EA003425B1 - Химерный ген, обеспечивающий экспрессию в растениях циклина d-типа, и способ получения растений с измененными ростовыми свойствами при использовании указанного гена - Google Patents

Abstract

Описан способ модификации роста и строения растений путем изменения уровня функциональной активности специфичных циклинов D-типа в клетках растения. Также описаны химерные гены, содержащие транскрибируемую область ДНК, кодирующую РНК или белок, которая при экспрессии либо увеличивает, либо уменьшает уровень функциональной активности белка, контролирующего клеточное деление, а также растительные клетки и растения, экспрессирующие такие химерные гены.

Description

Настоящее изобретение относится к применению циклинов Ό-типа, а также кодирующих их генов с целью получения растений с измененными фенотипами, в особенности, растений с измененными темпами роста или растений, в состав которых входят части с измененными темпами роста, и/или измененными относительными размерами, или растений с измененным строением. Данное изобретение также относится к растительным клеткам и растениям, экспрессирующим такие ДНК.

Предпосылки изобретения

Все эукариотические клетки во время своего деления проходят одни и те же последовательные серии событий, и термин «клеточный цикл» отражает упорядоченную природу и универсальность этих событий. В клеточном цикле эукариот репликация ДНК (8) и деление клетки (М) в норме разделены во времени переходными фазами (61 и 62) в последовательности 618-62-М. Такое расположение делает возможным точное контролирование вхождения в принципиально важные процессы репликации ДНК и митоза. Цитологические события, лежащие в основе клеточного цикла, представляют собой упорядоченную последовательность организованных во времени и пространстве молекулярных и клеточных процессов, которые определяют направленность и порядок клеточного цикла. Оказалось, что у всех эукариот прохождение клеточного цикла регулируется главными контролерами, действующими на границах перехода фаз 61-8 и 62-М. Для прохождения через эти контрольные точки необходима активация циклинзависимых киназ (СОК), каталитическую активность и субстратную специфичность которых определяют специфические регуляторные субъединицы, известные как циклины, а также взаимодействия с другими белками, которые регулируют степень фосфорилирования комплекса (А1йегЮп-Еекк1ег е! а1., 1993, 8о1отоп,

1993) . При почковании и делении дрожжей, 618 и 62-М фазовые переходы контролирует единственная СЭК, кодируемая геном сбс2+ у 8с1ихокассйаготусек ротЬе, и СЭС28 у 8ассйаготусек сегеуЩае. Соединение р34^сбс2 (р34^ССС28 у почкующихся дрожжей) с различными циклиновыми партнерами отличает две контрольные точки (№1кту111. 1993). Более сложная ситуация имеет место в клетках млекопитающих, где, по крайней мере, шесть родственных, но различных СОК (кодируемых сбс2/сбк1, сбк2, сбк3, сбкаш4, сбк5, сбкб), каждая в соединении с одним или несколькими родственными циклиновыми партнерами, играют различные роли (Еапд апб Ыетероп, 1991, Меуегкоп е! а1., 1991, 1992, Хюпд е! а1., 1992Ь, Тка1 е! а1., 1993а, уап беп Неиуе1 апб Наг1оте, 1993, Меуегкоп апб Наг1оте,

1994) . Циклины В-типа представляют собой основной класс, участвующий в 62-М переходе и ассоциации с р34 или ее прямыми гомологами (Ыигке, 1990). Циклин В представляет со бой один из двух циклинов, первоначально описанных как накапливающиеся в яйцах беспозвоночных в течение интерфазы и быстро разрушающихся в митозе (Еуапк е! а1., 1983), он является компонентом фактора, способствующего созреванию у Хепорик (Миггау е! а1., 1989). Следовательно, установлена тождественность гомологов циклина В у многих видов эукариот. Циклин А также имеет широкое распространение у многоклеточных организмов, и точно его роль неясна, хотя максимум его накопления предполагает его функционирование в 8 фазе (Р1епек, 1993).

Фазовый переход 61-8 лучше всего изучен у 8. сегеуЩае. Генетические исследования определили точку в позднем 61, названную 8ТАВТ. После прохождения 8ТАВТ, клетки готовы к вхождению в 8 фазу и для завершения полного дополнительного цикла деления, результатом которого будет образование двух дочерних клеток, вновь находящихся в 61 фазе. (Найтеей, 1974, Ыакту1й, 1993). Продукты трех 61 циклиновых генов 8. сегеуЩае, называемых СЕХЕ ΕΕΝ2 и ΓΈΝ.!, представляют собой основные лимитирующие компоненты для прохождения через 8ТАКТ (Вюйагбкоп е! а1., 1989, ^й!епЬегд е! а1., 1990, Туегк е! а1., 1993). Транскрипция ΕΕΝ1 и ΕΕΝ2 активируется в 61, и накопление их белковых продуктов до критического порогового уровня по механизму положительной обратной связи приводит к активации р34^ССС28 киназы и переходу через 8ТАКТ (Эшск апб Ыакту!й, 1991). Затем 61 циклины деградируют вследствие наличия РЕ8Т мотивов в их первичной последовательности, что в результате проявляется в быстром белковом кругообороте. (Водегк е! а1., 198б, Бете е! а1., 1991, обзор Вееб, 1991).

циклины 8. сегеуЩае являются, по крайней мере, частично избыточными, так как дрожжевые штаммы, в которых два из трех 61 циклиновых гена удалены, а третий помещен под контроль галактозо-регулируемого промотора, проявляют фенотип с галактозозависимым ростом. Такие штаммы используют для определения клонов кДНК дрозофилы и человека, которые выживают в условиях данного с1пдефицитного фенотипа на глюкозной среде, когда единственный имеющийся дрожжевой ген СЕ-Ν репрессирован (Ко££ е! а1., 1991; Байне е! а1., 1991; Беоро1б апб О'Еаггей, 1991; Бете е! а1., 1991; Хюпд е! а1., 1991). Этим способом идентифицировали человеческие кДНК, кодирующие три новых класса циклинов: С, Ό и Е. Хотя эти циклины проявляют только ограниченную гомологию с дрожжевыми СЕ-Ν белками, они подтвердили важность понимания контролирующих факторов действующих в клетках млекопитающих в течение 61 и в точке рестрикции на границе 61-8 фаз (Рагбее, 1989; Тка1 е! а1., 1993Ь). Циклин Е может действовать как лимитирующий скорость компонент на границе 61-8 фаз (О1Ий1Ьо апй ЯоЬейк, 1993; \νίιηιηο1 е! а1., 1994), в то время как зависимость содержания циклина Ό от сывороточных ростовых факторов (Ма!кикЫте е! а1., 1991; Ва1йш е! а1., 1993; 8е\\1пд е! а1., 1993) позволяет предположить, что циклины Ό-типа могут образовывать связь между данными сигналами и кодом клеточного цикла.

Важным фактором, участвующим в регуляции протекания клеточного цикла у млекопитающих, является ген восприимчивости к ретинобластоме, кодирующий ретинобластомный белок (ЯЬ). ЯЬ связывает и инактивирует Е2Р семейство факторов транскрипции, благодаря чему ЯЬ реализует большую часть возможности задерживать клеточное деление в С1 фазе. Известно, что Е2Р транскрипционные факторы включают ген циклина Е и гены 8-фазы, и увеличение содержания циклина Е и/или Е2Р приводит к началу репликации (Νονίηκ, 1992, 1ойпкоп е! а1., 1993). Способность ЯЬ к инакцивации Е2Р зависит от степени его фосфорилирования. Большая часть С1 ЯЬ находится в гипофосфорилированном состоянии, но в поздней С1 фазе осуществляется фосфорилирование ЯЬ циклинзависимыми киназами, в частности, СИК4 связывается со своей необходимой регуляторной субъединицей, циклином Ό (Ршек, 1995), а СИК2 связывается с циклином Е (на границе С1/8) или циклином А (в 8 фазе). Такое множественное фосфорилирование ЯЬ побуждает его высвободить Е2Р, который может затем, в конечном счете, запустить транскрипцию генов 8фазы.

Растительные клетки применяли на ранних стадиях клеточного роста и деления, определяя отдельные фазы эукариотического клеточного цикла (Но^атй апй Ре1с, 1953), но имеется недостаточное количество материала по молекулярному контролю клеточного цикла в растительных системах. Растительные клетки, которые прекращают делиться ш у1уо, благодаря впадению в состояние покоя, или ш уйго. благодаря недостатку питательных веществ, задерживаются в главных контрольных точках в С1 и С2 (уап'! Но£ апй Коуаск; Оои1й е! а1., 1981; уап'! Но£, 1985), это, в общем, согласуется с действием контролирующих факторов в других эукариотических системах. Хотя зрелые растительные клетки можно обнаружить и с 01 и с 02 ДНК содержанием ДНК или 01, или 02 (Еуапк апй уап'! Но£, 1974; 0ои1й е! а1., 1981), 01 популяция, в общем, преобладает. Обнаружено, что 01 контрольная точка более важна в растительных клетках, культивированных в условиях азотного голодания; данные клетки задерживаются исключительно в 01 фазе (0ои1й е! а1., 1981). Таким образом, существуют сильные аналогии между главной контрольной точной в 01 для растительного клеточного цикла, 8ТАЯТ контролем у дрожжей и точкой рестрикции в клетках млекопитающих.

Для определения присутствия и локализации активных СО С2-родственных киназ в растительных клетках применяли антитела или гистон Н1 киназные тесты (1ойп е! а1., 1989, 1990, 1991; Мшеуик! е! а1., 1991; СЫа!ап!е е! а1., 1993; Со1акап!1 е! а1., 1993; Йо1т е! а1., 1993), и с помощью гибридизации при пониженной жесткости; или избыточной полимеразной цепной реакции выделили кДНК, кодирующие функциональные гомологи СЭС2 киназы, из ряда растительных видов, включая: горох (Рейет апй 1асоЬк, 1990), люцерну (Ни! е! а1., 1991, 1993), АтаЫйорик (Реггейа е! а1., 1991; Ннауата е! а1., 1991), сою (М1ао е! а1., 1993), Ап!нтЫпит (РоЬег! е! а1., 1994) и кукурузу (Со1акапй е! а1., 1991). Ряд последовательностей кДНК, кодирующих растительные митотические циклины с характеристиками А- и В-типа или имеющие смешанные черты, присущие А- и В-типам, также выделили из различных видов, включая морковь (На!а е! а1., 1991), сою (На!а е! а1., 1991), АтаЫйоркщ (Нетег1у е! а1., 1992; Оау апй Яеййу, 1994) люцерну (Нп! е! а1., 1992), АпйттЫпит (РоЬег! е! а1., 1994) и кукурузу (Яепаийш е! а1., 1994).

8оп1 е! а1. (1995) выявил новое семейство из трех родственных циклинов из АгаЫйоркщ с помощью комплементации дрожжевого штамма, дефицитного по 01 циклинам. Отдельные члены данного семейства проявляют тканезависимую экспрессию, и консервативны в других видах растений. Они образуют отдельную группу растительных циклинов, и названы циклинами δ-типа, что свидетельствует об их сходстве с циклинами Ό-типа млекопитающих. Родственность последовательностей δ и Ό циклинов включает Ν-концевую последовательность ЬхСхЕ. Лейцину в позиции -1 или -2 предшествует аминокислота с кислой боковой цепью (Ό, Е). Первоначально этот мотив обнаружен в определенных вирусных онкобелках, и он в значительной степени участвует в связывании с ретинобластомным белком. По аналогии с циклином Ό млекопитающих, эти растительные гомологи способны проводить ростовые и фитогормональные сигналы в растительный клеточный цикл. В этом отношении показано, что при повторной стимуляции культивированных в суспензии клеток, циклин δ3 быстро индуцируется растительным регулятором роста цитокинином, и циклин δ2 индуцируется источником углерода. Яепаийш е! а1., (1996) дал определение группам и номенклатуре растительных циклинов, и сейчас 5-циклины называются СусЭ циклинами.

Όη1ι1 е! а1., (1995) обнаружил в люцерне циклин (сусМк4), определенный как δ3 люцерны.

Недавно ЯЬ-подобные белки были обнаружены в растениях. Х1е е! а1., (1996); СгаП е!

а1., (1996) описывают выделение и предвари5 тельную характеристику гомолога ВЬ из кукурузы.

Ооегпег с1 а1. (1996) описывает эктопическую экспрессию циклина В-типа (сус 1А1 из АтаЫборкй) под контролем промотора из сбс2а гена в АтаЫборкй. «сбс2а» трансгенные растения с сильной экспрессией трансгена имели значительно повышенную скорость роста корня. Более того, в трансгенных растениях рост и развитие латеральных корней ускоряли последующей индукцией индолуксусной кислотой по сравнению с контрольными растениями.

Нетег1у с1 а1., (1995) описывают трансгенный табак и растения АтаЫборкй, экспрессирующие дикий тип или доминантные мутации киназы, функционирующей в фазу митоза (СОС2а). Растения, постоянно избыточно продуцирующие СОС2а дикого типа или мутантную форму, для которых было предсказано, что они ускоряют клеточный цикл, не обнаруживали значительного изменения развития. Ожидают, что при экспрессии в АтаЫборщк мутантная СОС2а задерживает клеточный цикл, отменяя клеточное деление. Получали несколько растений табака, постоянно продуцирующих последнюю мутантную киназу. Такие растения содержали существенно меньше клеток, но больших размеров.

В РСТ патентной публикация XVО 92/ 09685 описан способ подавления роста растительных клеток, включающий модулирование уровня белков клеточного цикла в растении во время и в условиях, достаточных для подавления клеточного деления. Предпочтительный белок, обнаруженный в примерах, представляет собой р34^с<1с2 киназу и т.п. функционирующая в фазе.

В VО 93/12239 описаны растения с измененной высотой и другими фенотипическими эффектами, в частности с преждевременным цветением и увеличенным количеством цветков, с помощью трансформации растительного генома сбс25 геном из дрожжей, таких как 8сБ|/окассБаготусек ротЬе.

VО 97/47647 относится к выделению и характеристике последовательности растительной ДНК, кодирующей ретинобластомный белок, ее применению для подавления роста растительных клеток, растений и/или вирусов растений, а также использование векторов, растений, животных или животных клеток, измененных посредством манипуляций в контролирующем пути, основанном на ретинобластомном белке растений.

В патенте США 5514571 описано применение циклина Ό1 в качестве негативного регулятора пролиферации клеток млекопитающих. Избыточная экспрессия циклина Ό1 блокирует рост клеток млекопитающих, в то время как блокирование экспрессии циклина Ό1 ускоряет клеточную пролиферацию.

Сущность изобретения

Изобретение относится к способу получения растения с измененными ростовыми характеристиками или измененным строением, содержащий химерный ген, содержащий следующие оперативно связанные фрагменты ДНК:

a) экспрессируемый растением промоторный участок;

b) транскрибируемый участок ДНК, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую растительный белок, контролирующий клеточное деление, а именно растительный циклин Ό-типа, способный связывать или фосфорилировать ретинобластомаподобный белок в клетках растения, выбранную из нуклеотидной последовательности ЕМВЬ Ассеккюп Ыо. Х83369 от положения 104 до положения 1108, кодирующей белок АтаЫборкй 1БаБапа СУСЭ1, нуклеотидной последовательности ЕМВЬ Ассеккюп Ыо. Х83370 от положения 195 до положения 1346, кодирующей белок АтаЫборщк 1БаБаиа СУСЭ2. нуклеотидной последовательности ЕМВЬ Ассеккюп Ыо. Х83371 от положения 266 до положения 1396, кодирующей белок АтаЫборкй 1БаБапа СУСО3, нуклеотидной последовательности 8ЕО ΙΌ N0: 1 от положения 182 до положения 1243, кодирующей белок МсоБапа 1аЬасит СУСО2;1, нуклеотидной последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 2 от положения 181 до положения 1299, кодирующей белок МсоБапа 1аЬасит СУСО3;1, нуклеотидной последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 3 от положения 198 до положения 1298, кодирующей белок NКобана 1аЬаснш СУСО3;2, нуклеотидной последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 4 от положения 165 до положения 1109, кодирующей белок НеБайБик йЬетокик СУСЭ1;1, нуклеотидной последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 5 от положения 48 до положения 1118, кодирующей белок НеБайБик йЬетокик СУСО3;1, нуклеотидной последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 21 от положения 316 до положения 1389, кодирующей белок 2еа таук СУС02, или генетически вырожденных вариантов указанных нуклеотидных последовательностей; и

c) 3'-концевую структуру и сигнал полиаденилирования, функционирующий в растительных клетках.

Изобретение также относится к химерным генам, содержащим следующие оперативно связанные фрагменты ДНК:

a) экспрессируемый растением промоторный участок;

b) транскрибируемый участок ДНК, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую растительный белок, контролирующий клеточное деление, а именно растительный циклин Ό-типа, способный связывать или фосфорилировать ретинобластомаподобный белок в клетках растения, выбранную из нуклеотидной последовательности ЕМВЬ Ассеккюп №. Х83369 от положения 104 до положения

Ί

1108, кодирующей белок АгаЫборкщ Лайапа СУСЭЕ нуклеотидной последовательности ЕМВЬ Ассекыоп Νο. Х83370 от положения 195 до положения 1346, кодирующей белок ЛгаЫάορδίδ Лайапа СУСЭ2. нуклеотидной последовательности ЕМВЬ Асеевой Νο. Х83371 от положения 266 до положения 1396, кодирующей белок АгаЫборык ЛаНапа СУСЭ3. нуклеотидной последовательности 8ЕО ΙΌ N0: 1 от положения 182 до положения 1243, кодирующей белок МсоИапа 1аЬасит СУСЭ2:1. нуклеотидной последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 2 от положения 181 до положения 1299, кодирующей белок МсоИапа 1аЬасит СУСЭ3:1. нуклеотидной последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 3 от положения 198 до положения 1298. кодирующей белок МсоИапа 1аЬасит СУСЭ3:2. нуклеотидной последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 4 от положения 165 до положения 1109. кодирующей белок НеНапЛик ЛЬегокик СУСЭ1;1, нуклеотидной последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 5 от положения 48 до положения 1118. кодирующей белок НеНапЛик ЛЬегокик СУСЭ3;1, нуклеотидной последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 21 от положения 316 до положения 1389. кодирующей белок 2еа таук СУСЭ2. или генетически вырожденных вариантов указанных нуклеотидных последовательностей; и

с) 3'-концевую структуру и сигнал полиаденилирования, функционирующий в растительных клетках.

Подробное описание изобретения

Используемый здесь термин «строение» растения относится к общей морфологии, которая определяется относительными размерами. расположением и числом некоторых частей растения (например следующих органов, не ограничиваясь ими: листья, соцветия, органы накопления, такие как клубни, корни, стебли, цветки, или части органов, такие как: лепестки, чашелистики, пыльники, рыльце, столбик, черешок и т.п.). «Изменение строения растения», таким образом, относится к изменениям общей морфологии в результате изменения, например, числа, размера и расположения органов или частей органов. Понятно, что изменение одного органа или части органа или нескольких органов или частей органов, как было описано, будет выражаться в изменении строения растения. Этого можно достигнуть путем изменения (то есть увеличения или уменьшения) активности клеточного деления в существующей меристеме и/или органном примордии, или путем создания меристем бе поуо.

Используемый здесь термин ко-супрессия относится к способу транскрипционной и/или посттранскрипционной супрессии накопления РНК, что выражается в супрессии экспрессии гомологичных эндогенных генов или трансгенов. Супрессия экспрессии эндогенного гена может быть достигнута с помощью введения трансгена, включающего сильный промо тор, оперативно связанный с ДНК участком, в результате чего полученная транскрибируемая РНК представляет собой смысловую РНК, включающую нуклеотидную последовательность, которая составляет, по крайней мере, 75%, предпочтительно 80%, в частности, по крайней мере 85%, более узко, по крайней мере, 90%, конкретно, по крайней мере, 95% от кодирующей или транскрибируемой последовательности ДНК (смысловой) гена, экспрессия которого подлежит супрессии. Предпочтительно, транскрибируемый ДНК участок не кодирует функциональный белок. В частности, транскрибируемый участок не кодирует белок.

Используемый здесь термин экспрессируемый растением промотор означает промотор, который способен управлять транскрипцией в растительной клетке. Он включает любые промоторы растительного происхождения, но также и любой промотор нерастительного происхождения, который способен управлять транскрипцией в растительной клетке, то есть определенные промоторы вирусного и бактериального происхождения, такие как промоторы СаМУ358 или Т-ДНК гена.

Термин «экспрессия гена» относится к процессу, при котором участок ДНК под контролем регуляторных участков, в частности промотора, транскрибируется в РНК, которая является биологически активной, то есть способна или к взаимодействию с другой нуклеиновой кислотой или с белком, или обладает способностью к трансляции в биологически активный полипептид или белок. Считают, что ген кодирует РНК, если конечный продукт экспрессии этого гена представляет собой биологически активную РНК, такую как, например, антисмысловая РНК или рибозим. Считают, что ген кодирует белок, если конечный продукт экспрессии гена представляет собой биологически активный белок или полипептид.

Термин «ген» означает любой фрагмент ДНК, включающий участок ДНК («транскрибируемый участок ДНК»), который транскрибируется в клетке в молекулу РНК (например, мРНК) под контролем подходящих регуляторных участков, например, экспрессируемого растением промотора. Таким образом, ген может включать несколько оперативно соединенных фрагментов ДНК, таких как: промотор, 5'лидерная последовательность, кодирующий участок и 3'-участок, включающий сайт полиаденилирования. Эндогенный растительный ген представляет собой ген, который в природе обнаруживается в видах растений. Химерный ген представляет собой любой ген, который в норме не обнаруживается в видах растений или, альтернативно, любой ген, в котором промотор не соединен в природе с частью или целым транскрибируемого участка ДНК или, по крайней мере, с другими регуляторными участками гена.

Данное изобретение основано на неожиданной находке, что химерные гены, включающие ДНК, кодирующую растительный циклин Ό-типа, могут быть стабильно интегрированы в геном растительных клеток под контролем экспрессируемого растением промотора без оказания вредного влияния, и более того, что повышенная экспрессия в растительных клетках такого циклина Ό-типа, приводит к специфическим изменениям скорости роста и строения полученных трансформированных растений.

Таким образом, изобретение относится к модулированию уровня экспрессии или активности циклинов Ό-типа, предпочтительно устойчивым образом, в клетках растения с целью изменения строения или скорости роста, или и того, и другого у трансформированного растения, а также у его потомства. Удобно, когда содержание или функциональная активность белков, контролирующих клеточное деление, а именно циклинов Ό-типа, контролируют генетически с помощью изменения экспрессии генов, кодирующих эти белки, контролирующие клеточное деление. Увеличение содержания или функциональной активности белка, контролирующего клеточное деление, такого как циклин Ό-типа, может быть достигнуто генетически, например, путем манипулирования с числом копий кодирующего гена(ов), путем изменения промоторного участка кодирующих генов, или путем манипулирования с генами, прямо или опосредованно регулирующими уровень экспрессии белка, контролирующего клеточное деление. Иначе, содержание белка, контролирующего клеточное деление, может быть увеличено путем стабилизирования мРНК, кодирующей белок, контролирующий клеточное деление, или путем стабилизирования белка, контролирующего клеточное деление, например, путем удаления деструктирующих мотивов или, так называемых, РЕ8Т последовательностей.

Функциональный уровень или активность белка, контролирующего клеточное деление, такого как циклин Ό-типа, могут быть увеличены с помощью уменьшения уровня антагониста или ингибитора белка, контролирующего клеточное деление, с помощью следующих способов, но не ограничиваясь ими: предоставление клетке белка, например, неактивного белка, контролирующего клеточное деление, но похожего на тот белок, чей функциональный уровень желают увеличить, или, предоставляя часть такого белка, контролирующего клеточное деление, которая еще обладает способностью к связыванию ингибитора или другого регуляторного белка, или еще обладает способностью к связыванию циклин-зависимых киназ. Также функциональный уровень или активность белка, контролирующего клеточное деление, могут быть увеличены с помощью изменения или мутации белка, контролирующего клеточное деление, с целью уменьшения или отмены способности связываться с антагонистом или ингибитором активности белка, имеющего отношение к клеточному делению.

Понижение функциональной активности белка, контролирующего клеточное деление, такого как циклин Ό-типа, можно достигнуть, например, с помощью уменьшения пула мРНК, кодирующих белок, контролирующий клеточное деление, что возможно при трансляции, с помощью таких методов, как (но не ограничивается ими): антисмысловая РНК, действие рибозима или ко-супрессия. Иначе, функциональный уровень белка, контролирующего клеточное деление, можно понизить с помощью увеличения уровня антагониста или ингибитора белка, вызывающего клеточное деление.

В целях данного изобретения «белок, контролирующий клеточное деление» представляет собой полипептид или белок, который необходим для регуляции прохождения эукариотической клетки через клеточный цикл, предпочтительно растительной клетки, или белок, который способен воздействовать на вхождение клеток в клеточный цикл или воздействовать на прохождение клетки через клеточный цикл путем прямого взаимодействия с белком, который необходим для регуляции прохождения через клеточный цикл, или взаимодействия с полипептидом или белком, который может выполнять эквивалентную функцию, но не является при этом необходимым для регуляции клеточного цикла.

Белки, подходящие для контролирования клеточного деления, представляют собой белки, способные самостоятельно или в комбинации с другими белками фосфорилировать РЬподобный белок, предпочтительно, способные фосфорилировать КЬ-подобный белок в растительных клетках в 01-8 переходной фазе, или способные связываться с карманным доменом РЬ-подобных белков, предпочтительно белки, содержащие ЬхСхЕ связывающий мотив, включенный в аминокислотную последовательность, или родственный ему мотив, такой как Ьх8хЕ или ЕхСхЕ (связывающие мотивы приведены в однобуквенном аминокислотном коде, где х представляет собой любую аминокислоту). Особенно предпочтительны циклины, которые включают ЬхСхЕ связывающий мотив (и/или родственный мотив) в Ν-концевой половине белка, предпочтительно, в пределах первых 50 аминокислотных остатков, в особенности, в пределах первых 30 аминокислотных остатков, такие как, циклины Ό-типа, в особенности растительные циклины Ό-типа, особенно циклин из группы АгаЫборкЬ Шайапа СУСО1, АгаЫборкЬ Шайапа СУСО2, АгаЫборкЬ Шайапа СУСО3, Мсойапа 1аЬасиш СУСО3;1, N10011303 1аЬасиш СУСО2;1, №сойапа 1аЬасиш СУСО3;2, Нейап11шк ШЬетокик СУСО1;1, 2еа таук СУСО2, Не1ί;·ιη11ιι.ΐ5 ШЬетокик СУСО3;1 или циклин, с суще ственно похожими аминокислотными последовательностями.

Указанные растительные циклины Ό-типа полностью охарактеризованы с помощью аминокислотной последовательности, закодированной в последовательности ДНК в ЕМВБ Ассеккюп N Х83369 с нуклеотидного положения 104 до нуклеотидного положения 1108 для АгаЫάορκίκ (Набапа СУСЭ1. ЕМВЬ Ассеккюп N Х83370 с нуклеотидного положения 195 до нуклеотидного положения 1346 для АгаЬИоркщ (Набапа СУСП2. ЕМВЬ Ассеккюп N Х83371 с нуклеотидного положения 266 до нуклеотидного положения 1396 для АгаЬИорщк (бабапа СУСО3. нуклеотидной последовательности 8ЕЦ ΙΌ N 1 с нуклеотидного положения 182 до нуклеотидного положения 1243 для Мсобапа (аЬасит СУСЭ2:1. нуклеотидной последовательности 8ЕЦ ΙΌ N 2 с нуклеотидным положением 181 до нуклеотидного положения 1299 для №соОапа (аЬаспт СУСВ3;1, нуклеотидной последовательности 8ЕЦ ΙΌ N 3 с нуклеотидным положением 198 до нуклеотидного положения 1298 для Мсобапа (аЬаспт СУСЭ3:2. нуклеотидной последовательности 8ЕЦ ΙΌ N 4 с нуклеотидным положением 165 до нуклеотидного положения 1109 для Небап!бик (иЬегокик СУСО1;1, нуклеотидной последовательности 8ЕЦ ΙΌ N 5 с нуклеотидным положением 48 до нуклеотидного положения 1118 для НебапШик ШЬегокик СУСЭ3;1. нуклеотидной последовательности 8ЕЦ ΙΌ N 21 с нуклеотидным положением 316 до нуклеотидного положения 1389 для 2еа таук СуСэ2.

Вследствие увеличения, соответственно уменьшения, содержания или функциональной активности, или активности таких белков, контролирующих клеточное деление, таких как циклины Ό-типа, ускоряется, соответственно замедляется, переход от 61 к 8 фазе в растительных клетках, или увеличивается, соответственно уменьшается, процентное соотношение активно делящихся клеток, в результате взаимодействия этих белков с КЬ-подобными белками, что влияет на способность КЬ-подобного белка к инактивации определенных факторов транскрипции. Далее, экспрессия таких белков, контролирующих клеточное деление, взаимодействующих с КЬ-подобными белками, дает возможность клеткам эффективно инициировать процессы деления, тогда как напротив, ожидается, что (избыточная) экспрессия С2/митотических циклинов (таких как циклины В-типа или продукт сбс25 гена) приводит к быстрому прохождению через С2/митотические фазы уже начатых клеточных циклов.

В целях данного изобретения «КЬподобные белки» определяют как белки из группы: человеческий КЬ-1 белок (Бее е( а1., 1987; Ассеккюп № Р06400), человеческий р107 (Е\геп е! а1., 1991; Ассеккюп № Б14812) и человеческий р130 (Наппоп е( а1., 1993; Ассеккюп №

А49370), РВЕ дрозофилы Щи е! а1., 1996; Ассеккюп № для ДНК кодирующего гена Х96975), мышиный КЬ (Ветпагбк е( а1., 1989; Ассеккюп № Р13405), КЬ цыпленка (Воебтеб е! а1., 1994; Ассеккюп № Х72218), Хепорик КЬ (Эек(гее е( а1., 1992; Ассеккюп № А44879), 2тКЬ, КЬ1 из 2еа таук (Х1е е! а1., 1996; Огай е! а1., 1996; каталожный номер для ДНК кодирующих генов: Х98923; ОепВапк И52099), а также некоторые другие белки, которые одновременно обладают, по крайней мере, 25-30% сходством аминокислотной последовательности (идентичностью), по крайней мере, с тремя членами указанной выше группы, и включают консервативный остаток цистеина, в положении 706 человеческого КЬ-1, или в эквивалентной позиции других КЬподобных белков (см., например, Х1е е! а1., 1996).

КЬ-подобные белки являются членами небольшого семейства, известного как «карманные белки». Данный термин произошел от названия консервативного домена, состоящего из двух частей, так называемого «карманного домена», который представляет собой сайт связывания для нескольких белков, контролирующих рост, таких как семейство факторов транскрипции Е2Е, циклинов Ό-типа и вирусных онкобелков. А и В субдомены карманного домена являются более консервативными по сравнению с остальным белком (приблизительно 50-64% для А и В субдоменов) и отделены неконсервативным спэйсером (промежутком). Карманные домены локализованы между аминокислотами в положениях 451 и 766 для человеческого КЬ, 321 и 811 для человеческого р107, 438 и 962 для человеческого р130, 445 и 758 для КЬ мыши, 441 и 758 для КЬ цыпленка, 440 и 767 для Хепорик КЬ, 11 и 382 для сот 2тКЬ, 89 и 540 для КЬ1 кукурузы.

В целях изобретения «связывание с КЬподобным белком» или «связывание с карманным доменом КЬ-подобного белка» может быть проанализировано с помощью методик ш νί6Ό или одного из методов ш νίνΌ, или их комбинацией. В методе ш νί6Ό, анализируют связывание между интересующим белком, меченым ³⁵8метионином, и комплексом из белка глутатион 8-трансферазы (68Т) и карманным доменом КЬподобного белка, такого как человеческий КЬ. Сшивание с 68Т дает возможность упростить очистку и фиксацию пришитого белка на глутатион-сефарозные шарики. Взаимодействие между анализируемым белком и КЬ-подобным белком сравнивают со связыванием того же самого белка и сшивкой 68Т белка с КЬподобным белком с мутацией в консервативном цистенине в позиции, эквивалентной цистеину 706 в человеческом КЬ С706Е. Такой метод описан, например, Эочбу е! а1., (1993) и Е\геп е! а1., (1993). В варианте данного метода КЬ-подобный белок можно экспрессировать в клетках насекомых, инфицированных бакуловирусом (Эочбу с1 а1., 1993). В другом варианте и ВЬ-подобный белок и ВЬ-связывающий белок можно коэкспрессировать в клетках насекомых, и их ассоциацию детектируют путем гель-фильрации или ко-иммунопреципитации (О'ВеШу с1 а1., 1992).

Метод ίη νίνο, который можно использовать для определения связывания белка с карманным доменом ВЬ-подобных белков, представляет собой дрожжевую двухгибридную систему (Е1е1б§ апб 8!гопд, 1989). Анализ основан на способности восстанавливать функциональную активность САЬ4 из двух отдельных 6АЬ4-сшитых белков, содержащих ДНК связывающий домен (6АЬ4^ВВ) и активационный домен (6АЬ4^ав), пришитые к карманному домену ВЬ-подобного белка, и белка, который будут анализировать, соответственно. Экспрессирующие плазмиды, включающие химерные гены, кодирующие эти сшитые белки, вводят в дрожжевой штамм, кодирующий соответствующие САЬ4 индуцибельные маркеры, например, в штамм Н57с (Рей1о1ег е1 а1., 1994), содержащий 6АЬ4-индуцибельные ΗΙ83 и Ьас2 маркеры, или в штамм Υ190 (Нагрег е! а1., 1993). Белки, связывающие карманный домен ВЬ-подобного белка, позволят расти в условиях отсутствия гистидина. Пример двухгибридного метода, демонстрирующий взаимодействие белка с ВЬподобным белком описан БигГее е! а1., 1993.

Предпочтительно включать подходящие контрольные эксперименты, например, раздельное введение экспрессирующих плазмид в тот же дрожжевой штамм, или введение экспрессирующих плазмид, кодирующих сшитые белки, содержащие ДНК-связывающий домен (САЬА^ВВ) и активационный домен (6АЬА^ав), сшитые с мутированным карманным доменом ВЬподобного белка, предпочтительно мутированным в С706 или в эквивалентных позициях, и белок, который будут анализировать, соответственно.

Альтернативный способ определения связывания белка с карманным доменом ВЬподобных белков ίη νίΐτο включает временную экспрессию обоих белков в растительных клетках, предпочтительно в протопластах табака, и иммунопреципитацию, с использованием антител, направленных против одного из двух белков для измерения ко-преципитации другого белка.

В целях изобретения «фосфорилирование ВЬ-подобного белка» можно проанализировать с помощью методов ίη νίΐτο, основанных на использовании гамма ³²Р меченного аденозинтрифосфата для контроля способности белка (или комбинации белков, таких как циклины и циклин-зависимые киназы) переносить меченую фосфатную группу на белок-мишень, что хорошо известно в данной области.

В целях изобретения «циклин» можно определить как регуляторный белок, включающий белковый домен из приблизительно 100 аминокислот, известный как «циклиновый бокс». Циклиновый бокс представляет собой сайт связывания циклин-зависимых киназ, позволяющий циклину оказывать свое регуляторное действие на киназную активность СБК.

Циклиновый бокс можно идентифицировать путем сравнения аминокислотных последовательностей белка с известными циклиновыми боксами, например, аминокислотной последовательности между положениями 81-186 С.УСБ1 из АгаЬ1бор818 !йайапа, между положениями 96201 С.УСБ2 из АгаЫборык !йайапа, между позициями 86-191 С.УСБ3 из АгаЫборкк !йайапа, циклиновые боксы описаны Вепаибш е! а1., (1994; 1996), 8ош е! а1., (1995) апб Нетег1у е! а1., (1992). Аминокислотную последовательность отождествляют с циклиновым боксом на основании сравнения последовательности, которая должна содержать, по крайней мере, пять консервативных остатка, необходимых для активности циклина В(97),Б(126),Ь(144), К(155),Е (185)(отмеченные позиции получены из последовательности С.УСБ2 из АгаЫборык !йайапа) в эквивалентных позициях (см., например, 8ош е! а1., (1995) апб Вепаибш е! а1., (1996).

Циклины Б-типа (циклин Б или СуеБ) представляют собой циклины, которые характеризуются наличием дополнительных характеристических последовательностей, таких как ЬхСхЕ мотив или родственные мотивы для связывания ВЬ-подобных белков, которые обнаруживаются в Ν-концевой части белка, предпочтительно находятся между Ν-концом и циклиновым боксом, в частности в пределах первых 50 аминокислот, конкретно в пределах 30 первых аминокислот от инициирующего метионинового остатка. Предпочтительно, лейцину связывающего мотива в позиции -1 или -2 предшествует аминокислота с кислой боковой цепью (Б, Е). Можно обнаружить и другие связывающие мотивы, такие как Ьх8хЕ или ЕхСхЕ. Действительно, Рйе1р§ е! а1., (1992) определил, что мутация связывающего мотива ЬхСхЕ в Ьх8хЕ у человеческого папилломавируса Е7 не влияет на способность белка связывать ВЬ-подобные белки. На основании гомологии последовательности определены три группы Б-циклинов: СуеБ1 (включающие АгаЫборык !йайапа СуеБ1 и Не11ап!йи8 НЬегокик ΟΥΟΌΝ), СуеБ2 (включающие АгаЬ1бор818 !йайапа СуеБ2, Мсойапа !аЬасит СТСБ2;1, /еа таук СΥС^2), СΥС^3 (включающие АгаЫборшк !йайапа СусБ3 и Мсойапа !аЬасит ΟΥΟΌ^^, №сойапа !аЬасит С.УСБ3;2 и Нейап!йи8 !иЬего8И8 С.УСБ3;1).

Номенклатура и консенсусные последовательности для различных типов и групп растительных циклинов, включая циклины Б-типа, описаны Вепаибш е! а1., (1996), и могут использоваться для классификации новых циклинов на основании их аминокислотной последовательности.

В целях изобретения, белки, контролирующие клеточное деление, можно доставлять в клетки или прямым способом, например, путем электропорации протопластов в присутствии белков, контролирующих клеточное деление, или непрямым способом, путем трансформации растительных клеток экспрессируемым в растении химерным геном, кодирующим интересующий белок, временно или постоянно встраивая его в геном протопластов.

В одном аспекте изобретения с целью получения растения с измененной скоростью роста или измененным строением, увеличивают содержание или функциональную активность белка, контролирующего клеточное деление, способного к фосфорилированию КЬ-подобного белка, или связыванию карманного домена КЬподобных белков, таких как циклин Ό-типа, путем интегрирования в геном клеток растения химерного гена, включающего следующие оперативно связанные фрагменты ДНК:

A) экспрессируемый в растении промоторный участок, в частности СаМУ358 промоторный участок,

B) транскрибируемый участок ДНК, кодирующий белок, экспрессия которого увеличивает содержание или функциональная активность циклина Ό-типа; и необязательно,

C) З'-концевая структура или сигнал полиаденилирования, функционирующий в растительных клетках.

В предпочтительном осуществлении изобретения, уровень экспрессии циклина Ό увеличивают путем введения в геном растительной клетки химерного гена, включающего транскрибируемый участок ДНК, кодирующий циклин Ό, под контролем экспрессирующегося в растении промотора. Транскрибируемый участок ДНК включает нуклеотидную последовательность, выбранную из нуклеотидной последовательности ЕМВЬ Ассекыоп № Х83369 с нуклеотидным положением 104 до нуклеотидного положения 1108, ЕМВЬ Ассекщоп № Х83370 с нуклеотидного положения 195 до нуклеотидного положения 1346, ЕМВЬ Ассекыоп № Х83371 с нуклеотидного положения 266 до нуклеотидного положения 1396, нуклеотидной последовательности 8ЕО ΙΌ № 1 с нуклеотидного положения 182 до нуклеотидного положения 1243, нуклеотидной последовательности 8ЕО ΙΌ № 2 с нуклеотидного положения 181 до нуклеотидного положения 1299, нуклеотидной последовательности 8ЕО ΙΌ № 3 с нуклеотидного положения 198 до нуклеотидного положения 1298, нуклеотидной последовательности 8ЕО ΙΌ N 4 с нуклеотидного положения 165 до нуклеотидного положения 1109, нуклеотидной последовательности 8ЕО ΙΌ № 5 с нуклеотидного положения 48 до нуклеотидного положения 1118 и нуклеотидной последовательности 8ЕО ΙΌ № 21 с нуклеотидного положения 316 до нуклеотидного положения 1389 для 2еа таук.

В особенно предпочтительном осуществлении уровень экспрессии циклина СУ СО2 типа изменяют (напр., увеличивают) путем введения в геном растительной клетки «химерного сусО2 гена», включающего транскрибируемый участок ДНК, кодирующий циклин СУСО2 типа, под контролем экспрессируемого в растении промотора, предпочтительно конститутивного промотора, в частности СаМУ358 промотора, такого как химерный сусО2 ген плазмиды рСЕС1, с целью изменить морфологию, строение и ростовые характеристики трансгенного растения, в частности увеличить вегетативный рост трансгенного растения, конкретно, изменить скорость роста трансгенного растения.

В целях изобретения «увеличение» или «уменьшение» измеряемых фенотипических особенностей считают как разность между средним значением измерений, относящихся к описанию этой особенности у различных растений одной трансгенной линии растений, и средним значением измерений этой особенности у дикого типа растений, деленную на среднее значение измерений этой особенности у дикого типа растений, выраженную в процентах, причем трансгенное и контрольное (дикий тип) растения растут в одних и тех же условиях поступления питательных веществ, света, влажности, температуры и т.п., предпочтительно в стандартных условиях. Предпочтительный уровень увеличения или уменьшения является статистически значимым, предпочтительно с доверительным интервалом 0,05, еще предпочтительнее с доверительным интервалом 0,01, подсчитанный, например, путем анализа вариаций (напр., как описано в 81аЙ5Йса1 Ме11юй5 Ьу 8пейесог апй Сосйтап).

Увеличение вегетативного роста трансгенного растения предпочтительно проверять путем измерения увеличения сухого веса в течение ростового периода. Среднее увеличение сухого веса определяют как разницу средних значений сухого веса трансгенных растений и растений дикого типа, умноженную на 100 и деленную на среднее значение сухого веса растений дикого типа. Обычно в результате введения химерных генов сусО2 настоящего изобретения, увеличение сухого веса, особенно в раннем периоде роста, колеблется от, по крайней мере, примерно 39 до примерно 350%, в особенности, от примерно 68 до примерно 150%.

Очевидно, что увеличение сухого веса вследствие введения химерных генов данного изобретения, может изменяться в зависимости от видов растений или от использованных химерных генов, и в рамки изобретения включено любое значительное увеличение сухого веса трансгенных растений, в частности, увеличение сухого веса, по крайней мере, примерно в 1,44,5 раза по сравнению с сухим весом нетрансформированных контрольных растений, в частности, по крайней мере, в 1,8-2,7 раз по сравне17 нию с нетрансформированными контрольными растениями. В любом случае, средний сухой вес трансгенных растений статистически значимо отличается от среднего сухого веса нетрансформированных растений.

Также можно определить увеличение вегетативного роста трансгенного растения путем сравнения числа листьев, наблюдаемых на трансгенных растениях, и на контрольных растениях дикого типа в любую данную точку времени. Ожидают, что разница в количестве листьев трансгенных растений в середине периода роста, будет, по крайней мере, примерно в 1,1-3 раза, в частности, по крайней мере, в 1,5-2 раза по сравнению с числом листьев у нетрансформированных растений.

Увеличение вегетативного роста трансгенного растения также можно проверить путем измерения высоты стебля (измеряют от уровня земли до вершины ростовой точки) в течение периода роста. Среднее увеличение высоты стебля определяют как разницу средней высоты стебля трансгенных растений и растений дикого типа, умноженную на 100 и деленную на среднюю высоту растений дикого типа. Обычно, в результате введения химерных генов сусЭ2 настоящего изобретения, увеличение высоты стебля колеблется от, по крайней мере, примерно 65% в раннем периоде роста, по крайней мере, примерно 20-30% в середине периода роста, до, по крайней мере, примерно 10% в период цветения, но может быть и очень высока - примерно 120-190% в раннем периоде роста, примерно от 40-50 до 75% в середине периода роста, и примерно 15-20% в конце стадии цветения.

Очевидно, что увеличение высоты стебля в результате введения химерных генов данного изобретения, может изменяться в зависимости от видов растений или от используемых химерных генов, и любое значимое увеличение высоты стебля у трансгенных растений входит в рамки изобретения, в частности, высота стебля, превышающая, по крайней мере, в 1,1-3 раза высоту стебля нетрансформированных контрольных растений, в частности, превышающая по крайней мере в 1,5-2 раза высоту стебля нетрансформированных контрольных растений.

Разница высоты стебля между трансгенными и контрольными растениями уменьшается в процессе роста, так как темп роста замедляется во время цветения. Таким образом, конечная высота трансгенного растения может быть такой же, как и конечная высота нетрансгенного растения.

Трансгенные растения с включенными химерными генами сусЭ2 данного изобретения, имеют ускоренный темп роста по сравнению с нетрансформированными растениями, что выражается в уменьшении времени, необходимого для достижения данного сухого веса или высоты стебля. Используемый здесь термин «темп роста» относится к увеличению в размере рас тения или части растения за одни сутки, в частности, увеличение высоты стебля за одни сутки, и его можно подсчитать как разницу между размером растения или части растения в начале и в конце периода, включающего определенное количество дней, в частности 6-8 дней, деленную на количество дней. Предпочтительно выражать увеличение темпа роста в соответствии с общим определением увеличения измеряемого фенотипа, но также его можно выражать как отношение между темпом роста трансгенных растений и темпом роста нетрансформированных контрольных растений в течение одного и того же периода времени, в одних и тех же условиях.

Как упоминалось ранее, увеличение скорости роста в результате введения химерных генов данного изобретения, может изменяться в зависимости от видов растений или от используемых химерных генов, и любое значимое увеличение темпа роста у трансгенных растений входит в рамки изобретения, в частности, увеличение темпа роста колеблется от примерно 4 до примерно 85%, более конкретно от примерно 20 до примерно 60%, особенно, от примерно 30 до примерно 50%.

Увеличение вегетативного роста трансгенного растения также можно оценить путем измерения длины или размера самого большого листа в различные точки времени в течение периода роста, пока листья еще развиваются. Измеряемый фенотип представляет собой измерение ускоренного созревания трансгенных растений. Среднее увеличение длины самого большого листа вследствие введения химерных генов настоящего изобретения (определяют как разницу между средней длиной самого большого листа трансгенных растений и растений дикого типа, умноженную на 100 и деленную на среднюю длину самого большого листа растений дикого типа), колеблется от примерно 7-31% (в среднем, примерно 17%) в раннем периоде роста до примерно 3-14% (в среднем, примерно 7%) в середине ростового периода.

Опять же, такие увеличения размера самого большого листа, в результате введения химерных генов данного изобретения, могут изменяться в зависимости от видов растений или от используемого химерного гена, и любое значимое увеличение роста или размера листа у трансгенных растений входит в рамки данного изобретения.

В другом осуществлении данного изобретения в растения также могут быть введены химерные гены сусЭ2. с целью увеличения развития корней параллельно с увеличением вегетативной части над поверхностью земли (стебель, листья, цветы), и это увеличение может колебаться в пределах примерно 40-70%, но, опять же, это увеличение может изменяться в зависимости от видов растений и от используемого химерного гена, и любое значимое увеличение, в частности статистически значимое увеличение корневого развития, входит в рамки настоящего изобретения.

В другом осуществлении изобретения в растения также может быть введен химерный ген, контролирующий клеточное деление, в частности, химерные гены ονοΌ2. с целью увеличения размера, а также числа цветков, в особенности числа плодоносящих цветков, и числа плодоносящих семяпочек в каждом цветке. Очевидно, что в результате увеличения числа плодоносных цветков, и числа плодоносящих семяпочек в каждом цветке (что в целом приводит к увеличенному количеству семян на одно растение), можно получить увеличение урожая семян на одно растение. Понятно, что увеличение числа цветков и семяпочек на цветок, а также увеличение урожая семян может изменяться в зависимости от видов растения, трансформированного химерными генами данного изобретения, контролирующими клеточное деление, и от используемых химерных генов. Обычно, увеличение размеров цветков в результате введения химерного гена, включая сусО2, кодирующий участок ДНК под контролем промотора СаМУ358, колеблется в пределах, по крайней мере, примерно 4-30%, в частности в пределах примерно 10-20%. Обычно увеличение числа цветков, колеблется от, по крайней мере, примерно 20% до, по крайней мере, примерно 50%, в частности от, по крайней мере, примерно 24% до, по крайней мере, примерно 45%, а увеличение числа семян на одно растение (выраженное на основании веса) попадает в пределы от, по крайней мере, примерно 5% до, по крайней мере, примерно 55%, в частности от, по крайней мере, примерно 10% до, по крайней мере, примерно 30%, и конкретно примерно 25%.

В еще одном осуществлении изобретения в растения или их семена также можно ввести химерные гены сусО2, с целью увеличения прорастания. Обнаружено, что трансгенные семена, включающие химерные гены сусЭ2 изобретения, могут прорастать быстрее по сравнению с контролями дикого типа на, по крайней мере, примерно 8-16 ч.

Более того, в растения также можно ввести упомянутые химерные гены с целью уменьшения среднего числа дней, необходимых до достижения развития цветорасположения, таким образом, эффективно уменьшая время, необходимое для начала цветения. Трансгенные растения, с включенными химерными генами сусЭ2 изобретения, таким образом, достигают зрелости, в частности стадии цветения, раньше, но имеют нормальные размеры цветущего растения. Фактическое уменьшение времени, необходимого до достижения стадии цветения, может зависеть от видов растений и от используемых химерных генов. Обычно трансгенные растения, несущие химерный ген, включающий сусЭ2 кодирующий участок ДНК под контролем про мотора СаМУ358, показывают уменьшение времени, необходимого до начала цветения, по крайней мере, от примерно 3 до примерно 1112%, в частности, по крайней мере, от примерно 4 до примерно 7%.

В другом осуществлении изобретения, увеличивают функциональную активность циклина Ό-типа, получая растение с измененным темпом роста или строения путем введения в геном клеток растения химерного гена, включающего следующие оперативно связанные фрагменты ДНК:

A) экспрессируемый в растении промоторный участок, в частности промоторный участок СаМУ358,

B) транскрибируемый участок ДНК, кодирующий белок, который при экспрессии увеличивает функциональную активность белка, контролирующего клеточное деление, предпочтительно, кодирующий мутантный белок, контролирующий клеточное деление, или часть мутантного белка, контролирующего клеточное деление, более предпочтительно, кодирующий мутантный циклин Ό-типа или часть циклина Όтипа, в частности, кодирующий циклин Ό-типа с мутацией в циклиновом боксе (конкретно замена аминокислоты 185 или аминокислоты 155 циклина 02-типа, в особенности Е185А или К155А) , или циклин Ό-типа, у которого удалены РЕ8Т последовательности, в частности, который делегирован по С-концу для удаления РЕ8Т последовательностей, или циклин Ό-типа, у которого изменен или делегирован ЬхСхЕ связывающий мотив, в частности, у которого делегирован С-остаток из ЬхСхЕ связывающего мотива; и необязательно

C) образование 3'-концевая структура и сигнал полиаденилирования, функционирующий в растительных клетках.

Никоим образом не ограничивая изобретение в отношении механизма действия, полагают, что мутантные белки, контролирующие клеточное деление, оказывают свое действие путем изолирования ингибиторов или антагонистов нормальных белков, контролирующих клеточное деление.

Особенно предпочтительная комбинация олигонуклеотидов для ПЦР амплификации растительных циклинов Ό2 типа представляет собой олигонуклеотид, выбранный из группы олигонуклеотидов, имеющих ДНК последовательности: 8ЕО ΙΌ N 12 или 8ЕО ΙΌ N 13 и олигонуклеотид, выбранный из группы олигонуклеотидов, имеющих ДНК последовательности: 8ЕО ΙΌ N 14 или 8ЕО ΙΌ N 15. Особенно предпочтительная комбинация олигонуклеотидов для ПЦР амплификации растительных циклинов Ό3 типа представляет собой олигонуклеотид, выбранный из группы олигонуклеотидов, имеющих ДНК последовательности: 8ЕО ΙΌ N 16 или 8ЕО ΙΌ N 17 или 8ЕО ΙΌ N 18 и олигонуклеотид, выбранный из группы олигонуклеотидов, имеющих

ДНК последовательности: 8ЕО ΙΌ N 19 или 8ЕО ΙΌ N 20. Амплифицированный фрагмент ДНК затем используют для отбора кДНК или геномной библиотеки (в строгих условиях) с целью получения клонов полной длины.

Иначе, дополнительные гены, кодирующие циклины, выделенные из растений, могут быть получены с помощью таких способов, как, но не ограничиваются ими: функциональное дополнение условных С1-8 циклин-дефицитных дрожжевых штаммов, как описано 8οηί е! а1. (1995) апб ИаЫ е! а1. (1995) или использование дрожжевой двухгибридной системы (Пе1б8 апб 8опд. 1989), с целью выделения последовательностей ДНК, кодирующих циклины, связывающие карманный домен КЬ-подобных белков, как описано выше.

Кроме того, известно, что некоторые растения содержат более одного гена, кодирующего циклин Ό-типа одной подгруппы (напр., табак содержит, по крайней мере, 2 гена из подгруппы СуеИЗ) и очевидно, что и эти варианты могут быть использованы в области изобретения.

Более того, для получения того же эффекта можно использовать циклины Ό-типа, которые имеют аминокислотную последовательность, в существенной мере похожую на те, что раскрыты в данном изобретении, например мутантные циклины Ό-типа. Выражение «аминокислотные последовательности, в существенной степени сходные», означает, что при выравнивании обоих рассматриваемых последовательностей, процент идентичности последовательности (то есть число позиций с идентичными аминокислотными остатками, деленное на число остатков в более короткой из двух аминокислотных последовательностей) выше 80%, предпочтительно, выше 90%. Выстраивание в ряд двух аминокислотных последовательностей выполняют по алгоритму ХУПЬиг апб Ыршапп (УбЬит апб Ыртапп, 1983), используя окно-размеры 20 аминокислот, с длиной слова в 2 аминокислоты и промежутком в 4. Компьютерный анализ и интерпретацию данных о последовательности, включая выстраивание в ряд последовательности, как описано выше, удобно проводить, используя программы 1п!еШдепебс§™ 8ш!е (1п!е11щепеЕс5 1пс., СА).

Понятно, что для конструирования химерных генов данного изобретения, контролирующих клеточное деление, можно использовать любую последовательность ДНК, кодирующую белок, контролирующий клеточное деление, в частности циклин Ό-типа, и особенно, последовательности ДНК, которые частично или полностью синтезированы человеком.

Понятно также, что для получения сходных эффектов можно использовать и другие промоторы, экспрессируемые растением, в частности конститутивные промоторы, например, промоторы опиновой синтазы Τι или Βί плазмид из АдтоЬас!епит, в частности, промотор нопалин-синтазы. Более того, как известно специалистам в данной области, существуют различные формы СаМУ358 промотора, и при использовании таких альтернативных СаМУ358 промоторов, а также тех, что описаны Ни11 апб Нотееб, У1то1оду, 86, р. 482 (1978), осуществление изобретения можно достигнуть в равной мере.

Следующим предметом изобретения является предоставление растений с измененной морфологией или строением, ограничений для специфических органов или тканей, с помощью использования ткане-специфичных или органоспецифичных промоторов для контроля экспрессии ДНК, кодирующей циклин Ό-типа. Такие ткане-специфичные или органоспецифичные промоторы хорошо известны в данной области и включают, не ограничиваясь ими, следующие: семя-специфичные промоторы (напр., У089/03887), органо-примордиальноспецифичные промоторы (Ап е! а1., 1996), стебель-специфичные промоторы (Ке11ег е! а1., 1988), листья-специфичные промоторы (Ниб5ре111 е! а1., 1989), мезофил-специфичные промоторы (такие как свето-индуцибельные промоторы КиЫксо), корне-специфичные промоторы (Ке11ег е! а1., 1989), клубне-специфичные промоторы (Кеб е! а1., 1989), промоторы, специфичные к васкулярной ткани (Ре1етап е! а1., 1989), меристема-специфичные промоторы (такие как промотор 8НООТМЕВ18ТЕМБЕ88 (8ТМ) гена, Ьопд е! а1., 1996), примордий-специфичный промотор (такой как промотор АпбтгЫпит СусО3а гена, Ооопап е! а1., 1998) и т.п.

В другом осуществлении данного изобретения, экспрессию химерного гена, кодирующего белок, контролирующий клеточное деление, при желании можно проконтролировать с помощью соответствующего химического индуктора, путем операбельного связывания участка ДНК, кодирующего белок, контролирующий клеточное деление, и промотора, экспрессию которого индуцируют химическим соединением, например, промотора гена, раскрытого в Еигореап Ра!еп! риЬбсабоп ЕР 0332104 или промотор гена, раскрытый в УО 90/08826.

В другом осуществлении изобретения, экспрессию химерного гена, кодирующего белок, контролирующий клеточное деление, такой как циклин Ό-типа, можно проконтролировать с помощью сайт-специфических рекомбиназ и соответствующих им цис-действующих последовательностей, например, путем вставки между промотором, экспрессируемым растением, и транскрибируемым участком, кодирующим белок, контролирующий клеточное деление, неродственной нуклеотидной последовательности (предпочтительно с сигналами окончания транскрипции и/или трансляции), фланкированной цис-действующими последовательностями, узнаваемыми сайт-специфической рекомбина зой (напр., 1ох или ЕВТ сайты); предоставляя растительные клетки, включающие этот химерный ген с сайт-специфической рекомбиназой (напр., Сге ЕЬР) так, что при рекомбинации вставленная неродственная нуклеотидная последовательность элиминируется, таким образом, придавая химерному гену, контролирующему клеточное деление, возможность экспрессироваться.

Считают, что морфологические изменения растений, полученные вследствие увеличения экспрессии циклинов Ό-типа, благодаря введению химерного гена, включающего участок ДНК, кодирующий циклин Ό-типа, под контролем экспрессируемого растением промотора, можно усилить путем удаления, переделки или инактивации РЕ8Т последовательностей. РЕ8Т последовательности представляют собой аминокислотные последовательности, богатые пролином, глютаматом или аспартатом, серином или треонином, локализованные между позитивно заряженными фланкирующими остатками, они участвуют в быстром обороте белка, включающего такие последовательности. (Туегк е! а1., 1992; Сгокк, 1988; АйепЬегд апб Вееб, 1988; 8а1ата е! а1., 1994). Удаление таких РЕ8Т последовательностей в дрожжевых циклинах стабилизирует циклины ίη νίνο (Ршек, 1995). РЕ8Т участки можно определить с помощью компьютерного анализа, используя такие программы, как РЕ8ТЕ1ЙЭ (Водегк е! а1., 1986; Вес11к1етег. 1990). Мутация ДНК, кодирующей белок, контролирующий клеточное деление, с изменением РЕ8Т последовательностей с помощью таких способов, как описаны, например, 8атЬгоок е! а1. (1989), является источником в пределах данной области.

В дальнейшем ожидают, что количественные эффекты фенотипических изменений можно модулировать, (то есть усиливать или репрессировать) с помощью экспрессии химерных генов, кодирующих эндогенный СусЭ, в качестве альтернативы применению гетерологичных генов из других растений, кодирующих похожие белки. Предпочтительно использование гетерологичных генов, в частности гетерологичных генов, кодирующих похожие белки с идентичностью аминокислотной последовательности с эндогенным белком, контролирующим клеточное деление менее чем на 65%, предпочтительно менее чем на 75%, наиболее предпочтительно менее чем на 65%.

В другом аспекте данного изобретения морфологию растений можно изменить с помощью уменьшения экспрессии циклина Э-типа. Этого можно достигнуть, используя, например, антисмысловую-РНК, рибозим или методики ко-супрессии. Наконец, в растительные клетки вводят, в частности стабильно интегрируют в геном растительных клеток, химерный ген, включающий транскрибируемый участок ДНК, который транскрибируется в РНК, продукция которой в свою очередь уменьшает, ингибирует или предотвращает экспрессию циклина Э-типа, в растительных клетках.

В возможном осуществлении данного аспекта, транскрибируемый участок ДНК химерного гена кодирует антисмысловую РНК, которая комплементарна, по крайней мере, части смысловой мРНК, кодирующей циклин Э-типа. Таким образом, антисмысловая РНК включает участок, который комплементарен части смысловой мРНК, предпочтительно на протяжении, по крайней мере, в 50 оснований по длине, в частности, по крайней мере, 100-1000 оснований по длине. Антисмысловая РНК может быть комплементарна любой части последовательности мРНК: она может быть комплементарна последовательности, близкой к 5' концу или кэппинг-сайту, или части или целому лидерного участка, комплементарна интронному или экзонному участку (или участку, соединяющему экзон и интрон), комплементарна смысловой пре-мРНК, или участку, между некодирующим и кодирующим участками, части или целому кодирующего участка, включая 3' конец кодирующего участка, и/или целому или части 3' или хвостового участка. Сходство последовательности между антисмысловой РНК и комплементарной ей смысловой РНК, кодирующей белок, контролирующий клеточное деление, должно быть в пределах, по крайней мере, от, примерно 75 до 100%.

В другом осуществлении этого аспекта, транскрибируемый участок ДНК химерного гена кодирует специфический РНК фермент или, так называемый, рибозим (см. например АО 98/05852), способный высокоспецифично расщеплять смысловую мРНК, кодирующую циклин Э-типа.

Еще в одном осуществлении уровень функционального циклина Ό-типа, можно уменьшить с помощью экспрессии химерного гена, включающего участок ДНК, кодирующий белок или полипептид, который при экспрессии уменьшает уровень циклина Ό-типа, или ингибирует циклин Ό-типа, с целью подавить его функцию в растительных клетках. Предпочтительно, чтобы химерный ген кодировал антитело, которое связывает циклин Э-типа.

Уменьшение содержания или функциональная активность циклина Ό-типа, в клетках трансгенного растения, с включенными химерными генами этого осуществления изобретения, приводит к изменению строения, особенно к уменьшению высоты стебля, уменьшению темпа роста или к задержке цветения у трансгенных растений по сравнению с нетрансформированными растениями, растущими в одних и тех же условиях. Полученный эффект может изменяться в зависимости от видов растений или от используемых химерных генов, и любой эффект строения и/или темпа роста, в частности уменьшения высоты стебля или темпа роста, или уве25 личение времени, необходимого для развития цветорасположения, входит в рамки данного изобретения.

Уменьшение темпа роста в результате уменьшения уровня циклина Б-типа, в частности циклина СУСБ2 типа, колеблется примерно от 30 до 60%, в частности примерно от 35 до 50%.

Уменьшение высоты стебля в результате уменьшения уровня циклина Б-типа, в частности циклина СУСБ2 типа, колеблется примерно от 10 до 60%, в частности примерно от 30 до 50%, конкретно около 40%.

Увеличение времени цветения в результате уменьшения уровня циклина Б-типа, в частности циклина Б2 типа, колеблется примерно от 10 до 40%, в частности примерно от 15 до 38%.

Химерный ген, контролирующий клеточное деление, кроме всего прочего, может включать регуляторную или другие последовательности, такие как лидерные последовательности (напр., саЬ22Ь лидер из Ре1ип1а или лидер омега из ΤΜV (СаШе е! а1., 1987), сигналы 3' транскрипционной терминации и полиаденилирования (напр., ген синтазы октопина (Бе Стеуе е! а1., 1982) или ген нопалин-синтазы (Берккет е! а1., 1982) или Т-ДНК ген 7 (Уе11еп апб ЗсНе11. 1985) и т.п. (Сиетшеаи е! а1., 1991; РгоибГоо!, 1991; ЗаГасоп е! а1., 1991; Модеп е! а1., 1990; Мипгое е! а1., 1990; Ва11ак е! а1., 1989; 1окЫ е! а1., 1987), согласованные последовательности инициирования трансляции у растений (1окЫ, 1987), интроны (Ьцейткеп апб Аа1Ьо!, 1991) и т.п., операбельно связанные с нуклеотидной последовательностью химерного гена, контролирующего клеточное деление, такого как ген циклина Бтипа.

Предпочтительно, чтобы рекомбинантная ДНК, включающая химерный ген, контролирующий клеточное деление, сопровождалась маркером химерного гена. Химерный маркерный ген может включать маркерную ДНК, которая операбельно связана с 5' концом экспрессируемого растением промотора, предпочтительно конститутивного промотора, такого как СаМУ35З, или светоиндуцируемого промотора, такого как промотор гена, кодирующий малую субъединицу РпЫксо; и операбельно связана с 3' концом подходящего транскрипционного 3' формирования у растений и сигналами полиаденилирования. Ожидают, что выбор маркерной ДНК не является критичным, и можно использовать любые подходящие маркерные ДНК. Например, маркерная ДНК может кодировать белок, который придает трансформированной клетке растения отличительный цвет, например, А1 ген (Меиег е! а1., 1987), может придавать трансформированной растительной клетке гербицидную устойчивость, так Ьаг ген, кодирует устойчивость к фосфинотрицину (ЕР 0 242 246), или может придавать трансформированным клеткам устойчивость к антибиотикам, как аас(6') ген, кодирующий устойчивость к гентамицину (АО 94/01560).

Хотя очевидно, что изобретение можно применять по существу ко всем видам и разновидностям растений, изобретение особенно подходит для изменения строения и увеличения темпа роста растений, имеющих коммерческое значение. Ожидают, что усиление вегетативного роста в большей степени проявится в растениях, которые не подвергали обширному разведению и селекции для ускорения вегетативного роста. Изобретение будет особенно уместно для растений, которые выращивают в оранжереях (теплицах), в особенности для уменьшения времени, необходимого тепличному растению до достижения требуемой стадии развития, например (но не ограничивается ими): цветение, образование плодов или образование семян. Кроме того, изобретение будет уместно для усиления темпа роста деревьев, особенно деревьев с мягкой древесиной, таких как сосна, тополь, эвкалипт и т. п. Другое важное приложение изобретения включает расширение эффективной территории, в пределах которой можно культивировать растения в результате уменьшения времени, необходимого для достижения экономически важной стадии развития. Особенно предпочтительными растениями для применения настоящего изобретения являются: кукуруза, маслянно-семенная капуста, льняное семя, пшеница, злаковые травы, люцерна, бобовые растения, Втаккка овощ, помидоры, латук, рис, ячмень, картофель, табак, сахарная свекла, подсолнечник, декоративные растения, такие как гвоздика, хризантема, розы, тюльпаны и т. п.

Рекомбинантную ДНК, включающую химерный ген, контролирующий клеточное деление, можно стабильно включить в ядерный геном клетки или растения. Генный перенос можно осуществить с помощью вектора, который представляет собой безвредную Τί-плазмиду, с включенным химерным геном изобретения, переносимую с помощью АдтоЬасктшш. Эту трансформацию можно осуществить, с помощью способов, описанных, например, в ЕР 0 116 718. Иначе, для трансформации растительной клетки можно использовать любой тип вектора, и способы его применения, например: прямой генный перенос (как описано, например, в ЕР 0 233 247), трансформация с помощью опыления (как описано, например, в ЕР 0 270 356, АО 85/01856 и ИЗ 4 684 611), вирус-опосредованная трансформация растительной РНК (как описано, например, в ЕР 0 067 553 и ИЗ 4 407 956), липосома-опосредованная трансформация (как описано, например, в ИЗ 4 536 475) и т.п.

Также подходят другие методы, например, бомбардировка микроснарядами, как описано

Етошш е! а1, (1990) и Сотбоп-Кашш е! а1. (1990) для кукурузы. Клетки однодольных растений, таких как важные злаки, также можно трансформировать, используя поврежденную и/или ферментативно расщепленную плотную эмбриогенную ткань, способную к образованию плотных эмбриогенных наплывов, или поврежденные и/или расщепленные незрелые эмбрионы, как описано в XVО 92/09696. Полученную трансформированную растительную клетку затем используют для регенерации трансформированного растения традиционным способом.

Полученное трансформированное растение можно использовать в традиционной схеме размножения для получения более трансформированных растений с теми же характеристиками, или для введения химерного гена, контролирующего клеточное деление изобретения в другие разновидности того же вида или родственные виды растения. Семена, полученные от трансформированных растений, содержат химерный ген изобретения, контролирующий клеточное деление, в качестве стабильного геномного включения.

Нижеследующие не ограничивающие примеры описывают конструирование химерных генов, контролирующих клеточное деление, и использование таких генов с целью модификации строения и темпа роста растений. В примерах, все методики рекомбинантных ДНК проводят в соответствии со стандартными протоколами, как описано 8атЬгоок е! а1., (1989) Мо1еси1аг С1оп1пд: А ЬаЬогаЮгу Мапиа1, 8есопб Ебйюи, бо1б 8ргшд НагЬог ЬаЬогаЮгу Ргекк, ΝΥ и в Уо1итек 1 и 2, АикиЬе1 е! а1., (1994) Ситтеи! Рго!осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Ситтеи! Рго!осо1к, И8А, кроме особо оговоренных случаев. Стандартные материалы и способы для молекулярной работы с растениями описаны в Р1аи! Мо1еси1аг Вю1оду ЬаЬГах (1993), Κ..Ό.Ό. Сгоу, совместно опубликовано с В1О8 8аепцПс РиЬйсайоик Ыб. (ИК) и В1аск\хе11 8с1еи!Шс РиЬйсайоик, ИК.

На всем протяжении описания и примеров даны ссылки на следующие последовательности:

8ЕЦ ГО N 1: кДНК, кодирующая Мсойаиа !аЬасит СУСГО2:1

8ЕЦ ГО N 2: кДНК, кодирующая N койапа !аЬасит СΥС^3;1

8ЕЦ ГО N 3: кДНК, кодирующая Мсойаиа !аЬасит СΥС^3;2

8ЕЦ ГО N 4: кДНК, кодирующая НейаиШик !иЬегокик СΥС^1;1

8ЕЦ ГО N 5: кДНК, кодирующая НейаиШик !иЬетокик СΥС^3;1

8ЕС ГО N 6: Т-ДНК рб8У5

8ЕЦ ГО N 7: ПЦР праймер 1 8ЕЦ ГО N 8: ПЦР праймер 2 8ЕЦ ГО N 9: ПЦР праймер 3 8ЕЦ ГО N 10: ПЦР праймер 4 8ЕЦ ГО N 11: ПЦР праймер 5 8ЕЦ ГО N 12: ПЦР праймер 6 8ЕЦ ГО N 13: ПЦР праймер 1 8ЕЦ ГО N 14: ПЦР праймер 8 8ЕЦ ГО N 15: ПЦР праймер 9 8ЕЦ ГО N 16: ПЦР праймер 10

8ЕЦ ГО N 17: ПЦР праймер 11 8ЕЦ ГО N 18: ПЦР праймер 12 8ЕЦ ГО N 19: ПЦР праймер 13 8ЕЦ ГО N 20: ПЦР праймер 14 8ЕЦ ГО N 21: кДНК, кодирующая 2еа таук С.УСГО2

Плазмиды рСЕС1 и рСРК.9 помещены в хранилище в Ве1д1аи Соотбта!еб СоПесйопк о£ Мктоотдашктк (ВССМ) ЬаЬогаЮпит уоог Мо1еси1аие Вю1од1е-Р1акпибесо11есие (ЬМВР) ип1уегк1(е11 беи!

КУУебедаискк!гаа! 35

В-9000 беи! Ве1дшт марта 1997 года и им присвоены следующие номера хранения:

МС 1061(рСЕС1): ВССМТОМВР3657

ИН5« (рСВК9): ВССМ/ЬМВР3656

Плазмиды рВ1ие8ст1р!-2М18 помещены в хранилище в Ве1д1аи Соотбта!еб СоПесйопк о£ М|сгоогдап1ктк (ВССМ) ЬаЬогаЮпит уоог Мо1еси1аие Вю1од1е-Р1акпибесо11есие (ЬМВР) ип1уегк11е11 беи!

КУУебедаискк!гаа! 35

В-9000 беи! Ве1дшт 19 марта 1998 года под номером хранения:

ВССМТОМВР 3866.

Примеры

Пример 1. Конструирование химерных генов.

1.1. Конструирование химерного гена СаМУ358-А111сусО2 и его включение в Т-ДНК вектор.

Жо1-8ас1 фрагмент в 1298 п.о., включающий ДНК, кодирующую С'.УСГО2 из А. 1йайапа (имеющую нуклеотидную последовательность ЕМВБ Ассеккюи N Х83370 с нуклеотидной позиции 194 до нуклеотидной позиции 1332) обрабатывают полимеразой Клёнова, образуя тупые концы из выступающих, и присоединяют к 8та1 линеаризированной рАКТ7 (б1еауе, 1992), получая плазмиду рСЕС1. Таким образом, конструируют химерный ген, фланкированный №11 сайтами, в котором ДНК, кодирующая С'.УСГО2. операбельно связана с СаМУ358 промотором СаЬЬВ-Л изолята (Нагрк!ег е! а1., 1988) и 3'оск участком (МасЭопа1б е! а1., 1991). Затем, химерный ген вставляют между Т-ДНК границей ТДНК вектора, включающего также выбранный химерный маркерный ген.

С этого конца химерный сусЭ2 ген отрезают от рСЕС 1, используя №!1, и связывают с №б линеаризированной рАКТ27 (б1еауе, 1992), получая рСЕС8. рАКТ27 включает выбранный химерный маркерный ген, состоящий из следующих операбельно связанных фрагментов: промотор гена нопалин-синтазы, пео кодирующий участок и 3' конец гена нопалин-синтазы (Аи е! а1., 1988).

Иначе, химерный ген сусИ2 отрезают от рСЕС1, используя соответствующий рестрикционный фермент (например, №11) и вводят в полилинкер между Т-ДНК граничными последо29 вательностями Т-ДНК вектора рС8У8 вместе с выбранным химерным маркерным геном (р88ИЬаг-3'оск; Эе А1те1ба е! а1., 1989), получая рСЕС8Ь.

рС8У5 получают из плазмиды рС8С1700 (СогпеШкеп апб Уапбе\у1е1е, 1989) , но она отличается от последней тем, что не содержит гена бета-лактамазы, и тем, что ее Т-ДНК характеризуется последовательностью 8ЕЦ ΙΌ Νο 6.

Пример 2. Опосредованная АдгоЬас1епит трансформация растений табака Т-ДНК векторами из примера 1.

Т-ДНК вектор рСЕС5 вводят ЛдгоЬас1епит 1итеГас1епк ЬВЛ4404 (К1ар\\рк е! а1., 1980) с помощью электропорации, как описано ^Уа1кегреаск апб Уе1!еп (1995), и отбирают трансформантов, используя соответственно спектиномицин и тетрациклин.

Т-ДНК вектор рСЕС8Ь вводят в А. ТитеГааепк С58С1В1ГК с помощью трехродительского скрещивания (ΌίΙΙη е! а1., 1980).

Полученные штаммы АдгоЬас!егшт используют для трансформации Мсобапа !аЬасит уаг Хап1Ы, применяя способ листовой б1кс трансформации, как описано Ап е! а1., 1985.

Одиннадцать растений табака трансформировали рСЕС5 (обозначают С8 линии с 1 по 3 и с 5 по 12).

Растения, трансформированные рСЕС5 ТДНК, анализируют на копированное число вставленных трансгенов с помощью 8ои111егп гибридизации, используя ВатН1, расщепленную ДНК, полученную из этих растений, и меченный 0,7 т.п.н. №о1-ЕсоШ фрагмент из 122 кДНК (включающий часть сусЭ2 кодирующего участка; 8ош е! а1., 1995). Все линии С8-2, С8-3, С8-5, С8-8, С8-1, С8-9, С8-10, С8-11, С8-12 имеют одну копию трансгена, линия С8-7 имеет две копии, линия С8-6 имеет три копии, и линия С81 имеет четыре копии трансгена.

ТО (первичные трансформанты) являются самовоспроизводящимися, и позволяют собрать семена (Т1 семена). Растения, выращенные из Т1 семян, обозначили С8-Т1-Х, где Х означает номер линии исходного трансформанта. Семена от Т1 растений относятся к Т2 семени; растения, выращенные из таких семян называют С8-Т2-Х, где Х вновь является номером исходного трансформанта. Когда поколение не упоминают, значит растения проращены из Т1 семени.

№г111егп анализ подтвердил транскрипцию трансгенов, по крайней мере, у линий С8-1, С83, С8-7, 3К9, 4К9 и 8К9.

Пример 3. Фенотипический анализ трансформированных растений табака.

3.1. Растения табака, с включенным СаМУ358-АЛСусО2 химерным геном.

Семена от первичных трансформантов (ТО растений) поверхностно стерилизуют в 10% хлорной извести в течение 15 мин и основательно промывают стерильной водой. Поверхностно-стерилизованные семена проращивают на

СМ среде, содержащей канамицин в конечной концентрации 100 мкг/мл. Семена на плашках помещают на 5 дней в 4°С (яровизация) и затем переносят в ростовую камеру при 23 °С. Все временные точки относят ко дню помещения в ростовую камеру. Через 18 дней после помещения в ростовую камеру (то есть после 23 дней в целом), канамицин-резистентные саженцы перемещают в семянной лоток, содержащий землю, и выращивают при фотопериоде в 18 ч в ростовой комнате. Еще через 10 дней эти растения переносят в 3-дюймовые растительные горшочки, и еще через дополнительные 15 дней переносят в 8-дюймовые растительные горошки, где они остаются все остальное время эксперимента, 3-й 8-дюймовые растительные горшочки инкубируют в теплице, поддерживая при дополнительном освещении, достигая 18 часового фотопериода. В пределах теплицы растения размещают случайным образом.

Измерения начинают через два дня, (то есть через 45 дней или через 27 дней в земле; обозначают неделя 1), и повторяют каждую неделю в течение семи недель, как предписано. Для каждой линии анализируют следующее количество растений: 22 растения для линии С8-1, 7 растений для линии С8-7, 5 растений для линии С8-8, 6 растений для линии С8-9, 4 растения для линии С8-10, 6 растений для линии С8-11, 5 растений для линии С8-12, 34 растения для нетрансформированного контроля (дикий тип).

Анализируют следующие параметры: высоту растения от поверхности земли до самой высокой точки (то есть до растущей верхушки; результаты в табл. 1 как средняя высота ± стандартное отклонение в см); длину самого большого листа в определенное время (результаты в табл. 2 как средняя длина ± стандартное отклонение в см), время (результаты в табл. 3 как среднее время ± стандартное отклонение в днях), при котором меристема цветорасположения видна невооруженным глазом (цветорасположение в 0,25 см и 1 см); высота, на которой видна меристема цветорасположения (результаты в табл. 3 как средняя длина ± стандартное отклонение в см); длина лепестковой трубки цветков; ширина шейки лепестковой трубки (результаты в табл. 3 как средняя длина и ширина ± стандартное отклонение в мм); общее число семенных коробочек на растение; средний семенной выход (на основании веса) на растение.

Трансгенные растения показывают повышенный темп роста, проявляющийся со стадии посадки, приводящий к увеличению средней высоты стебля (табл. 1). Во временную точку неделя 3, все популяции трансгенных линий значимо больше, чем нетрансформированные контроли (ΐ-тест; при доверительном интервале 95%), а линии С8-1, С8-2, С8-3, С8-5, С8-11 значимо больше, чем нетрансформированные контроли, при доверительном интервале 99%. Уве личенный темп роста также выражается в среднем больших листьях в определенные моменты времени, которые соответствуют периоду, во время которого еще продолжается развитие листа (табл. 2) а также больших цветках, у которых лепестковая трубка в среднем длиннее у трансгенных растений, по сравнению с лепестковой трубкой цветков ^трансформированных растений.

Также у трансгенных растений увеличено число цветков, а также число плодоносящих цветков, что проявляется в большем числе семенных коробочек, и большем семенном выходе на растение (результаты в табл. 4А). Более того, количество семян на коробочку больше у трансгенных растений, чем у растений контрольного дикого типа. Отклонение от нормы семенного выхода в линии С8-Т1-6 возникло благодаря высокому проценту ампутации цветков.

Таким образом, можно сделать заключение, что постоянная экспрессия А111СусО2 кодирующей ДНК приводит к увеличению как числа семенных коробочек, так и общего выхода семян на одно растение.

В конце сравнивают корневое развитие саженцев дикого типа и трансгенных саженцев (табл. 4В). Семена стерилизуют, сеят в плашки с СМ средой без селекции, яровизуют, и затем помещают в вертикальном положении в ростовую комнату. Длину корня измеряют через 9 и 13 дней после яровизации и регистрируют наличие боковых корней. Используют семена линии С8-Т1-7 и С8-Т2-2 (гомозиготы). Линия С8-Т1-7 имеет две вставки, которые расщепляются приблизительно 15:1 на канамициновых плашках. Из этой линии проращивают 35 саженцев, и оказалось, что три из них, показывали тот же темп роста, что и наблюдаемый в саженцах дикого типа. Результаты от этих саженцев регистрировали отдельно, через девять дней после яровизации. Для определения значимости разницы средних значений применяют ΐ-тест, и уровень значимости отмечен в таблице. N8 означает отсутствие значимой разницы между образцами. Таким образом, оказалось, что увеличение вегетативного роста в апикальных частях сбалансировано равнозначным увеличением корневого развития.

Таблица 1

Среднее значение высоты (в см) трансформированных растений табака с включенным СаМУ358-А1сусЭ2

Линия	Неделя 1 (45 дней)	Неделя 2 (51 день)	Неделя 3 (59 дней)	Неделя 4 (65 дней)	Неделя 5 (73 дня)	Неделя 6 (81 день)	Неделя 7 (89 дней)
С8-Т1-1	5,86+2,45	13,71+3,43	38,91+6,61	63,09+9,69	99,42+10,25	123,30+24,60	137,09+31,90
С8-Т1-2	8,50+1,23	18,29+2,21	49,86+4,73	77,64+4,73	117,14+10,71	147,71+17,75	168,00+9,93
С8-Т1-3	8,61+2,59	17,41+4,94	43,14+9,08	66,61+11,04	100,41+15,57	134,95+21,17	145,73+22,15
С8-Т1-5	6,81+1,16	16,31+1,89	44,38+3,66	70,69+5,30	106,50+6,12	143,63+12,33	159,88+9,88
С8-Т1-6	4,83+1,75	10,75+2,51	33,10+6,47	52,67+5,83	84,83+8,08	120,50+13,73	141,80+5,63
С8-Т1-7	8,64+3,04	18,82+4,56	48,32+6,12	74,66+7,12	111,50+8,38	149,59+11,05	169,14+11,99
С8-Т1-8	5,50+1,41	13,2+2,41	41,2+2,17	62,40+3,98	97,40+8,08	34,20+5,63	156,80+11,86
С8-Т1-9	3,75+1,44	10,58+3,32	35,67+6,80	62,17+9,72	100,67+12,24	137,83+2,34	162,17+18,67
С8-Т1-10	9,88+1,89	21,00+4,08	47,75+8,02	75,38+7,11	113,75+9,21	152,75+11,99	164,50+177,2
С8-Т1-11	10,00+2,30	19,51+3,82	45,17+5,63	72,25+5,50	103,33+11,52	144,58+5,63	152,83+18,28
С8-Т1-12	9,20+2,66	17,9+5,15	42,8+11,01	68,6+13,32	103,40+14,40	140,80+12,16	161,8+10,76
Дикий тип	4,48+1,63	10,50+3,33	31,82+6,62	54,00+7,89	86,56+10,91	121,81+18,28	145,18+19,44

Таблица 2. Среднее значение длины листа (в см) самого большого листа трансформированных растений табака с включенным СаМУ358-А1сусЭ2.

Линия	Неделя 1	Неделя 2	Неделя 3
С8-Т1-1	13,500+1,846	19,909+2,004	27,114+2,182
С8-Т1-2	16,643+1,282	23,500+1,354	29,643+1,842
С8-Т1-3	15,955+2,400	20,951+3,737	27,341+3,095
С8-Т1-5	15,062+1,635	21,563+1,741	28,875+2,372
С8-Т1-6	14,667+1,402	20,833+1,807	29,927+1,201
С8-Т1-7	15,886+1,718	22,000+1,498	28,909+1,974
С8-Т1-8	14,167+2,229	20,500+1,871	27,583+1,856
С8-Т1-9	12,417+2,035	18,917+2,010	26,333+2,113
С8-Т1-10	14,750+2,693	20,167+2,825	27,583+2,635
С8-Т1-11	15,833+2,113	21,333+1,602	28,333+1,722
С8-Т1-12	14,600+1,432	21,400+1,475	28,100+2,608
Дикий тип	12,676+1,846	18,691+2,280	26,352+1,960

Таблица 3А. Цветковое развитие (средняя высота для цветорасположения в 0,25 см или 1 см (в см), среднее время, необходимое для достижения цветорасположения в 0,25 см или 1см (в днях после яровизации) у табака, трансформированного СаМУ358А111СусО2.

Линия	Среднее время до цветорасположения в 0,25 см, дни	Среднее время до цветорасположения в 1 см, дни	Средняя высота при цветорасположении в 1 см, см
С8-Т1-1	67,35+4,580	74,75+4,541	105,5+21,670
С8-Т1-2	65,42+2,573	72,00+3,546	110,6+21,439
С8-Т1-3	68,77+3,436	74,32+3,414	106,5+14,134
С8-Т1-5	70,25+2,712	76,63+2,387	122,4+6,737
С8-Т1-6	68,00+2,828	73,33+2,944	117,0+5,550
С8-Т1-7	70,95+3,034	77,15+2,852	133,4+14,497
С8-Т1-8	72,60+3,286	77,60+2,793	116,1+5,482
С8-Т1-9	73,17+3,251	79,50+2,429	129,25+10,324

С8-Т1-10	72,50±2,517	77,75±2,986	127,7±19,202
С8-Т1-11	66,67±1,033	73,17±2,137	104,6±4,924
С8-Т1-12	70,00±4,000	76,40±3,715	121,6±7,893
Среднее значение	69,61±2,587	75,69±2,329	117,70±10,082
Дикий тип	74,90±3,222	79,09±2,342	111±10,020

Таблица ЗВ. Цветковое развитие (среднее значение величины цветка, то есть длины и ширины (мм) ) табака, трансформированного СаМУ358А1йСусО2.

Измеряют длину и ширину 5 цветков от каждого растения, и подсчитывают среднее значение ширины и длины цветка для каждой трансгенной линии. Значения для каждой независимой трансгенной линии сравнивают с таковым дикого типа, используя ΐ-тест. Таблица показывает уровень вероятности, при котором результаты являются статистически значимыми по сравнению с диким типом, пк означает отсутствие значимой разницы.

Линия	Среднее значение длины цветка, мм	Уровень значимости	Среднее значение ширины цветка, мм	Уровень значимости
С8-Т1-1	47,22±2,261	Р<0,001	33,45±1,668	Р<0,001
С8-Т1-2	44,19±1,848	Р<0,01	31,14±1,486	Р<0,001
С8-Т1-3	41,30±1,720	№	31,04±1,360	Р<0,001
С8-Т1-5	47,30±2,822	Р<0,002	33,30±1,945	Р<0,001
С8-Т1-6	50,78±1,990	Р<0,001	34,25±1,467	Р<0,001
С8-Т1-7	48,04±2,604	Р<0,001	33,19±1,391	Р<0,001
С8-Т1-8	42,90±1,252	№	30,13±2,270	№
С8-Т1-9	45,12±1,906	Р<0,01	30,56±1,333	Р<0,002
С8-Т1-10	44,60±1,627	Р<0,01	30,93±2,002	Р<0,01
С8-Т1-11	42,40±1,891	№	29,10±2,998	№
С8-Т1-12	42,57±0,978	Р<0,05	28,55±1,190	Р<0,05
Среднее значение	45,093±2,877	Р<0,002	31,43±1,886	Р<0,001
Дикий тип	41,22±1,005	-	26,76±1,099	-

Таблица 4А. Среднее количество семенных коробочек на растение, средний вес семян, содержащихся в шести коробочках (г), средний семенной выход на растение (г) у табака, трансформированного СаМУ358А1йСусО2

Линия	Среднее количество семенных коробочек	Средний вес семенного содержимого 6 коробочек, к	Средний семенной на 1 растение, г
С8-Т1-1	105,15±14,96	1,085±0,174	19,015
С8-Т1-2	127,29±7,82	0,824±0,137	17,481
С8-Т1-3	110,46±16,30	1,106±0,179	20,361
С8-Т1-5	97,86±10,81	1,105±0,178	18,023
С8-Т1-6	78,60±12,97	1,078±0,150	14,123
С8-Т1-7	118,17±15,64	1,131±0,253	22,275
С8-Т1-8	123,75±4,78	1,123±0,165	23,162
С8-Т1-9	110,83±20,91	1,090±0,218	20,134
С8-Т1-10	104,20±10,99	1,122±0,311	19,485
С8-Т1-11	138,20±8,35	1,116±0,222	25,705
С8-Т1-12	106,20±12,62	1,134±0,056	20,072
Дикий тип	106,73±16,47	0,938±0,118	16,685

Таблица 4В. Сравнение корневого развития саженцев дикого типа и трансгенных саженцев.

Линия	Число рас- тений	% боковых корней	Средняя длина корня, мм		Уровень значимости
9 дней после яровизации
УТ	23	36	15,326	±1,893
С8-Т1-7	25	100	26,520	±1,971	0,001
	3	33	14,000	±3,464	№
С8-Т2-2	28	100	26,911	±2,064	0,001
13 дней после я!	ровизации
Дикий тип	16	100	28,188	±1,893
С8-Т1-7	13	100	53,846	±1,971	0,001
С8-Т2-2	15	100	51,267	±3,464	0,001

Пример 4. Выделение СусО-гомологичных генов из других растений.

кДНК библиотеку, полученную от экспоненциально растущих ΒΥ-2 клеток табака конструируют в ЬатЬба Ζαρ Ехргекк векторе (8!га!адепе). Приблизительно 7,5х10⁵ библиотечных клонов высевают на чашки, и делают реплика-блоты с каждой чашки, используя НуЬопб N' найлоновые мембраны (Атегкйат Ιηΐ), которые затем фиксируют с помощью обжига при 80°С в течение 2 ч. Мембраны гибридизуют с сусЭ2 гетерологичными зондами, меченными а-³²Р бСТР путем случайного примирования. СусЭ2 зонд состоит из 1298 п.о. №о1-8ас1 фрагмента сусЭ2 из А. !йайапа (имеющего нуклеотидную последовательность ЕМВЬ Ассеккюп Ν Х83370 с нуклеотидной позиции 194 до нуклеотидной позиции 1332). СусЭ3 гибридизации проводят при 55°С, и мембраны дважды промывают в в 2х88С/0, 1%.

Литература

Ап е! а1., 1985 ЕМВО 1. 4: 277-284

Ап е! а1., 1988 Вшагу уес!отк 1п: ОеМп 8В, 8с1п1регоог1 КА, Уегта ΌΡ8 (ебк) Р1зп! Мо1еси1аг Вю1оду Мапиа1 ррА3/1-А3/19. Кйптег Асабепнс РыЬНкНегк. Оогбгесй!).

Ап е! а1., 1996, Тйе Р1ап! Се11 8: 15-30

Апбо е! а1., 1993, Ргос. Να!1. Асаб. 8сй И8А 90: 8571-9575

А1йет!оп-Рекк1ег е! а1., 1993 8етт. Се11 Вю1. 4: 433-442

АикиЬе1 е! а1. 1994 Сиггеп! Рго!осо1к т Мо1еси1аг Вю1оду. Сиггеп! Рго!осо1к, И8А.

Ва1бт е! а1. 1993 Оепек Эеу. 7: 812-821

Ва11ак е! а1. 1989 №с1. Ас1бк Кек. 17: 78917903

Ветагбк е! а1. 1989 Ргос. Να!1. Асаб. 8ск

И8А 86: 6474-6478

Воейтей е! а1. 1994 Се11 ОгоМй Όίίίετ. 5:

221-230

Сй1а!ап!е е! а1. 1993 Р1ап! 8сй 89: 13-21

Со1акап!1 е! а1. 1991 Ргос. №111. Асаб. 8сй

И8А 88: 3377-3381

Со1азап!1 е1 а1. 1993 Р1ап! Се11 5: 1101-1111

Согпекззеп апй Уапйе\\к1е 1989 №01. Ас1йз Кез. 17: 833

Сгозз 1988, Мо1. Се11. Вю1. 8: 4675-4684

Сгоу 1993 Р1ап1 Мо1еси1аг Вк1оду ЬаЬГах ВЮ8 8с1епИГ1с РиЬксакопз Ий. (ИК) апй В1аск\те11 8скп!Шс РиЫкакопз, ИК.

ОаЛ1 е1 а1. 1995 Р1ап! Се11 7:1847-1857

Оау апй Кеййу 1994 ВксЫт. Вкркуз. Ас!а Сепе 81гис!. Ехргезз. 1218: 115-118

Ое А1те1йа е! а1. 1989 Мо1. Сеп. Сепе!. 218: 78-86

Ое В1оск е! а1. 1987 ЕтЬо 1. 6: 2513-2518

Ое В1оск е! а1. 1989 Р1ап! Ркузк1. 91: 694

Ое Сгеуе е! а1. 1982 1. Мо1. Арр1. Сепе!. 1: 499

Оерккег е! а1. 1982 1. Мо1. Арр1. Сепе!. 1: 561

Пезкее е! а1. 1992 Эет Вю1. 153: 141-149

Этск апй №зту111 1991 №!иге 351: 754757

ΌίΙΙη е! а1. 1980 Ргос. №!1. Асай. 8ск И8А 77: 7347-7351

Ооегпег е! а1. 1996 №11иге 380: 520-523

Эоопап е! а1. 1998 т Р1ап! Се11 ОМзкп (Егапаз, ΌιιώΙζ апй Л^е, Ейз.) РогИапй Ргезз, Ьопйоп.

9о\\й\ е! а1. 1993 Се1173:499-511

Эи е! а1. 1996 Сепез апй Пеуе1ортеп! 10: 1206-1218

ЭигГее е! а1. 1993 Сепез апй Оете1ортеп1 7:555-569

Еуапз апй уап'! НоГ, 1974 Ехр. Се11 Кез. 87: 259-264

Еуапз е! а1., 1983 Се11 33: 389-396

Е\теп е! а1. 1991 Се11 66: 1155-1164 Е\теп е! а1. 1993 Се11 73:487-497

Еапд апй №\\рог1 1991 Се11 66: 731-742

ЕеЛег апй 1асоЬз 1990 Ргос. №!1. Асай. 8ск И8А 87: 5397-5401

ЕеЛ1о!ег е! а1. 1994 №с1. Ас1йз Кез. 22:1502-1503

Ееггека е! а1. 1991 Р1ап! Се11 3: 531-540

Е1е1йз апй 8опд 1989 №11иге 340: 245-246

ЕоЬей е! а1. 1994 ЕМВО 1. 13: 616-624

Еготт е! а1. 1990 В1о/ТесЛпо1оду 8: 833

Еиегз! е! а1. 1996 Р1ап! Ркузк1. 112: 10231033

СаШе е! а1. 1987 №с1. Ас1йз Кез. 15: 32573273

С1еауе 1992 Р1ап! Мо1. Вю1. 20: 1203-1207

Согйоп-Катт е! а1. 1990 Тке Р1ап! Се11 2:603

Сои1й е! а1. 1981 Рго!ор1азта 106: 1-13

СгаЛ апй Ьагкшз 1995 8скпсе 269: 12621264

СгаЛ е! а1. 1996 Ргос. №!1. Асай. 8ск И8А 93: 8962-8967

Сиегтеаи е! а1. 1991 Мо1. Сеп. Сепе!. 226:141-144

Наппоп е! а1. 1993 Сепез Όον. 7: 2378-2391

На!а е! а1. 1991 ЕМВО 1 10: 2681-2688

Нагрег е! а1. 1993 Се11 75: 805-816

Нагрз!ег е! а1. 1988 Мо1. Сеп. Сепе!. 212: 182-190

Наг1\те11 1974 Вас!епо1. Кеу. 38: 164-198

Нетег1у е! а1. 1992 Ргос. №И. Асай. 8ск И8А 89: 3295-3299

Нетег1у е! а1. 1995 ЕМВО 1. 14: 3295-3299 НЛауата е! а1. 1991 Сепе 105: 159-165

НиГ е! а1., 1991 Ргос. №И. Асай. 8ск И8А 88: 1636-1640

Н1й е! а1., 1992 Р1ап! Се11 4: 1531-1538

Н1й е! а1., 1993 Р1ап! 1. 4: 61-69

Но\тагй апй Ре1с, 1953 НегейЛу 6 (зирр1.): 216-273

Нийзре!к е! а1. 1989 Р1ап! Мо1 Вк1 12: 579589

1оЛп е! а1. 1989 Р1ап! Се11 1: 1185-1193

1оЛп е! а1. 1990 1. Се11 8ск 97: 627-630

1оЛп е! а1. 1991 Рго!ор!азта 161: 70-74 1о1тзоп е! а1., 1993 №11иге 365: 349-352 1опез е! а1. 1992 Тгапздеп. Кезеагск 1: 285297

1озЛ1 е! а1. 1987 №с1. Ас1йз Кез. 15: 96279639

1озЫ 1987 №с1. Ас1йз Кез. 15: 6643-6653

КеЛ е! а1., 1989 ЕМВО 1. 8: 1323-1330 Ке11ег е! а1. 1988 ЕМВО 1. 7: 3625-3633

Ке11ег е! а1. 1989 Сепез Оеуек 3: 1639-1646

1<1ар\\дк е! а1. 1980 1. Вас!епо1. 141: 128136

КоГГе е! а1. 1991 Се11 66:1217-1228

КоГГе е! а1. 1992 8скпсе 257: 1689-1694 КоГГ е! а1. 1993 8с1епсе 260: 536-539 ^μζ апй 8ске11 1986 Мо1. Сеп. Сепе!. 204: 383

Ьакие е! а1. 1991 Сепез Эет. 5: 2166-2175

Ьеоро1й апй О'Еагге11 1991 Се11 66: 12071216

Ьее е! а1. 1987 книге 329: 642-645

Еем е! а1. 1991 Се11 66: 1197-1206

Ьопд е! а1. 1996 книге 379: 66-69

ЬиеЛгзеп апй ^а1Ьо! 1991 Мо1. Сеп. Сепе!. 225: 81-93

МасЭопа1й е! а1. 1991/Нис1. Ас1йз. Кез. 19: 5575-5581

Ма!зизЫте е! а1. 1991 Се11 65: 701-713 Ма!зизЫте е! а1. 1992 Се11 71: 323-334

Меуег е! а1. 1987 книге 330: 677

Меуегзоп апй Наг1о\т 1994 Мо1. Се11. Вю1. 14: 2077-2086

Меуегзоп е! а1. 1991 Со1й 8рппд НагЬог 8утр. ОиапН Вю1. 56: 177-186

Меуегзоп е! а1. 1992 ЕМВО 1. 11: 2909-2917

М1ао е! а1. 1993 Ргос. №И. Асай. 8ск И8А 90: 943-947

Мккетоге е! а1. 1987 Р1ап! Се11 Кер. 6: 439-442

Мшеуик1 е! а1. 1991 Рго!ор1азта 162: 182186

Модеп е! а1. 1990 Р1ап! Се11, 2: 1261-1272

Мипгое е! а1. 1990 Сепе, 91: 151-158

3Ί

МигакЫде апб 8коод 1962 Ркукюк Р1ап!. 15: 473

Миггау е! а1. 1989 №11иге 339: 280-286 №18шу111 1993 Сигг. 0ρίη. Се11. Вю1. 5: 166179 №νίηκ 1992 8с1епсе 258: 424-429

№.1гке 1990 №11иге 344: 503-508

0к!киЬо апб КоЬейк 1993 8с1епсе 259: 1908-1912

0'КеШу е! а1., 1992. Васи1оу1гик ехргеккюп νес!ο^κ - А ЬаЬога!огу тапиа1. Егеетап апб Со. №\у Уогк

Рагбее 1989 8с1епсе 246: 603-608

Ре1етап е! а1. 1989 Сепе 84: 359-369

Рке1рк е! а1. 1992 I. Уйо1. 66: 2418-2427

Ртек, 1993 Тгепбк Вюскет. 8ск 18: 195197

Ртек 1995 Вюскет I. 308: 697-711

Ртек 1995 Абν. Сапсег Кек. 66: 181-212

РгоибГоо! 1991 Се11, 64:671-674

Оие11е е! а1. 1993 Сепек 1)е\. 7: 1559-1571

Кескк!етег 1990 8ет1пагк Се11 Вю1. 1: 433440

Кееб 1991 Тгепбк Сепе!. 7:95-99

Кепаибт е! а1. 1994 Ргос. №111. Асаб. 8ск И8А 91: 7375-7379

Кепаибт е! а1. 1996 Р1ап! Мо1еси1аг Вю1оду 32: 1003-1018

Кюкагбкоп е! а1., 1989 Се11 59:1127-113

Кодегк е! а1. 1986 8аепсе 234: 364-368 8аЕасоп е! а1. 1991 Сепек Эеу 5: 141-149

8а1ата е! а1. 1994 Мо1. Се11. Вю1. 14: 79537966

8атЬгоок е! а1. 1989 Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, 8есопб Ебйюп, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, NΥ

8еутд е! а1. 1993 I. Се1. 8οΐ. 104: 545-555

8пебесог апб Соскгап 1967 8!а!1кйса1 Ме!кобк Тке !о\уа 8!а!е Ипгуегкйу Ргекк, Атек, Ьуа, И.8.А.

8о1отоп 1993 Сигг. 0рт. Се11 Вю1. 5: 180186

8от е! а1. 1995 Тке Р1ап! Се11 7: 85-103

Тка1 е! а1. 1993а Эеуе1ортеп1 119: 10291040

Тка1 е! а1. 1993Ь 0псодепе 8: 1593-1602

Туегк е! а1. 1992 ЕМВ0 I. 11: 1773-1784

Туегк е! а1., 1993 ЕМВ0 I. 12: 1955-1968 νаη беп Неиуе1 апб Наг1оу 1993 8аепсе 262: 2050-2054 νаη'! НоГ апб Коуаск 1972 Л Тке Оупатюк ок Мепк!ет Се11 РорШайопк, М.ХУ. МШег апб СС Кеикпей, ебк (NΥ: Р1епит) рр 15-32 νаη'! НоГ, 1985 Л Тке Се11 ОМкюп Сус1е ш Р1ап!к, ЕА. Вгуап! апб Ό. Егапак, ебк (СатЬпбде: СатЬпбде Итуегкйу Ргекк) рр 1-13

Уе1!еп апб 8ске11 1985 №с1. Ас1бк Кек. 13: 6998

Ха1кегреаск апб Уейеп 1995 Л: СеМп 8В, 8скйрегоой КА, Уегта ЭР8 (ебк) Р1ап! Мо1еси1аг В1о1оду Мапиа1 рр В1/1-В1/19. К1иуег Асабетю РиЬНккегк, Оогбгеск!

ХУПЬиг апб Ыртапп 1983 Ргос. №11. Асаб.

8с1. и.8.А. 80: 726 ХУ1тте1 е! а1. 1994 0псодепе 9: 995-997

ХУШепЬегд апб Кееб 1988 Се11 54: 10611072

ХУшепЬегд е! а1. 1990 Се11 62: 225-237 Хе е! а1. 1996 ЕМВ0 I. 15: 4900-4908

Хюпд е! а1., 1992 Се11 71: 505-514

Хюпд е! а1., 1991 Се11 65: 691-699

Перечень последовательностей (1) Общая информация:

(ί) Заявитель:

(a) Название: СатЬпбде Итуегкйу Тесктса1 8егу1сек Ь!б.

(b) Улица: Тке 01б 8скоо1к Тг1пИу Ьапе (c) Город: СатЬпбде (е) Страна: Ипйеб Ктдбот (Г) Индекс (ΖΙΓ): СВ2 1Т8 (д) телефон: 44-1223334755 (к) телефакс: 44-1223332797 (ίί) Название изобретения: Растения с измененным ростом.

(ΐϊϊ) Количество последовательностей: 21. (ίν) Компьютерная форма:

(а) тип диска: гибкий диск (в) компьютер: ГВМ РС совместимый (с) операционная система: РС-Э08/М8Ό08 (б) программное обеспечение: Ра!еп! Л Ке1еаке #1.0,

Уегкюп #1.30 (ЕР0)

Информация для 8ЕО ΙΌ №: 1: (ί) характеристики последовательности:

(а) длина: 1284 пар оснований (в) тип: нуклеиновая кислота (с) спираль: двойная (б) топология: линейная (ίί) молекулярный тип: кДНК для мРНК (ίίί) гипотетичность: нет (ίν) антисмысловая: нет (у)источник происхождения: (а) организм: Мсойапа !аЬасит (ίχ) особенности:

(а) имя/ключ: (в) локализация: 182 1243 (б) другая информация:/запись=«кДНК, кодирующая циклин СУСЭ2;1”» (χί) описание последовательности: 8ЕО ΙΌ №: 1:

САААТТТТТС ТСССТТСТАТ АСТСТСТТТС СТСТТСТСТТ АААААТССТТ АААААТТТАТ60

ТТТТТТТААС ААТСТСАТ6Т АААТВВЗАТТ АААТТТТСТА ААААТАТААЗ АТТТТСАТАА120

АЗВВССТТТА АТТАТААСАТ АСТАААТТАА ВАТТТТТТТТ ТТССТТТССТ АСТТТССТТТ180

ААТВВСАССТ САТААСАТТТ АТЗАТТТТВТ АСССТСАААТ С7ТТТАТВТА САЗАААСААА240

ААЗТСТТТСТ ТТТОАТСАТЗ ТТЗАТТСТТТ САСТАТДАВТ СААСАСААСА ТТЗАААСТАА300

ЗАЗТАААЗАС ТТЗАЗСТТТА АСААТЗСТАТ ТАСАТСАСАС ССДТТЗАТТЗ АТТТСССААС360

ТТТААСТСАА СААТССТТЗА ЗТТТТАТССТ ССАААЗЗСАА АТВЗАСТТТТ ТСССТАААЗА420

ТСАТТАТЗТС САСАСАТТСА ВААСТСВАВА ТТТССАТТТС АСТСТЗАСАА ААВАВВСТСТ480

ТВАТТСЗАТТ ТТВААСВСТС АТАТВСАСТА ТЗЗАТТТЗВА ЗАВСТВАВТТ ТТТСТТТВТС540

САТАААТТАС ТТСВАТСВАТ ТТСТАТСТСТ СТАТСААТТС ССААСААСТА АААСТТСЗАС600

АСТОСААТТС ТТАССТВТЗЗ ССТСТСТАТС АСТТЗСАЗСС ААААТСЗААС АААТТААТСТ660

ТССТТТВАСТ СТТЗАТТТАС АЗВТАЗЗЗЗА ТСССАААТТТ ВТАТТТСААЗ ССААААСТАТ720

АСАААСААТС ЗААСТТТТСС ТАТТААССАС АТТВААЗТСВ АСААТССААС СТТАТАСАСС780

ТТАСАСАТТС АТАВАТТАТТ ТТАТВАЗААА ОАТ5ААТССТ САТСАААТСС САТСТССССС840

СТТЗАТТТСТ ВЗАТСААТВС ААСТСАТАТТ ААССАТААТА АСААСТАТТС АТТТСТТСВА900

АТТСАССТСТ ТСТСАААТТС САВСАТСАСТ СЗСААТСТСТ СТТТСАВЗЗС АААТАСААСС960

ААААСАСАТТ ЗАТААЗЗСАА ТЗССТТВСТТ СТТСАТАСАС ТТАСАСААСС СТАЗАЗТЗСА1020

ЗААСТСТСТТ СААСТСАТТС ААВАТТТВАС ААСТССТАСТ АТТАСТАСТС СТССТССТСС1080

СТСАТТАВТА ССТСАААСТС СТАТТВВАЗТ СТТ5СААССА ССАССАТССТ ТВАВСТАСАА1140

ААЗТЗЗТЗАТ САСАЗААСАЗ ТТЗВАТСАТС ТАСААСТТСТ ТСАСАТАСТА АААЗЗАЗААА1200

АСТТС-АСАСА ТСАТСТТТАС АССАТЗЗЗАС ТТСАВААААВ ТТСТСААТСТ ВААТТТТССС 1260 ТТТТТААААА АААААААААА АААА12В4

Информация для 8ЕО ΙΌ №: 2:

(ί) характеристики последовательности:

(а) длина: 1679 пар оснований (в) тип: нуклеиновая кислота (с) спираль: двойная (й)топология: линейная (ίί) молекулярный тип: кДНК для мРНК (ίίί) гипотетическая: нет (ίν) антисмысловая: нет (ν) источник происхождения:

(а) организм: Шсойапа 1аЬасит (1х)особенности:

(а) имя/ключ: (в) локализация: 181.....1299 (й) другая информация :/запись=«кДНК, кодирующая циклин

СУСИ3;1» (χί) описание последовательности: 8ЕЦ ΙΌ №: 2:

АААСЗАВТСТ СТСТСТАСТС СТССТССТАТ АВСТТТТСТС ТСТТСТТСТС ТТСАСАССТС60

ССАСААСАСА СААТСАСАСА ААА7АВАСАЗ СААААТЗАЗТ АТВСТЗАААА АВСТТТСТТТ120

ТСТАТААТСА САААААОАСА ТТТАТАТАСА ТСТСТТСТТС ТАСТТССТТС ТТАСТАЗААЗ180

АТЗССААТАЗ ААСАСААТСА ЗСААСААВАА СТАТСТСААТ СТТТТСТТТТ АСАТССТСТТ240

ТАСТСТСААС ААСААСААЗА ААААТЗЗЗЗА САТТТАЗТАС АТЗАТЗАСАС ТАТТАТТАСА300

ССАСТСТСТТ САЗААВТААС ААСААСААСА АСААСААСАА САААЗССТАА ТТСТТТАТТА360

ССТТТЗСТТТ ТЗТТЗЗААСА АВАТТТАТТТ ТС63ААВАТВ ААВАЗСТТСТ ТТСАСТТТТС420

ТСТАААЗААА ААВАААСССА ТТСТТЗЗТТТ ААСАСТТТТС ААСАТСАСТС ТТТАСТСТСТ480

ТСТВСССВТС ТТЗАТТСТСТ 6СААТЗЗАТТ ТТААААСТСА АТЗСТТАТТА ТССТТТСТСТ540

ЗСТТТСАСТС ССВТТТТАВС СА7АААТТАС ТТТЗАСАСЗТ ТТСТЗАСТАЗ ТСТТСАТТАТ600

САСАААСАТА ААССТТСЗАТ ВАТТСААСТТ ССТЗСТСТТА СТТЗТСТТТС ТТТАЗСТЗСТ660

АААСТТВААС АААСТСААСТ ТССТСТТСТТ ТТАЗАТТТТС ААСТССАССА ТССТАААТАТ720

СТЗТТТСАЗЗ САААААСТАТ ТСАААСААТС ЗАЗСТТТТА6 ТСТТВТСТТС АСТААААТВВ780

АЗЗАТВААТС САЗТЗАСССС АСТ7ТСАТТТ СТТЗАТСАТА ТТАТААССАС ССТТССССТА840

АСАААТААТА ТТСАСТСВВА АТТТСТТАСА АСАТСТВААА АТСТССТССТ СТСТАТТАТВ900

ССТСАТТС7А ЗАТТССТАСС ТТАТАТСССС ТСТЗТАТТЗВ ССАСТЗСААТ ТАТССТТСАС960

СТТАТТСАТС ААСТТСАВСС ТТ37ААТТСТ СТТЗАСТАСС ААААТСААСТ ТСТТЗСЗСТТ1020

СТСААААТТА АСААСВАЗАА АЗТЗААТААТ ТССТТТСААС ТСАТАТСАСА АСТСТСТТСТ1080

ААВСССАТТТ САСАСАААСС САААТАТСАС ААТССТАЗТС АТАВСССААВ ТЗСТВТААТТ1140

САТССААТТТ АСАЗТТСАВА ААСТТСАААТ САТТСАТСЗЗ АТТТЗЗАЗТС ААСАТСТТСА1200

ТАТТТТССТЗ ТТТТСААЗАА ААЗСАВАСТА СААЗААСАЗС АААТСАААТТ СЗСАТСТТСА1260

АТТАВСАСАВ ТТТТТВТЗВА АЗСТЗТТСЗТ АЗТССТСАТТ ААААТСААТС АССТВАТТТА1320

ТСТСТТТТСТ ТТСТТАТТАС СААСТАТСЗТ СЗТААТААТА ТТТАТТСАТА ТТСАЗААЗТА1380

ТТТАССТТТА АТЗТСАТТТТ САААААТТАС АТЗААААТСС АААААААСАА ААЗААЗАЗСТ1440

ТАЗСТВВТВС ТТЗСАЗТТЗВ САЗАЗААСАС ЗАСТЗССТТТ ТТТТТССАВС АСТЗТАВТСТ1500

АСТАСТАСТЗ ЗАААССАЗАВ АТАЗАВАЗАЗ ЗАВААААСАС АЗААААТСТС САСТАТТТВТ1560

ТТТТТСТСТА ТТСАТАТСАА ТТСТСТСТТА ЗОТССТТТТС АТВСАТССАТ АСТТТТСАТЗ1620

ЗАСАТАТТТТ АТАТАТТТАС ТАТААТСАТА ААТТСТТСАА ТААААААААА ΆΑΑΑΑΑΑΑΑ1679

Информация для 8ЕО ΙΌ №: 3:

(ί) характеристики последовательности:

(а) длина: 1431 пар оснований (в) тип: нуклеиновая кислота (с) спираль: двойная (й) топология: линейная (ίί) молекулярный тип: кДНК для мРНК (ίίί) гипотетическая: нет (ίν) антисмысловая: нет (νί) источник происхождения:

(а) организм: Шсойапа 1аЬасит (ίχ) особенности:

(а) имя/ключ: (в) локализация: 198.....1298 (й) другая информация:/запись=«кДНК, кодирующая циклин

СУСИ3;2» (χί) описание последовательности: 8ЕЦ ΙΌ №: 3:

САССТТТАСТ СТСТТСТССТ ТТТТСЗСТСТ ТСССАТТСТС ТССТТСТСТТ ТСТТТАТТТТ60

СТЗТССТСТА ЗАЗАЗАЗАЗА ЗАААЗТАТАА ССАААССАСС АЗАТАТСТТА СТСЗСТССАА120

САТТСАСТТТ ТЗЗСТТАССТ ТСААСАТААТ ЗАЗТАСАССС ТОСАТТСТСТ ТСТТСССТСА180

АСААСААСАА ЗААЗААЗАТЗ ЗТТТТСССТТ ТАСАТАСТСА ССТССТАААТ ССААТСТТТЗ240

АТЗТССТТТА СТЗТСАЗЗАА ЗАТСЗАТТС? ТССАСЗАТЗА ТЗАТТТАСЗА ЗААТССТСТА300

ЗТАСТТТАЗА АСААСТАСВА ААТААТЗТЗА ААААЗАСТСТ АЗСТТТАТТА СААТЗТЗАСА360

ТЗТТТТСЗЗА АЗАТСАССАЗ СТТЗТСАСТС ТТТТААСТАА ЗЗАААААЗАЗ ТСТСАТТТСЗ420

ЗТТТТЗАТТЗ ТТТААТСТСА ЗАТЗСАСАТС ССТТТТТАЗТ СЗАССТТАСА АААСАСЗСАТ480

ТЗЗАТТЗЗАТ 6ТТСАЗАЗТС АТТССТСАСТ АТССТТТСАС ТЗСТАТСАСТ ЗСТСТТТТАС540

СТСТСААТТА ТТТТСАТАЗС Т7ТЗТАТСТЗ ЗАСТСТССТТ ТСАСАААЗАТ ААСССТТССА600

ТЗАЗТСААСТ ТССТССТ6ТЗ ССТТСТСТТТ СТАТТЗСТЗС ТАААСТСЗАА 6А6АСССААЗ660

ТСССССТТСТ СТТАЗАССТС СААСТЗССТЗ АТТСААЗАТТ ТВТСТТТЗАЗ ЗСАААСАСТА720

ТТСАВАСААТ СЗААСТСТТЗ СТССТСТССА СТСТТААЗТС ВААААТСААТ ССАВТВАСАС780

САСТАТСТТТ САТТЗАТСАТ АТСАТ5АВЗА ЗАТТТСЗАТТ САТСАССААТ СТАСАТТТВВ840

АТТТТСТТАВ ВАСАТСТСАА ССССТСАТТС ТТССТАТТАТ САСТЗАТТСТ АВВСТСТТСС900

АТТАТССТСС АТСТСТТАТТ ВСААСТССАС ТАВТВТАТТТ СЗТВАТСААТ СА6АТТЗАВС960

СТТССААТЗС ААТСВААТАС САВААТСАСС ТСАТСАСТЗТ ТСТТАААЗТС АААСАЗВАТА1020

СТТТТЗААВА АТВССАТСАТ СТТАТТСТАС АВСТААТ366 САСТТСТССС ТАСААТАТСТ1080

ЗССАААЗССТ СААЗСЗСЛАА САТСААТСГТС’ТАССТСССАС ТССААВТСВА СТТАТСВАТЗ 1140 САТАТТТТА5 ТТЗССАСАСС ТСТААТЗАТТ ССТВСТСВВТ АССАТСТТСА АТТТСАТССТ1200

САССАВААСС ТСАВТАТААВ АВСАТСАААА СТСАСВАТСА ВАСААТСАСА СТСЗСТССАС1260

ТЗАСТТСТ37 ТТСТСТСЗТТ ВТВВССАСТА ЗТССТСЗТТЗ АТСАЗТАТСТ СА7ТСТСТАЗ1320

АТТАТСТАВТ АТТАСЗЗСТА ТЗЗТТАСТАТ АТВАТСТСТС ТТТТТТЗЗТА ТЗТТСТСТТА1380

ААСТССАВТ7 ВСАСААТВСТ СТЗАТВТТСС АТТААААААА АААААААААА А1431

Информация для 8ЕО ΙΌ №: 4:

(ί) характеристики последовательности:

(а) длина: 1788 пар оснований (в) тип: нуклеиновая кислота (с) спираль: одинарная (й)топология: линейная (ίί) молекулярный тип: кДНК для мРНК (ίίί) гипотетическая: нет (ίν) антисмысловая: нет (ν) источник происхождения:

(а) организм: НейапШик !иЬегокик (ίχ) особенности:

(а) имя/ключ: (в) локализация: 1б5.....1109 (б) другая информация :/запись=«кДНК, кодирующая циклин

СУСБ1;1» (χί) описание последовательности: 8ЕЦ Ш \о: 4:

САСААСААТС АСТТСТАСТС АСТАТТСАСТ АСТТАСТААТ САСТССААСТ ТСТССЗСССА60

СТТТТСАСС? САААСССССЗ ЕААСТССЕСС ССТССССТСЗ АСССТСААТС АСТСААТСТТ120

АЕСААТТАТС ТТСАСААСАС ТАТЕААСААТ СААСАССЗЕТ САТСАТСТСА АТСТССТССТ180

СТЗАСТЗСТТ СТСССАСТТА СТСТССТССС АЗОАСТСССС САТАТТАТСС ССССАССАСС240

СОССССАС7С СТССТАТСАТ ТТССААТАТТ СССССЗАСТТ ТСАТЗАТТСЕ АТСССССАЕТ300

ТТАТАЕААСА ЕЗАЕАЕАААЕ ТТССТТССАС ЕААТСЕАТТА ССТССАСССА ТТТСААТСЕС360

ААЗТТСТССА ТССТТСТССТ АЗАЕААОААТ ССЗТТСССТС САТССТТААЕ СТССААСССТ420

ТТТАССЗАТ? ТСАССССТТЕ АСЕЕССТАСС ТСТСССТТАА СТАТСТОЕАТ ССТТТСАТСТ490

АТТЕССЗТЕЗ СТТСССЕЕТС ЕСАААТСЕЕТ ЕЕСССТТЕСА АСТСТТАТСТ СТАЕСАТССТ540

ТЕТСТТТАЕС ТССТААААТС ОАЕЕАААССС ТТАТТССТТС ТАТТСТТЕАТ СТССАСЕТТЕ600

ААЗСТССААА АТАТАТТТТС ЕАССССАААА СААТСССААС ААТССАСТТТ СТТЕТЕСТТА660

СТСТТТТОЕА ТТССАЕАСТА АЕАТСССТТА САССЗТТТАЕ СТТТАТСССС ТТСТТТТССС720

АСААААТСЕА ТССАТСТЕЕА АТЗТАТАСЕС СТТТССТТАТ СТСААЕЗЗСА АСАСАААТТА790

ТССТСТСААА ТАТТСААСАА ЕСТАЕТТТАС ТТСАЗТАТТС СССАТСАТСТ АТТССТССТС840

СААСААТАСТ ТТЕТССАЕСА АЕТЕАТСТТТ СТАААТТСТС АСТТАТСААТ ЗСТСАТСА900

СТЕААТСАТЕ СТСТСАТССС СТТАЕСАААС А ЗАЛЕ АТ САС ААААТСТТАС АСАСТТСТАС960

ААТСТССААА САТАТТСССС СТАСАТЕТТС САСТСАТСАС ЗССТСЗАЕТС АСТАСТСАСТ 1020 САССТСАСТС АТССТССТСС ТСТТСТТСЗС САТССССТТА САААААЗАСС АААСТАААТА 1060 АСТАСТСАТЕ САТАСАЗЕАС 5АСААААЕАТ СААААТААСС АЗАСААААТА ААТАААТААА 1140 ТССЗЗАТТСС ТСТСТАТАТТ ТТТТАААЕЗА АТСААСАААТ АТАТАТАААА ААААААААТС 1200 ЗАСТСАЕЕАА ААЕСААСЕАА АЕССЕССЕСА СЕААЕААААЕ ССЕССЗЗАЕС ОАСЕААЕААЕ 1260 ТСССТСАСАА АЕТСССТСАА АЕССЕЗТСТС САЕТТССССС ТСЗСААЕААТ СЕСТАСЗТТТ 1320 СТАААААААС СССЕАТАСЗС ТСААССТАСС СЗАТСССЗАЕ СТССЕАТСТА ССТТЕСТССТ 1390 СТТСТАСААТ АССТТССТСС ТЕАССТТТТЕ САСТТССССС ЕАААТССАЕС ОАСАЕАТААС 1440 ААЕААЕАСАА ЕСАТАААССС ТАЕЕСАСТТЕ СТАТТЕЗСТС ТТАСЕААСЕА ТЗА5СААТТС 1500 СССАДАТТЕС ТТЕСТЕЕТЕТ ТАСТАТТССТ АЕТЕЕАЕЕТС ТСТТССССАА ТАТСААТССС 1560 ЗТТСТТТТСС ССААСААСТС ТТСТТСТТСТ ТСТЕСТЕСТС АСААЕАСССС САААТСТААА 1620 ААЕТСЗССТА ААААЕЕСТСС ТТАСАТАЕАТ СТТТСТЕЕТТ АТАСТТЕСТТ АЗАТТААСТТ 1690 СААЕСААААС АСТСТСТТТТ ЕТТСААТТАЗ ТССТСТСЕСА АТСТААСТАТ ТТТЕСТССТС 1740 ТТСААААТСТ ТААТТЕЕАТА СТАТСТТСТТ ТААААААААА АААААААА 1788

Информация для 8ЕЦ Ш Но: 5: (ί) характеристики последовательности: (а) длина: 1414 пар оснований (в) тип: нуклеиновая кислота (с) спираль: двойная (о.) топология: линейная (ίί) молекулярный тип: кДНК для мРНК (ίίί) гипотетическая: нет (ίν) антисмысловая: нет (у)источник происхождения: (а) организм: НейапШик !иЬегокик (ίχ) особенности:

(а) имя/ключ: (в) локализация: 48.....1118 (б) другая информация :/запись=«кДНК, кодирующая циклин

СУСО3;1» (χί) описание последовательности: 8ЕЦ Ш

Ко: 5:

ТТЕААССТТС АТТТСТТТТС ТТТТСТТСТТ ТСТААТСАСС ААССССААТЗ ЕССАТТТТАТ60

САССАТАТТС АТСТТСТТТС ТТАЕАСАСАС ТСТТТТЕСАА ТЗААСААСАА ЕАТСАТСААТ120

АТСАТЕААТА ТСАСТАТСАА ЕАТЕААТТТА САСАААССАС ССТСАСАЕАТ ТСАТСТЕАТС180

ТССАТСТТСС СССССТЕСАС СААСТАЕАТТ ТСТСАТСЕЕА АСАТЕААЕАЕ СТТСТСТССТ240

ТСТТСАСААД АЕААСААЕАЕ САССАААААС АААССССТТС ТАСТСТСТСТ ТТТСССАААА300

СТАСТСССТС АЗТТТТТССТ ЕСТССТАААЕ АЕССТЕТАСА ТТСЗАТССТТ ААЕСТСАААА360

ЕТТЗТТАТЕЕ АТТСАСАССТ СТТАСАЗССА ТТТТАЕССАТ СААТТАТСТТ ОАТАССТТТС420

ТТТСТАСССТ ССАТТТТСАА ЗААСАТАААС СТТЗЕАТЕАТ ТСААСТТСТТ ЕСТЕТТАЕТТ480

СТСТСТСТТТ АССТССТААА ЗТТЗААСААА СТСААЕТЕСС АСТСТТАСТА САТСТТСААС540

ТАЗАЗСАСАС ТААЕТАСТТС ТТТСАЕССТА ААААСАТАСА АААААТЗСАС СТТТТЗСТСА600

ТСТСААСТТТ ЕАААТЕЗАЕС АТЕААСССАЕ ТЗАСАССААТ СТСАТТТСТТ ЕАТСАСАТТС660

ТААСААЕЗСТ ТЗОАТТААСТ ЗАТСАТЕТТС АТТЕССАТТТ ТТТСААЕААА ТСТСААЕСТА720

ТЕАТССТТТС ТТТАСТТТСА ЕАТТСААЕАТ ТСЕТЗТЕТТА ТАААССАТСС СТЕТТЕСССА780

САССТАСААТ ССТТСАСЕТТ СТАЕАТСААА ТТЕАТССТСС СААТТСТАТТ САСТАСААААВ40

СТСААСТТСТ ЕЗАТСТТСТС ААААССАСТА АЕЕАСЕАСАТ АААССА5ТСТ ТАССАССТСА900

ТТСТССАЗСТ АССТТАСЕАТ САТСАСААСА ААССААААСА ТЕАТССАААС ЕАСАСААСАА960

ССААТССССТ ТАСТССАЕСТ ЕЗССТЕАТСС АТТТСАСТТС ТЗАТСАААЗТ ТСАААТЕАЕТ1020

САТСЕСААСТ ТААТЕСТСАТ САТТТССЕСС АСССТТСАТТ СААЕААААСА АЕААТСЕАТТ1080

СААСААТТСС СЗТТСЕЕЕТТ ТЕЕТТСАСТТ АТААЕСТТТА АТСЗАСЗСТА СТТСТАААСА1140

ТЕТААТСССС АТЕСАСЗСТА ТТААТССТАС ЕЕТССАСТАС ТАСАТАТААТ СССССТАТАА1200

ААТТАТАСЕТ ТААСАТСАСС АЕТСЕТАСЕС СТСЕАЕАТСТ ССТТАТССТТ ЕСТСААТТТС1260

ТСТАТЗСТТТ ТАОЕТСЕТТТ ТТААТСТЕАС ΑΤΑΑΑΤΤΑΆΑ ТТССЗТАТСТ ТААСТСТТТА1320

ТСААЕСААТС ЗАССТТАТАТ ТТАТТСТТТЕ АТАТТСАЕАА ТТАААТТССА ТСЕЗАААААА1380

АААААААААА АААААААААА АААААААААА АААА1414

Информация для 8ЕЦ Ш №: б: (ί) характеристики последовательности:

(а) длина: 100 пар оснований (в) тип: нуклеиновая кислота (с) спираль: двойная (б) топология: линейная (ίί) молекулярный тип: другая нуклеиновая кислота (а) описание :/бекс = «ДНК последовательность Т-ДНК Р68У5» (ίίί) гипотетическая: нет (ίν) антисмысловая: нет (ίχ) особенности:

(а) имя/ключ: (в) локализация: 1.....25 (б) другая информация :/метка= КВ /запись=правая граница последовательности из Т-ДНК Р68У5» (ίχ) особенности:

(а) имя/ключ: (в) локализация: 2б.....75 (б) другая информация:/метка = МС8 /запись = составной сайт клонирования (ίχ) особенности:

(а) имя/ключ: (в) локализация: 7б.....100 (б) другая информация :/метка = ЬВ /запись = левая граница последовательности из Т-ДНК р68У5 (χί) описание последовательности: 8ЕЦ Ш Ио: б:

ААТТАСААСС ЕТАТАТАТСС ТСССАСТАСТ ССЕСССТССА ССССЕСТАСС ССЗСЗААССТ 60

ТАСАТССАТС САЕССАТТТА СААТТСААТА ТАТССТЗССЕ ¹⁰⁰

Информация для 8ЕЦ Ш №: 7: (ί) характеристики последовательности:

(а) длина: 17 пар оснований (в) тип: нуклеиновая кислота (с)спираль: одинарная (б) топология: линейная (ίί) молекулярный тип: другая нуклеиновая кислота (а) описание :/йекс = «олигонуклеотидный праймер 1 для ПЦР» (χί) описание последовательности: 8ЕО ΙΌ №: 7:

0СМТ00АТУС ТУАА00Т

Информация для 8ЕО ΙΌ №: 8: (ί) характеристики последовательности:

(а) длина: 17 пар оснований (в) тип: нуклеиновая кислота (с)спираль: одинарная (й)топология: линейная (ίί) молекулярный тип: другая нуклеиновая кислота (а) описание :/йекс = «олигонуклеотидный праймер 2 для ПЦР» (χί) описание последовательности: 8ЕО ΙΌ №: 8:

Т0СТТ0ТС№Т ТА0СТ0С

Информация для 8ЕО ΙΌ №: 9: (ί) характеристики последовательности:

(а) длина: 18 пар оснований (в) тип: нуклеиновая кислота (с) спираль: одинарная (й) топология: линейная (ίί) молекулярный тип: другая нуклеиновая кислота (а) описание :/йекс = «олигонуклеотидный праймер 3 для ПЦР» (χί) описание последовательности: 8ЕО ΙΌ №: 9:

АА0ААТ00АК УТТСТТ0Т

Информация для 8ЕО ΙΌ №: 10: (ί) характеристики последовательности:

(а) длина: 19 пар оснований (в) тип: нуклеиновая кислота (с) спираль: одинарная (й) топология: линейная (ίί) молекулярный тип: другая нуклеиновая кислота (а) описание :/йекс = «олигонуклеотидный праймер 4 для ПЦР» (χί) описание последовательности: 8ЕО ΙΌ №: 10:

АЯЛб^ТУСУ К0С№0СА0С Информация для 8ЕО ΙΌ №: 11:

(ί) характеристики последовательности:

(а) длина: 19 пар оснований (в) тип: нуклеиновая кислота (с) спираль: одинарная (й) топология: линейная (ίί) молекулярный тип: другая нуклеиновая кислота (а) описание :/йекс = «олигонуклеотидный праймер 5 для ПЦР» (χί) описание последовательности: 8ЕО ΙΌ N0: 11:

ССЯТСАСАСС А№0БГУТСА0 19

Информация для 8Е0 ΙΌ №: 12: (ί) характеристики последовательности:

(а) длина: 16 пар оснований (в) тип: нуклеиновая кислота (с) спираль: одинарная (й) топология: линейная (ίί) молекулярный тип: другая нуклеиновая кислота (а) описание:/йекс = «олигонуклеотидный праймер 6 для ПЦР» (χί) описание последовательности: 8Е0 ΙΌ №: 12:

Т00№0АТТТ0 0АТТТ0 16

Информация для 8Е0 ΙΌ №: 13: (ί) характеристики последовательности:

(а) длина: 17 пар оснований (в) тип: нуклеиновая кислота (с) спираль: одинарная (й) топология: линейная (ίί) молекулярный тип: другая нуклеиновая кислота (а) описание:/йекс = «олигонуклеотидный праймер 7 для ПЦР» (χί) описание последовательности: 8Е0 ΙΌ №: 13:

А’ШААЭТАСТ Т00АТС017

Информация для 8Е0 ΙΌ №: 14: (ί) характеристики последовательности:

(а) длина: 19 пар оснований (в) тип: нуклеиновая кислота (с) спираль: одинарная (й) топология: линейная (ίί) молекулярный тип: другая нуклеиновая кислота (а) описание:/йекс = «олигонуклеотидный праймер 8 для ПЦР» (χί) описание последовательности: 8Е0 ΙΌ №: 14:

А0СТТ0САЭТ СТССАЭТТС 19

Информация для 8Е0 ΙΌ №: 15: (ί) характеристики последовательности:

(а) длина: 17 пар оснований (в) тип: нуклеиновая кислота (с)спираль: одинарная (й)топология: линейная (ίί) молекулярный тип: другая нуклеиновая кислота (а) описание:/йекс = «олигонуклеотидный праймер 9 для ПЦР» (χί) описание последовательности: 8Е0 ΙΌ №: 15:

ТСА0АА0^С ТСААЭТС 17

Информация для 8Е0 ΙΌ №: 16: (ί) характеристики последовательности:

(а) длина: 17 пар оснований (в) тип: нуклеиновая кислота (с) спираль: одинарная (й) топология: линейная (ίί) молекулярный тип: другая нуклеиновая кислота (а) описание:/йекс = «олигонуклеотидный праймер 10 для ПЦР» (χί) описание последовательности: 8Е0 ΙΌ №: 16:

0АКГ00А1ЪГУ ’тААЯбТ 17

Информация для 8ЕЦ ΙΌ №: 17: (ί) характеристики последовательности:

(а) длина: 17 пар оснований (в) тип: нуклеиновая кислота (с)спираль: одинарная (б) топология: линейная (ίί) молекулярный тип: другая нуклеиновая кислота (а) описание :/бекс = «олигонуклеотидный праймер 11 для ПЦР» (χί) описание последовательности: 8ЕЦ ΙΌ №: 17:

АА6АВААКСС νΤΟΟΑΤΟ 17

Информация для 8ЕЦ ΙΌ №: 18: (ί) характеристики последовательности:

(а) длина: 20 пар оснований (в) тип: нуклеиновая кислота (с) спираль: одинарная (б) топология: линейная (ίί) молекулярный тип: другая нуклеиновая кислота (а) описание :/бекс = «олигонуклеотидный праймер 12 для ПЦР» (χί) описание последовательности: 8ЕЦ ΙΌ №: 18:

6ТК6ЛА6АКЛ СТСАА6ТВСС 20

Информация для 8ЕЦ ΙΌ №: 19: (ί) характеристики последовательности:

(а) длина: 24 пар оснований (в) тип: нуклеиновая кислота (с) спираль: одинарная (б) топология: линейная (ίί) молекулярный тип: другая нуклеиновая кислота (а) описание:/бекс = «олигонуклеотидный праймер 13 для ПЦР» (χί) описание последовательности: 8ЕЦ ΙΌ №: 19:

ТССХСТХ.АСУ ССХТКСАТУУ ТССА 24

Информация для 8ЕЦ ΙΌ №: 20: (ί) характеристики последовательности:

(а) длина: 20 пар оснований (в) тип: нуклеиновая кислота (с) спираль: одинарная (б) топология: линейная (ίί) молекулярный тип: другая нуклеиновая кислота (а) описание: /бекс = «олигонуклеотидный праймер РВ14 для ПЦР» (χί) описание последовательности: 8ЕЦ ΙΌ №: 20:

6СV6NN6СNЛ NNNСЛ6ЛN66 20

Информация для 8ЕЦ ΙΌ №: 21: (ί) характеристики последовательности:

(а) длина: 1846 пар оснований (в) тип: нуклеиновая кислота (с) спираль: двойная (б) топология: линейная (ίί) молекулярный тип: кДНК для мРНК (ΐϊϊ) гипотетическая: нет (ίν) антисмысловая: нет (ν) источник происхождения:

(а) организм: 2еа таук (ίχ) особенности:

(а) название/ключ: (в) локализация: 316.....1389 (с) другая информант/запись = «кДНК, кодирующая циклин

СУСО2» (χί) описание последовательности: 8ЕЦ ΙΌ №: 21:

СТЗСАСТСЗС СТАЗССС5СС тсстсстссс сстстснсзс ТССТСТСТСС ТССССТСТСС60

АСТТЗАЗААС ААСАСААТТА СЗАААААААС ССААААААСА ТТТАССТТТТ ТТСТАТСТСТ120

АТАТТАТСТЗ ААТАААТСАА САССАССААС АЗЗЗЗАСССА 0С0АСССАЗС 5СЗАССАСТА180

ССАААТССАС АСТССАТАСС ААССАССТСЗ СЗАЗААЗЗЗО ААААЗЗЗЗЗА ЗЗААЗАЗСТТ240

СЗСТТЗТЗТА ТТЗАТТЗСТС ССТССТССАЗ ТСССТЗСАТТ СЗТЗСССТТТ ТТЗЗСААСТА300

ССТЗЗСЗТСС СААССАТССТ ЗССЗЗЗСТАТ САСТСССССЗ ССТСССТССТ ССТСТССССС360

САЗСАЗААСЗ СТССТАТТСТ ССЗССТЗЗАС САССАТСССС АЗЗАСТССТС СТСССССССС420

СССЗСТАССС СЗССАССТЗА САССЗТСЗСС ССССССЗССС ССАССЗССЗТ СЗССЗТСЗАТ480

СЗСАТТТТЗА СЗЗАЗТТССС СТТССТСТСЗ ЗАТОАСТЗСЗ ТТСССАСССТ СЗТЗЗАЗААЗ540

ЗАССТЗЗАЗС АСАТСССС6С ЗЗАЗЗЗЗТАС СТССАЗААСС ТССАЗСЗАСЗ ЗСАТЗСССАС600

СТССАТТТС6 ССВСССТСА6 СААЗЗАСЗСС АТСЗАТТЗЗА ТТТСЗААЗЗТ САТТЗАЗСАТ660

ТАСААТТТСС САСССТТСАС ТССССТТТТС ТСТСТСААСТ АССТССАТАЗ АТТССТСТСС720

АСЗТАТЗАЗТ ТСССТСААЗС САСАЗСТТСС АТЗАСТСАЗС ТСТТСССАСТ СЗСТТЗСТТС780

ТСТТТЗЗСТТ ССААААТССА АЗАЗАСТТТТ ЗТЗССАСТСС ССТТЗЗАТТТ ЗСАЗЗТАЗСЗ840

САЗЗСАААСТ ТТСТТТТТСА ЗЗСААЗЗАСС АТАААААЗЗА ТССАССТТСТ ССТССТААЗС900

АССТТАААСТ СЗАЗСАТЗСА ТССТЗТТАСТ ЗСТТЗСТСАТ ТТЗТТЗААТА СТТТСТТСАТ960

АААТТЗАЗТС АТСАТЗСТСС АСССТССТТЗ СТТЗСАСЗСТ СТСЗСТСТТС ЗЗАССТТСТС1020

ТТЗАЗСАССЗ СТААА5СТСС ТСААТТСЗТЗ ЗТАТТСАСАС ССТССЗАЗАТ ТЗСТЗССАЗТ1080

СТТССАСТТС СТЗСТАТСЗЗ ССААТЗСАЗЗ АСТТСТЗТАА ТТЗАЗАЗАЗС Т6СТАЗТАЗС1140

ТЗСАААТАТТ ТЗЗАСААССА САЗЗЗТТТТА АЗАТСССАТЗ АААТЗАТТСА АЗАЗААЗАТТ1200

АСТЗСССЗАА ЗСАТТЗТССТ АААЗТСТССТ ВЗАТСАТСАА ТСТССТСТСТ СССАСАААЗС1260

ССААТАСЗТС ТССТЗЗАСЗС ТССАЗССТСТ СТЗАЗТСААС АААЗСЗАТЗА СЗСТАСТЗТС1320

ЗЗЗТСТССТЗ САСТАТ5ТТА ССАТА6ТТСТ ТССАСААЗСА АЗАЗЗАСААС ЗАТСАСТАСА1380

ССТСТАСТСТ ААТТСТССТА СЗСТТСАЗОТ ЗТССТССТСА ССЗСТСТАСС АСТТТТТСА71440

ТЗЗТТСАААС АТСТТАААТТ ТАСТТГСССС ССТЗСАЗЗАТ ТАТСЗТТТАС ТСААЗТАСТТ1500

ЗСТЗААТСЗА СААСААААСА СЗСАСАСТАС ТТЗЗТССАТА ААЗАСААЗАА ААТААСТСЗС1560

АЗСЗТСССЗС САЗССАЗСЗС ТЗСААТССАЗ ТТСАТЕСААЗ АСССТАСАСТ ССАЗЗЗЗЗЗС1620

ТЗСТЗЗТЗТА ЗЗТАЗАЗАЗС ЗААСААЗЗСА ТТСАСАТАСЗ ССЗТАСАЗАТ ВАОАЗАОССТ1680

СТССТАТСТТ ТТЗТАСТТТТ ССТССТТСАС ТТТЗСААТСА АСТАТАТААА СААЗЗАТТСС1740

СТТССЗЗСАЗ ТЗААСАТТТС ТСЗЗАТСААА АЗААТСАААА АЗСАТЗЗЗЗЗ ТСЗЗСАЗАЗЗ1800

ААТАСААСАА ΤΤΤ3ΑΤΑΤΆΤ ТТССАТАААС ТААААААААА АААААА1846

Claims (2)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Химерный ген, содержащий следующие оперативно связанные фрагменты ДНК:

   a) экспрессируемый растением промоторный участок;

   b) транскрибируемый участок ДНК, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую растительный белок, контролирующий клеточное деление, а именно растительный циклин Ό-типа, способный связывать или фосфорилировать ретинобластомаподобный белок в клетках растения, выбранную из нуклеотидной последовательности ЕМВЬ Ассеккюп №. Х83369 от положения 104 до положения 1108, кодирующей белок АгаЫборкй (БаНапа СУСО1, нуклеотидной последовательности ЕМВЬ Ассеккюп №. Х83370 от положения 195 до положения 1346, кодирующей белок АгаЬ1борйк (БаНапа СУСО2, нуклеотидной последовательности ЕМВЬ Ассеккюп №. Х83371 от положения 266 до положения 1396, кодирующей белок АгаЫборкй 1БаБапа СУСО3, нуклео47 тидной последовательности 8Е0 ГО N0: 1 от положения 182 до положения 1243, кодирующей белок МсоПапа (аЬасит СУСЭ2;1, нуклеотидной последовательности 8Е0 ГО N0: 2 от положения 181 до положения 1299, кодирующей белок МсоПапа 1аЬасит СУСЭ3;1, нуклеотидной последовательности 8Е0 ГО N0: 3 от положения 198 до положения 1298, кодирующей белок МсоПапа 1аЬасит СУСЭ3;2, нуклеотидной последовательности 8Е0 ГО N0: 4 от положения 165 до положения 1109, кодирующей белок НейапОшк ШЬегокик СУСЭ1;1, нуклеотидной последовательности 8Е0 ГО N0: 5 от положения 48 до положения 1118, кодирующей белок НейапОшк 1иЬегокик СУСЭ3;1, нуклеотидной последовательности 8Е0 ГО N0: 21 от положения 316 до положения 1389, кодирующей белок 2еа таук СУСЭ2, или генетически вырожденных вариантов указанных нуклеотидных последовательностей; и

   с) 3'-концевую структуру и сигнал полиаденилирования, функционирующий в растительных клетках.
2. 2. Способ получения растения с измененными ростовыми характеристиками или измененным строением, причем указанный способ предусматривает изменение концентрации или функциональной активности растительного белка, контролирующего клеточное деление, а именно циклина Ό-типа, способного связывать или фосфорилировать ретинобластомаподобный белок в клетках растения, путем обеспечения экспрессии химерного гена, охарактеризованного в п.1, в указанных клетках растения.