフォルトの設定を用いて求められる値を意味する。
また、配列番号１、７、９、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２に示した塩基配列からなり、配列番号２、８、１０、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１及び４３に示したアミノ酸配列をコードするLRR-RLP遺伝子に類似した機能を有する遺伝子は、植物ゲノム情報が明らかとなっていない場合には、対象となる植物からゲノムを抽出するか或いは対象となる植物のcDNAライブラリーを構築し、配列番号１、７、９、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２に示した塩基配列からなるLRR-RLP遺伝子の少なくとも一部に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするゲノム領域或いはcDNAを単離することで同定することができる。ここで、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、45℃、6×SSC（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）でのハイブリダイゼーション、その後の50〜65℃、0.2〜1×SSC、0.1％SDSでの洗浄が挙げられ、或いはそのような条件として、65〜70℃、1×SSCでのハイブリダイゼーション、その後の65〜70℃、0.3×SSCでの洗浄を挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory(1989)に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。
LRR-RLK遺伝子
本発明においてLRR-RLK遺伝子は、ロイシンリッチリピート構造を有する受容体様キナーゼをコードする遺伝子からなり、At3g28450遺伝子、At1g27190遺伝子及びAt1g69990遺伝子を含む第２グループ、又はAt3g47570遺伝子、At3g47580遺伝子、At3g47090遺伝子、At3g47110遺伝子、At5g20480遺伝子及びAt5g39390遺伝子を含む第３グループから選ばれる。
本発明においてLRR-RLK遺伝子は、ロイシンリッチリピート構造を有する受容体様キナーゼをコードする遺伝子からなり、At3g28450遺伝子、At1g27190遺伝子及びAt1g69990遺伝子を含む第２グループ、又はAt3g47570遺伝子、At3g47580遺伝子、At3g47090遺伝子、At3g47110遺伝子、At5g20480遺伝子及びAt5g39390遺伝子を含む第３グループから選ばれる。
ここで、第２グループとは、後述する実施例で示すように、植物に導入することで当該植物の塩ストレス耐性を向上できたAt1g69990遺伝子に対して機能的に等価若しくは同等であると評価される遺伝子群から構成されるグループを意味する。また、第３グループとは、後述する実施例で示すように、植物に導入することで当該植物の塩ストレス耐性を向上できたAg5g39390遺伝子に対して機能的に等価若しくは同等であると評価される遺伝子群から構成されるグループを意味する。At1g69990遺伝子又はAg5g39390遺伝子に対して機能的に等価若しくは同等であると評価される遺伝子群は、例えば、SALAD Databaseを使用することによって検索・同定することができる。
より具体的に、シロイヌナズナにおいて、第２グループに含まれるLRR-RLK遺伝子としては、At3g28450遺伝子、At1g27190遺伝子及びAt1g69990遺伝子が挙げられ、本発明ではこれら遺伝子群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子を導入するか、内在する遺伝子の発現制御領域を改変する。なかでも、導入対象又は発現制御領域の改変対象とする遺伝子としては、At1g27190遺伝子又はAt1g69990遺伝子が好ましい。特に本発明においては、At1g69990遺伝子を導入するか、内在するAt1g69990遺伝子の発現制御領域を改変することがより好ましい。
一例として、At1g69990遺伝子のコーディング領域の塩基配列を配列番号３に示し、At1g69990遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号４に示す。
また、より具体的に、シロイヌナズナにおいて、第３グループに含まれるLRR-RLK遺伝子としては、At3g47570遺伝子、At3g47580遺伝子、At3g47090遺伝子、At3g47110遺伝子、At5g20480遺伝子及びAt5g39390遺伝子が挙げられ、本発明ではこれら遺伝子群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子を導入するか、内在する遺伝子の発現制御領域を改変する。なかでも、導入対象又は発現制御領域の改変対象とする遺伝子としては、At3g47110遺伝子、At5g20480遺伝子又はAt5g39390遺伝子が好ましく、At5g20480遺伝子又はAt5g39390遺伝子がより好ましい。特に本発明においては、At5g39390遺伝子を導入するか、内在するAt5g39390遺伝子の発現制御領域を改変することがより好ましい。
一例として、At5g39390遺伝子のコーディング領域の塩基配列を配列番号５に示し、At5g39390遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号６に示す。
また、本発明においては、上述したシロイヌナズナ由来のLRR-RLK遺伝子、例えばAt1g69990遺伝子やAt5g39390遺伝子と機能的に等価な遺伝子を導入するか、内在する遺伝子の発現制御領域を改変しても良い。ここで機能的に等価な遺伝子とは、例えばシロイヌナズナ以外の生物由来であって、第２グループに含まれるLRR-RLKをコードする遺伝子又は第３グループに含まれるLRR-RLKをコードする遺伝子の意味である。
上記機能的に等価な遺伝子は、特に限定されず、種々の生物に関する遺伝子配列を格納したデータベースを検索することで特定することができる。すなわち、配列番号３若しくは５に示した塩基配列又は配列番号４若しくは６に示したアミノ酸配列をクエリー配列として、例えばDDBJ/EMBL/GenBank国際塩基配列データベースやSWISS-PROTデータベースを検索し、公知のデータベースから容易に検索・同定することができる。
ここで、シロイヌナズナ以外の生物としては、何ら限定されないが、例えばイネを挙げることができる。すなわち、At1g69990遺伝子に対して機能的に等価な遺伝子としては、イネにおけるOs04g0487200遺伝子を挙げることができる。また、シロイヌナズナ及びイネ以外の植物由来であって、At1g69990遺伝子に対して機能的に等価な遺伝子としては、シトカスブルース・トウヒ（Picea sitchensis）由来の遺伝子（UniProt データベース アクセッション番号ABR16721）及びヨーロッパブドウ（Vitis vinifera）由来の遺伝子（UniProt データベース アクセッション番号CAO14859）を挙げることができる。
Os04g0487200遺伝子のコーディング領域の塩基配列を配列番号１１に示し、当該遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１２に示す。ABR16721遺伝子のコーディング領域の塩基配列を配列番号１３に示し、当該遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１４に示す。CAO14859遺伝子のコーディング領域によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１５に示す。
また、At5g39390遺伝子に対して機能的に等価な遺伝子としては、イネにおけるOs02g0215700遺伝子及び02g0215500遺伝子を挙げることができる。また、シロイヌナズナ及びイネ以外の植物由来であって、At5g39390遺伝子に対して機能的に等価な遺伝子としては、ヨーロッパブドウ（Vitis vinifera）由来の遺伝子（UniProt データベース アクセッション番号CAN83822及びCAO41339）を挙げることができる。
Os02g0215700遺伝子のコーディング領域の塩基配列を配列番号１６に示し、当該遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１７に示す。Os02g0215500遺伝子のコーディング領域の塩基配列を配列番号１８に示し、当該遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１９に示す。CAN83822遺伝子のコーディング領域の塩基配列を配列番号２０に示し、当該遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２１に示す。CAO41339遺伝子のコーディング領域の塩基配列を配列番号２２に示し、当該遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２３に示す。
なお、本発明において、LRR-RLK遺伝子としては、上述したような配列番号３、５、１１、１３、１６、１８、２０及び２２に示した塩基配列からなり、配列番号４、６、１２、１４、１５、１７、１９、２１及び２３に示したアミノ酸配列をコードするLRR-RLK遺伝子に限定されるものではない。すなわち、LRR-RLK遺伝子としては、配列番号４、６、１２、１４、１５、１７、１９、２１及び２３に示したアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸配列が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み、且つ、LRR-RLKとして機能するものであっても良い。ここで、複数個のアミノ酸としては、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１個から５個、特に好ましくは１個から３個を意味する。なお、アミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、上記LRR-RLK遺伝子をコードする塩基配列を、当該技術分野で公知の手法、すなわち、上述した「LRR-RLP遺伝子」の欄において説明した方法を適用することができる。
また、LRR-RLK遺伝子としては、上述した「LRR-RLP遺伝子」の欄における説明と同様に相同遺伝子であってもよい。また、LRR-RLK遺伝子としては、配列番号４、６、１２、１４、１５、１７、１９、２１及び２３に示したアミノ酸配列に対する類似度(Similarity)が例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上であるアミノ酸配列を有し、LRR-RLK活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を挙げることができる。ここで、類似度の値は、上述した「LRR-RLP遺伝子」の欄における説明と同様である。
さらに、LRR-RLK遺伝子としては、上述した「LRR-RLP遺伝子」の欄における説明と同様に、対象となる植物からゲノムを抽出するか或いは対象となる植物のcDNAライブラリーを構築し、配列番号３、５、１１、１３、１６、１８、２０及び２２に示した塩基配列からなるLRR-RLK遺伝子の少なくとも一部に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするゲノム領域或いはcDNAを単離することで同定することができる。ここで、ストリンジェントな条件とは、上述した「LRR-RLP遺伝子」の欄における説明と同様である。
本発明に係る植物体は、上述した第１グループに含まれるLRR-RLP遺伝子、上述した第２グループに含まれるLRR-RLK遺伝子又は上述した第３グループに含まれるLRR-RLK遺伝子を導入するか、内在する遺伝子の発現制御領域を改変することによって、塩ストレス耐性等の環境ストレス耐性が野生型と比較して有意に向上したものとなる。これら遺伝子を植物体内に導入する手法としては、植物体内で発現を可能とするプロモーターの制御下に外因性の上記遺伝子を配置した発現ベクターを導入する手法をあげることができる。内在する当該遺伝子の発現制御領域を改変する手法としては、対象とする植物体における内在性の遺伝子のプロモーターを改変する手法を挙げることができる。
一例としては、植物体内で発現を可能とするプロモーターの制御下に上述した遺伝子を配置した発現ベクターを対象の植物に導入する手法が好ましい。
発現ベクター
発現ベクターは、植物体内で発現を可能とするプロモーターと、上述したLRR-RLP遺伝子又はLRR-RLK遺伝子とを含むように構築する。発現ベクターの母体となるベクターとしては、従来公知の種々のベクターを用いることができる。例えば、プラスミド、ファージ、またはコスミド等を用いることができ、導入される植物細胞や導入方法に応じて適宜選択することができる。具体的には、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、pBluescript、pBluescriptSK、ｐＢＩ系のベクター等を挙げることができる。特に、植物体へのベクターの導入法がアグロバクテリウムを用いる方法である場合には、ｐＢＩ系のバイナリーベクターを用いることが好ましい。ｐＢＩ系のバイナリーベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＢＩＧ、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ２２１等を挙げることができる。
発現ベクターは、植物体内で発現を可能とするプロモーターと、上述したLRR-RLP遺伝子又はLRR-RLK遺伝子とを含むように構築する。発現ベクターの母体となるベクターとしては、従来公知の種々のベクターを用いることができる。例えば、プラスミド、ファージ、またはコスミド等を用いることができ、導入される植物細胞や導入方法に応じて適宜選択することができる。具体的には、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、pBluescript、pBluescriptSK、ｐＢＩ系のベクター等を挙げることができる。特に、植物体へのベクターの導入法がアグロバクテリウムを用いる方法である場合には、ｐＢＩ系のバイナリーベクターを用いることが好ましい。ｐＢＩ系のバイナリーベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＢＩＧ、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ２２１等を挙げることができる。
プロモーターは、植物体内で上記遺伝子を発現させることが可能なプロモーターであれば特に限定されるものではなく、公知のプロモーターを好適に用いることができる。かかるプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ）、各種アクチン遺伝子プロモーター、各種ユビキチン遺伝子プロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター、タバコのＰＲ１ａ遺伝子プロモーター、トマトのリブロース１，５−二リン酸カルボキシラーゼ・オキシダーゼ小サブユニット遺伝子プロモーター、ナピン遺伝子プロモーター等を挙げることができる。この中でも、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、アクチン遺伝子プロモーター又はユビキチン遺伝子プロモーターをより好ましく用いることができる。上記各プロモーターを用いれば、植物細胞内に導入されたときに任意の遺伝子を強く発現させることが可能となる。
また、プロモーターとしては、植物における部位特異的に発現させる機能を有するものを使用することもできる。このようなプロモーターとしては、従来公知の如何なるプロモーターを使用することができる。このようなプロモーターを使用して、上記遺伝子を部位特異的に発現させることによって、上記遺伝子を発現した植物器官における環境ストレス耐性を野生型と比較して向上させることができる。
なお、発現ベクターは、プロモーター及び上記遺伝子に加えて、さらに他のＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。当該他のＤＮＡセグメントは特に限定されるものではないが、ターミネーター、選別マーカー、エンハンサー、翻訳効率を高めるための塩基配列等を挙げることができる。また、上記組換え発現ベクターは、さらにＴ−ＤＮＡ領域を有していてもよい。Ｔ−ＤＮＡ領域は特にアグロバクテリウムを用いて上記組換え発現ベクターを植物体に導入する場合に遺伝子導入の効率を高めることができる。
転写ターミネーターは転写終結部位としての機能を有していれば特に限定されるものではなく、公知のものであってもよい。例えば、具体的には、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終結領域（Ｎｏｓターミネーター）、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓの転写終結領域（ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター）等を好ましく用いることができる。この中でもＮｏｓターミネーターをより好ましく用いることできる。上記組換えベクターにおいては、転写ターミネーターを適当な位置に配置することにより、植物細胞に導入された後に、不必要に長い転写物を合成し、強力なプロモーターがプラスミドのコピー数を減少させるといった現象の発生を防止することができる。
形質転換体選別マーカーとしては、例えば薬剤耐性遺伝子を用いることができる。かかる薬剤耐性遺伝子の具体的な一例としては、例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール等に対する薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。これにより、上記抗生物質を含む培地中で生育する植物体を選択することによって、形質転換された植物体を容易に選別することができる。
翻訳効率を高めるための塩基配列としては、例えばタバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列を挙げることができる。このｏｍｅｇａ配列をプロモーターの非翻訳領域（５’ＵＴＲ）に配置させることによって、上記融合遺伝子の翻訳効率を高めることができる。このように、上記組換え発現ベクターには、その目的に応じて、さまざまなＤＮＡセグメントを含ませることができる。
組換え発現ベクターの構築方法についても特に限定されるものではなく、適宜選択された母体となるベクターに、上記プロモーター及び上記遺伝子並びに必要に応じて上記他のＤＮＡセグメントを所定の順序となるように導入すればよい。例えば、上記遺伝子とプロモーターと（必要に応じて転写ターミネーター等）とを連結して発現カセットを構築し、これをベクターに導入すればよい。発現カセットの構築では、例えば、各ＤＮＡセグメントの切断部位を互いに相補的な突出末端としておき、ライゲーション酵素で反応させることで、当該ＤＮＡセグメントの順序を規定することが可能となる。なお、発現カセットにターミネーターが含まれる場合には、上流から、プロモーター、上記遺伝子、ターミネーターの順となっていればよい。また、発現ベクターを構築するための試薬類、すなわち制限酵素やライゲーション酵素等の種類についても特に限定されるものではなく、市販のものを適宜選択して用いればよい。
また、上記発現ベクターの増殖方法（生産方法）も特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。一般的には大腸菌をホストとして当該大腸菌内で増殖させればよい。このとき、ベクターの種類に応じて、好ましい大腸菌の種類を選択してもよい。
形質転換
上述した発現ベクターは、一般的な形質転換方法によって対象の植物内に導入される。発現ベクターを植物細胞に導入する方法（形質転換方法）は特に限定されるものではなく、植物細胞に応じた適切な従来公知の方法を用いることができる。具体的には、例えば、アグロバクテリウムを用いる方法や直接植物細胞に導入する方法を用いることができる。アグロバクテリウムを用いる方法としては、例えば、Bechtold, E., Ellis, J. and Pelletier, G. (1993) In Planta Agrobacterium-mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis plants. C.R. Acad. Sci. Paris Sci. Vie, 316, 1194-1199. あるいは、Zyprian E, Kado Cl, Agrobacterium-mediated plant transformation by novel mini-T vectors in conjunction with a high-copy vir region helper plasmid. Plant Molecular Biology, 1990, 15(2), 245-256.に記載された方法を用いることができる。
上述した発現ベクターは、一般的な形質転換方法によって対象の植物内に導入される。発現ベクターを植物細胞に導入する方法（形質転換方法）は特に限定されるものではなく、植物細胞に応じた適切な従来公知の方法を用いることができる。具体的には、例えば、アグロバクテリウムを用いる方法や直接植物細胞に導入する方法を用いることができる。アグロバクテリウムを用いる方法としては、例えば、Bechtold, E., Ellis, J. and Pelletier, G. (1993) In Planta Agrobacterium-mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis plants. C.R. Acad. Sci. Paris Sci. Vie, 316, 1194-1199. あるいは、Zyprian E, Kado Cl, Agrobacterium-mediated plant transformation by novel mini-T vectors in conjunction with a high-copy vir region helper plasmid. Plant Molecular Biology, 1990, 15(2), 245-256.に記載された方法を用いることができる。
発現ベクターを直接植物細胞に導入する方法としては、例えば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、ポリエチレングリコール法、パーティクルガン法、プロトプラスト融合法、リン酸カルシウム法等を用いることができる。
また、DNAを直接植物細胞に導入する方法を採るなら、対象とする遺伝子の発現に必要な転写ユニット、例えばプロモーターや転写ターミネーターと、対象とする遺伝子を含んだDNAであれば十分であり、ベクター機能が必須ではない。さらに、転写ユニットを有さない対象とする遺伝子のタンパク質コード領域のみを含むDNAであっても、宿主の転写ユニット内にインテグレートし、対象となる遺伝子を発現することができればよい。
上記発現ベクターや、発現ベクターを含まず対象となる遺伝子を含んだ発現カセットが導入される植物細胞としては、例えば、花、葉、根等の植物器官における各組織の細胞、カルス、懸濁培養細胞等を挙げることができる。ここで、発現ベクターは、生産しようとする種類の植物体に合わせて適切なものを適宜構築してもよいが、汎用的な発現ベクターを予め構築しておき、それを植物細胞に導入してもよい。
発現ベクターの導入対象となる植物、換言すると環境ストレス耐性を向上させる植物としては、特に限定されない。すなわち、上記遺伝子を発現させることによって、あらゆる植物体について環境ストレス耐性向上効果を期待することができる。対象となる植物としては、例えば、双子葉植物、単子葉植物、例えばアブラナ科、イネ科、ナス科、マメ科、ヤナギ科等に属する植物（下記参照）が挙げられるが、これらの植物に限定されるものではない。
アブラナ科：シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、アブラナ（Brassica rapa、Brassica napus、Brassica campestris）、キャベツ(Brassica oleracea var. capitata)、ハクサイ（Brassica rapa var. pekinensis）、チンゲンサイ（Brassica rapa var. chinensis）、カブ（Brassica rapa var. rapa）、ノザワナ（Brassica rapa var. hakabura）、ミズナ（Brassica rapa var. lancinifolia）、コマツナ（Brassica rapa var. peruviridis）、パクチョイ（Brassica rapa var. chinensis）、ダイコン（Raphanus sativus）、ワサビ（Wasabia japonica）など。
ナス科：タバコ（Nicotiana tabacum）、ナス(Solanum melongena)、ジャガイモ（Solaneum tuberosum）、トマト（Lycopersicon lycopersicum）、トウガラシ（Capsicum annuum）、ペチュニア（Petunia）など。
マメ科：ダイズ(Glycine max)、エンドウ（Pisum sativum）、ソラマメ（Vicia faba）、フジ（Wisteria floribunda）、ラッカセイ（Arachis hypogaea）、ミヤコグサ（Lotus corniculatus var. japonicus）、インゲンマメ（Phaseolus vulgaris）、アズキ（Vigna angularis）、アカシア（Acacia）など。
キク科：キク（Chrysanthemum morifolium）、ヒマワリ（Helianthus annuus）など。
ヤシ科：アブラヤシ（Elaeis guineensis、Elaeis oleifera）、ココヤシ（Cocos nucifera）、ナツメヤシ（Phoenix dactylifera）、ロウヤシ（Copernicia）など。
ウルシ科：ハゼノキ（Rhus succedanea）、カシューナットノキ（Anacardium occidentale）、ウルシ（Toxicodendron vernicifluum）、マンゴー（Mangifera indica）、ピスタチオ（Pistacia vera）など。
ウリ科：カボチャ（Cucurbita maxima、Cucurbita moschata、Cucurbita pepo）、キュウリ（Cucumis sativus）、カラスウリ（Trichosanthes cucumeroides）、ヒョウタン（Lagenaria siceraria var. gourda）など。
バラ科：アーモンド（Amygdalus communis）、バラ（Rosa）、イチゴ（Fragaria）、サクラ（Prunus）、リンゴ（Malus pumila var. domestica）など。
ナデシコ科：カーネーション（Dianthus caryophyllus）など。
ヤナギ科：ポプラ(Populus trichocarpa、Populus nigra、Populus tremula) など。
イネ科：トウモロコシ(Zea mays)、イネ(Oryza sativa)、オオムギ（Hordeum vulgare）、コムギ（Triticum aestivum）、タケ（Phyllostachys）、サトウキビ（Saccharum officinarum）、ネピアグラス（Pennisetum pupureum）、エリアンサス（Erianthus ravenae）、ミスキャンタス（ススキ）（Miscanthus virgatum）、ソルガム（Sorghum）スイッチグラス（Panicum）など。
ユリ科：チューリップ（Tulipa）、ユリ（Lilium）など。
アブラナ科：シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、アブラナ（Brassica rapa、Brassica napus、Brassica campestris）、キャベツ(Brassica oleracea var. capitata)、ハクサイ（Brassica rapa var. pekinensis）、チンゲンサイ（Brassica rapa var. chinensis）、カブ（Brassica rapa var. rapa）、ノザワナ（Brassica rapa var. hakabura）、ミズナ（Brassica rapa var. lancinifolia）、コマツナ（Brassica rapa var. peruviridis）、パクチョイ（Brassica rapa var. chinensis）、ダイコン（Raphanus sativus）、ワサビ（Wasabia japonica）など。
ナス科：タバコ（Nicotiana tabacum）、ナス(Solanum melongena)、ジャガイモ（Solaneum tuberosum）、トマト（Lycopersicon lycopersicum）、トウガラシ（Capsicum annuum）、ペチュニア（Petunia）など。
マメ科：ダイズ(Glycine max)、エンドウ（Pisum sativum）、ソラマメ（Vicia faba）、フジ（Wisteria floribunda）、ラッカセイ（Arachis hypogaea）、ミヤコグサ（Lotus corniculatus var. japonicus）、インゲンマメ（Phaseolus vulgaris）、アズキ（Vigna angularis）、アカシア（Acacia）など。
キク科：キク（Chrysanthemum morifolium）、ヒマワリ（Helianthus annuus）など。
ヤシ科：アブラヤシ（Elaeis guineensis、Elaeis oleifera）、ココヤシ（Cocos nucifera）、ナツメヤシ（Phoenix dactylifera）、ロウヤシ（Copernicia）など。
ウルシ科：ハゼノキ（Rhus succedanea）、カシューナットノキ（Anacardium occidentale）、ウルシ（Toxicodendron vernicifluum）、マンゴー（Mangifera indica）、ピスタチオ（Pistacia vera）など。
ウリ科：カボチャ（Cucurbita maxima、Cucurbita moschata、Cucurbita pepo）、キュウリ（Cucumis sativus）、カラスウリ（Trichosanthes cucumeroides）、ヒョウタン（Lagenaria siceraria var. gourda）など。
バラ科：アーモンド（Amygdalus communis）、バラ（Rosa）、イチゴ（Fragaria）、サクラ（Prunus）、リンゴ（Malus pumila var. domestica）など。
ナデシコ科：カーネーション（Dianthus caryophyllus）など。
ヤナギ科：ポプラ(Populus trichocarpa、Populus nigra、Populus tremula) など。
イネ科：トウモロコシ(Zea mays)、イネ(Oryza sativa)、オオムギ（Hordeum vulgare）、コムギ（Triticum aestivum）、タケ（Phyllostachys）、サトウキビ（Saccharum officinarum）、ネピアグラス（Pennisetum pupureum）、エリアンサス（Erianthus ravenae）、ミスキャンタス（ススキ）（Miscanthus virgatum）、ソルガム（Sorghum）スイッチグラス（Panicum）など。
ユリ科：チューリップ（Tulipa）、ユリ（Lilium）など。
なかでも、サトウキビやトウモロコシ、ナタネ、ヒマワリ等のバイオ燃料の原料となりうるエネルギー作物を対象とすることが好ましい。エネルギー作物の環境ストレス耐性を向上させることによって、当該エネルギー作物の栽培範囲や栽培条件を大幅に拡張することができる。すなわち、野生型では栽培が不可能であった土地や環境要因下（例えば平均気温や、土壌に含まれる塩濃度等）においても、エネルギー作物を栽培することが可能となり、バイオエタノール、バイオディーゼル、バイオメタノール、バイオDME、バイオGTL(BTL)及びバイオブタノール等のバイオ燃料の低コスト化を実現できるからである。
また、上述したように、本発明で使用可能なLRR-RLP遺伝子やLRR-RLK遺伝子は、種々の植物から単離して使用することができ、環境ストレス耐性を向上させる対象の植物の種類に応じて、適宜選択して用いることができる。すなわち、対象の植物が単子葉植物である場合には、LRR-RLP遺伝子やLRR-RLK遺伝子として単子葉植物から単離したものを導入することが好ましい。特に、対象の植物がイネである場合には、イネ由来のLRR-RLP遺伝子（配列番号７）やLRR-RLK遺伝子（配列番号１１、１６及び１８）を導入することが好ましい。
なお、本発明においては、対象の植物が単子葉植物であったとしても、双子葉植物由来のLRR-RLP遺伝子やLRR-RLK遺伝子を導入しても良い。すなわち、例えば、シロイヌナズナ由来のLRR-RLP遺伝子やLRR-RLK遺伝子は、双子葉植物に限らず、広く単子葉植物に分類される植物に導入してもよい。
その他の工程、その他の方法
上述した形質転換処理後、植物体のなかから適切な形質転換体を選抜する選抜工程を、従来公知の方法で行うことができる。選抜の方法は特に限定されるものではなく、例えば、ハイグロマイシン耐性等の薬剤耐性を基準として選抜してもよいし、形質転換体を育成した後に、植物体そのもの、または任意の器官や組織における環境ストレス耐性が有意に向上しているものを選抜してもよい。
上述した形質転換処理後、植物体のなかから適切な形質転換体を選抜する選抜工程を、従来公知の方法で行うことができる。選抜の方法は特に限定されるものではなく、例えば、ハイグロマイシン耐性等の薬剤耐性を基準として選抜してもよいし、形質転換体を育成した後に、植物体そのもの、または任意の器官や組織における環境ストレス耐性が有意に向上しているものを選抜してもよい。
また、形質転換処理で得られた形質転換植物から定法に従って後代植物を得ることができる。上記LRR-RLP遺伝子やLRR-RLK遺伝子が導入された形質を保持した後代植物を、その環境ストレス耐性を基準として選抜することによって、上記形質を有することで環境ストレス耐性が向上した安定的な植物系統を作出することができる。なお、形質転換植物やその子孫から、植物細胞や種子、果実、株、カルス、塊茎、切穂、塊等の繁殖材料を得て、これらを基に上記形質を有することで環境ストレス耐性が向上した安定的な植物系統を量産することも可能である。
なお、本発明における植物体とは、成育した植物個体、植物細胞、植物組織、カルス、種子の少なくとも何れかを含むものを指す。つまり、本発明では、最終的に植物個体まで成育させることができる状態のものであれば、全て植物体とみなす。また、上記植物細胞には、種々の形態の植物細胞が含まれる。かかる植物細胞としては、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片等が含まれる。これらの植物細胞を増殖・分化させることにより植物体を得ることができる。なお、植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて、従来公知の方法を用いて行うことができる。
以上説明したように、本発明によれば、上述したLRR-RLP遺伝子やLRR-RLK遺伝子を植物体に導入するか、内在するこれら遺伝子の発現制御領域を改変することで、野生型の植物体と比較して、塩ストレス耐性などの環境ストレス耐性が向上した植物体を提供することができる。
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕1．材料および方法
1−1．実験材料
実験材料にはシロイヌナズナ変異体（Activation-tag T-DNA lines: Weigel T-DNS lines、計20072系統）の種子を用いた。なお、種子はNottingham Arabidopsis Stock Centre(NASC) より購入した。実験材料として使用した種子についてはWeigel, D., et al., Plant Physiol., 122, 1003-1013 (2000)を参考とすることができる。
1−1．実験材料
実験材料にはシロイヌナズナ変異体（Activation-tag T-DNA lines: Weigel T-DNS lines、計20072系統）の種子を用いた。なお、種子はNottingham Arabidopsis Stock Centre(NASC) より購入した。実験材料として使用した種子についてはWeigel, D., et al., Plant Physiol., 122, 1003-1013 (2000)を参考とすることができる。
1−2．方法
1−2−1．塩耐性変異体の選抜
Weigel T-DNA linesの種子を、NaCl 125 mMあるいは150 mMを含む改変MS寒天（1%）培地〔B5培地のビタミン、ショ糖10 g/l、寒天（細菌培地用；和光純薬工業社製）8 g/L〕に無菌播種し、22℃、30〜100μmol/m2/secの照明下（16時間明期/8時間暗期のサイクル）で培養した。播種後2〜4週間後、塩耐性変異体候補を選抜した。なお、MS培地はMurashige, T. et al. (1962) Physiol. Plant., 15, 473-497を参照する。また、B5培地についてはGamborg, O.L. et al. (1968) Experimental Cell Research, 50, 151-158を参照する。
1−2−1．塩耐性変異体の選抜
Weigel T-DNA linesの種子を、NaCl 125 mMあるいは150 mMを含む改変MS寒天（1%）培地〔B5培地のビタミン、ショ糖10 g/l、寒天（細菌培地用；和光純薬工業社製）8 g/L〕に無菌播種し、22℃、30〜100μmol/m2/secの照明下（16時間明期/8時間暗期のサイクル）で培養した。播種後2〜4週間後、塩耐性変異体候補を選抜した。なお、MS培地はMurashige, T. et al. (1962) Physiol. Plant., 15, 473-497を参照する。また、B5培地についてはGamborg, O.L. et al. (1968) Experimental Cell Research, 50, 151-158を参照する。
1−2−2．DNA調製
選抜した耐塩性シロイヌナズナ系統のゲノムへのT-DNA挿入部位を、TAIL-PCR法により決定した。まず、栽培したシロイヌナズナから幼葉を採取し、液体窒素凍結下で粉砕した。QIAGEN社製DNA調製キット（DNeasy Plant Mini Kit）を用いてキット添付の標準プロトコルに従ってDNAを調製した。
選抜した耐塩性シロイヌナズナ系統のゲノムへのT-DNA挿入部位を、TAIL-PCR法により決定した。まず、栽培したシロイヌナズナから幼葉を採取し、液体窒素凍結下で粉砕した。QIAGEN社製DNA調製キット（DNeasy Plant Mini Kit）を用いてキット添付の標準プロトコルに従ってDNAを調製した。
1−2−3．TAIL-PCR法及びT-DNA挿入部位の推定
Weigel T-DNA linesで用いられているアクティベーションタギング用ベクター（pSKI015 : GenBank accession No.AF187951）の左のT-DNA配列（T-DNA left border）付近に3種類の特異的プライマーTL1、TL2及びTL3を設定し、任意プライマーP1を用いて、以下のPCR反応液及び反応条件下でTAIL-PCR（島本功、佐々木卓治監修, 新版, 植物のPCR実験プロトコル, 2000, 83-89pp, 秀潤社, 東京、Genomics, 25, 674-681, 1995、 Plant J., 8, 457-463, 1995）を行い、T-DNAに隣接するゲノムDNAを増幅した。
Weigel T-DNA linesで用いられているアクティベーションタギング用ベクター（pSKI015 : GenBank accession No.AF187951）の左のT-DNA配列（T-DNA left border）付近に3種類の特異的プライマーTL1、TL2及びTL3を設定し、任意プライマーP1を用いて、以下のPCR反応液及び反応条件下でTAIL-PCR（島本功、佐々木卓治監修, 新版, 植物のPCR実験プロトコル, 2000, 83-89pp, 秀潤社, 東京、Genomics, 25, 674-681, 1995、 Plant J., 8, 457-463, 1995）を行い、T-DNAに隣接するゲノムDNAを増幅した。
プライマーTL1、TL2、TL3及びP1の具体的な配列は以下の通りである。
TL1: 5'-TGC TTT CGC CAT TAA ATA GCG ACG G-3‘（配列番号４４）
TL2: 5'-CGC TGC GGA CAT CTA CAT TTT TG-3‘（配列番号４５）
TL3: 5'-TCC CGG ACA TGA AGC CAT TTA C-3'（配列番号４６）
P1: 5'-NGT CGA SWG ANA WGA A-3‘（配列番号４７）
TL1: 5'-TGC TTT CGC CAT TAA ATA GCG ACG G-3‘（配列番号４４）
TL2: 5'-CGC TGC GGA CAT CTA CAT TTT TG-3‘（配列番号４５）
TL3: 5'-TCC CGG ACA TGA AGC CAT TTA C-3'（配列番号４６）
P1: 5'-NGT CGA SWG ANA WGA A-3‘（配列番号４７）
なお、配列番号４７において、nは、a、g、c又はtを表し(存在位置：1及び11)、またsは、g又はcを表し(存在位置：7)、さらにwは、a又はtを表す(存在位置：8及び13)。
１回目のPCR反応液組成及び反応条件をそれぞれ表１及び表２に示す。
１回目のPCR反応液組成及び反応条件をそれぞれ表１及び表２に示す。
２回目のPCR反応液組成及び反応条件をそれぞれ表３及び表４に示す。
３回目のPCR反応液組成及び反応条件をそれぞれ表５及び表６に示す。
次いで、2回目と3回目の反応産物をアガロースゲルで電気泳動した後、増幅の有無と反応産物の特異性を確認した。また、3回目の増幅産物は、特異的プライマーTL3を用いて、直接BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit Ver.3.1（アプライドバイオシステム社製）でシーケンス反応を行い、ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer（アプライドバイオシステム社製）によって塩基配列の決定を行った。
その結果、５種類の塩基配列を決定した。すなわち、538bpの配列情報、311bpの配列情報、498bpの配列情報、633bpの配列情報及び245bpの配列情報が得られた。得られた配列情報を、順に配列番号４８〜５２に示した。
これら得られた配列情報を用いて、The Arabidopsis Information Resource（TAIR：http://www.arabidopsis.org/）のBLASTにより検索したところ、T-DNA挿入部位は、それぞれ順に、シロイヌナズナ１番染色体の遺伝子〔AGI（The Arabidopsis Genome Initiative gene code）コード：At1g69990〕と遺伝子〔AGI（The Arabidopsis Genome Initiative gene code）コード：At1g70000〕間、シロイヌナズナ5番染色体の遺伝子〔AGI（The Arabidopsis Genome Initiative gene code）コード：At5g39400〕、シロイヌナズナ3番染色体の遺伝子〔AGI（The Arabidopsis Genome Initiative gene code）コード：At3g05630〕、シロイヌナズナ2番染色体の遺伝子〔AGI（The Arabidopsis Genome Initiative gene code）コード：At2g33110〕及びシロイヌナズナ１番染色体の遺伝子〔AGI（The Arabidopsis Genome Initiative gene code）コード：At1g71810〕と遺伝子〔AGI（The Arabidopsis Genome Initiative gene code）コード：At1g71820〕間と判明した。
1−2−4．活性化されている遺伝子の予測
アクティベートされている遺伝子を、1−2−3．により判明した各々のT-DNA挿入部位（At1g69990とAt1g70000間、At5g39400、At3g05630、At2g33110及びAt1g71810とAt1g71820間）近傍10Kb以内に存在する推定Open reading frame(ORF)遺伝子の配列から予測した。
アクティベートされている遺伝子を、1−2−3．により判明した各々のT-DNA挿入部位（At1g69990とAt1g70000間、At5g39400、At3g05630、At2g33110及びAt1g71810とAt1g71820間）近傍10Kb以内に存在する推定Open reading frame(ORF)遺伝子の配列から予測した。
1−2−5．予測した遺伝子の取得
1−2−4．でアクティベート（活性化）されていると予測した、LRR-RLK（leucine-rich repeat receptor-like protein kinase ）遺伝子 (At1g69990)、LRR-RLK（leucine- rich repeat receptor-like protein kinase）遺伝子 (At5g39390)、LRR（leucine-rich repeat）タンパク質遺伝子(At3g05650)及びLRR（leucine-rich repeat）タンパク質遺伝子(At2g33080)のORF領域を含む断片を増幅するために、TAIR（http://www.arabidopsis.org/home.html）で公開されている配列情報を基にしてそれぞれ一対のプライマーを設計・合成した（表７）。なお、これら一対のプライマーには、発現ベクターへ導入するときに必要となる制限酵素サイトを付加するように設計した（表７）。
1−2−4．でアクティベート（活性化）されていると予測した、LRR-RLK（leucine-rich repeat receptor-like protein kinase ）遺伝子 (At1g69990)、LRR-RLK（leucine- rich repeat receptor-like protein kinase）遺伝子 (At5g39390)、LRR（leucine-rich repeat）タンパク質遺伝子(At3g05650)及びLRR（leucine-rich repeat）タンパク質遺伝子(At2g33080)のORF領域を含む断片を増幅するために、TAIR（http://www.arabidopsis.org/home.html）で公開されている配列情報を基にしてそれぞれ一対のプライマーを設計・合成した（表７）。なお、これら一対のプライマーには、発現ベクターへ導入するときに必要となる制限酵素サイトを付加するように設計した（表７）。
またLRR-RLK（leucine-rich repeat receptor-like protein kinase ）遺伝子(At1g71830)のORF領域を含む断片を増幅するために、TAIR（http://www.arabidopsis.org/home.html）で公開されている配列情報を基にしてそれぞれ三組のプライマーを設計・合成した（表８）。なお、これら三組のプライマーの内、Forward１とReverse３のプライマーには、発現ベクターへ導入するときに必要となる制限酵素サイトを付加するように設計した（表８）。
1−2−2．記載の方法に従って、野生型シロイヌナズナ、Col-0エコタイプから鋳型DNAを調製した。酵素としてTakara Ex Taq（タカラバイオ社製）、Platinum Pfx DNA Polymerase（Invitrogen社製）又はPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（NEW ENGLAND BioLabs：NEB社製）、プライマーとして、表７に示した一対のプライマーを用いた。PCRの反応液組成、および反応条件は、各酵素に添付のプロトコルに従った。またLRR-RLK遺伝子(At1g71830)については、表８に示した三組のプライマー、酵素としてPlatinum Pfx DNA Polymerase（Invitrogen社製）を用いてPCRを行い、三組のPCR増幅産物を得た。各PCR増幅産物を2％アガロースゲル（TAEバッファー）で電気泳動し、エチジウムブロマイドにより断片を染色した。目的断片を含むゲルをメスで切り出し、 GFX PCR DNA and GEL Band Purification Kit （Amersham社製）を用いて目的のDNA断片を溶出・精製した。その３DNA断片を鋳型に、またプライマーとしてForward１とReverse３を用いて、オーバーラップPCRを行った。
各PCR増幅産物を、上記と同様にアガロースゲルで電気泳動後、切り出し精製した。得られたDNA断片に、A-Ａddition Kit（QIAGEN社製）を用いてにアデニンを付加した。アデニンを付加した増幅DNAを、TOPO TA Cloning Kit（Invitrogen社製）を用いて、TA-Cloning用pCR2.1ベクターにライゲーション後、キット添付のコンピテントセル（E.coli TOP 10）に形質転換した。形質転換後、50μl/mlのカナマイシンを添加したLB培地で培養し、形質転換体を選抜した。出現したコロニーを50μl/mlのカナマイシンを添加したLB培地で液体培養し、得られた菌体からQIAGEN 社製Plasmid Mini Kitを用いてプラスミドDNA を調製した。
得られたLRR-RLK遺伝子 (At1g69990)のORFを含む断片をクローニングしたベクター、LRR-RLK遺伝子 (At5g39390)のORFを含む断片をクローニングしたベクター、LRR（タンパク質遺伝子(At3g05650)のORFを含む断片をクローニングしたベクター、LRRタンパク質遺伝子(At2g33080)のORFを含む断片をクローニングしたベクター及びLRR-RLK遺伝子(At1g71830)のORFを含む断片をクローニングしたベクターの塩基配列決定及び配列解析をそれぞれ行った。
1−2−6．植物発現用ベクターの作製
タバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列を含む植物発現用ベクターpBI121に、LRR-RLK遺伝子(At1g69990)、LRR-RLK遺伝子(At5g39390)、LRRタンパク質遺伝子(At3g05650)、LRRタンパク質遺伝子(At2g33080)、LRR-RLK遺伝子(At1g71830)のORFを含む断片を挿入したコンストラクトの作製を行った。
タバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列を含む植物発現用ベクターpBI121に、LRR-RLK遺伝子(At1g69990)、LRR-RLK遺伝子(At5g39390)、LRRタンパク質遺伝子(At3g05650)、LRRタンパク質遺伝子(At2g33080)、LRR-RLK遺伝子(At1g71830)のORFを含む断片を挿入したコンストラクトの作製を行った。
まず、1−2−5．でLRR-RLK遺伝子 (At1g69990)のORFを含む断片をクローニングしたpCR2.1ベクターを、制限酵素Sal I及びBsrG Iで処理した。
次に、同様にｏｍｅｇａ配列を含むpBI121を制限酵素Sal I及びBsrG Iで処理した。これら制限酵素消化産物について0.8％アガロースゲル電気泳動を行い、GFX PCR DNA and GEL Band Purification Kit（Amersham）を用いて、ゲルより約1850bpのLRR-RLK遺伝子(At1g69990)のORFを含む断片及びｏｍｅｇａ配列を含むpBI121を、それぞれ分取・精製した。
ｏｍｅｇａ配列を含むpBI121の断片をベクターとしてLRR-RLK遺伝子 (At1g69990)のORFを含む断片を導入するため、ベクター：インサート比が1：10になるように混合し、等量のTaKaRa Ligation Kit ver.2（タカラバイオ社製）を用いて16℃で一晩ライゲーション反応を行った。
反応液の全量を100μlのコンピテントセル（E.coli strain DH5α，TOYOBO）に添加し、キット添付のプロトコルに従って形質転換を行った。50μg/mlのカナマイシンを含むLB寒天培地に塗布し一晩培養し、出現したコロニーを50μg/mlのカナマイシンを添加したLB培地で液体培養し、得られた菌体からPlasmid Mini Kit（QIAGEN社製）を用いてプラスミドDNAを調製した。
得られたLRR-RLK遺伝子 (At1g69990)のORFを含む断片をサブクローニングした発現ベクターの塩基配列決定および配列解析を行った。
なお、LRR-RLK遺伝子 (At5g39390)、LRRタンパク質遺伝子(At2g33080)及びLRR-RLK遺伝子(At1g71830)については、上述した方法に準じて発現ベクターに組み込み、塩基配列決定及び配列解析を行った。LRRタンパク質遺伝子(At3g05650)については、TA-Cloning用pCR2.1ベクターにクローニング後、制限酵素Sal Iで処理後、DNA Blunting Kit （タカラバイオ社製）を用いて平滑末端化し、フェノールクロロフォルム処理後、制限酵素BsrG Iで処理した。同様にｏｍｅｇａ配列を含むpBI121を制限酵素Sal Iで処理後、DNA Blunting Kit （タカラバイオ社製）を用いて平滑末端化し、フェノールクロロフォルム処理後、制限酵素BsrG Iで処理した。上述した方法に準じて発現ベクターに組み込み、塩基配列決定及び配列解析を行った。
1−2−7．アグロバクテリウム法を用いたシロイヌナズナへの遺伝子導入
1−2−6．で作製した各植物発現用ベクターをエレクトロポレーション法（Plant Molecular Biology Manual, Second Edition , B. G. Stanton A. S. Robbert, Kluwer Acdemic Publishers 1994）により、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）C58C1株に導入した。次いで植物発現用ベクターが導入されたアグロバクテリウム・ツメファシエンスを、Cloughらにより記載された浸潤法（Plant J., 16, 735-743, 1998）により、野生型シロイヌナズナ エコタイプCol-0に導入した。
カナマイシン含有培地で形質転換体を選抜し、自家受粉によりT2世代の植物を作製した。
1−2−6．で作製した各植物発現用ベクターをエレクトロポレーション法（Plant Molecular Biology Manual, Second Edition , B. G. Stanton A. S. Robbert, Kluwer Acdemic Publishers 1994）により、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）C58C1株に導入した。次いで植物発現用ベクターが導入されたアグロバクテリウム・ツメファシエンスを、Cloughらにより記載された浸潤法（Plant J., 16, 735-743, 1998）により、野生型シロイヌナズナ エコタイプCol-0に導入した。
カナマイシン含有培地で形質転換体を選抜し、自家受粉によりT2世代の植物を作製した。
1−2−8．形質転換体の表現形の確認
耐塩性試験：
1−2−7．で作製した各々の種子と、対象として非組換えの野生型シロイヌナズナの種子を、150mM NaClを含むＭＳ寒天培地に無菌播種した。これを22℃、16時間明期8時間暗期、光強度約30〜45μE/cm2で10日間培養し、塩耐性試験を行った。
耐塩性試験：
1−2−7．で作製した各々の種子と、対象として非組換えの野生型シロイヌナズナの種子を、150mM NaClを含むＭＳ寒天培地に無菌播種した。これを22℃、16時間明期8時間暗期、光強度約30〜45μE/cm2で10日間培養し、塩耐性試験を行った。
2．結果
上記1−2−8．の耐塩性試験結果として、野生型、LRR-RLK遺伝子(At1g69990)、LRR-RLK遺伝子(At5g39390)、LRR-RLP遺伝子(At3g05650)、LRR-RLP遺伝子(At2g33080)及びLRR-RLK遺伝子(At1g71830)のORFを含む断片を導入した形質転換植物体のプレートを撮影した写真を図１〜図５に示した。図１、図２及び図４から、LRR-RLK遺伝子(At1g69990)、LRR-RLK遺伝子(At5g39390)及びLRR-RLP遺伝子(At2g33080)のORFを含む断片を導入した形質転換植物体では、高塩濃度培地において発芽、生育しており野生型と比較して耐塩性が向上していることが明らかとなった。
上記1−2−8．の耐塩性試験結果として、野生型、LRR-RLK遺伝子(At1g69990)、LRR-RLK遺伝子(At5g39390)、LRR-RLP遺伝子(At3g05650)、LRR-RLP遺伝子(At2g33080)及びLRR-RLK遺伝子(At1g71830)のORFを含む断片を導入した形質転換植物体のプレートを撮影した写真を図１〜図５に示した。図１、図２及び図４から、LRR-RLK遺伝子(At1g69990)、LRR-RLK遺伝子(At5g39390)及びLRR-RLP遺伝子(At2g33080)のORFを含む断片を導入した形質転換植物体では、高塩濃度培地において発芽、生育しており野生型と比較して耐塩性が向上していることが明らかとなった。
しかし、図３及び図５に示すように、LRR-RLP遺伝子(At3g05650)及びLRR-RLK遺伝子(At1g71830)のORFを含む断片を導入した形質転換植物体では、はっきりした耐塩性の向上は見られなかった。
Claims (63)
- At5g40170、At2g25440、At2g32680、At3g24900、At3g25020、At3g25010、At2g33020、At2g33080、At2g32660、At2g33050及びAt2g33060を含む第１グループから選ばれるロイシンリッチリピート構造を有する受容体様タンパク質をコードする遺伝子、At3g28450、At1g27190及びAt1g69990を含む第２グループから選ばれるロイシンリッチリピート構造を有する受容体様キナーゼをコードする遺伝子、及びAt3g47570、At3g47580、At3g47090、At3g47110、At5g20480及びAt5g39390を含む第３グループから選ばれるロイシンリッチリピート構造を有する受容体様キナーゼをコードする遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を導入した、又は内在する当該遺伝子の発現制御領域を改変した植物体。
- 上記第１グループから選ばれるロイシンリッチリピート構造を有する受容体様タンパク質をコードする遺伝子は、At5g40170、At2g25440、At2g32680、At3g24900、At3g25020、At3g25010、At2g33020、At2g33080、At2g32660、At2g33050及びAt2g33060からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子若しくは当該遺伝子に機能的に等価な遺伝子であることを特徴とする請求項１記載の植物体。
- 上記機能的に等価な遺伝子は、シロイヌナズナ以外の生物由来のロイシンリッチリピート構造を有する受容体様タンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項２記載の植物体。
- 上記シロイヌナズナ以外の生物は、イネ（Oryza sativa）又はキャベツ（Brassiaca oleracea）であることを特徴とする請求項３記載の植物体。
- 上記第１グループから選ばれるロイシンリッチリピート構造を有する受容体様タンパク質をコードする遺伝子は、以下の（a）〜（c）のいずれかのタンパク質をコードすることを特徴とする請求項１記載の植物体。
（a）配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質
（b）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み、ロイシンリッチリピート構造を有し、受容体様活性を有するタンパク質
（c）配列番号１に示す塩基配列の相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、ロイシンリッチリピート構造を有し、受容体様活性を有するタンパク質 - 上記第２グループから選ばれるロイシンリッチリピート構造を有する受容体様キナーゼをコードする遺伝子は、At3g28450、At1g27190及びAt1g69990からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子若しくは当該遺伝子に機能的に等価な遺伝子であることを特徴とする請求項１記載の植物体。
- 上記機能的に等価な遺伝子は、シロイヌナズナ以外の生物由来のロイシンリッチリピート構造を有する受容体様キナーゼをコードする遺伝子であることを特徴とする請求項６記載の植物体。
- 上記シロイヌナズナ以外の生物は、イネ（Oryza sativa）、シトカスブルース・トウヒ（Picea sitchensis）又はヨーロッパブドウ（Vitis vinifera）であることを特徴とする請求項７記載の植物体。
- 上記第２グループから選ばれるロイシンリッチリピート構造を有する受容体様キナーゼをコードする遺伝子は、以下の（a）〜（c）のいずれかのタンパク質をコードすることを特徴とする請求項１記載の植物体。
（a）配列番号４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質
（b）配列番号４に示すアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み、ロイシンリッチリピート構造を有し、受容体様キナーゼ活性を有するタンパク質
（c）配列番号３に示す塩基配列の相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、ロイシンリッチリピート構造を有し、受容体様キナーゼ活性を有するタンパク質 - 上記第３グループから選ばれるロイシンリッチリピート構造を有する受容体様キナーゼをコードする遺伝子は、At3g47570、At3g47580、At3g47090、At3g47110、At5g20480及びAt5g39390からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子若しくは当該遺伝子に機能的に等価な遺伝子であることを特徴とする請求項１記載の植物体。
- 上記機能的に等価な遺伝子は、シロイヌナズナ以外の生物由来のロイシンリッチリピート構造を有する受容体様キナーゼをコードする遺伝子であることを特徴とする請求項１０記載の植物体。
- 上記シロイヌナズナ以外の生物は、イネ（Oryza sativa）又はヨーロッパブドウ（Vitis vinifera）であることを特徴とする請求項１１記載の植物体。
- 上記第３グループから選ばれるロイシンリッチリピート構造を有する受容体様キナーゼをコードする遺伝子は、以下の（a）〜（c）のいずれかのタンパク質をコードすることを特徴とする請求項１記載の植物体。
（a）配列番号６に示すアミノ酸配列を含むタンパク質
（b）配列番号６に示すアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み、ロイシンリッチリピート構造を有し、受容体様キナーゼ活性を有するタンパク質
（c）配列番号５に示す塩基配列の相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、ロイシンリッチリピート構造を有し、受容体様キナーゼ活性を有するタンパク質 - 双子葉植物であることを特徴とする請求項１乃至１３いずれか一項記載の植物体。
- アブラナ科植物であることを特徴とする請求項１乃至１３いずれか一項記載の植物体。
- シロイヌナズナであることを特徴とする請求項１乃至１３いずれか一項記載の植物体。
- アブラナであることを特徴とする請求項１乃至１３いずれか一項記載の植物体。
- 単子葉植物であることを特徴とする請求項１乃至１３いずれか一項記載の植物体。
- イネ科植物であることを特徴とする請求項１乃至１３いずれか一項記載の植物体。
- イネであることを特徴とする請求項１乃至１３いずれか一項記載の植物体。
- サトウキビであることを特徴とする請求項１乃至１３いずれか一項記載の植物体。
- At5g40170、At2g25440、At2g32680、At3g24900、At3g25020、At3g25010、At2g33020、At2g33080、At2g32660、At2g33050及びAt2g33060を含む第１グループから選ばれるロイシンリッチリピート構造を有する受容体様タンパク質をコードする遺伝子、At3g28450、At1g27190及びAt1g69990を含む第２グループから選ばれるロイシンリッチリピート構造を有する受容体様キナーゼをコードする遺伝子、及びAt3g47570、At3g47580、At3g47090、At3g47110、At5g20480及びAt5g39390を含む第３グループから選ばれるロイシンリッチリピート構造を有する受容体様キナーゼをコードする遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を植物体に導入する、又は植物体に内在する当該遺伝子の発現制御領域を改変することを特徴とする植物に環境ストレス耐性を付与する方法。
- 上記第１グループから選ばれるロイシンリッチリピート構造を有する受容体様タンパク質をコードする遺伝子は、At5g40170、At2g25440、At2g32680、At3g24900、At3g25020、At3g25010、At2g33020、At2g33080、At2g32660、At2g33050及びAt2g33060からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子若しくは当該遺伝子に機能的に等価な遺伝子であることを特徴とする請求項２２記載の方法。
- 上記機能的に等価な遺伝子は、シロイヌナズナ以外の生物由来のロイシンリッチリピート構造を有する受容体様タンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項２３記載の方法。
- 上記シロイヌナズナ以外の生物は、イネ（Oryza sativa）又はキャベツ（Brassiaca oleracea）であることを特徴とする請求項２４記載の方法。
- 上記第１グループから選ばれるロイシンリッチリピート構造を有する受容体様タンパク質をコードする遺伝子は、以下の（a）〜（c）のいずれかのタンパク質をコードすることを特徴とする請求項２２記載の方法。
（a）配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質
（b）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み、ロイシンリッチリピート構造を有し、受容体様活性を有するタンパク質
（c）配列番号１に示す塩基配列の相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、ロイシンリッチリピート構造を有し、受容体様活性を有するタンパク質 - 上記第２グループから選ばれるロイシンリッチリピート構造を有する受容体様キナーゼをコードする遺伝子は、At3g28450、At1g27190及びAt1g69990からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子若しくは当該遺伝子に機能的に等価な遺伝子であることを特徴とする請求項２２記載の方法。
- 上記機能的に等価な遺伝子は、シロイヌナズナ以外の生物由来のロイシンリッチリピート構造を有する受容体様キナーゼをコードする遺伝子であることを特徴とする請求項２７記載の方法。
- 上記シロイヌナズナ以外の生物は、イネ（Oryza sativa）、シトカスブルース・トウヒ（Picea sitchensis）又はヨーロッパブドウ（Vitis vinifera）であることを特徴とする請求項２８記載の方法。
- 上記第２グループから選ばれるロイシンリッチリピート構造を有する受容体様キナーゼをコードする遺伝子は、以下の（a）〜（c）のいずれかのタンパク質をコードすることを特徴とする請求項２２記載の方法。
（a）配列番号４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質
（b）配列番号４に示すアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み、ロイシンリッチリピート構造を有し、受容体様キナーゼ活性を有するタンパク質
（c）配列番号３に示す塩基配列の相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、ロイシンリッチリピート構造を有し、受容体様キナーゼ活性を有するタンパク質 - 上記第３グループから選ばれるロイシンリッチリピート構造を有する受容体様キナーゼをコードする遺伝子は、At3g47570、At3g47580、At3g47090、At3g47110、At5g20480及びAt5g39390からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子若しくは当該遺伝子に機能的に等価な遺伝子であることを特徴とする請求項２２記載の方法。
- 上記機能的に等価な遺伝子は、シロイヌナズナ以外の生物由来のロイシンリッチリピート構造を有する受容体様キナーゼをコードする遺伝子であることを特徴とする請求項３１記載の方法。
- 上記シロイヌナズナ以外の生物は、イネ（Oryza sativa）又はヨーロッパブドウ（Vitis vinifera）であることを特徴とする請求項３２記載の方法。
- 上記第３グループから選ばれるを有するロイシンリッチリピート構造を有する受容体様キナーゼをコードする遺伝子は、以下の（a）〜（c）のいずれかのタンパク質をコードすることを特徴とする請求項２２記載の方法。
（a）配列番号６に示すアミノ酸配列を含むタンパク質
（b）配列番号６に示すアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み、ロイシンリッチリピート構造を有し、受容体様キナーゼ活性を有するタンパク質
（c）配列番号５に示す塩基配列の相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、ロイシンリッチリピート構造を有し、受容体様キナーゼ活性を有するタンパク質 - 上記植物体は、双子葉植物であることを特徴とする請求項２２乃至３４いずれか一項記載の方法。
- 上記植物体は、アブラナ科植物であることを特徴とする請求項２２乃至３４いずれか一項記載の方法。
- 上記植物体は、シロイヌナズナであることを特徴とする請求項２２乃至３４いずれか一項記載の方法。
- 上記植物体は、アブラナであることを特徴とする請求項２２乃至３４いずれか一項記載の方法。
- 上記植物体は、単子葉植物であることを特徴とする請求項２２乃至３４いずれか一項記載の方法。
- 上記植物体は、イネ科植物であることを特徴とする請求項２２乃至３４いずれか一項記載の方法。
- 上記植物体は、イネであることを特徴とする請求項２２乃至３４いずれか一項記載の方法。
- 上記植物体は、サトウキビであることを特徴とする請求項２２乃至３４いずれか一項記載の方法。
- At5g40170、At2g25440、At2g32680、At3g24900、At3g25020、At3g25010、At2g33020、At2g33080、At2g32660、At2g33050及びAt2g33060を含む第１グループから選ばれるロイシンリッチリピート構造を有する受容体様タンパク質をコードする遺伝子、At3g28450、At1g27190及びAt1g69990を含む第２グループから選ばれるロイシンリッチリピート構造を有する受容体様キナーゼをコードする遺伝子、及びAt3g47570、At3g47580、At3g47090、At3g47110、At5g20480及びAt5g39390を含む第３グループから選ばれるロイシンリッチリピート構造を有する受容体様キナーゼをコードする遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を導入した、又は内在する当該遺伝子の発現制御領域を改変した形質転換植物を準備する工程と、
前記形質転換植物の後代植物の環境ストレス耐性を評価し、当該環境ストレス耐性が有意に向上した系統を選抜する工程とを含む、植物体の製造方法。 - 上記第１グループから選ばれるロイシンリッチリピート構造を有する受容体様タンパク質をコードする遺伝子は、At5g40170、At2g25440、At2g32680、At3g24900、At3g25020、At3g25010、At2g33020、At2g33080、At2g32660、At2g33050及びAt2g33060からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子若しくは当該遺伝子に機能的に等価な遺伝子であることを特徴とする請求項４３記載の製造方法。
- 上記機能的に等価な遺伝子は、シロイヌナズナ以外の生物由来のロイシンリッチリピート構造を有する受容体様タンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項４４記載の製造方法。
- 上記シロイヌナズナ以外の生物は、イネ（Oryza sativa）又はキャベツ（Brassiaca oleracea）であることを特徴とする請求項４５記載の製造方法。
- 上記第１グループから選ばれるロイシンリッチリピート構造を有する受容体様タンパク質をコードする遺伝子は、以下の（a）〜（c）のいずれかのタンパク質をコードすることを特徴とする請求項４３記載の製造方法。
（a）配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質
（b）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み、ロイシンリッチリピート構造を有し、受容体様活性を有するタンパク質
（c）配列番号１に示す塩基配列の相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、ロイシンリッチリピート構造を有し、受容体様活性を有するタンパク質 - 上記第２グループから選ばれるを有するロイシンリッチリピート構造を有する受容体様キナーゼをコードする遺伝子は、At3g28450、At1g27190及びAt1g69990からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子若しくは当該遺伝子に機能的に等価な遺伝子であることを特徴とする請求項４３記載の製造方法。
- 上記機能的に等価な遺伝子は、シロイヌナズナ以外の生物由来のロイシンリッチリピート構造を有する受容体様キナーゼをコードする遺伝子であることを特徴とする請求項４８記載の製造方法。
- 上記シロイヌナズナ以外の生物は、イネ（Oryza sativa）、シトカスブルース・トウヒ（Picea sitchensis）又はヨーロッパブドウ（Vitis vinifera）であることを特徴とする請求項４９記載の製造方法。
- 上記第２グループから選ばれるロイシンリッチリピート構造を有する受容体様キナーゼをコードする遺伝子は、以下の（a）〜（c）のいずれかのタンパク質をコードすることを特徴とする請求項４３記載の製造方法。
（a）配列番号４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質
（b）配列番号４に示すアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み、ロイシンリッチリピート構造を有し、受容体様キナーゼ活性を有するタンパク質
（c）配列番号３に示す塩基配列の相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、ロイシンリッチリピート構造を有し、受容体様キナーゼ活性を有するタンパク質 - 上記第３グループから選ばれるロイシンリッチリピート構造を有する受容体様キナーゼをコードする遺伝子は、At3g47570、At3g47580、At3g47090、At3g47110、At5g20480及びAt5g39390からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子若しくは当該遺伝子に機能的に等価な遺伝子であることを特徴とする請求項４３記載の製造方法。
- 上記機能的に等価な遺伝子は、シロイヌナズナ以外の生物由来のロイシンリッチリピート構造を有する受容体様キナーゼをコードする遺伝子であることを特徴とする請求項５２記載の製造方法。
- 上記シロイヌナズナ以外の生物は、イネ（Oryza sativa）又はヨーロッパブドウ（Vitis vinifera）であることを特徴とする請求項５３記載の製造方法。
- 上記第３グループから選ばれるロイシンリッチリピート構造を有する受容体様キナーゼをコードする遺伝子は、以下の（a）〜（c）のいずれかのタンパク質をコードすることを特徴とする請求項４３記載の製造方法。
（a）配列番号６に示すアミノ酸配列を含むタンパク質
（b）配列番号６に示すアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み、ロイシンリッチリピート構造を有し、受容体様キナーゼ活性を有するタンパク質
（c）配列番号５に示す塩基配列の相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、ロイシンリッチリピート構造を有し、受容体様キナーゼ活性を有するタンパク質 - 上記植物体は、双子葉植物であることを特徴とする請求項４３乃至５５いずれか一項記載の製造方法。
- 上記植物体は、アブラナ科植物であることを特徴とする請求項４３乃至５５いずれか一項記載の製造方法。
- 上記植物体は、シロイヌナズナであることを特徴とする請求項４３乃至５５いずれか一項記載の製造方法。
- 上記植物体は、アブラナであることを特徴とする請求項４３乃至５５いずれか一項記載の製造方法。
- 上記植物体は、単子葉植物であることを特徴とする請求項４３乃至５５いずれか一項記載の製造方法。
- 上記植物体は、イネ科植物であることを特徴とする請求項４３乃至５５いずれか一項記載の製造方法。
- 上記植物体は、イネであることを特徴とする請求項４３乃至５５いずれか一項記載の製造方法。
- 上記植物体は、サトウキビであることを特徴とする請求項４３乃至５５いずれか一項記載の製造方法。
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