SK131799A3 - Plants with modified growth - Google Patents

Description

Rastliny s modifikovaným rastom

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka použitia proteínov, ktoré kontrolujú bunkové delenie alebo jeho časti, presnejšie sa týka proteínov kontrolujúcich bunkové delenie a viažucich retiblastómové proteíny a im podobné, ďalej sa týka cyklínov, najmä cyklínov D-typu a génov, ktoré ich kódujú, na vypestovanie rastlín s modifikovanými fenotypmi, najmä rastlín s upravenými rýchlosťami rastu alebo rastlín, ktoré obsahujú časti z takto upravených rastlín a/alebo rastlín s upravenými pomernými veľkosťami alebo rastlín s upravenou architektúrou. Tento vynález sa taktiež týka rastlinných buniek a rastlín, ktoré sú vyjadrené ako DNAs.

Doterajší stav techniky . * I ,

Všetky eukaryotické bunky majú prirodzenú schopnosť sa v určitých prípadoch deliť, pričom vznikajú ich identické kópie. Toto sa deje počas bunkového cyklu. V eukaryotických bunkách cyklus DNA replikácie (S) a bunkové delenie (M) sú prirodzene časovo oddelené fázami G1 a G2 v poradí G1-S-G2-M. Toto usporiadanie umožňuje prístup ku rozhodujúcim procesom DNA replikácie a presnú kontrolu mitózy. Základná cytologická podstata bunkového cyklu spočíva v usporiadanej sérii časovo a priestorovo organizovaných molekulárnych a bunkových procesov, ktoré určujú smer a poradie bunkového cyklu. Progresia bunkové cyklu zdá sa byť regulovaná vo všetkých eukaryotách hlavným kontrolným mechanizmom, ktorý je v činnosti pri hraniciach medzi G1 - S a G2 - M fázou. Prechod cez tieto kontrolné body vyžaduje aktiváciu kináz závislých na cyklíne (CDKs), ktorých katalytická aktivita a substrátová špecifickosť je určená špecifickými regulačnými podjednotkami známymi ako cykliny a interakciami s inými proteínmi, ktoré regulujú fosforyláciu komplexu (Atheron-Fessier a kol., 1993; Solomon, 1993). Pri klíčení a pri priamom delení buniek kvasiniek, fázové prechody Gl - S a G2 M sú kontrolované jedným CDK kódovaným cdc2+ génom v Schizosaccharomyces pombe a CDC26 v Saccharomyces cerevisiae. Spájanie p34^cdc2 (p34^CRr28 v klíčení kvasiniek) s rozdielnymi cyklínovými partnermi rozlišuje dva kontrolné body (Nasmyth, 1993). V bunkách cicavcov prevláda komplexnejšia situácia s aspoň šiestimi príbuznými alebo odlišnými C-DKs ( kódované cdc2/cdkl, cdk2, cdk3, cdkain 4, cdk5 a cdk6), ktoré majú rozdielne úlohy, každý v spojení s jedným alebo viacerými kognitívnejšími cyklínovými partnermi.(Fang a Newport, 1991; Meyerson a kol., 1991, 1992; Xiong a kol., 1992b; Tsai a kol., 1993a; Van den Heuvel a Harlow, 1993; Meyerson a Harlow, 1994) Cyklíny B-typu sú hlavnou triedou zapojenou do G2-M prechodu a spájania s p34^cdc2 alebo s jeho priamymi homológmi. (Nurse, 1990 ). Cyklin B je jeden z dvoch cyklínov pôvodne definovaných ako akumulujúci sa vo vajciach bezstavovcov v priebehu interfázy a rýchlo zničený v mitóze (Evans a kol., 1983), a je to zložka Xenopus faktoru podporujúceho dozrievanie (Murray a kol., 1989). Homológy B cyklínu sa identifikovali z viacerých eukaryotických druhov. Cyklin A je tiež všeobecne rozšírený v mnohobunkových organizmoch a jeho presná úloha nie je však jasná, aj keď

I jeho nadbytok poukazuje na funkciu v S fázy (Pines, 1993).

Fázový prechod G1 do S je najlepšie preskúmaný v S. cerevisiae. Genetické štúdie definujú neskorý bod v Gl, ktorý sa nazýva ŠTART. Po prechode ŠTART, bunky sú pripravené na vstup do S fázy a na kompletné delenie, ktorého výsledkom sú dve dcérske bunky znovu v Gl fázy (Hartwell, 1974; Nasmyth, 1993). Produkty troch S. cerevisiae Gl cyklínových génov nazývaných CLN1, CLN2 a CNL3 sú limitujúcimi zložkami na prechod cez ŠTART (Richardson a kol., 1989; Wittenberg a kol., 1990; Tyres a kol., 1993). Transkripcia CLN1 a CNL2 je aktivovaná v Gl a akumulácia ich proteínových produktov dosiahne kritickú prahovú hladinu pozitívnym „feedback“ mechanizmom, ktorý vedie k aktivácii p34^rDC28 kinázy a k prechodu cez ŠTART (Dirick a Nasmyth, 1991). Gl cyklíny sú potom degradované dôsledkom PEST motívov v ich primárnej sekvencie, ktorej výsledkom je rapídna proteínová premena (Rogers a kol., 1986; Lew a kol., 1991; Reed, 1991).

Cyklíny G1 Λ’ cerevisiae sú aspoň čiastočne nadbytočné, pretože v kvasinkových kmeňoch sú dva z troch G1 cyklínových génov vymazané a tretie miesto je pod kontrolou promótora regulujúceho galaktózu a poskytuje rast fenotypu závislý na galaktóze. Použili sa také kmene na identitu Drosophila a ľudských cDNA klonov, ktoré udržujú podmienený cln-deficientný fenotyp na t ' , * * glukózových platniach, kde je potlačený jediný prítomný kvasinkový CLN gén (Koff a kol., 1991; Lahue a kol., 19991; Léopold a O’Farrell, 1991; Lew a kol., 1991; Xiong a kol., 1991). Ľudské cDNAs kódujúce tri nové triedy cyklínov C, D a E sa identifikovali týmito prostriedkami. Aj keď tieto cyklíny predstavujú len limitovanú homológiu s kvasinkovými CLN proteínmi sú dôležité na pochopenie kontrolných mechanizmov, ktoré operujú v bunkách cicavcov v priebehu G1 a pri reštrikčnom bode pri hranici fázyGl a fázy S (Pardee, 1989, Matsushime a kol., 1992; Koff a kol., 1992, 1993; Ando a kol., 1993; Quelle a kol., 1993; Tsai a kol., 1993b) Cyklín E môže pôsobiť ako zložka limitujúca rýchlosť pri hranici G1 fázy a S fázy (Ohtsubo a Roberts, 1993; Wimmel a kol., 1994), zatiaľ čo závislosť hladíp cyklínu D na sére rastových faktorov (Matsushime akol., 1991; Baldin a kol., 1993; Sewing a kol., 1993) poukazuje na to, že cyklíny D typu môžu tvoriť spojenie medzi týmito signálmi a progresiou bunkového cyklu.

Predpokladaným dôležitým faktorom v regulácii progresie bunkového cyklu u cicavcov je retinoblastómová citlivosť génu, ktorý kóduje retinoblastómový proteín (Rb). Rb spája a inaktivuje E2F skupinu transkripčných faktorov a to vďaka svojej rozlišovacej schopnosti. Rb svoj potenciál vynakladá na zabránenie bunkového delenia v GI fáze. E2F transkripčné faktory sú známe na zapojenie cyklínu E a génov S-fázy a zvýšenie hladiny cyklínu E a/alebo E2F vedie ku začiatku replikácie (Nevins, 1992; Johnson a kol , 1993). Rozlišovacia schopnosť Rb na inaktivovanie E2F závisí na jeho štádiu fosforylácie. V priebehu Gl je Rb vo hypofosforylačnom štádiu, ale v neskorej Gl fáze, fosforylácia Rb je uskutočnená kinázami závislými na cyklíne, najmä CDK4, ktoré vytvárajú komplex so základnými regulačnými podjednotkami, cyklín D (Pines, 1995) a CDK2 vytvárajú komplex s cyklínom E ( pri hranici Gl/S ) alebo s cyklinom A ( v S fáze) Tieto násobné fosforfylácie Rb zapríčiňujú uvoľnenie E2F, ktorý môže podporovať transkripciu génov S fázy.

Rastlinné bunky v skorších štúdiách bunkového rastu a bunkového delenie sa použili na definovanie jednotlivých fáz eukaryotického bunkového cyklu (Howard a Pele, 195.3), ale -chýbali údaje o kontrole bunkového cyklu na molekulárnej úrovni v rastlinných systémoch. Rastlinné bunky zastavujú svoje delenie in vivo, ktoré je spôsobené pokojovým stavom alebo in vitro, ktoré je spôsobené nedostačujúcou výživou principiálne v kontrolných bodoch v Gl a G2 (Van’t Hof, 1974; Gould a kol., 1981; Van’t Hof, 1985) vo všeobecnosti tento kontrolný systém operuje aj v iných eukaryotických systémoch. Aj keď dozreté rastlinné bunky môžu mať iný podiel Gl alebo G2 DNA (Evans a Van’Hof, 1974; Gould a kol., 1981), Gl populácia je vo všeobecnosti dominantná. Gl kontrolný bod je striktne prítomný v kultivovaných rastlinných bunkách na dusíkovej výžive. Tieto bunky sú prednostne zastavené v Gl fáze (Gould a kol., 1981). Existuje silná analógia medzi principiálnym kontrolným bodom v Gl rastlinného bunkové cyklu, ŠTART bodom v kvasinkách a reštrikčným bodom buniek cicavcov.

Testy na protilátky alebo histón Hl kinázu sa použili na indikovanie prítomnosti a lokalizácie aktívnych príbuzných kináz CDC2 v rastlinných bunkách (John a kol., 1989, 1990, 1991; Mineyuki a kol., 1991; Chiatante a kol., 1993; Colasanti a kol., 1993; John a kol., 1993) a cDNAs, ktoré kódujú funkčné homológy CDC2 kinázy boli izolované redukciou hybridizácie alebo nadbytočnej polymerizačnej reťazovej reakcie u rastlinných druhov, ktoré zahrnujú hrach (Feiler a Jacobs, 1990), ďatelinu (Hirt a kol., 1991, 1993), Arcihidopsis (Ferreira a kol., 1991; Hirayama a kol., 1991), sójový bob (Miao a kol., 1993), Antirrhinum (Fobert a kol , 1994) a kukurica (Colasanti a kol., 1991). Počet cDNA sekvencií kódujúcich rastlinné mitotické cyklíny A- alebo B- typu alebo zmes znakov A- a B- typu, ktoré sú tiež izolované z rôznych druhov zahrnujúcich mrkvu (Hata a kol., 1991), sójové boby (Hata a kol , 1991), Arabidipsis (Hemerly a kol., 1992; Day a Reddy, 1994), ďatelinu (Hirt a kol , 1992), Antirrhinum (Fobert a kol , 1994) a kukuricu (Renaudin a kol., 1994)

Soni a kol. (1995) identifikovali novú rodinu troch príbuzných cyklínov v Arabidopsis komplementáciou kvasinkového kmeňa deficientného v Gl cyklínoch. Individuálne členy tejto rodiny vykazujúce tkanivovú špecifickú expresivitu sú zachované v iných rastlinných druhoch.

Tvoria odlišnú skupinu rastlinných cyklínov označovanú ako cyklíny δtypu čo naznačuje ich podobnosť s D-typom cyklínov u cicavcov. Sekvenčný vzťah medzi δ a D cyklínmi zahrnuje N-terminálnu sekvenciu LxCxE. Leucin je predchádzaný pri pozícii 1 alebo 2 aminokyselinou s kyslým miestom v reťazci (D, E). Tento motív bol identifikovaný vo vírusových onkoproteínoch a je silne implikovaný vo väzbe na retinoblastómový protein. V anológii ku cicavčiemu cyklínu D jeho rastlinné homológy môžu mať rastové a fytohormonálne signály v bunkovom cykle. Bolo ukázané, že na restimuláciu buniek kultivovaných v suspenzii, cyklínu δ3 bol rapídne indukovaný regulátorom rastlinného rastu cytokinínom a cyklín δ2 bol indikovaný uhlíkovým zdrojom. Renaudin a kol. (1996) definovali skupiny a nomenklatúru rastlinných cyklínov a δ-cyklínov

I teraz nazývaných ako CyčD cyklíny. ₍

Dahl a kol. (1995) identifikovali v ďateline cyklín (cycMs4) príbuzný s Ô3 v ďateline.

Rb podobné proteíny boli identifikované v rastlinách. Obidvaja Xie a kol.(1996) a Grafi a kol (1996) opísali izoláciu a predbežnú charakterizáciu Rb homológa z kukurice.

* Doener a kol. (1996) opísali ektopickú expresivitu cyklínu B typu (cyclAt z Arabidopsis) pod kontrolou promótora z cdc2a génu v Arabidopsis Transgénové „cdc2a“ rastliny obsahujúce transgén mali zvýšenú rýchlosť rastu koreňa. Avšak rast a vývoj laterálnych koreňov sa zrýchlil nasledujúcou indukciou indoletánovej kyseliny v transgénových rastlinách.

Hemely a kol. (1995) opísali transgénové rastliny tabaku a Arabidopsis obsahujúce divý typ alebo dominante mutácie kinázy operujúcej pri mitóze (CDC2a). Rastliny prednostne produkujú divý typ CDC2a alebo mutantnú formu, ktorá spôsobuje zrýchlenie bunkového cyklu, ale nie je preukázaný významne zmenený vývoj. Mutant CDC2a je zodpovedný za zastavenie bunkového cyklu, prerušenie bunkového delenia, ktoré sa prejavilo v Arabidopsis. Získali sa určité tabakové rastliny, ktoré prednostne produkujú novší mulant kinázy. Tieto rastliny obsahujú značne menší počet ale väčších buniek.

, V PCT patentovej prihláške „WO“ 92/Q9685 je opísaný spôsob na kontrolu bunkového rastu rastlín, ktoré obsahujú meniacu sa hladinu proteínu bunkového cyklu v rastline v určitom čase za podmienok dostatočnej kontroly bunkového delenia. Uprednostnený proteín je napríklad p34^cd,:2 kináza alebo podobný proteín operujúci v mitóze.

V WO 93/12239 sú opísané rastliny so zmenenou výškou a inými fenotypovými efektmi ako je najmä predčasné kvitnutie a zvýšenie počtu kvetov transformáciou rastlinného genómu s cdc25 génom z kvasiniek ako sú Schiznsaccharomyces pombe.

WO 97/47647 sa týka izolácie a charakterizácie rastlinnej DNA sekvencie na kódovanie retinoblastómového proteínu, ktorý je využívaný na kontrolu

I . » rastu v rastlinných bunkách, rastlinách a/alebo rastlinných vírusoch taktiež je využívaný vo vektoroch, rastlinách alebo živočíchov alebo v živočíšnych bunkách upravených prostredníctvom manipulácie kontroly cesty retinoblastómového proteínu rastlín.

US patent 5,514,571 zahrnuje použitie cyklínu Dl ako negatívneho regulátora bujnenia cicavčej bunky. Zvýšená expresia cyklínu Dl blokuje rast cicavčej bunky, zatiaľ čo blokovaná expresia cyklínu Dl podporuje bunkové bujnenie

Podstata vynálezu

Vynález poskytuje spôsob na získanie rastlín s pozmenenými rastovými charakteristikami alebo pozmenenou architektúrou, najmä rastlín s redukovanou alebo zvýšenou rastovou rýchlosťou, rastlín, ktoré vyžadujú skrátený čas na kvitnutie alebo rastlín so zvýšeným počtom kvetov na rastlinu, alebo rastlín so zvýšeným počtom ústrojov obsahujúcich krok pozmenenia hladiny alebo funkčnej hladiny proteínu, ktorý kontroluje bunkové delenie a je schopný viazať a/alebo fosforylovať proteíny podobné Rb proteínu, prednostne proteín kontrolujúci bunkové delenie, ktorý obsahuje LxCxE väzbový motív alebo príbuzný motív, prednostne v N-terminálnej časti proteínu, najmä D-typ cyklínu vo vnútri rastlinných buniek.

, Vynález tiež poskytuje spôsob na získanie . rastlín s pozmenenými rastovými charakteristikami alebo pozmenenou architektúrou obsahujúcou krok pozmenenia hladiny alebo funkčnej hladiny proteínu kontrolujúceho bunkové delenie integráciou chimérického génu do genómu buniek rastliny, ktorá obsahuje nasledujúce použiteľné spájajúce DNA fragmetny

a) promótorovú oblasť najmä CaMV35S promótorovu oblasť,

b) transkribovanú DNA oblasť kódujúcu RNA alebo proteín, ktorý ak je vyjadrený zvyšuje alebo znižuje hladinu alebo funkčnú hladinu proteínu, ktorý kontroluje bunkové delenie a voliteľne

c) 3' koniec tvoriaci a polyadenylačný signál funkčný v rastlinných bunkách.

• · ,1

V súlade s vynálezom, transkribo'vaná óblasť DNA ikóduje antišense RNA, ribozóm alebo sense RNA reťazec, ktorý ak je vyjadrený redukuje, inhibuje alebo predchádza expresii proteínu kontrolujúceho bunkové delenie, najmä endogénny cyklín D-typu.

Ďalej v súlade s vynálezom transkribovaná DNA kóduje proteín, ktorý kontroluje bunkové delenie a ktorý je schopný viazať vreckovú doménu proteínu ako Rb, prednostne proteín kontrolujúci bunkové delenie obsahuje LxCxE viazaný motív, presnejšie cyklín D-typu, najmä cyklín D-typu z rastlín, presnejšie cyklín D-typu, ktorý je vybraný zo skupiny Arahidopsis thaliana CYCD1, Arahidopsis thaliana CYCD2, Arahidopsis thaliana CYCD3, Nicotiana tahacum CYCD2;1, Nicoliana tahacum CYCD3;1, Nicotiana tahacum CYCD3;2, Hclianthus tuherosns CYCD1J, Zea mays CYCD2 a Helianlhus tuherosns CYCD3;1.

Taktiež v súlade s vynálezom transkribovaná RNA kóduje proteín alebo peptid, ktorý keď sa prejaví zvyšuje uvedenú funkčnú hladinu uvedeného proteínu kontrolujúceho bunkové delenie, najmä proteínu alebo peptidu vybraného z: mutantu cyklínu D-typu, z časti cyklínu D-typu, z cyklínu D-typu, ktorý má mutáciu v cyklínovom boxe, z cyklínu D2-typu, ktorý má substituovanú aminokyselinu 185 alebo amynokyselinu 155, z cyklínu D2-typu, ktorý má mutáciu E185A alebo K155A, z cyklínu D-typu, kde PEST sekvencie sú odstránené, z cyklínu D-typu, kde LxCxE väzbový motív bol zmenený alebo * 1 vymazaný, alebo z cyklínu D-typu, kde C-zvyšok z LxCxE väzbového motívu bol vymazaný.

Predmetom vynálezu sú taktiež chimérické gény.

Ďalej vynález poskytuje rastlinné bunky, rastliny a semená, ktoré obsahujú chimérické gény podľa vynálezu a majú pozmenené rastové charakteristiky a/alebo pozmenenú architektúru.

w

Ďalší predmet vynálezu poskytuje využitie proteínu kontrolujúceho bunkové delenie, ktorý je schopný viazať vreckovú doménu Rb proteínu a/alebo je schopný fosforylácie Rb proteínu, najmä proteín kontrolujúci bunkové delenie obsahujúci LxCxE väzbový motív v N-terminálnej časti _f I » proteínu, špecifickejšie cyklín D-typu a’ gény ich kódujúce na pozmenenie rastových charakteristík alebo architektúry rastliny. Proteín kontrolujúci bunkové delenie je kódovaný chimérickým génom integrovaným v genóme rastlinných buniek.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Tu používaný pojem „architektúra“ predstavuje všeobecnú morfológiu, ktorá zahrnuje relatívnu veľkosť, umiestnenie a počet jednotlivých častí (t j orgány ako (nie sú na ne obmedzené) listy, kvetenstvo, zásobné orgány tak ako hľuzy, korene, stonky, kvety alebo časti orgánov tak ako plátky, kališne lístky, anteridium, čnelka, listová stopka a podobne). „Pozmenená architektúra rastlín“ poukazuje na zmeny vo všeobecnej morfológii a výsledkami týchto zmien sú napríklad počet, veľkosť a umiestnenie orgánov alebo častí orgánov. Je samozrejmé, že pozmenenie jedného orgánu alebo časti orgánu alebo pozmenenie niekoľkých orgánov alebo časti orgánov, ako sú opisované, sa prejaví v zmenenej architektúre rastliny. Toto môže byť dosiahnuté pozmenením (t.j. zvýšením alebo zredukovaním) účinnosti bunkového delenia v existujúcich meristémoch a/alebo v primordium orgánu alebo vytvorením de novo meristémov.

Tu používaný výraz „ko-supresia“ odkazuje na proces transkripčnej a/alebo post-transkripčnej supresie RNA akumulácie v sekvencii špecifickým spôsobom majúcim za následok supresiu a expresiu homologických endogénnych génov alebo transgénov. Supresia expresie endogénnych génov môže byť dosiahnutá zavedením transgénu, ktorý obsahuje silný promótor viazaný na DNA oblasť pomocou ktorého výsledná transkribovaná RNA je sense RNA obsahujúca nukleotidovú sekvenciu, ktorá má aspoň 75%, prednostne aspoň 80%, prednostne aspoň 85%, prednostnejšie aspoň 90%, špeciálne aspoň 95% na kódovanie alebo transkribovanie DNA sekvenie (sense) génu, ktorého expresia je potlačená. Prednostne transkribovaná DNA oblasť nie je kódovaná na funkčný proteín. Obzvlášť transkribovaná oblasť nie je kódovaná na proteín.

Tu používaný výraz „promótor expresie rastliny“ Znamená promótor, ¹ I ktorý je schopný riadiť trankripciu v rastlinnej bunke. Tento zahrnuje určitý promótor rastlinného pôvodu ale tiež určitý promótor nerastlinného pôvodu, ktorý je schopný smerovať transkripciu v rastlinnej bunke ako napríklad promótory vírusového alebo bakteriálneho pôvodu tak ako CaMV3 5S alebo TDNA génové promótory.

Tu používaný výraz „expresia génu“ odkazuje na proces, kde DNA oblasť pod kontrolou regulačných oblasti, najmä promótora, je transkribovaná do RNA, ktorá je biologicky aktívna, ktorá je ďalej schopná byť prepísaná do biologicky aktívneho polypeptidu alebo proteínu. Gén je uvedený na kódovanie RNA, keď konečný produkt expresie génu je biologicky aktívna RNA ako aj napríklad antisense RNA alebo ribozóm. Gén je uvedený na kódovanie proteínu, keď konečný produkt expresie génu je biologicky aktívny proteín alebo polypeptid.

Tu používaný výraz „gén“ znamená určitý DNA fragment obsahujúci DNA oblasť („transkribovanú DNA oblasť“), ktorá je transkribovaná do RNA molekuly (ako napr. mRNA) v bunke pod kontrolou regulátora oblasti, napr.

promótora expresie rastliny. Gén môže teda obsahovať niekoľko viazaných DNA fragmentov, tak ako je promótor, 5' vedúca sekvencia, kódujúca oblasť, 3' oblasť, ktorá obsahuje polyadenylačné miesto. Endogénny rastlinný gén je gén, ktorý je pôvodne prítomný v rastlinných druhoch. Chimérický gén je určitý gén, ktorý nie je normálne prítomný v rastlinných druhoch alebo alternatívne, * k ‘ určitý gén, v ktorom promótor nie je združený s časťou alebo celou transkribovanou DNA oblasťou alebo s aspoň inou regulačnou oblasťou génu.

Vynález je založený na neočakávanom nájdení chimérických génov obsahujúcich DNA, ktoré kódujú proteín kontrolujúci bunkové delenie, ktorý je schopný viazať Rb proteín najmä rastlinný cyklín D-typu pod kontrolou promótora expresie rastliny, ktorý by mohol byť integrovaný v genóme rastlinných buniek, bez škodlivých efektov a okrem toho, ktorý zvyšuje expresiu proteínu kontrolujúceho bunkové delenie, najmä cyklín D-typu, v rastlinných bunkách vedúci ku špecifickej premene v rastovej rýchlosti a architektúre výsledných transformovaných rastlín.

Teda vynález satýka modulácie úrovne,expresie alebo aktivity funkčných ¹ » proteínov kontrolujúcich bunkové delenie, prednostne v stabilnom stave, vo vnútri rastlinných buniek rastliny určenej na zmenenie architektúry a/alebo rastovej rýchlosti transformovanej rastliny a jej potomstva. Obvykle hladina alebo funkčná hladina proteínov kontrolujúcich bunkové delenia je kontrolovaná geneticky zmenením expresie génov kódujúcich tieto proteíny kontrolujúce bunkové delenie. Zvyšovanie hladiny alebo funkčnej hladiny proteínu kontrolujúceho bunkové delenie geneticky môže byť dosiahnuté napr. manipuláciou kópie počtu kódujúceho génu (génov) zmenením promótorovej oblasti kódujúcich génov alebo manipuláciou génov regulujúcich priamo alebo nepriamo hladinu expresie proteínu kontrolujúceho bunkové delenie. Alternatívne, hladina proteínu kontrolujúceho bunkové delenie môže byť zvýšená stabilizáciou mRNA, ktorá kóduje proteín kontrolujúci bunkové delenie alebo stabilizáciou proteínu kontrolujúceho bunkové delenie napríklad odstránením deštrukčných motívov alebo takzvaných PEST sekvencii.

Funkčná hladina alebo aktivita proteínu kontrolujúceho bunkové delenie môže byť zvýšená znížením hladiny antagonistu alebo inhibítora promótorového

II proteínu bunkového delenia pomocou techník (ale nie je nimi obmedzená), ktoré poskytujú bunky s proteínom, ktorý inaktivuje proteín kontrolujúci bunkové delenie podobný na jeden, ktorého funkčná hladina je zvýšená alebo časť tohto proteínu kontrolujúceho bunkové delenie, ktorý je ešte schopný viazať inhibítor alebo iný regulačný proteín, alebo je ešte schopný viazať sa na ¹ i, * I kinázy závislé na cyklíne. Funkčná hladina alebo aktivita proteínu kontrolujúceho bunkové delenie môže byť zvýšená zmenou alebo mutáciou proteínu kontrolujúceho bunkové delenie na redukciu alebo elimináciu viazania antagonistu alebo inhibítora aktivity proteínu, ktorý sa týka bunkového delenia.

Redukcia funkčnej hladiny proteínu kontrolujúceho bunkové delenie môže byť dosiahnutá napríklad zvýšením mRNA kódujúcej proteín kontrolujúci bukové delenie, ktorý je k dispozícii na transláciu pomocou techník ako (nie je limitovaná na ne) antisense RNA, ribozomálne pôsobenie alebo ko-supresia. Alternatívne, funkčná hladina proteínu môže byť znížená zvyšovaním hladiny antagonistu alebo inhibítora proteínu kontrolujúceho bunkové delenie.

Na cieľ tohto vynálezu „proteín kontrolujúci bunkové delenie“ je polypeptid alebo proteín, ktorý je vyžadovaný na reguláciu progessie cez bunkový cyklus eukaryotickej bunky, prednostne rastlinnej bunky alebo proteínu, ktorý môže uskutočniť vstup buniek do bunkového cyklu alebo uskutočniť progresiu buniek cez bunkový cyklus priamou interakciou s proteínom požadovaným na reguláciu progresie cez bunkový cyklus alebo polypeptid alebo proteín, ktorý môže prevziať ekvivalentnú funkciu ale nie je požadovaný na reguláciu bunkového cyklu.

Vhodné proteíny kontrolujúce bunkové delenie sú proteíny schopné fosforylácie samotné alebo v kombinácii s inými proteínmi ako Rb podobnými proteínmi, prednostne sú schopné fosforylácie Rb proteínu v rastlinnej bunke v Gl-S prechodnej fáze alebo sú schopné viazania vreckovej domény proteínov podobných retinoblastómu (Rb), prednoste proteíny majúce LxCxE väzbový motív obsiahnutý vo vnútri aminokyselinovej sekvencie alebo podobný motív ako je LxSxE alebo FxCxE (väzbové motívy sú predstavované v jednom liste aminokyselinového kódu kde x predstavuje určitú aminokyselinu) Obzvlášť preferované sú cyklíny, ktoré obsahujú LxCxE viazaný motív (a/alebo podobný motív) v N-terminálnej polovici proteínu, prednostne vo vnútri prvých 50 aminokyselinových zvyškov, najmä vo vnútri prvých 30 aminokyselinových zvyškov, tak ako cyklíny D-typu, najmä rastlinné cyklíny D-typu, špeciálne cyklíny zo skupiny Arahidopsis thaliana CYCDI, Arahidopsis- thaliana C.YCD2, Arahidopsis thaliana CYCD3, Nicotiana tahacum CYCD3J, Nicotiana tahacum CYCD2;1, Nicotiana tahacum CYCD3;2, Helianthus tuherosus CYCD1J, Zea mays CYCD2 a Helianthus tuherosus CYCD3J alebo cyklín v podstate podobný proteínovým sekvenciám.

Spomínané rastlinné cyklíny D-typu sú plne charakterizované aminokyselinovou sekvenciou kódovanou DNA sekvenciou EMBL Prístupové číslo N° X83369 od nukleotidovej polohy 104 až do nukleotidovej polohy 1 108 pre Arahidopsis thaliana CYCDI, EMBL Prístupové číslo N° X83370 od nukleotidovej polohy 195 až do nukleotidovej polohy 1346 pre Arahidopsis thalina CYCD2, EMBL Prístupové číslo N° X83371 od nukleotidovej polohy 266 až do nukleotidovej polohy 1396 pre. Arahidopsis thaliana CYCD3,

I l

nukleotidová sekvencia SEQ ID N° 1 od nukleotidovej polohy 182 až do nukleotidovej polohy 1243 pre Nicotiana tahacum CYCD2J, nukleotidová sekvencia SEQ ID N° 2 od nukleotidovej polohy 181 až do nukleotidovej polohy 1299 pre Nicotiana tahacum CYCD3;1, nukleotidová sekvencia SEQ ID N° 3 od nukleotidovej polohy 198 až do nukleotidovej polohy 1298 pre Nicotiana tahacum CYCD3;2, nukleotidová sekvencia SEQ ID N° od nukleotidovej polohy 165 až do nukleotidovej polohy 1109 pre Helianthus tuherosus CYCD1;1, nukleotidová sekvencia SEQ ID N° 5 od nukleotidovej polohy 48 až do nukleotidovej polohy 1118 pre Helianthus tuherosus CYCD3;I a nukleotidová sekvencia SEQ ID N° 21 od nukleotidovej polohy 3 16 až do nukleotidovej polohy 1389 pre Zea mays CYCD2.

Zvýšenie respektivne zníženie hladiny alebo funkčnej hladiny alebo aktivity týchto proteinov kontolujúcich bunkové delenie zrýchluje respektivne zdržuje prechod z Gl do S fázy v rastlinných bunkách alebo zvyšuje respektivne znižuje proporciu aktívne deliacich sa buniek ich interakciou s Rb proteínmi ovplyvňujúcimi spôsob Rb proteínu na inaktiváciu určitých transkripčných faktorov. Ďalej je spomínané, že expresia týchto proteínov kontrolujúcich bunkové delenie, ktoré interagujú s Rb proteínmi a umožňuje bunkám iniciovať deliace procesy, zatiaľ čo expresia G2/mitotických cyklínov (tak ako cykliny B-typu alebo cdc25 génový produkt) je v kontraste predpokladaná, že vedie ku pevnejšej progresii cez G2/mitotické fázy

I, bunkových’ cyklov už naštartovaných.

Na cieľ tohto vynálezu „Rb proteíny“ sú definované ako proteiny zo skupiny ľudských Rb-1 proteínov (Lee a kol. 1987; Prístupové číslo P06400), ľudský p 107 (Ewen a kol., 1991; Prístupové číslo L14812) a ľudský pl30 (Hannon a kol., 1993; Prístupové číslo A49370), Drosophila RBF (Du a kol., 1996; Prístupové číslo n°pre DNA vstup kódujúceho génu X96975), myšací RB (Bernads a kol., 1989; Prístupové číslo n° P13405), kurací RB (Boehmelt a kol., 1994; Prístupové číslo n° X72218), Xenopus Rb (Destree a kol., 1992; Prístupové číslo A44879), ZmRb a Rbl z Zea mciys (Xie a kol., 1996; Grafi a kol., 1996; Prístupové číslo počty na DNA vstup kódujúcich génov: X98923; GenBank U52099) tak dojne ako určitý, proteín, ktorý má súčasne aspoň 25' , I * I

30% aminokyselinovej’ sekvencie podobnej (totožnej) s aspoň troma členmi z hore spomínanej skupiny a obsahuje zachovaný cysteínový zvyšok lokalizovaný pri pozícii 706 ľudského Rb-1 alebo pri ekvivalentných polohách v iných Rb proteinoch (pozri Xie a kol., 1996).

Rb proteíny sú členmi malej rodiny známej ako „vreckové proteíny“. Tento termín je odvodený z udržiavanej dvojdielnej domény, nazývanej ako „vrecková doména“, ktorá je väzbovým miestom pre niekoľko rastových kontrolných proteínov tak, ako je E2F rodina transkripčných faktorov. D-typ cyklínov a vírusových onkoproteínov. A a B subdomény vreckovej domény sú viac udržiavané než umiestnené proteíny (~50-64% pre A a B subdomény) a sú separované neudržiavaným oddeľovačom Vreckové domény sú lokalizované medzi aminokyselinami v polohách 451 a 766 pre ľudský Rb, 321 až 811 pre ľudský p 107, 438 až 962 pre ľudský p130, 445 až 758 pre myší RB, 441 až 758 pre kurací RB, 440 až 767 pre Xenopus Rb, 1 I až 382 pre ZmRb, 89 až 540 pre Rbl.

Pre cieľ vynálezu „väzbovosť na Rb proteinu“ alebo „väzbovosť na vreckovú doménu Rb proteinu“ môže byť analyzovaná in vitro testom alebo jedným z in vivo testov alebo ich kombináciou V in vitro teste, väzbovosť je analyzovaná medzi testovaným proteínom označeným ³⁵S-metionínom a fúznym proteínom glutation-S-transferáza (GST) a vreckovou doménom Rb proteinu, ako je ľudský Ŕb. Fúzia na GST umožňuje ľahké čistenie a fixáciu fúzneho proteinu na glutationové sefarózové guličky Interakcia medzi testovaným proteínom a Rb proteínom je porovnateľná ku vázbovosti medzi rovnakými proteínmi a fúznym proteínom GST a Rb proteínom s mutáciou v udržiavanom cysteíne pri polohe ekvivalentnej ku cysteínu 706 v ľudskom Rb, ako aj v ľudskom Rb C7066F. Takéto testy boli opísané napríklad Dowdym a kol.( 1993) a Ewenom a kol. (1993). V obdobe tohto testu Rb proteín sa môže prejaviť v bakulovírusom infikovaných bunkách hmyzu (Dowdy a kol. 1993). I inom variante obidva, Rb proteín a Rb-väzbový proteín sa môžu prejaviť v bunkách hmyzu a spájanie je detekované gélovou filtráciou alebo ko-imunoprecipitáciou (O'Reilly a kol. 1992).

In vivo test, ktorý môže byť použitý na určovanie väzbovosti proteinu na vreckovú doménu Rb proteínov je dvoj- hybridný kvasinkový systém (Fields a Song, 1989). Táto analýza sa spolieha na schopnosť obnovenia funkčnej GAL4 aktivity z dvoch separovaných GAL4 fúznych proteínov obsahujúcich DNA väzbovú doménu (GAL4^BD) a aktivačnú doménu (GAL4^An) spojenú ku vreckovej doméne Rb proteinu a respektíve na testovaný proteín. Expresívne plazmidy obsahujúce chimérické gény kódujúce tieto fúzne proteíny, ktoré sú zavádzané do kmeňa kvasiniek kódujúceho GAL4-odvodené markery, ako je kmeň HF7c (Feilloter a kol., 1994) obsahujúci GAL4-odvodený HIS3 a LacZ markery alebo kmeň Y190 (Harper a kol , 1993) Proteíny viazané na vreckovú doménu Rb proteinu umožňujú rast v neprítomnosti histidinu. Príklad dvojhybridného testu na demonštrovanie interakcie proteinu s Rb proteínom bol opísaný Durfee a kol. (1993).

Vhodné kontrolné experimenty zahrnujú oddelené zavádzanie do expresívnych plazmidov do kvasinkového kmeňa alebo zavádzanie expresívnych plazmidov kódujúcich fúzne proteíny obsahujúce DNA väzbovú doménu (GAL4^nr>) a aktivačnú doménu (GAL4^ad) pripojenú na mutovanú vreckovú doménu Rb proteínu, prednostne na mutovanú pri C706 alebo pri ekvivalentných pozíciách a proteín je analyzovaný.

Alternatívny in vilro test na určenie väzbovosti proteínu na vreckovú doménu Rb proteínov zahrnuje dočasnú expresivitu obidvoch proteínov v rastlinných bunkách, prednostne tabakové protoplasty a imunoprecipitáciu používajúcu protilátku priamo proti jednému z dvoch proteínov na meranie koprecipitácie druhého proteínu.

Na účel vynálezu „fosforylácia Rb proteínu“ môže byť analyzovaná in vitro testom, ktorý využíva gamma ³²P označený adenozíntrifosfát na monitorovanie obsahu proteínu (alebo kombinácie proteínov, ako sú cyklíny a kinázy závislé na cykline) na prenos označenej fosfátovej skupinu na cieľový proteín, ako je známe v stave techniky.

Na účel vynálezu „cyklín“ môže byť definovaný ako regulátor proteínu, ktorý obsahuje proteínovú doménu asi 100 aminokyselín .známych ako , I ' * · | „cyklínový box“. Cyklínový box je väzbovým miestom pre kinázy závislé nä cykline dovoľujúce cyklínu použiť jeho regulačný efekt na aktivitu kinázy CDKs.

Cyklínový box môže byť identifikovaný porovnaním aminokyselinovej sekvencie proteínu so známymi cyklínovými boxmi, ako je aminokyselinová sekvencia medzi polohami 81-186 CYCD1 z Arabidopsis Ihaliana, medzi polohami 96-201 CYCD2 z Arabidopsis ihaliana, medzi polohami 86-191 CYCD3 z Arabidopsis Ihaliana, cyklínové boxy sú opísané Renaudinom a kol (1994; 1996), Sonim a kol. (1995) a Hemelyom a kol. (1992). Aminokyselinová sekvencia identifikovaná ako cyklínový box na základ sekvencie je zostavená aspoň s piatich udržiavaných zvyškov, ktoré sú požadované na cyklinovú aktivitu R(97), D(126), L(I44), K(I55), E(185) (indikované polohy sú z sekvencie CYCD2 z Arabidopsis Ihaliana') pri ekvivalentných pozíciách (pozri Soni a kol (1995) a Renaudin a kol. (1996).

Cyklíny D-typu (cyklín D alebo CycD) sú cyklíny, ktoré sú charakterizované prítomnosťou prídavných charakteristických sekvencii, tak ako LxCxE motív alebo príbuzné motívy na viazanie Rb proteínov, ktorý je nájdený vo vnútri N-terminálnej časti proteinu, prednostne lokalizovaný medzi N-koncom a cyklínovým boxom, najmä vo vnútri prvých 50 aminokyselín, obzvlášť vo vnútri prvých 30 aminokyselín iniciujúcich metionínový zvyšok. Prednostne leucín väzbového motívu je predchádzaný pri pozícii-1 -alebo -2 , I , aminokyselinou s kyslým postranným reťazcom (D,E). Alternatívne väzbové motívy tak ako LxSxE alebo FxCxE sú taktiež prítomné. Phelps a kol. (1992) potvrdili, že mutujúci väzbový motív LxCxE v ľudskom papilomaviruse E7 na LxSxE spôsobuje, že proteín nie je schopný sa viazať na Rb proteiny. Tri skupiny cyklínov D-typu sa identifikovali na základe sekvenčnej homológie: CycDl (obsahujúci Arabidopsis íhaliana CycDl a Helianlhus tuberosus CYCD1;1) CycD2 (obsahujúci Arabidopsis thaliana CYCD2, Nicotiana tabacum CYCD2J, Zea mays CYCD2), CycD3 (obsahujúci Arabidopsis íhaliana CYCD3, Nicoliana tabacum CYCD3;1, Nicotiana tabacum CYCD3;2 a Helianlhus tuberosus CYCD3;1).

Nomenklatúra a dohoda o sekvenciách pre rozdielne typy a skupiny . ' ' ' * rastlinných cyklínov zahrnuje cyklíny D-typu, ktoré opísali Renaudin a kol. (1996) a môže sa použiť na klasifikáciu nových cyklínov založených na ich aminokyselinovej sekvencii.

Na účel vynálezu, proteiny kontrolujúce bunkové delenie môžu byť získané pre bunku priamo a to napríklad elektroporáciou protoplastov v prítomnosti proteínov kontrolujúcich bunkové delenie alebo nepriamo a to transformovaním rastlinných buniek s chimérickým génom expresie rastliny kódujúcim proteín, ktorý je dočasne alebo stabilne integrovaný v genóme protoplastov.

V jednom aspekte vynálezu hladina alebo funkčná hladina proteinu kontrolujúceho bunkového delenia schopného fosforylácie Rb proteinu alebo viazania vreckovej domény Rb proteínov je zvýšená na získanie rastliny s pozmenenou rastovou rýchlosťou alebo architektúrou integráciou chimérického génu do genómu buniek rastliny obsahujúcej nasledujúce väzbové DNA fragmenty:

a) rastlinno expresívna promótorova oblasť, najmä CaMV35S promótorova oblasť,

b) transkribovaná DNA oblasť kódujúca proteín, ktorý keď sa prejaví zvyšuje hladinu alebo funkčnú hladinu proteínu kontrolujúceho bunkové delenie; a

c) 3' koniec formujúci a polyadenylačný signál funkčný v rastlinných bunkách.

* »

V preferovanom uskutočnení vynálezu expresivita hladiny cyklínu D je zvýšená zavedením chimérického génu obsahujúceho transkribovanú DNA oblasť, ktorá kóduje cyklín D do genómu rastlinnej bunky pod kontrolou promótora expresie rastliny. Transkribovaná DNA oblasť prednostne obsahuje nukleotidovú sekvenciu vybranú z nukleotidovej sekvencie EMBL Prístupové číslo N° X83369 od nukleotidovej polohy 104 až do nukleotidovej polohy 1108, nukleotidová sekvencia EMBL Prístupové číslo N° X83370 od nukleotidovej polohy 195 až do nukleotidovej polohy 1346, nukleotidová sekvencia EMBL Prístupové číslo N° X83371 od nukleotidovej polohy 266 až do nukleotidovej polohy 1396, nukleotidová sekvencia SEQ ID N° 1 • od nukleotidovej polohy 182.až do nukleotidovej polohy 1243, nukleotidová sekvencia SEQ ID N° 2 od nukleotidovej polohy 181 až do nukleotidovej polohy 1299, nukleotidová sekvencia SEQ ID N° 3 od nukleotidovej polohy 198 až do nukleotidovej polohy 1298, nukleotidová sekvencia SEQ ID N° 4 od nukleotidovej polohy 165 až do nukleotidovej polohy 1109, nukleotidová sekvencia SEQ ID N° 5 od nukleotidovej polohy 48 až do nukleotidovej polohy 1118 alebo nukleotidová sekvencia SEQ ID N° 21 od nukleotidovej polohy 316 až do nukleotidovej polohy 1389 pre Zea mays CYCD2.

V obzvlášť preferovanom uskutočnení vynálezu hladina expresivity cyklínu typu CycD2 je pozmenená (zvýšená) zavedením „chimérického cycD2 génu“ obsahujúceho transkribovanú DNA oblasť kódujúcu cyklín typu CycD2 do genómu rastlinnej bunky pod kontrolou promótora expresie rastliny prednostne základného promótora, najmä CaMV35S promótora, ako je chimérický cycD2 gén plazmidu pCECl v usporiadaní na pozmenenie morfológie, architektúry a rastových charakteristických vlastností transgénovej rastliny, najmä na zvýšenie vegetatívneho rastu transgénovej rastliny, obzvlášť na pozmenenie rastovej rýchlosti transgénovej rastliny

Na účel vynálezu „zvýšenie alebo zníženie“ merateľnélio fenotypového znaku je kvantifíkované ako rozdiel medzi strednými meraniami vzťahujúci mi sa na opísaný znak v rozdielnych rastlinách jednej transgénovej rastlinnej línie a strednými meraniami znaku v divom type rastlín delené strednými meraniami znaku v divom type rastlín, vyjadriteľné v percentách, kde transgénové a kontrolné (divý typ) rastliny rastú za rovnakých podmienok dodávania živín, svetla, vlhkosti, teploty a podobne, prednostne za štandardných podmienok. Preferované hladiny zvýšenia alebo zníženia sú štatisticky signifikantné, prednostne pri 0,05 hladine spoľahlivosti, najmä pri 0,01 hladine spoľahlivosti podľa štatistickej metódy opísanej v Statistical Methods od Snedecora a Cochrana).

Zvýšenie vegetatívneho rastu transgénovej rastliny je prednostne sledované meraním zvýšenia váhy sušiny v priebehu rastovej periódy. Stredné zvýšenie váhy sušiny je definované ako rozdiel v strednej váhe sušiny transgénových rastlín a divého typu rastlín násobené stom a delené strednou váhou sušiny rastlín divého typu.'Typické'zvýšenie váhy sušiny, najmä v skorej

I rastovej perióde zavedením chimérických cycD2 génov podľa vynálezu je v intervale podľa vynálezu aspoň asi 39% až asi 350% obzvlášť asi 68% až asi 150%.

Je jasné, že zvýšenie váhy sušiny spôsobené zavedením chimérických génov podľa vynálezu sa môže meniť v závislosti na použitých rastlinných druhoch alebo chimérických génov a signifikantné zvýšenie váhy sušiny v transgénových rastlinách je zahrnuté vo vynáleze, najmä váha sušiny z aspoň asi 1,4 násobku na aspoň asi 4,5 násobku váhy sušiny v netransformovaných kontrolných rastlinách, najmä z aspoň asi 1,8 násobku na aspoň asi 2,7 násobku váhy sušiny v netransformovaných kontrolných rastlinách. V určitom prípade stredná váha sušiny transgénových rastlín je štatisticky signifikantné odlišná od strednej váhy netransformovaných rastlín.

Zvýšenie vegetatívneho rastu transgénovej rastliny môže byť určené porovnaním počtu listov viditeľných na transgénových rastlinách a kontrolných rastlinách divého typu za určitý čas. Rozdiel v počte listov transgénových rastlín v strede rastovej periódy je očakávaný aspoň asi 1,1 do aspoň 3 násobku, najmä aspoň asi 1,5 do 2 násobku listového počtu v netransformovaných rastlinách

Zvýšenie vegetatívneho rastu transgénovej rastliny môže byť tiež sledované meraním výšky stonky ( merané od úrovne pôdy po vrcholový bod) počas rastovej periódy. Stredné zvýšenie -výšky stonky je definované ako » rozdiel v strednej výške stonky transgénových rastlín a rastlín divého typu násobené stom a delené strednou výškou rastlín divého typu. Typické zvýšenie výšky stonky zavedením chimérických cycD2 génov podľa vynálezu, je aspoň asi 65% počas skorého rastu nad aspoň asi 20-30% v strednej rastovej perióde na aspoň asi 10% v čase kvitnutia ale môže byť vyššia asi 120% až asi 190% skorého rastu, 40-50% až asi 75% v strednej rastovej periódy, 15-20% na konci štádia kvitnutia.

Je zrejmé, že zvýšenie výšky stonky zavedením chimérických génov podľa vynálezu sa môže meniť v závislosti na rastlinných druhoch alebo chimérických génov a signifikantné zvýšenie výšky stonky v transgénových rastlinách je zahrnuté vo vynáleze, najmä výška stonky z aspoň asi 1,1,násobku až aspoň asi ’ t * násobok výšky stonky v netransformovaných kontrolných rastlinách, najmä aspoň asi 1,5 násobku až aspoň asi 2 násobok výšky stonky v netransformovaných kontrolných rastlinách.

Rozdiel vo výške stonky medzi transgénovými a kontrolnými rastlinami sa znižuje ako rastové procesy, pretože rastová rýchlosť klesá u rastlín, ktoré kvitnú. Koncová výška transgénovej rastliny môže byť podobná s koncovou výškou netransgénovej rastliny.

Transgénové rastliny obsahujúce chimérické cycD2 gény podľa vynálezu majú zvýšenú rastovú rýchlosť v porovnaní s netransformovanými rastlinami a výsledkom je redukovaný čas, ktorý je potrebný na úplné dosiahnutie váhy sušiny alebo výšky stonky. „Rastová rýchlosť“ ako je tu uvádzaná poukazuje na zvýšenie vo veľkosti rastliny alebo časti rastliny za deň, najmä na zvýšenie vo výške stonky za deň a môže byť vypočítaná ako rozdiel medzi veľkosťou rastliny alebo časti rastliny a koncom periódy, ktorá predstavuje počet dní. najmä 6 až 8 dni delené počtom dni. Zvýšenie rastovej rýchlosti je prednostne vyjadrené podľa všeobecnej definície zvýšenia merateľného fenotypu, ale môže byť tiež vyjadrené ako pomer medzi rastovou rýchlosťou transgénových rastlín oproti rastovej rýchlosti netransformovaných kontrolných rastlín počas tej istej periódy za tých istých podmienok.

Už spomínané zvýšenie rastovej rýchlosti spôsobené zavedením chimérických génov, najmä chimérických cycD2 génov podľa vynálezu sa môže meniť v závislosti od rastlinných druhov alebo chimérických génov a signifikantné zvýšenie rastovej rýchlosti u transgénových rastlín je zahrnuté vo vynáleze, najmä zvýšenie rastovej rýchlosti z asi 4 % až asi 85 %, obzvlášť z asi 20 % až asi 60 %, špeciálne z asi 30 % až asi 50 %

Zvýšenie vegetatívneho rastu transgénovej rastliny môže byť tiež sledované meraním dĺžky alebo veľkosti najväčšieho listu v rozdielnom čase počas rastovej periódy pričom listy sa ešte rozvíjajú. Tento zmerateľný fenotyp je rozmer zvýšenej zrelosti transgénových rastlín. Stredné zvýšenie dĺžky najväčšieho listu (definované ako rozdiel medzi strednou dĺžkou najväčšieho listu transgénových rastlín a rastlín divého typu násobený stom a delený strednou dĺžkou najväčšieho listu rastlín ‘divého typu) získané zavedením chimérických génov podľa vynálezu je z 7 % až 3 1 % (stredná hodnota asi 17 %) počas skorého rastu, na asi 3-14 % (stredná hodnota asi 7 %) v strednej rastovej perióde.

Znova tieto zvýšenia vo veľkosti najväčšieho listu spôsobené zavedením chimérických génov podľa vynálezu sa môžu meniť v závislosti na rastlinných druhoch alebo chimérickom géne a signifikantné zvýšenie v raste alebo veľkosti listu v transgénových rastlinách je zahrnuté vo vynáleze

Ďalší predmet vynálezu je chimérický gén kontrolujúci bunkové delenie a to najmä chimérické gény cycD2, ktoré môžu byť zavedené do rastlín na zvýšenie koreňového rozvoja, najmä na zvýšenie strednej dĺžky koreňa. Vo všeobecnosti zvýšenie koreňového rozvoja je paralelné so zvýšením v vegetatívnej časti nad zemou (stonka, listy, kvety) a môže byť z asi 40 % až asi 70 %, ale znova tieto zvýšenia môžu byť rozdielne v závislosti na rastlinných druhoch alebo chimérickom géne a signifikantné zvýšenie najmä štatisticky signifikantné zvýšenie v koreňovom rozvoji je zahrnuté vo vynáleze.

Ako už iný predmet vynálezu, chimérický gén kontrolujúci bunkové delenie najmä chimérické cycD2 gény môžu byť zavedené do rastlín na zvýšenie veľkosti ako aj počtu kvetov, najmä počtu oplodnených kvetov a počtu oplodnených ovulum v každom kvete Výsledkom zvýšenia počtu oplodnených kvetov a počtu oplodnených ,ovulum v každom kvete (všeobecne -vedie .ku väčšiemu počtu semien na rastlinu) je tiež zvýšenie množstva semien od rastliny. Je zrejmé, že zvýšenie počtu kvetov a ovulum na kvet tak ako aj zvýšenie množstva semien je rozdielne a závisí podľa vynálezu od rastlinných druhov transformovaných chimérickými génmi kontrolujúcimi bunkové delenie alebo od použitých chimérických génov. Typické zvýšenie v počte kvetov spôsobený zavedením chimérického génu obsahujúceho CycD2 kódujúcu DNA oblasť pod kontrolou CaMV35S promótora je v intervale aspoň asi 4 % až aspoň asi 30 %, najmä aspoň 10 % až aspoň asi 20 %. Typické zvýšenie v množstve kvetov je z intervalu asi aspoň 20 % až aspoň asi 50 %, najmä z asi % až asi 45 % zatiaľ čo zvýšenie počtu semien (vyjadriteľné vo váhe) je z aspoň asi 5 % až aspoň asi' 55 %, najmä aspoň asi 10 % až aspoň asi. 30 %' * ⁹ obzvlášť asi 25 %.'

V ešte ďalšom uskutočnení vynálezu chimérický gén kontrolujúci bunkové delenie najmä chimérické cycD2 gény môže byť tiež zavedený do rastlín alebo ich semien na zrýchlenie klíčenia. Zistilo sa, že transgénové semená obsahujúce chimérický cycD2 gény vynálezu môžu klíčiť aspoň medzi asi 8 až asi 10 hodín rýchlejšie ako kontrolné semená divého typu.

Spomínané chimérické gény môžu byť tiež zavedené do rastlín na zníženie stredného počtu dní požadovaných na dosiahnutie rozvoja kvetenstva, teda efektívne redukujú čas potrebný na začatie kvitnutia. Transgénové rastliny obsahujúce chimérické cycD2 gény vynálezu takto dosiahnu zrelosť, najmä štádium kvitnutia pričom majú normálnu veľkosť. Skutočná redukcia času požadovaná na dosiahnutie štádia kvitnutia môže závisieť na rastlinných druhov alebo chimérických génov. Typicky transgénové rastliny prechovávajúce chimérický gén obsahujúce CycD2 kódujúci DNA oblasť pod kontrolou C.aMV35S promótora prejavujú redukciu času požadovanú na kvitnutie z aspoň asi 3 % až 1 1 %, najmä aspoň asi 4 % až 7 %.

V ďalšom obzvlášť preferovanom uskutočnení chimérický gén obsahujúci

CycD3 kódujúci transkribovanú DNA oblasť pod kontrolou promótora expresie rastliny, prednostne základného promótora, obzvlášť CaMV35S promótora ako aj chimérický gén obsahujúci nukleotidovú sekvenciu chimérického cycD3 génu pCRK9 je zavedený do rastlinnej bunky na získanie transgénovej rastliny s pozmenenými morfologickými znakmi alebo architektúrou, obzvlášť s pozmenenou veľkosťou špecifických rastlinných častí alebo orgánov, obzvlášť s pozmenenou veľkosťou kvetov a morfológiou ako kvety s pretiahnutými a rozšírenými korunnými plátkami. Transgénové rastliny transformované s chimérickým génom obsahujúcim CycD3 kódujúcim DNA oblasť pod kontrolou promótora expresie rastliny (a ich potomstvo) prejavujú zvýšenie vo veľkosti kvetov asi 31 % na asi 44 %. Tieto transgénové rastliny kvitnú neskoršie než rastliny divého typu čo zodpovedá zvýšeniu času kvitnutia asi 5 % na asi 20 %, obzvlášť asi 8 % na asi 16 %.

V ďalšom uskutočnení vynálezu funkčná hladina proteínu kontrolujúceho bunkové delenie, ktorý je schopný fosforylácie, RB proteínu alebo viazania « i vreckovej domény Rb proteínov, obzvlášť cyklín D-typu je zvýšená na získanie rastliny s pozmenenou rastovou rýchlosťou alebo architektúrou integráciou chimérického génu do genómu buniek rastliny obsahujúce väzbové DNA fragmenty;

a) rastlinná expresívny promótorová oblasť, najmä CaMV35S promótorová oblasť,

b) transkribovaná DNA oblasť kódujúca proteín, ktorý keď sa prejaví zvýši sa funkčná hladina proteínu kontrolujúceho bunkové delenie, prednostne kódujúca mutujúci proteín kontrolujúci bunkové delenie alebo časť mutujúceho proteínu kontrolujúceho bunkové delenie, prednostnejšie kódujúca mutujúci cyklín D-typu alebo časť cyklínu D-typu, najmä kódujúca cyklín D-typu, ktorý má mutáciu v cyklinovom boxe (substitúcia aminokyseliny 185 alebo aminokyseliny 155 cyklínu D2-typu, špeciálne E 185A alebo K155A) alebo cyklín D-typu kde PEST sekvencie sú odstránené, najmä ktoré majú vymazaný C-terminál na odstránenie PEST sekvencií alebo cyklínu D-typu kde LxCxE väzbový motív bol vymenený alebo vymazaný, najmä kde C zvyšky z LxCxE väzbového motívu boli vymazané; a

c) 3' koniec formujúci a polyadenylačný signál funkčný v rastlinných bunkách.

Vynález nie je limitovaný spôsobom účinku, čo je myslené tak, že mutujúce proteíny kontrolujúce bunkové delenie sa získajú spôsobmi izolovania inhibítorov alebo antagonistov normálne funkčných proteínov kontrolujúcich bunkové delenie.

Z opisu je zrejmé, že chimérické gény obsahujúce transkribovanú DNA oblasť kódujúcu druhé cyklíny D-typu, najmä cyklíny odvedené od rastlín CycD skupiny môžu byť získané podobným spôsobom. Tieto gény sa môžu získať z iných rastlinných druhov alebo odrôd rozdielnymi spôsobmi, ktoré zahrnujú hybridizáciu použitím dostupných CycDl, CycD2 alebo CycD3 kódujúcich DNAs ako sondy a hybridizačné podmienky so zníženou presnosťou alebo polymerázovú reťazovú reakciu ako základ metód využívajúcich oligonukleotidy na dostupné nukleotidové sekvencie cyklínov. D-typu, prednostne oligonukleotidy majúce nukleotidovú sekvenciu zodpovedajúcu sekvenciám kódujúcim súhlasné aminokyselinové sekvencie, najmä oligonukleotidy majúce nukleotidovú sekvenciu zodpovedajúcu sekvenciám kódujúcim zásobné aminokyselinové sekvencie vo vnútri cyklínového boxu pre každú skupinu cyklínov. Tieto udržiavané aminokyselinové sekvencie môžu byť odvodené z vhodných DNA kódujúcich takéto aminokyselinové sekvencie. Obzvlášť preferovaná kombinácia oligonukleotidov na PCR zosilnenie rastlinných cyklínov Dl typu je oligonukleotid vybraný zo skupiny oligonukleotidov majúcich DNA sekvenciu SEQ ID N°, SEQ ID N° 8 alebo SEQ ID N° 9 a oligonukleotid vybraný zo skupiny oligonukleotidov majúcich DNA sekvenciu SEQ ID N° 10 alebo SEQ ID N° 1 I.

Obzvlášť výhodná kombinácia oligonukleotidov na PCR zosilnenie rastlinných cyklínov D2 typu je oligonukleotid vybraný zo skupiny oligonukleotidov majúcich DNA sekvenciu SEQ ID N° 12 alebo SEQ ID N° 13 a oligonukleotid vybraný zo skupiny oligonukleotidov majúcich DNA sekvenciu SEQ ID N° 14 alebo SEQ ID N° 15. Obzvlášť výhodná kombinácia oligonukleotidov na PCR zosilnenie rastlinných cyklínov D3 typu je oligonukleotid vybraný zo skupiny oligonukleotidov majúcich DNA sekvenciu SEQ ID N°I6, SEQ ID N° 17 alebo SEQ 1D N° 18 a oligonukleotid vybraný zo skupiny oligonukleotidov majúcich DNA sekvenciu SEQ ID N° 19 alebo SEQ ID N° 20. Zosilnený DNA fragment je. potom použitý na triedenie cD-NA alebo • I genómovej knižnice ( za prísnych podmienok) na izoláciu plnej dĺžky klonov.

Alternatívne, prídavné gény kódujúce cyklíny odvodené od rastlín môžu byť získané takými technikami ako, ale nie nimi limitované, funkčná komplementárna podmieneného Gl-S cyklínu deficientných kvasinkových kmeňov ako opisuje Soni a kol. (1995) a Dahl a kol. (1995) alebo použitím kvasinkového dvoj-hybridného systému (Fields a Song, 1989) na izoláciu DNA sekvencii kódujúcich cyklíny viazané na vreckovú doménu Rb proteínov opisované ako supra.

Ďalej je známe, že určité rastliny obsahujú viac než jeden gén kódujúci cyklín D-typu tej istej subskupiny ( tabak obsahuje aspoň dva gény CycD3 » · , . ¹ subskupiny) a je zrejmé, že tieto varianty môžu byť použité v rámci predmetu· vynálezu.

Okrem toho cyklíny D-typu, ktoré majú aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je podobná jednej sekvencii zahrnutej v tomto vynálezy, ako sú mutujúce cyklíny D-typu, môžu byť použité na ten istý účinok. Požívaný termín v podstate rovnaké „aminokyselinové sekvencie“ znamená, že keď dve relevantné sekvencie sú usporiadané, percentuálna sekvenčná identita, t.j. počet polôh s identickými aminokyselinovými zvyškami delený počtom zvyškov v kratšej z dvoch sekvencii je vyššia než 80 %, prednostne vyššia než 90 %. Orientácia dvoch aminokyselinových sekvencii bola vykonaná Wilbur a Lipmannovým algoritmom (Wilbur a Lipmann, 1983) použitím okna veľkosti 20 aminokyselín, slovo dĺžky 2 aminokyselín a interval chyby 4. Počítačová analýza a interpretácia sekvenčných dát, ktoré zahrnujú sekvenčné usporiadanie ako už bolo opísané, môžu byť jednoducho vykonané použitím programov Intelligenetics^1M Suite (Intelligenetics Inc , CA).

Je zrejmé, že akákoľvek DNA sekvencia kódujúca protein kontrolujúci bunkové delenie, najmä cyklín D typu, môže byť použitá na konštrukciu chimérických génov kontrolujúcich bunkové delenie, špeciálne DNA sekvencie, ktoré sú čiastočne alebo kompletne syntetizované človekom.

Je zrejmé, že iné promótory expresie rastliny, obzvlášť 'základné

I promótory také ako opín syntetázové promótori Agrobaktérium Ti- alebo Riplazmidov, najmä nopalín syntetázový promótor môžu byť použité na získanie podobných účinkov Predmet vynálezu môže byť realizovaný použitím alternatívneho CaMV3 5 promótora, ktorý je opísaný Hullom a Howellom, Virology, 86, pg. 482 (1978) ako je známe z doterajšieho stavu techniky

Ďalším predmetom vynálezu je poskytnúť rastliny s pozmenenou morfológiou alebo architektúrou obmedzenou na špecifické orgány alebo tkanivá použitím špecifických tkanivových alebo špecifických orgánových promótorov na kontrolu expresivity DNA kódujúcej protein kontrolujúci bunkové delenie, obzvlášť cyklínu D-typu. Takéto špecifické tkanivové alebo

I • I * , špecifické orgán,ové promótory sú veľmi dobre známe v stave techniky a zahrnujú, ale nie sú nimi limitované, „semeno-špecifické“ promótory (WO 89/03887), „orgán-primordiálny“ špecifické promótory (An a kol., 1996), „stonka-špecifické“ promótory (Keller a kol., 1988), „list-špecifické“ promótory (Hudspeth a kol., 1989), „mezofil-špecifické“ promótory ( ako svetlom ovplyvnené Rubisco promótory), „koreň-špecifické“ promótory (Keller a kol., 1989), „hľúza-špecifické“ promótory (Keil a kol., 1989), vaskulárne tkanivové špecifické promótori (Peleman a kol., 1989) meristematické špecifické promótori (ako promótorový SHOOTMER1STEMLESS (STM) gén, Long a kol., 1996) primordiálny špecifický promótor (ako promótorový Antirrhinum CycD3a gén, Doonan a kol., 1998) a podobne.

V ďalšom uskutočnení vynálezu, expresivita chimérického génu kódujúceho protein kontrolujúci bunkové delenie môže byť kontrolovaná aplikáciou vhodného chemického induktora, viazaním DNA oblasti kódujúcej protein kontrolujúci bunkové delenie na promótor, ktorého expresivita je indukovaná chemickou zlúčeninou, ako je promótor génu, ktorý je zahrnutý v Európskom patente „EP“ 0332104 alebo promótor génu, ktorý je zahrnutý v WO 90/08826

V ešte ďalšom uskutočnení vynálezu, expresivita chimérického génu kódujúceho proteín kontrolujúci bunkové delenie môže byť kontrolovaná požitípi miesto-špecifických rekombináz a im zodpovedajúcich cis-sekvencií a vložením odlišnej nukleotidovej sekvencie (prednostne s transkripčnými a/alebo translačnými terminačnými signálmi) lemovanej cis-sekvenciami rozpoznateľnými miesto-špecifickými rekombinázami (lox alebo FRT miesta) medzi promótor expresie rastliny a transkribovaná oblasť kódujúcu proteín kontrolujúci bunkové delenie a poskytuje rastlinné bunky obsahujúce chimérický gén s miesto-špecifickou rekombinázou (Cre alebo FLP) a to tak, že vložená odlišná nukleotidová sekvencia je eliminovaná rekombináciou, teda chimérický gén kontrolujúci bunkové delenie sa prejavuje.

Morfologické zmeny získané zvýšením expresivity proteínov kontrolujúcich bunkové delenie, obzvlášť cyklínov D-typu v rastlinách, ktoré je spôsobené zavedením cKimérického génu, ktorý obsahuje DNA oblasť kódujúcu proteín kontrolujúci bunkové delenie najmä cyklínu D-typu pod kontrolou promótora expresie rastliny môžu byť zvýšené odstránením adapčných alebo inaktivačných PEST sekvencii. PEST sekvencie sú aminokyselinové sekvencie, ktoré sú bohaté na prolín, glutamát alebo asparát a serín alebo treonín lokalizované medzi pozitívne nabitými lemujúcimi zvyškami, ktoré sú zahrnuté v rapídnej zmene proteínu obsahujúceho také sekvencie (Tyers a kol., 1992; Cross, 1988; Wittenberg a Reed, 1988; Salama a kol., 1994) Odstránenie týchto PEST sekvencii v cyklínoch kvasiniek stabilizuje cykliny in vivo (Pines 1995). PEST oblasti môžu byť identifikované počítačovou analýzou použitím softwaru ako je PESTF1ND (Rogers a kol., 1986; Rechsteiner, 1990). Mutácia DNA, ktorá kóduje proteín kontrolujúci bunkové delenie s pozmenenými PEST sekvenciami je známa používaná metóda opísaná Sambrookom a kol. (1989)

Kvantitatívne účinky fenotypových zmien môžu byť modulované (zvýšenie alebo potlačenie) expresivitou endogénnych bunkové delenie kontrolujúcich kódujúcich chimérických génov, obzvlášť endogénnych CycD kódujúcich chimérické gény ako alternatíva použitia heterológnych génov kódujúcich podobné proteíny z iných rastlín. Prednostne sú používané heterológne gény najmä heterológne gény kódujúce podobné proteíny s menej než asi 65%, prednostne menej než asi 75%, výhodnejšie menej než asi 65% identita aminokyselinovej sekvencie na endogénny proteín kontrolujúci bunkové delenie.

, ‘ ₍ J, ·

V inom aspekte tohto vynálezu, morfológia rastlín môže byť pozmenená znižovaním expresivity funkčných proteínov kontrolujúcich bunkové delenie, najmä cyklínu D-typu. Toto môže byť dosiahnuté použitím napríklad antisenseRNA, ribozómu alebo ko-supresívnymi technikami. Chimérický gén obsahujúci transkribovanú DNA oblasť, ktorá je transkribovaná do RNA a ich produkciu redukuje, inhibuje alebo predchádza expresivite proteínu kontrolujúceho bunkové delenie, najmä cyklínu D-typu vo vnútri rastlinných buniek. Chimérický gén je zavedený do rastlinných buniek, najmä stabilne integrovaný v genóme rastlinných buniek.

V jednom uskutočnení tohto aspektu, transkribovaná DNA oblasť , . . ¹ chimérického génu kóduje antisense RNA,, ktorá je komplementárna ku aspoň

I časti sense mRNA kódujúcou proteín kontrolujúci bunkové delenie, najmä cyklín D-typu. Antisense RNA teda obsahuje oblasť, ktorá je doplnková ku časti sense mRNA prednostne ku časti kontinuálneho reťazca v dĺžke 50 báz, najmä aspoň v dĺžke medzi 100 a 1000 bázami. Antisense RNA môže byť komplementárna ku určitej časti mRNA sekvencie: môže byť komplementárna ku sekvencii bližšej ku 5' koncu alebo čiapočke, ku časti alebo ku celej riadiacej oblasti, ku intrónovej alebo exónovej oblasti (alebo ku oblasti nesúcej exón a intrón) sense mRNA, ku oblasti nesúcej nekódujúcu a kódujúcu oblasť, ku celej alebo časti kódujúcej oblasti zahrnujúcej 3' koniec kódujúcej oblasti a/alebo ku celej alebo časti 3' alebo prívesná oblasť. Sekvenčná podobnosť medzi antisense RNA a komplementom sense RNA kódujúcim proteín kontrolujúci bunkové delenie je z intervalu aspoň okolo 75% až asi 100%.

V ďalšom uskutočnení tohto aspektu, transkribovaná DNA oblasť chimérického génu kóduje špecifický RNA enzým alebo takzvaný ribozóm (pozri WO 89/05852) schopný vysoko špecifického štiepenia sense mRNA kódujúcej proteín kontrolujúci bunkové delenie, najmä cyklín D-typu.

V ešte ďalšom uskutočnení, hladina funkčného proteínu kontrolujúceho bunkové delenie môže byť znížená expresiou chimérického génu, ktorý obsahuje DNA oblasť kódujúcu proteín alebo polypeptid, ktorý keď sa prejaví redukuje hladinu proteínu kontrolujúceho bunkové delenie, najmä cyklín Dtypu alebo inhibuje tento proteín, najmä cyklín D-typu aby sa uplatnila jeho '· » , » funkcia vo vnútri rastlinných buniek. Prednostne chimérický gén kóduje protilátku, ktorá sa viaže na proteín kontrolujúci bunkové delenie a najmä cyklín D-typu.

Znižovanie hladiny alebo funkčnej hladiny proteínu kontrolujúceho bunkové delenie, najmä cyklínu D-typu vo vnútri buniek transgénovej rastliny obsahujúcej chimérické gény tohto vynálezu sa prejaví v pozmenenej architektúre, najmä v znižovaní výšky stonky a v znižovaní rastovej rýchlosti alebo v oneskorení kvitnutia transgénových rastlín v porovnaní s netransformovanými rastlinami, počas rastu za tých istých podmienok.

Získaný efekt sa môže meniť v závislosti na rastlinných druhov alebo použitých 1 ' chimérických génov a určitý efekt na architektúru a/alebo rastovú rýchlosť, najmä znižovanie výšky stonky alebo rastovej rýchlosti alebo zvyšovanie času potrebného na rozvoj kvetenstva je zahrnutý v tomto vynáleze.

Znižovanie rastovej rýchlosti spôsobujúce znižovanie hladinu proteínu kontrolujúceho bunkové delenie, prednostne cyklín D-typu, najmä CYCD2 cyklín je z intervalu z asi 30 % až asi 60 % obzvlášť z asi 35 % až asi 50 %.

Zníženie výšky stonky spôsobené znižovaním hladiny proteínu kontrolujúceho bunkové delenie, prednostne cyklín D-typu, obzvlášť CYCD2 cyklín je z intervalu z asi 10 % až asi 60 %, najmä z asi 30 % až asi 50 %, prednostnejšie okolo 40 %.

Zvýšenie času kvitnutia spôsobené znížením hladiny proteínu kontrolujúceho bunkové delenie, prednostne cyklínu D-typu, najmä cyklínu D2typu je z intervalu asi 10 % až asi 40 % najmä z asi 15 % až asi 38 %.

Chimérický gén kontrolujúci bunkové delenie môže zahrnovať ďalšie regulátory alebo iné sekvencie ako sú vedúce sekvencie [cab22L vedúca sekvencia z Petúnie alebo omega vedúca sekvencia z TMV (Gallie a kol., 1987 ), 3' transkripčné terminačné a polyadenylačné signály (oktopín syntetázový gén [De Greve a koľ, 1982)] nopalínu syntetázového génu [Depicker a kol., 1982] alebo T-DNA gén 7 [Velten a Schell, 1985] a podobne [Guerineau a kol., 1991; Proudfoot, 1991; Safacon a kol., 1991; Mogen a kol., 1990; Munroe a kol., 1990; Ballas a kol., 1989; Joshi a kol., 198 7], - rastlinné

I ¹ 1 · translacné iniciačné sekvencie [Joshi, 1987], intróny [Luehrsen a Walbot, 1991] a podobne viazané na nukleotidovú sekvenciu chimérického génu kontrolujúceho bunkové delenie.

Prednostne rekombinantná DNA obsahuje chimérický gén kontrolujúci bunkové delenie prostredníctvom chimérického markera génu. Chimérický marker génu môže obsahovať marker DNA, ktorý je viazaný pri jeho 5' konci ku rastlinnému promótoru prednostne ku konštitutívnemu promótoru, ako je CaMV 35S promótor alebo ku svetlom ovplyvnenému promótoru, ako je promótor génu kódujúceho malú subjednotku Rubisco a ktorý je viazaný pri jeho 3' konci na vhodnú rastlinnú transkripciu 3' konca tvoriaceho a > polyadenylačného signálu. Je očakávané, že výber markerá DNA nie je . _φ , * l · rozhodujúci a môžu byť použité iné vhodné markery DNA. Napríklad, marker DNA môže kódovať proteín, ktorý poskytuje rozpoznateľnú farbu na transformáciu rastlinnej bunky, ako je Al gén (Meyer a kol., 1987) a môže poskytnúť herbicídmi rezistenciu na transformovanú rastlinnú bunku, ako je bar gén kódujúci rezistenciu na fosfinotricín (EP 0,242,246) alebo môže poskytnúť antibiotickú rezistenciu na transformované bunky, ako je aac(6') gén kódujúci rezistenciu na gentamycin (WO94/01560).

Je zrejmé, že vynález môže byť aplikovaný na všetky rastlinné druhy a odrody ale vynález je špeciálne určený na pozmenenie architektúry alebo na zvýšenie rastovej rýchlosti rastlín s komerčnou hodnotou. Očakáva sa, že zvýšenie vegetatívneho rastu bude realizované v rastlinách, ktoré nie sú rozsiahle pestované a majú nemenný vegetatívny rast. Vynález bude čiastočne relevantný pre rastliny, ktoré rastú v skleníku čiastočne vďaka zredukovanému času, ktorý je potrebný na úplne dosiahnutie požadovaného vývojového štádia, ako je kvitnutie, dozrievanie ovocia alebo semien. Vynález je ďalej dôležitý na zvýšenie rastovej rýchlosti stromov, najmä stromov, ako je borovica.

eucalyptus a podobné stromy. Vynález ďalej poskytuje zlepšenie aplikácie, ktorá zahrnuje rozšírenie účinnej plochy, kde rastliny môžu byť kultivované redukciou času potrebného na dosiahnutie úplného ekonomicky dôležitého vývojového štádia. Preferovanými rastlinami, na ktoré sa dá vynález aplikovať sú kukurica, repka olejná, ľan, pšenica, tráva, ďatelina, strukoviny,- brassica vegetable, rajčina, hlávkový šalát, jačmeň, zemiak, cukrová repa, slnečnica roľná a okrasné rastliny, ako sú karafiát, chryzanténa, ruža, tulipán a podobne.

Rekombinantná DNA obsahujúca chimérický gén kontrolujúci bunkové delenie môže byť stabilne inkorporovaná do jadrového genómu bunky rastliny.

Génový prenos môže byť uskutočňovaný pomocou vektora, ktorým je Tiplazmid obsahujúci chimérický gén podľa vynálezu a je prenášaný

Agrobaktérium. Transformácia môže byť uskutočnená použitím postupu, ktorý je opísaný napríklad v EP 0,116,718. Alternatívne môže byť použitý akýkoľvek typ vektora na transformáciu rastlinnej bunky, ktorá je vykonaná metódami, ako je priamy génový transfer (opísaný v EP 0,233,247), nepriama transformácia (opísaná v EP 0,270(356; WO . 85/01856 a US 4,684,611), * » * · rastlinný RNA vírus-nepriama transformácia (opísaná v EP 0,067,553 a UŠ 4,407,956), lipozóm-nepriama transformácia (opísaná v US 4,536,475) a podobne.

Iné metódy ako je bombardovanie kukurice s mikroprojektilmi ako je opísané Frommom a kol. (1990) a Gordon-Kamm a kol. (1990) sa ukazujú ako vhodné. Bunky monocotyledónnych rastlín ako sú hlavne obilniny môžu byť transformované použitím poškodeného a/alebo enzým-degradovaného kompaktného embryogenetického tkaniva schopného tvorby kompaktného embryogenetického kalusu alebo poškodeného a/alebo degradovaného nevyvinutého zárodku ako je opísané v WO 92/09696 Výsledná transformovaná rastlinná bunka môže byť použitá na regeneráciu a transformáciu rastliny v konvenčnom spôsobe.

Získaná transformovaná rastlina môže byť použitá v konvenčnej schéme množenia na produkciu transformovaných rastlín s tými istými charakteristikami alebo na zavedenie chimérického génu podľa vynálezu kontrolujúceho bunkové delenie v iných odrodách tých istých alebo príbuzných rastlinných druhov. Semená získané z transformovaných rastlín obsahujú chimérický gén podľa vynálezu kontrolujúci bunkové delenie ako stabilná genómová vložka.

Nasledujúce neobmedzujúce príklady opisujú stavbu chimérického génu kontrolujúceho bunkové delepie a použitie génov na modifikáciu architektúry a rastovej rýchlosti rastlín. Pokiaľ nie je v príkladoch určené inak všetky rekombinantné DNA techniky sú vykonávané podľa štandardných protokolov ako sú opísané v Sambrook a kol (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY a v časti 1 a 2 Ausubel a kol. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA. Štandardné materiály a metódy na molekulárnu prácu s rastlinami sú opísané v Plánt Molecular Biology Labfax (1993) do R.D.D. Croy, publikované BIOS Scientific Publications Ltd (UK) a Blackwell Scientific Publications, UK.

V priebehu celého opisu a príkladov sa odkaz odvoláva na nasledujúce sekvencie: , · , > »

SEQ ID N° 1: cDNA kódujúca Nicotiana tabacum CYCD2J SEQ ID N° 2; cDNA kódujúca Nicotiana tabacum CYCD3J SEQ 1DN°3: cDNA kódujúca Nicotiana tabacum CYCD3;2 SEQ ID N° 4: cDNA kódujúca Hehanihus tuberosus CYCD1J SEQ ID N° 5: cDNA kódujúca Helianlhus tuberosus CYCD3;1 SEQ ID N° 6; T-DNA kódujúca Helianlhus tuberosus CYCD3;1 SEQ ID N° 7: PCR primér 1

SEQ ID N° 8: PCR primér 2 SEQ ID N° 9: PCR primér 3 SEQ ID N° 10: PCR primér 4 SEQ ID N° 11: PCR primér 5 SEQ ID N° 12. PCR primér 6 SEQ 1D N° 13: PCR primér 7 SEQ ID N° 14: PCR primér 8

SEQ	ID	N°	15: PCR	primér 9
SEQ	ID	N°	16: PCR	primér 10
SEQ	ID	N°	17 PCR	primér 1 1
SEQ	ID	N°	18: PCR	primér 12
SEQ,	ID	N°	19: PCR	primér 13
SEQ	ID	N°'	20: PCR	primér 14
SEQ	ID	N°	21: cDN.	A kódujúca

Plazmidy pCECI a pCRK9 boli uložené v

Belgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM) Laboratórium voor Moleculaire Biologie-Plasmidecollectie (LMBP) Universiteit Gent

K.L. Ledeganckstraat 35

B-9000 Gent, Belgium marca 1997 boli priradené nasledujúce depozitné čísla: MC1061(pCECl): BCCM/LMBP3657 DH5a (pCRK9): BCCM/LMBP3656

Plazmidy pBlueScript-ZM 18 boli uložené v

Belgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM) Laboratórium voor Moleculaire Biologie-Plasmidecollectie (LMBP) Universiteit Gent

K.L. Ledeganckstraat 35

B-9000 Gent, Belgium marca 1998 pod depozitných číslom BCCM/LMBP 3866

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1. Konštrukcia chimérických génov

1.1 Konštrukcia CaM V35S-AthcycD2 chimérického génu a inklúzia do T-DNA vektoru,

1298 bp Ncol-SacI fragment obsahujúci DNA kódujúcu CYCD2 z A. (haliana (majúca nukleotidovú sekvenciu EMBL Prístupové čislo N° X83370 od nukleotidovej polohy 194 až do nukleotidovej polohy 1332) bol spracovaný Klenowou polymerázou na vykonanie zatupenia prečnievajúcich koncov a spájanie do malého linearizovaného pART7 (Gleave, 1992) dávajúci plazmid pCECl. V tejto ceste chimérický gén lemovaný Notl miestami bol konštruovaný v mieste, kde DNA kódujúca CYCD2 bola viazaná ku CaMV35S p-romótoru CabbB-Jl izolátu (Harpster a kol., 1988) a 3' ocs oblasti (MacDonald a kol., 1991). Chimérický gén bol potom vložený medzi T-DNA hranicu a T-DNA vektor obsahujúci tiež vybrané chimérické markery génu.

Chimérický cycD2 gén bol vyštiepený z pCECl použitím Notl a spájaný do Notl linearizovaného pART27 (Gleave, 1992) na tvorbu pCEC5. PART27 obsahuje chimérický vybraný markerový gén obsahujúci nasledujúce viazané fragmenty: nopalín syntetázový génový promótor, neo kódujúcu oblasť a 3' koniec nopalín syntetázového génu (An a kol., 1988).

Alternatívne, chimérický cycD2 gén je vyštiepený z pCECl použitím reštrikčného enzýmu (Notl) a zavedený do polylinkera medzi T-DNA hraničnú sekvenciu T-DNA vektora pGSV5 spoločne s vybraným chimérickým markerom génu (pSSU-bar-3'ocs, De Almeida a kol., 1989) dáva pCEC5b.

pGSV5 bolo odvodené z plazmidu pGSC1700 (Cornelissen a Vandewiele, 1989) ale odlišuje sa tým, že neobsahuje beta-laktamázový gén a že jeho TDNA je charakterizovaná sekvenciou SEQ ID N 6.

1.2 Konštrukcia CaM V35S-AthcvcD3 chimérického génu a inklúzia do T-DNA vektora

CycD3 cDNA bol izolovaný ako 1335 bp BslI-Dral fragment vytvorený spracovaním s Klenowou polymerázou (majúci nukleotidovú sekvenciu EMBL Prístupové číslo N° X83371 od nukleotidovej polohy 104 až do nukleotidovej polohy 1439) a vložený do Smal miesta pUCl8 na vytvorenie pRSl4a. Tento kloň nesie plne kódujúcu sekvenciu cycD3 s translačným iniciačným kodónom lokalizovaných hneď vedľa Smal miesta pUC18 v takej orientácii, že Sací miesto pUC18 je pri 5' konci cycD3 cDNA a BamHI miesto je pri 3' konci. 1.35kb Sacl-BamHI fragment pRS I4a bol izolovaný a Iigovaný asi ku 26.6 kb

Sacl-BamHI fragmentu pSLJ94 (Jones a kol., 1992) na vytvorenie pCRK9.

V tejto ceste chimérický gén bol konštruovaný tam, kde DNA kódujúca cycD3 kódovú oblasť z A. thaliana sa spája na CaMV35S promótor a 3' ocs oblasť.

V pCRK9 je chimérický gén lokalizovaný medzi T-DNA hranicu sprevádzaný chimérickým vybraným neo génom (Jones a kol., 1992) r

Alternatívne chimérický gén je excidovaný zpRS14a použitím vhodných reštrikčných enzýmov a zavedený v polylinkery medzi T-DNA hraničné sekvencie T-DNA vektora pGSV5 spoločne s vybraným chimérickým markerom génu (pSSU-bar-3'ocs; De Almeida a kol., 1989) za vzniku pCRK9b.

Príklad 2. Agrobaktérium-sprostredkovaná transformácia tabakových rastlín s T-DNA vektormi z príkladu 1.

T-DNA vektory pCEC5 a pCRK9 boli zavedené do Agrobaclerhim tumefeciens LBA4404 (Klapwijk a kol., 1980) elektroporáciou ako ju opisuje Walkerpeach a‘ Velten (1995) a transformanty boli vybrané použitím ¹ I ’ spektinomycínu respektívne tetracyklínu.

T-DNA vektory pCEC5b a pCRK9b sú zavedené v A. tume/aciens C58C1 Rif* triparentálnou zrnitou kolóniou baktérií (Ditta a kol., 1980).

Výsledné kmene Agrobacíerinm sa použili na transformáciu Nicoliana tahacum var Xanthi aplikovaním listovej diskovej transformačnej metódy ako ju opísal (An a kol., (1985).

Osem tabakových rastlín transformovaných s pCRK9 (označených ako IK9, 2K9, 3K9, 4K9, 8K9, 10K9, 17K9, I9K9) bolo generovaných a jedenásť tabakových rastlín transformovaný s pCEC5 (označených ako C8 línie 1 až 3 a 5 až 12 ).

Rastliny transformované pCRK9 T-DNA boli analyzované na počet kópii vložených transgénov Southern hybridizáciou používajúcou označený cDNA inzert pRSI4a ako sondu. Línie 2K9, 3K9 a 4K9 každá získala jednu kópiu transgénu aj keď línia 1K9 obsahovala tri kópie transgénu.

Rastliny transformované pCEC5 T-DNA boli analyzované na počet kópii vložených transgénov Southerm hybridizáciou využívajúcou BamHI digerovanú DNA pripravenú z týchto rastlín a boli označené ako 0,7 kb Ncol-EcoRl fragment z J22 cDNA (obsahujúci časť cycD2 kódujúcu oblasť; Soni a kol, 1995).. Línie C8-3, C8-5, C8-8, C8-1, C8-9, C8-10, C8-11, C8-12 mali jednu kópiu transgénu, línia C8-7 mala dve kópie, línia C8-6 mala tri kópie a línia C8-1 mala štyri kópie transgénu.

TO (primárny transformátor) bol samo oplodnený a prenesený na sadu semien (TI semená). Rastliny rastúce z TI semien boli označené C8-TI-X, kde X predstavuje líniové číslo originálneho transformantu. Semená z TI rastlín boli označené ako T2 semená. Rastliny rastúce z týchto semien sa pomenovali ako C8-T2-X, kde X je znova líniové číslo originálneho transformantu. Vždycky keď generácia nebola spomenutá, rastliny rástli z TI semena.

Nouthern analýza potvrdzuje transkripciu transgénov v aspoň líniách C81, C8-3, C8-7, 3K9 a 8K9.

. I . ' ' , I · i i ·

Príklad 3. Fenotypová analýza transformovaných tabakových rastlín.

3.1. Tabakové rastliny obsahujúce CaMV35S-AthCvcD2 chimérický gén.

Semená z primárnych transformantov (TO rastliny) boli povrchovo sterilizované v 10% bieliacom prostriedku počas 15 minút a dôkladne premyté v sterilnej vode. Povrchovo sterilizované semená boli klíčené na GM médiu obsahujúcom kanamycín v konečnej koncentrácii 100 gg/ml. Semená na platniach boli uložené na päť dní pri 4 °C (vernalizácia) a potom boli premiestnené do rastovej komory pri 23 °C. Na osemnásty deň po premiestnení do rastovej komory (po 23 dňoch celkovo) na kanamycín rezistentné semená boli prenesené do semenných misiek obsahujúcich pôdu a boli nechané rásť pod 18 hodinovými fotoperiódami v rastovej komore. Po ďalších 10 dňoch tieto rastliny boli prenesené do 3 palcových (76,2 mm) téglikov pre rastliny a po ďalších 15 dňoch do 8 palcových (203,2 mm) téglikov pre rastliny, kde boli udržiavané počas experimentu. Trojpalcové a osempalcové tégliky pre rastliny boli inkubované v skleníku pridaním osvetlenia a to na 18 hodinovú fotoperiódu. Rastliny boli uložené v náhodnom usporiadaní v skleníku.

Merania začali o dva dni neskôr (po 45 dňoch alebo po 27 dňoch v pôde;

označované ako týždeň 1) a boli zopakované každý týždeň počas siedmich týždňoch Nasledujúce číslo rastliny bolo analyzované na každej línii: 22 rastlín na línii C8-1, 7 rastliny na línii C8-2, 22 rastlín na línii C8-3, 8 rastlín na línii C8-5, 6 rastlín na línii C8-6, 22 rastlín na línii C8-7, 5 rastlín na línii C8-8, 6 rastlín na línii C8-9, 4 rastliny na línii C8-I0, 6 rastlín na línii C.8-1 1, 5 rastlín na línii C8-12, 34 rastlín na kontrolu (divý typ)

Analyzovali sa nasledujúce parametre: výška rastlín od povrchu pôdy až po najvyšší bod (rastový typ; sumarizovaný v tabuľke 1 ako stredná výška ± štandardná odchýlka v cm); dĺžka najväčšieho listu v definovanom čase ( sumarizovaná v tabuľke 2 ako stredná dĺžka ± štandardná odchýlka v cm), čas (sumarizovaný v tabuľke 3 ako stredný čas ± štandardná odchýlka v dňoch), v ktorom meristém kvetenstva je viditeľný voľne očami (kvetenstvo 0,25 cm a lem); výška, pri ktorej kvetenstvo meristému je > viditeľné (sumarizované v tabuľke 3 ako stredná dĺžka ± štandardná odchýlka v cm); dĺžka korunného plátku kvetov, šírka korunného plátku (sumarizovaná v tabuľke 3 ako stredná dĺžka a šírka ± štandardná odchýlka v mm); celkový počet semenných toboliek na jednu rastlinu a priemerný počet semien (na váhový základ) na rastlinu.

Transgénové rastliny prejavujú zvýšenú rastovú rýchlosť, zrejmú zo štádia semenáčikov čo spôsobuje väčšiu priemernú výšku stonky (tabuľka 1). Po troch týždňoch všetky populácie transgénových línií sú očividne vyššie než netransformované kontrolné rastliny (t-test; v hladine spoľahlivosti 95%), aj keď línie C8-1, C8-2, C8-3, C8-5, C8-11 sú významnejšie vyššie než netransformované kontrolné rastliny v hladine spoľahlivosti 99%. Zvýšená rastová rýchlosť sa tiež prejaví na priemerne väčších listoch v určenom čase, ktorý zodpovedá perióde, v ktorej pokračuje expanzia listu (tabuľka 2) a väčších kvetoch, v ktorých korunné plátky transgénových rastlín sú priemerne dlhšie ako korunné plátky kvetov netransformovaných kvetov.

Tiež sa zvýšilo množstvo kvetov v transgénových rastlinách ako aj počet oplodnených kvetov čo sa prejavilo v väčšom počte semenných toboliek a vo väčších semenách na rastlinu (údaje sú sumarizované v tabuľke 4A). Počet semien na tobolku bol väčší v transgénových rastlinách než v kontrolných rastlinách divého typu. Nenormálnosť semena v línii C8-T1-6 bola spôsobená

I ' ¹ l nadmerne vysokým percentom abcízie kvetu.

Konštitutívna expresivita AthCycD2 kódujúca DNA vedie ku zvýšeniu aj počtu semenných toboliek a celkového počtu semien na rastlinný základ.

Koreňový rozvoj v semenáčikoch divého typu a v transgénových semenáčikoch bol porovnaný v tabuľke 4B. Semená boli sterilizované a zasiate na platňu do GM média bez selekcie, jarovizované a potom uskladnené vo vertikálnej polohe v rastovej komore. Koreňová dĺžka bola meraná po deviatich dňoch a 13 dňoch po jarovizácii a prítomnosť laterálnych koreňov bola zaznamenaná. Použili sa semená z línie C8-T1-7 a C8-T2-2 (homozygótne).

Línia C8-TI-7 má dva inzerty, ktoré segregujú približne 15:1 na ^{1 1 1 1} * kanamycinových platniach. 35 semenáčikov rástlo z tejto línie, u trqch ¹ . · i zodpovedala rastová rýchlosť rýchlosti pozorovanej u semenáčikov divého typu. Údaje z týchto semenáčikov boli zaznamenané oddelene na 9 deň po jarovizácii. T-test bol aplikovaný na určenie významnosti stredného rozdielu a hladina významnosti je označená v tabuľke, ns označuje nepodstatné rozdiely medzi vzorkami. U semien zvýšenie vegetatívneho rastu v apikálnych častiach je vyrovnané rovnakým zvýšením v koreňovom rozvoji.

Tabuľka I x

o o

ľ?

J= ctí

CZ]

O cd wt

-S

Έ Q u O

Č/} 5*

CO ΙΖΊ f*] > ³ S (d

Λί

Sä ed

H cd

O

’ týždeň 7 (89 dni)

137.09 ± 31.90

-168.00 ±9.93

m ΊΓ· CN CN +1 CO r* iri XT

159 88 ±9.88

141.80 ±5.63

169.14 ± 11.99

- 156.80 ± 11.86

162.17 ± 18.67

164 50 ± 177.21

152.83 ± 18.28

161.8 ± 10.76

145.18 ± 19.44

O

tn

r-

PO

CO

in

PO

xt

03

CO

CO

00

CD

r*

CO

r-

o

CD

CO

03

CD

T“

CN

T-

CN

P0

tri

ó

*r—

tri

CN

oo

X~X

CN

T“·

CN

-H

CN

T

•H

•H

H

-H

-H

-H

44

o

-H

Ή

OO

-H

-H

u w

O

tn

PO

O

03

CN

CO

tn

m

O

S oo

CO

r*

03

CD

ΙΪ0

in

•v

00

h*

XT

00

00

·>

cd

XT

PO

O

03

CO

N.’

CN

xt

O

**

CN

CO

XT

CN

XT

r—

CO

in

Ν’

CN

Ift

r*-

CN

00

00

OO

xT

CN

O

CN

r*»

in

o

CO

o

CN

CN

tn

03

O

ó

iri

CD

cd

od

od

CN

03

v-

•Ν’

d

/—x ΝΊ »a

H

H

-H

H

H

1“

v-

X

•s -s •ä <o S. ĽL

-H

H

+1

O

CO

O

O

-H

in

Ή

-H

-H

CN

xT*

v—

UO

CO

ΙΓ3

T

r*.

r*.

CO

O

CO

r“

CD

h-’

co

cd

CO

XT

tn

2?

03

1**^

ó

O

oo

▼·

03

Ó

cd

cd

CD

03

T—

o

T“

v-

o

T“

o

o

00

V“

03

CO

XT

o

CO

CN

00

CN

o

CN

O)

CO

h-

O

CO

CO

r”

03

K

T—

tn

CO

00

oi

XT

V

tri

tri

P*

cd

03

r*-'

tri

cd

h-*

H .

+1

H

H

44

H

H

+1

H

-H

ľ?

03

+1

O)

h-

CO

O

r*-

oo

tn .

+1

OJ

33 ϊ@ <n

o

CD

.61

CD

CD

CD

T

W—

CO

CN

CD

o

cd

ó

CN

xT

CN

CN

tri

CN

oo

xŕ

CD

h*

CD

N-

in

r*-

(D

CO

fx-

h*

CD

tn

Ä xo

CD

,-

CO

00

CD

P*

CN

r*

O

CN

CO

v

CN

CD

r**

O

CO

T

T·

00

o

CD

o

(O

CD

xŕ

03

cd

CD

CO

CN

cd

od

tri

Ύ-

CD

m

-H

+1

+4

+1

H

-H

H

-H

-H

-H

H

« ~2

CO

T

00

o

CN

CN

N.

in

px.

-H

CN

o ·°

03

00

v—

CO

CO

CD

h·

v·

CO

00

>N O\

oo

03

cd

XT

cd

cd

XT

tri

tri

CN

-> <n ** x—z

CO

XT

v

v

P0

χτ

CO

•N

N1

CO

CO

v»

XT

03

CD

^r-

CN

oo

CN

tn

CO

χτ

CN

O)

CO

tn

m

xT

CO

o

OO

CO

<s »G O 4) A

cd

CN

τ'

x-

CN

XT

CN

cd

Ν’

cd

tri

cd

+1

-H

•H

Ή

+1

H

+1

-H

-H

•H

+1

-4-1

σι

v—

T“

tn

CN

CN

00

O

O)

o

•o ·§ »N w

h*· cd

CN od

7.4

CO CD

0.7

00 oo

cd

0.5

O V“

tn 03

l<

tn d

** vn

N

CN

in

CO

03

CD

tn

xt

xT

03

o

CD

ro

CN

m

r*-

o

XJ-

Ν’

oo

Γ0

CD

CD

__

CN

X“

CN

»—

T—

PO

1—

<1-

CN

CN

i-

>c o

Ή

+1

jj

H

+4

Ή

-H

•H

H

+1

4-1

+1

S ·§

CC 00.

.50

CO

CO

83

64

50

75

OO 00

00

20

G0 XT

S

tri

oo

cd

d

XT

CO

m

co

03

o

03

XT

X—/

CN

CO

o

CN

in

CO

hj.

00

CD

V”

x—

v

x—

r—

T“

e-

Línia

H CO

1— 1 CO

H 1 CO

H- _1 oo

8-T

8-T

H 1 00

H 1 CO

H ώ

t— 1 CO

t— 1 00

•5*

o

o

u

Θ

o

o

O

o

O

O

o

Ό

Tabuľka 2 cd •š c/3 tí

Im

X t

s g

«s w

g

Uf o

x e>

MÔ >o :rt >

C

týždeň 3

CM oo cm +1 O h- CM

29.643 ± 1.842

27.341 ±3.095

28.875 ±2.372

29.927 + 1.201

28.909 ± 1.974

27.583 ± 1.856 I_

26.333 ±2.113

27.583 ±2.635

28.333 ± 1.722

28.100 ±2.608

26.352 ± 1.960

M-

ΤΓ

b-

T“

r-

oo

o

tn

CM

in

o

o

ΙΩ

CO

v

o

o>

b-

t—

CM

o

b-

00

o

CO

b-

r^-

oo

00

o

00

co

M;

CM

CM

T“

CO

T-

M—

T-

T-

CM

CM

T-

t-

CM

CN

+1

+1

+l

+1

+l

+1

+l

-H

+1

+1

+1

+1

OJ

O)

o

T~

CO

co

o

o

b-

CO

o

T-

S

o

o

tn

co

CO’

o

o

co

CO

o

cn

2?

CD

LO

σι

tn

oo

o

CO

CD

T“

CO1

tí-

co

cri

co

ó

Ύ—

ó

CM

ô

oô

o

t—

V-

oô

CM

CM

CM

CM

CM

CM

V“

CM

CM

CM

CO

CM

o

UO

CM

00

O)

tn

CO

CO

CM

CO

sr

00

o

CO

o

T—

CM

co

cn

CO

N}-

oo

CM

’ST

CO

M”

r*-

CM

o

CO

v-

Tf

oo

CM

r*

-r-

CM

CM

CM

CM

T-

+1

+1

-H

+1

+l

+1

H

•H

Ή

+1

+1

+1

c

o

CO

m

CM

b-

CO

b-

b-

O

CO

o

CO

Ό

o

m

CO

CO

00

CO

T—

LO

CO

o

b-

»N

m

(O

CD

O

CD

CO

’sr

b-

oo

co

CO

U*

CO

CO

tri

tri

•'t

tri

M-

CM

O

tri

M

CM

'r-

H

*“

V™

í

O

cs

1

<\f 1

CO 1

CO

CO

ľ-

00

σ> .

r—

&

Ύ“—

«τ—

X—

v*

T—

ce *g Í2

Κ- Ι CO

l— 1 CO

1- 1 CO

1-8

8-T

8-T

8-T

( Γ CO ·

b- 1 CO -

1- 1 co-

H 1 eo

divý

o

O

o

O

o

O

o·.

O ;

O ;

o

o

Tabuľka 3A

Tabuľka 3 A Rozvoj kvetu (stredná výška kvetenstva 0,25 cm alebo 1 cm (v cm), stredný čas požadovaný na úplný rozvoj kvetenstva 0,25 cm alebo 1 cm ( v dňoch po jarovizácii)' «—I >

21.670

21.439

14.134

6.737

5.550

14.497

5.482

10.324

19.202

4.924

7.893

10.082

10.020

-H

H

-H

+1

+1

+1

+1

+1

+1

+1

+1

-H

+1

=- ε

5 u

tm «

•«2 m •5 £

U *5 P

i g 3

m

m

O

OT Ž

CD

W

tJ-

o

v

T—

CM

fs.

CO

co

fs-

iri

Ó

CD

C\j

O-’

co’

CD

03

f-.’

d

ΊΓ-

rs-’

o

T-

O

CM

T

co

T—

CM

CM

o

CM

x—

*“

T“

T“

T—

T—

ir·

CO

fs-

<3·

CM

CO

03

CO

m

03

CM

>+

't

CO

in

O1

CM

00

CO

T—

CM

TJ-

CO

in

CO

o>

co

fs-

M-

03

1—

C-.

CO

CO

CO

co’

oj

CM

cm

CM

CM

CM

CM

cd

CM

CM

E o

+1

+1

+1

+1

+1

+1

+1

+1

+1

+1

+1

+1

+1

a «

*Q >

ž* W S c T3 ϋ

u U £ w £ s

m

o

t CM

co

co

« m

C3

O

tn

r^-

o

03

03

r-.

o

CO

CO

CO

T“

CO

in

fs-

T—

m-

CO

O

Osí

CO

có

ru

r-j

03

r-

CO

cd

in

03

r-

í-

r-

c-

r-

c-

ľs.

fs.

fs.

fs.

h-

-

o

co

CO

CM

00

TT

co

Cs

CO

o

fs-

CM

oo

fs.

CO

CM

CO

OO

in

<r—

co

o

CO

CM

m

in

-M-

o-

00

o

CM

CM

m

O

o

in

CM

E u

Osi

CO

CM

CM

CO

CO

cd

CM

S-

d

CM

cd

V-l

+1

H

CS

+1

+1

+1

+1

+1

+1

+1

+1

+1

-H

+1

o

o

(fl ž rt M XJ C C 4) Ό >

m

CM

rs.

in

O

m

o

fs.

C3

(S.

o

o

ť c

CO

M;

fs.

CM

O

03

CO

Ί—

m

CO

o

CO

03

M C i

h*’

in

CO

ó

oo

ó

CM

CO

CM

CD

cd

03

CD

co

co

fs.

CO

fs.

o-

fs-

fs-

CO

r^-

co

fs.

o

CM

*3 o Έ

csi

CO

m

CO

r-

CO

03

T-

o

▼-

X—

T—

r—

ΊΓ“

o.

H

H

H

H-

H

8-T

1-

1-

H

H

H-

5

Jj

ώ

CO

ώ

CO

00

CO

1 CO

1 co

1 CO

1 CO

o 1—

É;

ϋ

O .

O

p

O ;

o·

O -

o<

o

O

O _1

yí _

Ό

Tabuľka 3B ed

O 3 S o >n ·£ e <2 e

Hladina významnosti

P < 0.001

P < 0.001

P < 0.001 |

P < 0.001

P < 0.001

P < 0.001

ns

P < 0.002

P < 0.01

ns

P < 0.05

P < 0.001

CO

CO

o

co

r-

o

co

CM

00

o

CO

05

CO

co

co

M·

co

05

r-

co

O

05

cn

co

05

CD

ST

CO

cn

'T

CO

CM

CO

O

cn

co

O

Ύ“

T“

»-

CM

CM

CM

Ί—

T*

+1

+1

+1

-M

+1

+l

+1

+1

+1

+1

H

+1

•H

Ή .5 g Krt *s >

·§ s*

IO

xr

-M-

O

tn

05

CO

(O

CO

o

IO

CO

CD

•m-

T“

O

CO

CM

T-

T“

to

O)

m

•M-

C-.

.03 ä

CO

t-

CO

CO

ó

ó

Ó

05

cô

τ-,

cd

•

CO

CO

CO

CO ,

CO

CO

CO

CO

CO

CM

CM

CO

CM

To O

Hladina význai

P <0.001

o ó v Q.

ns

P < 0.002

[ P < 0.001

P < 0.001

ns

P <0.01

P < 0.01

su

S0O > d

P < 0.002

1

CO

o

CM

o

CM

CO

N-

co

r*-

IO

CO

TJ-

CM

CM

05

o

m

o

CM

05

h-

r-

o

C\l

00

ľ·

CO

05

co

CM

05

CO

co

05

oo

o

5

c\i

·«-

T—

CM

V“

CM

1-

t-

t-

T—

Ó

cm’

t-

4)

+1

+1

+1

+1

+1

+1

+1

+1

+l

+1

+1

+1

-H

ce á TJ *cd

*§ fí S

CM

05

o

O

CO

Tt

o

CM

O

o

h-

co 05

CM

±3 P CO o

CM

CO

CO

N-

o

05

cp

M;

IO

q

CM

N-

TJ-

rU

Ô

CO

CM

tri

CM

CM

ΙΓ5

’T”

•M

M-

M-

v

ΙΓ5

TT

M-

•m·

tT

M-

st

M

TT

1-2

CO 1 Ύ“-

1-5

1-6

1-7

co 1 T“

1-9

o 1

1

CM V“

tä hodnota

&

‘S

Κ- Ι

I-

1-

1-

h-

I-

1-

H

1-

1-

1-

Ί?»

J

CO

CO

ώ

cô

ώ

CO

cô

ώ

cô

cô

có

ha W

‘•3

O

U

O

O

O

o

O

O

o

O

O

CZ)

Tabuľka 4A. Stredný počet semenných toboliek na rastlinu, stredná váha semenného obsahu šiestich toboliek (g), stredný počet semien na rastlinu (g) v tabaku, ktorý je trasformovaný s CaMV35SAthCycD2.

Línia	Stredný počet semenných toboliek	Stredná váha semenného obsahu v 6 tobolkách (g)	Stredný počet semien na rastlinu (g)
C8-T1-1	105,15 ± 14,96	1,085 ± 0,174	19,015
C8-T1-2	127,29 ± 7,82	0,824 ± 0,137	17,481
C8-T1-3	1 10,46 ± 16,30	1,106 + 0,179	20,361
C8-T1-5	97,86 ± 10,81	1,105 ± 0,178	18,023
C8-T1-6	78,60 ± 12,97	1,078 ± 0,150	14,123
C8-T1-7	118,17 ± 15,64	1,131 + 0,253	22,275
C8-T1-8 1	. ’ 123,75 + 4,78'	1,123 ±0,165	23,162
C8-T1-9	1 10,83 ± 20,91	1,090 ± 0,218	20,134
C8-T1-10	104,20 + 10,99	1,122 ± 0,311	19,485
C8-T1-11	138,20 ± 8,35	1,116 ± 0,222	25,705
C8-T1-12	106,20 ± 12,62	1,134 ± 0,056	20,072
divý typ	106,73 ± 16,47	0,938 + 0,1 18	16,685

Tabuľka 4B. Porovnanie koreňového rozvoja v semenáčikoch divého typu a v transgénových semenáčikoch

Línia	Počet rastlín	% Laterálne korene	Stredná koreňová dĺžka (mm)		Hladina významnosti
9 dní po jarovizácii
WT	23	36	15,326	± 1,893

C8-T1-7	25	100	26,520	± 1,971	0,001
	3	33	14,000	± 3,464	ns
C8-T2-2	28	100	26,91 1	± 2,064	0,001
1 3 dní po jarovizácii	, i J			1
WT	16	100	28,188	± 1,893
C.8-T1-7	13	100	53,846	± 1,971	0,001
C8-T2-2	15	100	51,267	± 3,464	0,001

3.2. Tabakové rastliny obsahujúce CaMV35S-AthCvcD3 chimérický gén.

Rastliny obsahujúce CaMV35S-AthCycD3 chimérický gén rástli z TI semien a boli spracované podľa opisu z kapitoly 3.1. Merania začali po 49 dňoch klíčenia s intervalmi asi sedem dní. Nasledujúci počet rastlinných línii « * | · bol analyzovaný pre každú líniu: 11 rastlín pre .líniu 1 K9, 19 rastlín pre líniu 3K9, 20 rastlín pre líniu 4K9 a 18 netransformovaných rastlín na kontrolu.

Analyzovali sa nasledujúce parametre: dĺžka a šírka korunného plátku (v cm) a čas (v dňoch), v ktorom aspoň 75% rastlín dosiahlo aspoň kvetenstvo. Tieto parametre sú sumarizované v tabuľke 5.

Tabuľka 5. Sumarizácia meraní tabakových rastlín obsahujúcich CaMV35SAthCycD3 chimérický gén.

Línia	Stredná dĺžka korunného plátku	stredná šírka korunného plátku	stredný čas potrebný na dosiahnutie kvetenstvo 1 cm (dni)
1K9	5,66 ±0,46	3,44 ± 0,27	100
3K9	5,18 ± 0,37	3,20 ± 0,3 5	100
4K9	5,48 + 0,38	2,90 ± 0,3 5	93

3,96 ± 0,12

2,39 ± 0,10

84

Tieto transgénové rastliny majú väčšie kvety, kde korunný plátok transgénových rastlín bol priemerne dlhší než korunný p.látok- kvetov netransformovaných rastlín* a tiež je potrebný dlhší čas na dosiahnutie štádia, v ktorom kvetenstvo je rozvinuté.

Príklad 4, Izolácia cvcD-homologických génov z iných rastlín.

CDNA knižnica vytvorená z exponenciálne rastúcich tabakových BY-2 buniek vytvorených v Lambda Zap Express vektore (Stratagén). Približne 7,5 x

10⁵ knižničných klonov bolo vytretých na platňu a replikačné bloty boli urobené z každej platne použitím Hybond N⁺ nylonových membrán (Amershan

Int.), ktoré boli fixované vypaľovaním pri 80 °C počas dvoch hodín. Membrány boli hybridizované s cycD2 alebo cycD3 heterológnymi vzorkami označenými , • · » , ako a-'²P cCTP náhodnou iniciáciou. cycD2 sonda obsahuje cycD3 fragment t. A. Ihaliana (405 bp HincII-KpnI fragment; majúci nukleotidovú sekvenciu EMBL Prístupové číslo N° X83371 od nukleotidovej polohy 557 až do nukleotidovej polohy 962). CycD2 sonda je zložená 1298 bp Ncol-SacI fragmentu cycD2 z A. (haliana (majúci nukleotidovú sekvenciu EMBL Prístupové číslo N° X83370 od nukleotidovej polohy 194 až do nuklotidovej polohy 1332). cycD3 hybridizácie boli uskutočnené pri 55 °C a membrány boli premývané 10 minút v 2xSSC/0,1 % SDS dvakrát za sebou a potom boli premývané raz 10 minút v 0,1 SSC/0,1% SDS pred autorádiografiou. cycD2 hybridizácie boli uskutočňované pri 48 °C Membrány boli premyté 10 minút v 2x SSC/0,1% SDS tri krát za sebou Všetky premytia boli uskutočňované pri izbovej teplote. Izolované knižničné klony boli excidované in vivo (podľa návodu na použitie) na vytvorenie subklonov v pBK-CMV fagemidu (Stratagén) a DNA sekvencia bola určená podľa štandardných metód. Sekvenčná informácia bola analyzované použitím GCG (Genetics Computer Group) Software (1994). Sekvencie cycD2;l, cycD3;l a cycD3;2, cDNAs z tabaku a predstavujú respektíve SEQ ID No. I, SEQ ID No 2, SEQ ID No. 3.

Ďalšia cDNA knižnica bola vytvorená z polyadenylovaných RNA izolátov z hľúz, koreňov a listov Helianlhus tuherosus. cDNA bola syntetizovaná z oligo (dT) priméru a. ligovaná do lambda ZAP1I vektora .do EcoRl miesta. ·

Približne 1,25 x 10⁶ klonov bolo vytretých na platňu, replikačné plak bloty boli urobené ako je opísané vyššie a hybridizované použitím označených sond získaných vyššie. Okrem toho bloty boli urobené skriningom s cycDl sondou obsahujúcou 401 bp Xbal-Aval fragment cycDl génu A. thaliana (majúci nukleotidovú sekvenciu EMBL Prístupové číslo N° X83369 od nukleotidovej polohy 312 až do nukleotidovej polohy 713). Izolované klony boli analyzované ako vyššie. Sekvencia cycDl;l a cycD3;l génov z Helianlhus tuherosus je predstavovaná v SEQ ID No. 4 a SEQ ID No. 5.

Ešte ďalšia knižnica bola urobená z polyadenylovanej RNA izolovanej z kalusového materiáju Zea mays (P991xH99)xH99. cDNA bola syntetizovaná z oligo (dT) priméru a ligovaná do, lambda ZAPII vektoru do EcoRl miesta. Približne 1,25 x 10^β klonov bolo vytretých na platňu, replikačný plak blot bol urobený ako je opísané vyššie a hybridizovaný použitím označených sond získaných vyššie. Izolované klony boli analyzované ako vyššie. Sekvencia cycD2 cDNA z Zea mays je reprezentovaná v SEQ ID No. 21.

Príklad 5. Konštrukcia antisense chimérických génov a transformácia tabaku

1298 bp Ncol-Sacl fragment obsahujúci DNA kódujúcu CYCD2 z A.thaliana (majúci nukleotidovú sekvenciu EMBL Prístupové číslo N° X83370 od nukleotidovej polohy 194 až do nukleotidovej polohy 1332) bol spracovaný Klenowou polymerizáciou na uskutočnenie zatupenia prečnievajúcich koncov a ligovaný do Smal linearizovaného pART7 (Gleave 1992). Plazmid bol vybraný tam kde inzertný DNA fragment bol v takej orientácii, že DNA kódujúca CYCD2 bola zavedená reverznou cestou medzi CaMV35S promótor CabbB-Jl izolátu (Harpster a kol., 1988) a 3'ocs oblasť (MacDonald a kol., 1991), tak že je tvorená expresia antisense RNA.

Chimérický antisense gén bol potom vložený medzi T-DNA a hranicu TDNA vektoru, ktorý obsahuje tiež vybraný chimérický marker génu Na tento koniec, chimérický gén bol vyštiepený z pCEC2 použitím Notl a ligovaný do Notl linerizovanej pART27 (Gleave a kol., 1992) na tvorbu pCEC.6. Tabakové rastliny boli transformované chimérickými génmi ako je opísané v príkJade 2.

Príklad 6, Analýza transformantov.

Rastliny transformované chimérickými génmi z príkladu 5 boli spracované tak ako je to opísané v príklade 3.1 . Analyzovalo sa sedem rastlín z línie C.9-2 a šesť rastlín z línie C.9-7.

Analyzovali sa nasledujúce parametre: výška rastlín od povrchu pôdy po najvyšší bod (sumarizované v tabuľke 6 ako stredná výška ± štandardná odchýlka v cm); dĺžka najväčšieho listu v určenom čase (sumarizované f

v tabuľke 7 ako stredná dĺžka ± štandardná odchýlka v cm); čas (sumarizovaný v tabuľke 8· ako stredný čas ± .Štandardná odchýlka' v dňoch), v ktorom meristém kvetenstva je pozorovateľný voľným okom; výška, pri ktorej * meristém kvetenstva je viditeľný (sumarizované v tabuľke 8 ako stredná dĺžka ± štandardná odchýlka v cm).

Transgénové rastliny sa vyznačujú zníženou rastovou rýchlosťou zo štádia semenáčikov. Výsledkom je preto menšia priemerná výška stonky (tabuľka 6). Znížená rastová rýchlosť tiež spôsobuje priemerne menšie listy v určených časoch, ktoré zodpovedajú perióde, v ktorej zväčšenie listu ešte ďalej pokračuje (tabuľka 7)

Tabuľka 6. Stredná výška (v cm) transformovaných tabakových rastlín, ktoré obsahujú CaMV35S-antisense cycD2.

Línia	C9-2	C9-7	netransformovaná kontrola
Týždeň 1	2,64 ± 1,22	2,75 ± 0,89	4,48 ± 1,63
Týždeň 2	6,64 ± 1,68	6,07 ± 1,43	10,50 ± 3,33
Týždeň 3	20,00 ± 3,74	17,21 ± 6,47	3 1,82 ± 7,89

Týždeň 4	34,07 ± 6,13	28,50 ± 5,83	54,00 ± 7,89
Týždeň 5	54,00 ± 8,87	45,14 ± 8,46	86,56 ± 10,91
Týždeň 6	74,29 + 9,97	61,29 ± 5,1 1	121,80 ± 18,28
Týždeň 7	85,92 ± 12,03,	71,'50 ±23,19	145,18 ± 19,44

Tabuľka 7. Rozdiel v strednej dĺžke najväčšieho listu transformovaných tabakových rastlín obsahujúcich CaMV35S antisense cycD2 a strednej dĺžky najväčšieho listu netransformovaných tabakových rastlín (v cm).

Línia	C9-2	C9-7	netransformovaná kontrola
Týždeň 1	-2,31	-4,30	0
Týždeň 2	-3,26	-6,44	0
Týždeň 3	-4,35	-8,91	0 1

Tabuľka 8A. Stredná veľkosť kvetu (mm), stredná výška kvetenstva (cm), stredný čas požadovaný na dosiahnutie rozvoja kvetenstva (dni) v tabaku, ktorý je transformovaný CaMV35S antisense cycD2.

Línia	Stredný čas na kvetenstvo (dni)	Stredná výška kvetenstva (cm)	Stredná dĺžka kvetu (mm)
C9-2	102’	95	NA
C9-7	89 7,95	68,57 9,62	38,3 1
netrasformovaná kontrola	79 2,39	1 1 1 10,02	41,22

Len jedna rastlina má rozvinuté kvetenstvo počas monitorovanej periódy.

Tabuľka 8B. Vplyv expresie antisense CycD2 na dĺžku kvetu transgénového tabaku bol analyzovaný v iných líniách (TI generácia) a štatisticky porovnaný s divým tipom použitím t-testu. Zmerala s dĺžka piatich kvetov z každej rastliny a vypočítala sa stredná dĺžka kvetu každej transgénovej línie. Hodnoty pre všetky nezávislé transgénové línie boli porovnané s divým typom použitím t-testu. Tabuľka ukazuje hladinu pravdepodobnosti, v ktorej výsledky sú štatisticky významné v porovnaní s divým typom.

Línia	Stredná dĺžka kvetov (mm)	Hladina významnosti
C9-T1-I	41,05 ± 1,558'	ns
C9-T1-3	40,68 ± 1,574	ns
C9-T1-7	38,68 + 1,991	ns
C9-T1-10	39,78 ± 1,024	P < 0,05
C9-T1-12	39,55 ± 1,568	P < 0,05
Stredná hodnota	40,00 ± 1,301	P < 0,05
divý typ	41,22 ± 1,005	-

Príklad 7. Transformácia repky olejnej T-DNAs z príkladu 1 a, podobné vektory a analýza transformovaných rastlín.

Hypokotylové rastliny Braxxica n apu x sú získané, kultivované a transformované tak, ako je to opísané De Blockom a kol., (1989), ak sa vezmú do úvahy nasledujúce modifikácie:

-hypokotylové rastlinu sú prekultivované v prvý deň na A2 médiu [MS, 0,5 g/1 Mes (pH 5,7), 1,2% glukózy, 0,5% agarózy, 1 mg/l 2,4-D, 0,25 mg/1 naftalénu kyseliny octovej (NAA) a 1 mg/1 6-benyzlaminopurín (BAP)].

-infekčné médium A3 je MS, 0,5 g/1 Mes (pH 5,7), 1,2% glukózy, 0,1 mg/1 NAA, 0,75 mg/1 BAP a 0,01 mg/1 giberelinikovej kyseliny (GA3).

-výberové médium A5G je MS, 0,5 g/1 Mes (pH5,7), 1,2% glukózy, 40 mg/1 adenínu.SO4, 0,5 g/1 polyvinylpyrolidónu (PVP), 0,5% agarózy, 0,1 mg/1 NAA, 0,75 mg/BAP, 0,01 mg/1 GA3, 250 mg/1 karbenicilinu, 250 mg/1 triacilínu, 5 mg/1 AgNO? na tri týždne Po tejto časovej perióde selekcia pokračovala na A5J médiu (podobné A5G ale s 3% sacharózou).

- regeneračné médium A6 je MS, 0,5 g/1 Mes (pH 5,7), 2% sacharózy, 40 mg/1 adeninu.SO4, 0,5 g/1 PVP, 0,5% agarózy, 0,0025 mg/l BAP a 250 mg/1 tiacilínu.

-zdravé výhonky sú prenesené do koreňového média, ktoré malo A9: polovica koncentrovaného MS, 1,5% sacharózy (pH 5,8), 100 mg/1 triacijínu, 0;6% agaru v jedno litrových nádobách.

MS je skratka pre Murashige a Skoog médium (Murashige and Skoog, 1962).

Hypokotylové explantáty sú infikované kmeňom Agrobaclerium tumefaciens CSSClRf^ nesúcim pomocný Ti-plazmid ako je pGV4000, ktorý je odvodený od pMP90 (Koncz a Schell, 1986) a získaný vložením bakteriálneho chlóramfenikolové rezistentného génu viazaného na 2,5 kb fragment majúci homológiu s T-DNA vektorom pGSV5 do pMP90 a T-DNA vektor odvodený z pGSV5 obsahujúci chimérické gény z príkladu 1 medzi T-DNA hranicami a chimérickým markérovým génom (pCEC5b a pCRK9b).

Transgénové rastliny repky .olejnej obsahujúcej chimérické gény podľa « . ’ · I vynálezu vykazujú zrýchlenie vegetatívneho programu (zvýšenie rastovej rýchlosti), redukciu času potrebného na dosiahnutie štádia kvitnutia, zvýšenie počtu kvetom a zvýšenie počtu semien na rastlinu.

Príklad 8, Transformácia rastlín kukurice vektormi z príkladu 1 a podobnými vektormi a analýza transformovaných rastlín.

Rastliny kukurice sú transformované vektormi z príkladu 1 podľa WO 92/09696. Transgénové rastliny kukurice obsahujúce chimérické gény z vynálezu vykazujú zrýchlenie vegetatívneho programu (zvýšenie rastovej rýchlosti), redukciu času potrebného na dosiahnutie štádia kvitnutia, zvýšenie počtu kvetov a zvýšenie počtu semien na rastlinu.

Príklad 9. Transformácia rastlín rajčín vektormi z príkladu 1 a podobnými vektormi a analýza transformovaných rastlín.

Rastliny rajčín sú transformované vektormi z príkladu 1 podľa De Blocka a kol. (1987). Transgénové rastliny rajčín obsahujúce chimérické gény z vynálezu vykazujú zrýchlenie vegetatívneho programu (zvýšenie rastovej rýchlosti), redukciu času požadovanú na dosiahnutie štádia kvitnutia, zvýšenie počtu kvetov a zvýšenie počtu ovocia na rastlinu.

Príklad 10, Transformácia rastlín šalátu vektormi z príkladu 1 a podobnými vektormi a analýza transformovaných rastlín.

Rastliny šalátu sú transformované vektormi z Príkladu 1 podľa Micheimore a kol. (1987). Transgénové rastliny šalátu obsahujúce chimérické gény z vynálezu vykazujú zrýchlenie vegetatívneho programu (zvýšenie rastovej rýchlosti), redukciu času potrebného na dosiahnutie štádia kvitnutia, zvýšenie počtu kvetov a zvýšenie počtu semien na rastlinu.

Príklad 11. Ďalšia fenotypová analýza progénu transgénových tabakový línii ¹ I transformovaných CaMV35SAthCvcD2 konštruktov podľa príkladu 3 v izolovaných a neizolovaných populáciách,

U progénových populáciách (obidve segregujúce alebo nesegregujúce) rastlín z transgénových tabakových línii transformovaných CaMV35SAthCycD2 konštruktami (línia 2 a línia 5 z príkladu 3) sa analyzovala dĺžka času potrebného na kvitnutie a zvýšenie vegetatívneho rastu meraním strednej výšky stonky alebo strednej váhy sušiny rastlín.

Segregácia transgénov bola monitorovaná zavedením ich rezistencie na kanamycín. Analyzovalo sa 32 rastlín zo segregujúcich populácií aj keď z nesegregujúcich populácii sa analyzovalo 12 rastlín Netransformovaná populácia pozostáva tiež z 12 rastlín.

Použili sa nasledujúce populácie:

Segregujúce populácie:

Línia 2

C8-T1-2 (TI semeno z C8-2 primárneho transformantu; segreguje sa 3:1 pre T-DNA)

C8-T2-2 (T2 semeno z C8-T1-2 rastliny #3 jednofarebnej, ktorá bola homozygótna a teda semeno sa segreguje 3:1 pre T-DNA)

C8-T2-2 (T2 semeno z hybridov C8-T1-2 rastliny #3 ku rastline divého typu používajúcej divý typ ako zdroj peľu. Toto semeno sa segreguje 1:1 pre T-DNA a rastliny, ktoré obsahujú všetky T-DNA sú homozygotné) Línia 5

C8-T1-5 (TI semeno z C8-5 primárneho transformantu sa segreguje 3:1 pre T-DNA)

C8-T2-5 (T2 semeno z C8-T1-5 rastliny #304 jednofarebnej, ktorá bola homozygótna a teda semeno sa segreguje 3:1 pre T-DNA)

Nesegreguiúce populácie

Línia 2

C8-T2-2 (T2 semeno z C8-T1-2 rastliny #302 jednofarebnej, ktorá bola homozygótna pre T-DNA) ‘ ' · · · ' 1 . ¹

Línia 5

C8-T2-5 (T2 semeno z C8-T1-5 rastliny #121 krížených s rastlinou divého typu používajúcej divý typ ako zdroj peľu. Rastlina #121 bola homozygótna pre T-DNA a každé T2 semeno je hemizygótne pre T-DNA). C8-T2-5 (T2 semeno z C8-T1-5 rastliny #121 jednofarebnej. Rastlina #121 bola homozygótna pre T-DNA a každé T2 semeno je homozygótne pre T-DNA).

Vplyv CycD2 nadexpresie na dĺžku času na začatie rozvoja kvetenstva v transgénovom tabaku bol meraný a štatisticky porovnaný s hodnotami tých istých parametrov meraných u kontrolnej populácie divého typu s použitím bez parametrického t-testu, v ktorom rozdielnosti divého typu a transgénovej populácie sa nepredpokladali rovnaké. Zaznamenal sa čas potrebný pre každú rastlinu na rozvoj kvetenstva 0,5 cm a vypočítal sa stredný počet dni po jarovirázicii. Hodnoty pre každú transgénovú populáciu sa porovnali s hodnotou pre divú populáciu pomocou t-testu. Údaje pre segregujúce línie boli oddelené od údajov pre populáciu rezistentnú na kanamycín a populáciu citlivú na kanamycín. Údaje pre rezistentnú populáciu na kanamycín sa tiež označili rozdelili na údaje pre homozygótnu subpopuláciu (ďalej nesegregujúca) rezistentnú na kanamycín a hemizygótnu subpopuláciu (segregujúca 31) rezistentnú na kanamycín. Tieto údaje, sú uvedené v tabuľke 9. V tabuľke 10 sú uvedené stredné hodnoty výšky stonky v transgénových nesegregujúcich líniách v rozdielnych časových bodoch po jarovizácii v porovnaní s populáciou divého typu (štatisticky analyzované). Hladina významnosti menej než 0,05 je vzatá do úvahy vysoko podstatný rozdiel medzi strednou výškou každej transgénovej línie a strednou výškou kontrolných, ns poukazuje nato, že tam nie je významný rozdiel medzi populáciami. V dodatku biomasa semenáčikov zo spomínaných nesegregujúcich populácii bola porovnaná so semenáčikmi divého typu v priebehu včasného vegetatívneho rastu. Semenáčiky boli zbierané po dňoch po jarovizácii a vážené pred vysušením pri 70 °C počas dvoch dňoch. Stredná váha sušiny semenáčikov a štandardná odchýlka bola vypočítaná a výsledky sú uvedené v tabuľke 11.

Tabuľka 9. Vplyv CycD2 expresie na dĺžku času potrebného na začatie rozvoja kvetenstva v transgénovom tabaku.

Populácia	Stredný čas na kvetenstvo 0,5 cm (dni)	v Štandardná odchýlka	Hladina významnosti
Nesegregujúce línie
WT	72,125	2,258	-
C8-T2-2 (302 jednofarebných).	63,62	3,863	0,001
C8-T1-5 (121 jednofarebných)	67,78	2,438	0,02
C8-T1-5 (121 x WT)	64,18	1,991	0,001
Stredná hodnota	65,19	2,258	0,001
Segregujúce línie
C8-T1 -2 jednofareb.	59,04	2,973	0,001

všetky Kan R
hemizygótne	59,32	3,1 10	0,001
homozygótne	58,50	2,507	0,001
Citlivé na kanamycín	73,00	5,944	n s
C8-T2-2 pl 3 x WT
všetky rezistentné na kanamycín	59,44	2,756	0,001
citlivé na kanamycín	69,10	2,846	ns
CS-T2-2 pl jednofareb. všetky Kan R	59,20	2.141	0,001
hemizygótne	59,25	1,653	0,001
homozygótne	59,38	3,021	0,001
citlivé na kanamycín	73,50	5,43 1	ns
C8-T1-5 všetky Kan R	62,67	3,367	0,001
citlivé na kanamycín	71,50	5,782	ns
C8-T2-5 pl 304 jednofareb.
hemizygótne	64,50	3,030	0,001
homozygótne	65,83	2,483	0,002
citlivé na kanamycín	74,50	7,764	ns

Tabuľka 10 <U

U *3* .G

Rt

VI

X>

O

Rt •O

Rt

O

Ä *4J >

O e

*0) oo

VI

G

Rt

U.

ľ o

+j v>

ε o

cx ž' ε

t ’o ε

o c

o

J«í vi >0G

O υ

>»

JZ

Rl ~5 x>

Λ

H <

CO

Ό m

>

S

Ri

U

CS

+1

4-1

4-1

44

G

τ-

CD

CO

in

CO

n

r“

CM

CM

CO

T—

co

v

co

G rt

CD_

CM

CO

q

C ΚΛ a r

co

r·*-

co'

CA

CD

O

r-

ΤΓ

CA

C

ó

*r·

C

ž

41

41

41

41

rr

m

Ό

m

o

«—>

m

O\

o

rs

Os

in o

r*

m

r*

00

r* r*

rn

m

un

SO

o

o o

o

ω

wn

vo

r*

·—

vo

vri

**

t·’

~~

o

—-

o

C

41

41

41

41

• r* G

wn

vO

m

rs

r*

CS

Ό

t**

*n

τσ

vn

oo

Os

ΜΊ

rs

in o

O

vd

o

CS

o

rs

rs

o o

MŠ

m

m

wn

vn

«Μ

rn

r^·

o

—·

o

o

..

-H

41

-H

41

*2

Ό

CS

Os

O

*n

m

Ό

O

Ό

rs

00

00

oo

m \O

r< o

O rn

ô CS

00 rs

o

Os

vo o

q

r-^

o 00

q

·“

oó

*—

*·

ó

·“

ô

*

CÄ

ó

a

-H

41

41

41

tt

rn

o

00

m

rs

*“

00

Vl »zs

cm

CM

«n

CM

00

o

o

o

m

O

00

^r

r<

CM

o

vo

q

<n

rs

o

Ό

od

o

**

ó

r*

r*‘

ó

r*

\d

ó

*a

t 41

41

41

41

*§

o

in

T-

00

σ\

oo

rn

00

00

OO

00

o

Os

Os

o

vri

o

rs

*—

o

rs

o

Os

00

p

CS

fO

oš

ó

m

oš

ó

m

^ŕ

ó

41

41

41

41

c

O\

Ό

m

00

in

vn

00

T“

00

T“

<n s·

vn

m

rs

rn

rs

O

v_a

O

00

O\

<n vd

o

cš

sn

o

vn

rn

o

“

rn

ó

—

o

ó

rs

rn

ó

*2

41

41

41

41

Ό

rs

m

m

vo

o

V“

Os

m

«—M

rs

CN

o

r*

un

O

xr

sn

O\

_

oo

o

oo

o

m

o

t-

—

·—

rn

ó

—

rn

o

<M

ó

c

•o

m

41

41

rs

T-

+1

T·

41

t-

O

m

CS

vo

O

rs

vo

o

o

«n

oo

o

vo

o

o

vo

o

Os

o

m

o

Ό

—

ó

—'

ó

00

—‘

o

Έ

s·

41

00

4i

CM

41

r-.

T“

41

00

t-

<*Ί

00

m

on

v-s

σ

un

o

σ

F^.

r>.

Tľ

CN

wn

Ό·

c

rs

vo

o

m

m

Q

—*

O

m

o

ô

ô

ó

o

O

Ä

o

x>

«Ξ

t.

_

. ¢9

CM

O c

o

l·-

«-J

o

o

O

m

•3

o

in

£

o

Popuíä

g i Ό

C8-T2

—i CM O CO

hladina

2 2 5 •ŕ

C8-T2-

o —» T“ CS

CS 3 es

s δ 5 r

C8-T2-

x c<

hladina

a a 5 t'1

Tabuľka ! 1 o

N co ' ^'N o -a 52 c >U C

5 oo f**.	530 ± 60.0	547 ± 24,9	946 ±154	382 ± 90,3
34 dní	337 ± 58.3	351 ±67.6	476 ± 120.2	135 ±60.72
28 dni	53.19 ±9.97	49.14 ±8.51	79.81 ± 20.36	29.88 ± 14.89
23 dni	22.11 ±6.59	Γ29.05 ± 10.50	39.51 ± 10.13	13.16 ±3.09
1 17 dni	3.75 ± 1.462	4.30 ± 1.623	5.48 ± 1.130	1.2±0.510
.5 u *»w r-» O	C8-T2-2 i (302 jednofarcb	C8-T2-5 (121 jednofarcb	C8-T2-5 (121x WT)	divý typ

Zoznam použitej literatúry

An et al. ,1985 EMBO J. 4: 277-284

An et al.. 1988 Binary vectors In; Gelvin SB, Schilperoort RA, Verma DPS (eds) Plánt Molecular Biology Manual pp A3/1-A3/19. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht).

An et al., 1996, The Plánt Celí 8: 15-30

Ando et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8571-9575

Atherton-Fessier et al., 1993 Semin. CelIBiol. 4: 433-442

Ausubel et al. 1994 Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA.

Baldin et al. 1993 Genes Dev. 7: 812-821

Ballas et al. 1989 Nucl. Acids Res. 17: 7891-7903

Bernards et al. 1989 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6474-6478

Boehmelt et al. 1994 Celí Growth Differ. 5:221-230

Chiatante et al. 1993 Plánt Sci. 89:13-21

Colasanti eí al. 1991 Prac. Natl. Acad. Sci. USA 88:3377-3381

Colasanti et al. 1993 Plánt Celí 5:1101-1111

Cornelissen and Vandewiele 1989 Nucl. Acids Res. 17: 833

Cross 1988, Mol. Celí. Biol. 8: 4675-4684

Cray 1993 Plánt Molecular Biology Labfax BIOS Scientific Pubiications Ltd (UK) and Blackwell Scientific Pubiications, UK.

Dahl etal. 1995 Plánt Celí 7: 1847-1857

Day and Reddy 1994 Biochim. Biophys.Acta Gene Struct. Express. 1218: 115-118

De Almeida et al. 1989 Mol. Gen. Genet. 218:78-86

De Block et al. 1987 Embo J. 6: 2513-2518

De Block et al. 1989 Plánt Physiol. 91: 694

De Greve et al. 1982 J. Mol. Appl. Genet. 1: 499

Depicker et al. 1982 J. Mol. Appl. Genet. 1: 561

Destree et al. 1992 Dev Biol. 153:141-149

Dirick and Nasmyth 1991 Náture 351: 754-757

Ditta et al. 1980 Prac. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7347-7351

Doerner et al. 1996 Náture 380: 520-523

Doonan et al. 1998 in Plánt Celí Division“ (Francis, Duditz and Inzé, Eds.) Portland Press. London.

Dowdy et al. 1993 Celí 73: 499-511

Du eí al. 1996 Genes and Development 10:1206-1218

Durfee et al. 1993 Genes and Development 7:555-569

Evans and van't Hof, 1974 Exp. Celí Res. 87: 259-264

Evans et al._t 1983 Celí 33: 389-396

Ewen etal. 1991 Celí 66: 1155-1164Ewen et st. 1993 Celí T3-. 487-497

Fang and Newport 1991 Celí 66: 731-742

Feiler and Jacobs 1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 5397-5401

Feilloter et al. 1994 Nucl. Acids Res. 22: 1502-1503

Ferreira et al. 1991 Plánt Celí 3: 531-540

Fields and Song 1989 Náture 340: 245-246

Fobert et ak 1994 EMBO J. 13: 616-624

Fromm et al. 1990 Bio/Technology 8: 833

Fuerst et al. 1996 Plánt Physiol.112:1023-1033

Gallie et al. 1987 Nucl. Acids Res. 15: 3257-3273

Gleave 1992 Plánt Mol. Biol. 20:1203-1207

Gordon-Kamm et al. 1990 The Plánt Celí 2: 603

Gould el al. 1981 Protoplasma 106:1-13

Grafi and Larkins 1995 Science 269: 1262-1264

Grafi et al. 1996 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8962-8967

Guerineau et al. 1991 Mol. Gen. Genet. 226:141-144

Hannon et al. 1993 Genes Dev. 7: 2378-2391

Hata et al. 1991 EMBO J10: 2681-2688

Harper et al. 1993 Celí 75: 805-816

Harpster et al. 1988 Mol. Gen. Genet.. 212: 182-190

Hartwell 1974 Bacteriol. Rev. 38:164-198

Hemerly et al. 1992 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3295-3299

Hemerly et al. 1995 EMBO J. 14: 3295-3299

Hirayama et al. 1991 Gene105:159-165

Hirt et al., 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1636-1640

Hirt et al., 1992 Plánt Celí 4:1531-1538

Hirt et al. 1993 Plánt J. 4: 61-69

Howard and Pele, 1953 HeredityG (suppl.): 216-273

Hudspeth et al. 1989 Plánt Mol Biol 12: 579-589

John et al. 1989 Plánt Celil: 1185-1193

John et al. 1990 J. Celí Sci. 97: 627-630

John et al. 1991 Protoplasma 161: 70-74

Johnson et al., 1993 Náture 365: 349-352

Jones et al. 1992 Transgen. Research 1: 285-297

Joshi eí al. 1987 Nucl. Acids Res. 15:9627-9639

Joshi 1987 Nucl. Acids Res. 15: 6643-6653

Keil et al., 1989 EMBO J. 8: 1323-1330

Keller et al. 1988 EMBO J. 7: 3625-3633

Keller et al. 1989 Genes Devel. 3: 1639-1646

Klapwhk et al. 1980 J. Bacteriol. 141: 128-136

Kofŕef a/.. 199-1 Celí 85: 12Í7-1Z28

Koff et al. 1992 Science 257: 1689-1694

Koff et al. 1993 Science 260: 536-539

Koncz and Schell 1986 Mol. Gen. Genet. 204: 383

Lahue et al. 1991 Genes Dev. 5: 2166-2175

Léopold and O'FarrelI 1991 Celí 66: 1207-1216

Lee et al. 1987 Náture 329: 642-645

Lew et al. 1991 Celí 66: 1197-1206 · ' ’ '

Long et al. 1996 Náture 379: 66-69

Luehrsen and Walbot 1991 Mol. Gen. Genet. 225: 81-93

MacDonald et al. ϊ99ϊΝυοΙ. Acids. Res. 19: 5575-5581

Matsushime etal. 1991 Celí 65: 701-713

Matsushime et al. 1992 Celí 71: 323-334

Meyeref a/. 1987 Náture 330: 677

Meyerson and Harlow 1994 Mol. Celí. Biol. 14: 2077-2086

Meyerson et al. 1991 Cold Spríng Harbor Symp. Quant. Biol. 56:177-186

Meyerson et al. 1992 EMBO J. 11: 2909-2917

Miao et al. 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 943-947

Micheimore et al. 1987 Plánt Celí Rep. 6: 439-442

Mineyuki etal. 1991 Protoplasma 162: 182-186

Mogen et al., 1990 Plánt Celí, 2: 1261-1272

Munroe et al. 1990 Gene, 91: 151-158

Murashige and Skoog 1962 Physiol. Plánt. 15:473

Murray et al. 1989 Náture 339: 280-286

Nasmyth 1993 Curr. Opin. Celí. Biol. 5: 166-179

Nevins 1992 Science 258: 424-429

Nurse 1990 Náture 344: 503-508

Ohtsubo and Roberts 1993 Science 259: 1908-1912

O'Reilly et al., 1992. Baculovirus expression vectors - A Laboratory manual. Freeman and Co. New York

Pardee 1989 Science 246: 603-608

Peleman et al. 1989 Gene 84: 359-369

Phelps et al. 1992 J. Virol. 66: 2418-2427

Pines, 1993 Trends Biochem. Sci. 18: 195-197

Pines 1995 Biochem J. 308: 697-711

Pines 1995 Adv. CancerRes. 66: 181-212

Proudfoot 1991 Celí, 64:671-674

Quelle et al. 1993 Genes Dev. 7: 1559-1571

Rechsteiner 1990 Seminars Celí Biol. 1: 433-440

Reed 1991 Trends Genet. T. 95-99

Renaudin et al. 1994' Prôc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 7375-7379

Renaudin et al. 1996 Plánt Molecular Biology 32: 1003-1018

Richardson et al., 1989 Celí 59:1127-113

Rogers et al. 1986 Science 234: 364-368 §afacon et al. 1991 GenesDev 5: 141-149

Salama etal. 1994 Mol. Celí. Biol. 14: 7953-7966

Sambrook et al. 1989 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY Sewing etal. 1993 J. Celí. Sci. 104: 545-555

Snedecor and Cochran 1967 Statistical Methods The lowa State University Press, Ames, lowa, U.S.A.

Solomon 1993 Curr. Opin. Celí Biol. 5: 180-186

Soni et al. 1995 The Plánt Celí 7: 85-103

Tsaietal. 1993a Development 119:1029-1040

Tsai et al. 1993b Oncogene 8: 1593-1602

Tyers et al. 1992 EMBO J. 11:1773-1784

Tyers et al., 1993 EMBO J. 12: 1955-1968 van den Heuvel and Harlow 1993 Science 262: 2050-2054 » van't Hof and Kova'cs 1972 In The Dynamics of Meristem Celí Po'pulatiorts, M.W. Miller and CC Keuhnert, eds (NY: Plénum) pp 15-32 van’t Hof, 1985 In The Celí Division Cycle in Plants, J.A. Bryant and D. Francis. eds (Cambridge: Cambridge University Press) pp 1-13 Velten and Schell 1985 Nucl. Acids Res. 13: 6998

Walkerpeach and Velten 1995 In: Gelvin SB, Schilperoort RA, Verma DPS (eds) Plánt Molecular Biology Manual pp B1/1-B1/19. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht Wilburand Lipmann 1983 Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 80: 726

Wimmel et al. 1994 Oncogene 9: 995-997

Wittenberg and Reed 1988 Celí 54: 1061-1072

Wittenberg etal. 1990 Celí 62: 225-237

Xie et al. 1996 EMBO J. 15: 4900-4908

Xiong et at., 1992 Ce//71: 505-514

Xiong et al., 1991 Celí 65: 691-699

Sekvenčný prehľad (1) Všeobecné informácie:

(i) Prihlasovateľ:

(A) MENO: Cambridge University Technical Services Ltd._ (B) ULICA: The Old S'choolš Trinity Lane (C) MESTO: Cambridge (E) KRAJINA: United Kingdom (F) POŠTOVÝ KÓD (ZIP): CB2 1TS (G) TELEFÓN: 44-1223334755 (H) TELEFAX: 44-1223332797 (ii) NÁZOV VYNÁLEZU: Rastliny s modifikovaným rastom (iii) POČET SEKVENCII: 21 (iv) POČÍTAČOM ČITATEĽNÁ FORMA:

(A) .MÉDIUM TYP: Floppy disk . · (B) POČÍTAČ: IBM PC kompaktibilný (C) OPERAČNÝ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patenln Release #1,0, Verzia #1,30 (EPO) (2) INFORMÁCIA PRE SEQ ID NO: 1:

(i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: 1284 základných párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: dvojvláknová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) MOLEKULOVÝ TYP: cDNA až mRNA (iii) HYPOTETICKÝ: nie (iv) ANTI-SENSE: nie (A) ORGANIZMUS: Nicotiana tabacum (ix) ZNAKY:

(A) MENO: (B) LOKALIZÁCIA: 182..1243 (D) INÉ INFORMÁCIE:/POZN.= „cDNA kódujúca cyklín CYCD2;1“ (xi) SEKVENČNÝ OPIS. SEQ ID NO: 1:

CAAATTTTTC	TCCCTTCTAT	AGTCTCTTTC	CTGTTCTCTT	AAAAATCCTT	aaaaatttat
TTTTTTTAAC	AATCTCATGT	AAATGGGATT	AAATTTTGTA	AAAATATAAG	ATTTTGATAA
AGGGGGTTTA	ATTATAACAT	AGTAAATTAA	GATTTTTTTT	TTGCTTTGCT	AGTTTGCTTT
AATGGCAGCT	GATAACATTT	ATGATTTTGT	AGCCTCAAAT	CTTTTATGTA	CAGAAACAAA
AAGTCTTTGT	TTTGATGATG	TTGATTCTTT	GACTÄTAAGT	CAACAGAACA	TTGAAACTAA
GAGTAAAGAC	TTGAGCTTTA	ACAATGGTAT	TAGATCAGAG	CCATTGATTG	ATTTGCCAAG
TTTAAGTGAA	GAATGCTTGA	GTTTTATGGT	GCAAAGGGAA	ATGGAGTTTT	TGCCTAAAGA
TGATTATGTC	GAGAGATTGA	GAAGTGGAGA	TTTGGATTTG	AGTGTGAGAA	AAGAGGCTCT
TGATTGGATT	TTGAAGGCTC	ATATGCACTA	TGGATTTGGA	GAGCTGAGTT	TTTGTTTGTC
GATAAATTAC	TTGGATCGAT	TTCTATCTCT	GTATGAATTG	CCAAGAAGTA	AAACTTGGAC
AGTGCAATTG	TTAGCTGTGG	CCTGTCTATC	ACTTGCAGCČ	AAAATGGAAG	AAATTAATGT
TCCTTTGACT	GTTGATTTAC	AGGTAGGGGA	TCCCAAATTT	GTATTTGAAG	GCAAAACTAT
ACAAAGAATG	GAACTTTTGG	TATTAAGCAC	ATTGAAGTGG	AGAATGCAAG	CTTATACACC
TTACACATTC	ATAGATTATT	TTATGAGAAA	GATGAATGGT	GATCAAATCC	CATCTCGGCC
GTTGATTTCT	GGATCAATGC	AACTGATATT	AAGCATAATA	AGAAGTATTG	ATTTCTTGGA
ATTCAGGTCT	TCTGAAATTG	CAGCATCAGT	GGCAATGTCT	GTTTCAGGGG	AAATACAAGC
AAAAGACATT	GATAAGGCAA	TGCCTTGCTT	CTTCATACAC	TTAGACAAGG	GTAGAGTGCA
GAAGTGTGTT	GAACTGATTC	AAGATTTGAC	AACTGCTACT	ATTACTACTG	CTGCTGCTGC
CTCATTAGTA	CCTCAAAGTC	CTATTGGAGT	GTTGGAAGCA	GCAGCATGCT	TGAGCTACAA
AAGTGGTGAT	GAoAGAACAG	TTGGATCATG	TACAACTTCT	TCACATACTA	AAAGGAGAAA
ACTTC-ACACA	TCATCTTTAG	.-.GCATGGGAC	TTCAGAAAAG	TTGTGAATCT	GAATTTTCCC

7TTTTAAAAA AAAAAAAAAA AAAA (2) INFORMÁCIA PRE SEQ ID NO: 2:

(i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: 13679 páry báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: dvojvláknová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) MOLEKULOVÝ TYP: cDNA až mRNA (iii) HYPOTETICKÝ: nie (iv) ANTI-SENSE: nie (vi) ORIGINÁLNY ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Nicotiana tabacum (ix) ZNAKY:

(A) MENO/HESLO: (B) LOKALIZÁCIA: 181..1299 (D) INÉ INFORMÁCIE:/POZN.= „cDNA kódujúca . CYCD3;1“ (xi) SEKVENČNÝ OPIS: SEQ ID NQ: 2: ’ cyklín

AAACGAGTCT	CTGTGTACTC	CTCCTCCTAT	agcttttctc	TCT.TCTTCTC	TTCACACCTC
CCACAACACA	CAATCAGACA	AAATAGAGAG	GAAAATGAGT	ATGGTGAAAA	AGCTTTGTTT
TGTATAATGA	GAAAAAGAGA	TTľATATACA	TCTCTTCTTC	TACTTCCTTC	TTACTAGAAG
ATGGCAATAG	AACACAATGA	GCAACAAGAA	CTATCTCAAT	CTTTTCTTTT	AGATGCTCTT
TACTGTGAAG	AAGAAGAAGA	AAAATGGGGA	GATTTAGTAG	ATGÄTGAGAC	TATTATTACA
CCACTCTCTT	CAGAAGTAAC	AAC.AACAACA	ACAACAACAA	CAAAGCCTAA	TTCTTTATTA
CCTTTGCTTT	TGTTGGAACA	AG.ATTTATTT	TGGGAAGATG	AAGAGCTTCT	TTCACTTTTC
TCTAAAGAAA	AAGAAACCCA	TľGTTGGTTT	AACAGTTTTC	AAGATGACTC	TTTACTCTGT
TCTGCCCGTG	TTGATTCTGT	GGAATGGATT	TTAAAAGTGA	ATGGTTATTA	TGGTTTCTCT
GCTTTGACTG	CCGTTTTAGC	CAľAAATTAC	TTTGACAGGT	TTCTGACTAG	TCTTCATTAT
CAGAAAGATA	AACCTTGGAT	G.AľTCAACTT	GCTGCTGTTA	CTTGTCTTTC	TTTAGCTGCT
AAAGTTGAAG	AAACTCAAGT	TCCTCTTCTT	TTAGATTTTC	AAGTGGAGGA	TGCTAAATAT

GTGTTTGAGG CAAAAACTAT

AGGATGAATC CAGTGACCCC

AGAAATAATA TTCACTGGGA

GCTGATTGTA GATTCGTACG

GTTATTCATC AAGTTGAGCC

CTCAAAATTA ACAAGGAGAA

AAGCCCATTT CACACAAACG

GATCCAATTT ACAGTTCAGA

TATTTTCCTG TTTTCAAGAA

ATTAGCAGAG TTTTTGTGGA

TCTCTTTTCT TTCTTATTAC

TTTACCTTTA ATGTCATTTT

TAGCTGGTGG TTGCAGTTGG

ACTACTACTG GAAAGCAGAG

TTTTTCTCTA TTCATATCAA

GACATATTTT ATATATTTAC

TCAAAGAATG GAGCTTTTAG

ACTTTCATTT CTTGATCATA

ATTTCTTAGA AGATGTGAAA 1

TTATATGCCG TCTGTATTGG

TTC-TAATTCT GTTGACTACC

AGTGAATAAT TGCTTTGAAC

CAAATATGAG AATCCTAGTC

AAGTTCAAAT GATTCATGGG

AAGCAGAGTA CAAGAACAGC

AGCTGTTGGT AGTCCTCATT

CAACTATGGT GGTAATAATA

CAAAAATTAC ATGAAAATGG

CAGÄGAAGAG GACTGGCTTT . ' r

ATAGAGAGAG GAGAAAAGÄC

TTCTCTCTTA GGTCCTTTTC

TAŤAATCATA AATTCTTGAA

TGTTGTCTTC ACTAAAATGG

TTATAAGGAG GCTTGGGCTA

ATCTCCTCCT CTCTATTATG

CCACTGCAAT TATGCTTCAC

AAAATCAACT TCTTGGGGTT

TCATATCAGA AGTGTGTTCT

ATAGCCCAAG TGGTGTAATT

ATTTGGAGTC AACATCTTCA

AAATGAAATT GGCATCTTCA

AAAATCAATC ACCTGATTTA

TTTATTGATA TTCAGAAGTA

AAAAAAAGAA AAGAAGAGCT

TTTTTGCAGG AGTGTAGTCT

AGAAAATCTG CACTATTTGT

ATGCATGCAT ACTTTTGATG

ΤΑΑΑΑΑΑΑΑΑ ΑΑΑΑΑΑΑΑΑ (2) INFORMÁCIA PRE SEQ ID NO: 3 (i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: 1431 páry báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: dvojvláknová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) MOLEKULOVÝ TYP. cDNA až mRNA (iii) HYPOTETICKÝ; nie (iv) ANTI-SENSE: nie (vi) ORIGINÁLNY ZDROJ :

• * » * (A) ORGANIZMUS. Nicotiana tabacum (ix) ZNAKY:

(A) MENO/HESLO: (B) LOKALIZÁCIA. 198..1298 (D) INÉ INFORMÁCIE:/POZN.= „cDNA kódujúca cyklín CYCD3;2“ (xi) SEKVENČNÝ OPIS: SEQ ID NO: 3:

CACCTTTACT	CTCTTCTCCT	TTTTGGCTCT	TCCCATTCTC	TCCTTCTCTT	TCTTTATTTT
CTGTCCTGTA	GAGAGAGAGA	GAAAGTATAA	GCAAAGCAGC	AGATATGTTA	CTGGGTCCAA
GATTGAGTTT	TGGCTTACCT	TGAAGATAAT	GAGTAGAGCC	TCCATTGTCT	TCTTCCGTCA
AGAAGAAGAA	GAAGAAGATG	GTTTTCCCTT	TAGATACTCA t	GCTCCTAAAT	CCAATCTTTG
ATGTCCTTTA	CTGTGAGGAA	GATCGATTCT	TGGACGATGA	TGATTTAGGA	GAATGGTCTA'
GTACTTTAGA	ACAAGTAGGA	AATAATGTGA	AAAAGACTCT	ÄCCTTTATTA	GAATGTGACA
TGTTTTGGGA	AGATGACCAG	CTTGTCACTC	TTTTAACTAA	GGAAAAAGAG	TCTCATTTGG
GTTTTGATTG	TTTAATCTCA	GATGGAGATG	GGTTTTTAGT	GGAGGTTAGA	AAAGAGGCAT
TGGATTGGAT	GTTGAGAGTC	ATTGCTCACT	ATGGTTTCAC (	TGCTATGACT	GCTGTTTTAG
CTGTGAATTA	TTTTGATAGG	TTTGTATCTG	GACTCTGCTT	TCAGAAAGAT	AAGCCTTGGA
TGAGTCAACT	TGCTGCTGTG	GCTTGTCTTT	CTATTGCTGC	TAAAGTGGAA	GAGACCCAAG
TCCCCCTTCT	CTTAGACCTC	CAAGTGGCTG	ATTCAAGATT	TGTGTTTGAG	GCAAAGACTA
TTCAGAGAAT	GGAACTCTTG	GTGCTCTCCA	CTCTTAAGTG	GAAAATGAAT	CCAGTGACAC
CACTATCTTT	CATTGATCAT	ATCATGAGGA	GATTTGGATT	CATGACCAAT	CTACATTTGG
ATTTTCTTAC-	GAGATGTGAA	CGCCTCATTC	TTGGTATTAT	CACTGATTCT	AGGCTCTTGC
ATTATCCTCC	ATCTGTTATT	GCAACTGCAG	TAGTGTATTT	CGTGATCAAT	GAGATTGAGC
CTTGCAATGC	AATGGAATAC	CAGAATCAGC	TCATGACTGT	TCTTAAAGTC	AAACAGGATA
GTTTTGAAGA .ATGCCATGAT	CTTATTCTAG	AGCTAATGGG	CACTTCTGGC	TACAATATCT
GCCAAAGCCT	.CAAGGGGAAA	„CATCAATqTG	.TACCTGGCAG	TCCAAGTG,GA	GTTATCGATG

CA7A777TAG TTGCGACAGC TCTAATGATT CGTGGTCGGT AGCATCTTCA ATTTCATCGT

CACCAGAACC TCAGTATAAG AGGATCAAAA CTCAGGATCA GACAATGACA CTGGCTCCAC

7GAG772TG7 77C7G7CG77 GTGGGCAGTA GTCCTCGTTG ATCAGTATCT CA77C7C7AG

ATTATCTAGT ATTACGGCTA TGGTTACTAT ATGATCTCTC TTTTTTGGTA 7G77C7C77A _t t *

AAC7GCAG77 GCACAA7GC7 C7GA7G77CC A77AAAAAAA AAAAAAAAAA A (2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID NO: 4:

(i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: 1788 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) MOLEKULOVÝ TYP: cDNA až mRNA.

(iii) HYPOTETICKÝ: nie (iv) ANTI-SENSE: nie (vi) ORIGINÁLNY ZDROJ :

(A) ORGANIZMUS: Helianthus tuberosus (ix) ZNAKY:

(A) MENO/HESLO: (B) LOKALIZÁCIA: 165..1109 (C) INÉ INFORMÁCIE:/POZN.= „cDNA kódujúca CYCD1;1“ (xi) SEKVENČNÝ OPIS: SEQ ID NO: 4:

CACAACAATC AC77C7AC7C AC7A77CAC7 AC77AC7AA7 CAC7GCAAC7 7C7CCGGCCA

C7777CACC7 CAAACCGCCG GAAC7CCGCC GC7CCGG7CG ACGG7GAA7C AC7GAA7C77

AGCAA77ATG 77CACAACAG 7A7GAACAA7 CAACACCGG7 CA7CA7G7CA A7C7CG7GC7

C7GAC7GC77 C7CCGAC77A C7C7GC7GCG AGGAC7CCGG CATA77A7CC GGCGACGACC

GGCCGGAG7G C7CC7A7GA7 77CGAA7A77 CCGGCGAC77 7GA7GA77CG A7CGCGGAG7

77A7AGAACA GGAGAGAAAG 77CG77CCAG GAA7CGA77A CG7CGAGCGA 777CAA7CGC cyklin

AAG77C7CGA TGCTTCTGCT AGAGAAGAAT CGGTTGCCTG GATCCTTAAG GTGCAACGGT TTTACGGATT TCAGCCGTTG ACGGCGTACC TCTCCGTTAA CTATCTGGAT CGTTTCATCT ATTGCCGTGG CTTCCCGGTG GCAAATGGGT GGCCCTTGCA ACTCTTATCT GTAGCATG'CT TGTCTTTAGC TGCTAAAATG GAGGAAACCC TTATTCCTTC TATTCTTGAT CTCCAGGTTG AAGGTGCAAA ATATATT.TTC GAGCCGAAAA CAATCCGAAG AATGGAGTTT CTTGTGCTTA GTGTTTTGGA TTGGAGACTA AGATCCGTTA ČACCGTTTAG CTTTATCGGC ŤTCTTTTCGC

ACAAAATCGA TCCATC7GGA

TCCTCTCAAA TATTCAAGAA

CAACAA7AC7 TTGTGCAGCA

C7GAA7CA7G GTGTGATGGC i

B ?

¹ AATCTCCÄAA GATATTGCCG

CAGGTGACTC ATCGTCGTCG

AC7AC7CA7G GATAGAGGAG

TCCGGATTCC 7CTC7A7A7T

GAGTCAGGAA AAGCAACGAA

TCCGTCACAA AGTCCGTCAA

CTAAAAAAAG GCCGATACGC

GTTCTAGAAT ACCTTGCTGC

AAGAAGACAA GGATAAACCC

GGGAAATTGC TTGCTGGTGT

G77C7777GC CCAAGAAGTC

AAGTCGCCTA AAAAGGCTGC

GAAGCAAAAC AGTCTCTTTT

ATG7ATACGG GTTTCCTTAT

GCTAGTT7AC TTGAGTATTG

AGTGATCTTT CTAAATTCTC

CTTAGCAAAG AGAAGATCAC

GTACATGTTC GAGTCATGAC

TCTTCTTCGC CATCGCCTTA

GACAAAAGAT GAAAATAAGG

TTTTAAAGGA ATCAACAAAT

AGCCGCCGGA GGAAGAAAAG

AGCCGGTCTC CAGT7CCCCG

TCAACGTACC GGATCCGGAG

TGAGGTTTTG GAGTTGGCGG

TAGGCACTTG CTATTGGCTG

TACTATTGCT AGTGGAGGTG

7TC7TCTTC7 TCTGCTGCTG

TTAGATAGAT GT77C7GG77

GTTCAATTAG 7CG7C7GGCA

CTCAAGGGCA ACACAAATTA

GCCATCA7G7 ATTGCTGCTG

ACTTATCAAT GCTGATCATG

AAAATGTTAC AGAC77G7AC t

GGC7CGAG7G AGTACTGAGT

CAAAAAGAGG AAACTAAATA

AGACAAAATA ÄATAAATAAA

ATATA7AAAA AAAAAAAATG

GCGCCGGAGC GAGGAAGAAG

TCGGAAGAAT CGC7AGGT77

CTCCGATCTA CCTTGCTGCT

GAAATGCAGC GAGAGATAAC

T7AGGAACGA 7GAGGAA7TG

TGTTGCCCAA TATCAATCCG

AGAAGACCCC CAAA7C7AAA

A7AG77GG7T AGA77AAG77

ATGTAACTAT TTTGGTCGTC

TTCAAAATGT 7AA77GGA7A CTATCTTC7T TAAAAAAAAA AAAAAAAA (2) INFORMÁCIA PRE SEQ ID NO: 5:

(i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: 1414 párové bázy (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: dvojvláknová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) MOLEKULOVÝ TYP: cDNA až mRNA (iii) HYPOTETICKÝ: nie (iv) ANTI-SENSE: nie (vi) ORIGINÁLNY ZDROJ :

(A) ORGANIZMUS: Helianthus tuberosus (ix) ZNAKY:

(A) MENO/HESLO: (B) LOKALIZÁCIA: 48. 1118 (C) INÉ INFORMÁCIE:/POZN.= „cDNA kódujúca· cyklín • CYCD3;1“ (xi) SEKVENČNÝ OPIS: SEQ ID NO: 5:

TTGAACCTTC	ATTTCTTTTC	TTTTCTTCTT	TCTAATCACC	AACCCCAATG	GCCATTTTAT
CACCATATTC	ATCTTCTTTC	TTAGACACAC	TCTTTTGCAA	TGAACAACAA	GATCATGAAT
ATCATGAATA	TGAGTATGAA	GATGAATTTA	CACAAACCAC	CCTCACAGAT	TCATCTGATC
TCCATCTTCC	CCCCCTGGAC	CAACTAGATT	TGTCATGGGA	ACATGAAGAG	CTTGTGTCCT
TGTTCACAAA	AGAACAAGAG	CAGCAAAAAC	AAACCCCTTG	TACTCTCTCT	TTTGGCAAAA
CTAGTCCCTC	AGTTTTTGCT	GCTCGTAAAG	AGGCTGTAGA	TTGGATCCTT	AAGGTCAAAA
GTTGTTATGG	ATTCACACCT	CTTACAGCCA	TTTTAGCCAT	CAATTATCTT	GATAGGTTTC
TTTCTAGCCT	CCATTTTCAA	GAAGATAAAC	CTTGGATGAT	TCAACTTGTT	GCTGTTAGTT
GTCTCTCTTT	AGCTGCTAAA	GTTGAAGAAA	CTCAAGTGCC	ACTCTTACTA	GATCTTCAAG
TAGAGGACAC	TAAGTACTTG	TTTGAGGCTA	AAAACATACA	AAAAATGGAG	CTTTTGGTGA
TGTCAACTTT	GAAATGGAGG	ATGAACCCAG	TGACACCAAT	CTCATTTCTT	GATCACATTG

TAAGAAGGCT	TGGATTAACT	GATCATGTTC	ATTGGGATTT	TTTCAAGAAA	TGTGAAGCTA
TGATCCTTTG	TTTAGTTTCA	GATTCAAGAT	TCGTGTGTTA	TAAACCATCC	GTGTTGGCCA
CAGCTACAAT	GCTTCACGTT	GTAGATGAAA	TTGATCCTCC	CAATTGTATT	GACTACAAAA
GTCAACTTCT	GGATCTTCTC	AAAACCACTA	AGGACGACAT	AAACGAGTGT	TACGAGCTCA
TTGTCGAGCT	AGCTTACGAT 1	CÄTCACAACA	AACGAAAACA	TGATGCAAAC	GAGACAACAA.-
CCAATCCGGT	TAGTCCAGCT	GGCGTGATCG	ATTTCACTTG	TGATGAAAGT	TCAAATGAGT
CATGGGAACT	TAATGCTCAT	CATTTCCGCG	AGCCTTCATT	CAAGAAAACA	AGAATGGATT
CAACAATTCG	GGTTCGGGTT	TGGTTCACTT	ATAAGCTTTA	ATCGAGGGTA	GTTGTAAACA
TGTAATCCGC	ATGCACGCTA	TTAATCCTAC	GGTCCACTAC	TACATATAAT	CGGCCTATAA
AATTATAGGT	TAAGATGACC	AGTCGTAGGC	GTCGAGATGT	CCTTATGGTT	GGTCAATTTC
TCTATGGTTT	TAGGTCGTTT	TTAATGTGAG	ATAAATTAAA	TTCGGTATGT	TAAGTCTTTA
TCAAGCAATG	GACGTTATAT	TTATTGTTTG	ATATTGAGAA	TTAAATTCCA	TGGGAAAAAA
ΑΆΑΆΑΑΑΑΑΑ	ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ	ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ	AAAA

(2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID NO: 6:

(i) .SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: 100 párov báz ' ‘ (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: dvojvláknová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) MOLEKULOVÝ TYP: iná nukleová kyselina (A) OPIS: = „DNA sekvencia T-DNA PGSV5“ (iii) HYPOTETICKÝ: nie (iv) ANTI-SENSE: nie (ix) ZNAK (A) MENO/HESLO’ (B) LOKALIZÁCIA: 1..25 (D) INÉ 1NFORMÁCIE /OZN.= RB /POZN. = „pravá hranica sekvencie z T-DNA PGSV5 (ix) ZNAK:

(A) MENO/HESLO’ 69 (B) LOKALIZÁCIA: 26..75 (C) INÉ INFORMÁCIE:/OZN.= MCS /POZN. = „Mnohonásobné klonované miesto“ (ix) ZNAK:

(A) MENO/HÉSLO: - ' ' · (B) LOKALIZÁCIA: 76..100 (C) INÉ INFORMÁCIE:/OZN.= LB /POZN. = „ľavá hranica sekvencie z T-DNA PGSV5 (xi) Sekvenčný opis: SEQ ID NO: 6:

AATTACAACG GTATATATCC TGCCAGTACT CGGCCGTCGA CCGCGGTACC CGGGGAAGCT TAGATCCATG GAGCCATTTA CAATTGAATA TATCCTGCCG (2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID NO: 7:

(i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY?

(A) DĹŽKA: 17 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) MOLEKULOVÝ TYP: iná nukleová kyselina (A) OPIS: = „oligonukleotidový primér 1 pre PCR“ (xi) SEKVENČNÝ OPIS: SEQ ID NO: 7: GCMTGGATYC TYAAGGT (2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID NO: 8:

(i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: 17 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) MOLEKULOVÝ TYP: iná nukleová kyselina (A) OPIS: = „oligonukleotidový primér 2 pre PCR“ (xi) SEKVENČNÝ OPIS: SEQ ID NO: 8:

TGCTTGTCWT TAGCTGC (2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID NO: 9:

(i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: 18 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) MOLEKULOVÝ TYP: iná nukleová kyselina (A) OPIS: = „oligonukleotidový primér 3 pre PCR“ (xi) SEKVENČNÝ OPIS: SEQ ID NO: 9:

AAGAATGGA ÝTTCTTGT » ' (2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID NO: 10:

(i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: 19 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) MOLEKULOVÝ TYP: iná nukleová kyselina (A) OPIS: = „oligonukleotidový primér 4 pre PCR“ (xi) SEKVENČNÝ OPIS- SEQ ID NO: 10: ARAGNATYCY KGCWGCAGC (2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID NO: 11 (i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: 19párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) MOLEKULOVÝ TYP: iná nukleová kyselina (A) OPIS: = „oligonukleotidový primér 5pre PCR“ (xi) SEKVENČNÝ OPIS: SEQ ID NO: 11 CCRTCACACC AWGNYTCAG (2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID NO: 12 (i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: lópárov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) MOLEKULOVÝ TYP: iná .nukleová kyselina (A) OPIS: = „oligonukleotidový primér 6pre PCR“' (xi) SEKVENČNÝ OPIS: SEQ ID NO: 12 TGGWGATTTG GATTTG (2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID NO: 13 (i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: 17párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) MOLEKULOVÝ TYP: iná nukleová kyselina (A) OPIS: = „oligonukleotidový primér 7pre PCR“ (xi) SEKVENČNÝ OPIS: SEQ ID NO: 13 ATNAANTACT TGGATCG (2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID NO: 14 (i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: 19 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) MOLEKULOVÝ TYP: iná nukleová kyselina (A) OPIS: = „oligonukleotidový primér 8 pre PCR“ (xi) SEKVENČNÝ OPIS: SEQ ID NO: 14:

AGCTTGCANT CTCCATTC (2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID NO: 15:

(i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: 17 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina . (C) POČET VLÁKIEN: jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: lineárna · (ii) MOLEKULOVÝ TYP: iná nukleová kyselina (A) OPIS: = „oligonukleotidový primér 9 pre PCR“ (xi) SEKVENČNÝ OPIS: SEQ ID NO: 15:

TCAGAAGNCC TGAANTC (2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID NO: 16:

(i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: 17 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) MOLEKULOVÝ TYP: iná nukleová kyselina (A) OPIS: = „oligonukleotidový primér 10 pre PCR“ (xi) SEKVENČNÝ OPIS: SEQ 1D NO: 16: GANTGGATNY TNAARGT (2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID NO: 17:

(i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: 1^ párov báz · (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) MOLEKULOVÝ TYP: iná nukleová kyselina (A) OPIS: = „oligonukleotidový primér 11 pre PCR“ (xi) SEKVENČNÝ OPIS: SEQ ID NO: 17:

AAGABAARCC WTGGATG (2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID NO: 18:

, t (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) DĹŽKA: 20 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) MOLEKULOVÝ TYP: iná nukleová kyselina (A) OPIS: = „oligonukleotidový primér 12 pre PCR“ (xi) SEKVENČNÝ OPIS: SEQ ID NO: 18:

GTKGAAGARA CTCAAGTBCC (2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID NO: 19:

(i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: 24 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) MOLEKULOVÝ TYP: iná nukleová kyselina (A) OPIS: = „oligonukleotidový primér 13 pre PCR“ (xi) SEKVENČNÝ OPIS: SEQ ID NO: 19:

TGGNGTNACW GGNTKCATYY TČCA (2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID NO; 20:

(i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: 20 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) MOLEKULOVÝ TYP: iná nukleová kyselina (A) OPIS: = „oligonukleotidový primér PR14 pre PCR“ (xi) SEKVENČNÝ OPIS: SEQ ID NO: 20: • GCWGNNGCNA NNNCAGANGG' (2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID NO: 21:

(i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: 1846 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: dvojvláknová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) MOLEKULOVÝ TYP: cDNA až mRNA (iii) HYPOTETICKÝ: nie (iv) ANTI-SENSE: nie (v) ORIGINÁLNY ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Zea mays (ix) ZNAK:

(A) MENO/HESLO: (B) LOKALIZÁCIA: 316..1389 (C) INÉ INFORMÁCIE:/pozn. = „cDNA kódujúca cyklín CYCD2“ (xi) SEKVENČNÝ OPIS: SEQ ID NO: 21:

CTGCAGTGGC	CTAGCCGGCG	TCGTCCTCCC	CCTCTCHCGC	TCCTCTGTCC	TCCCCTCTCC
ACTTGAGAAG	AACACAATTA	GGAAAAAAAG	GCAAAAAACA	TTTACCTTTT	TTCTATCTGT
ATATT.-.TCTG	AATAAATCAA	GAGGAGGAAG	AGGGGAGGGA	GCGAGGGAGG	GGGAGGAGTA
GCAAATCCAG	ACTCCATAGC	AACCAGCTCG	CGAGAAGGGG	AAAAGGGGGA	GGAAGAGCTT
CGCTTGTGTA	TTGATTGCTC	GCTGCTCCAG	TCCCTGCATT	CGTGCCGTTT	TTGGCAAGTA
GGTGGCGTGG	CAAGCATGGT	GCCGGGCTAT	GACTGCGCCG	CCTCCGTGCT	GCTGTGCGCG
GAGGACAACG	CTGCTATTCT	CGGCCTGGAC	GACGATGGGG	AGGAGTCCTC	CTGGGCGGCC
GCCGCTACGC	CGCCACGTGA	CACCGTCGCC	GCCGCCGCCG	CCACCGGGGT	CGCCGTCGAT
GGGATTTTGA 1	.CGGAGTTCCC	t CTTGCTCTCG	GATGACTGCG f	TTGCGACGCT	.CGTGGAGAAG
GAGGTGGAGC	ACATGCCCGC	GGAGGGGTAC	CTCCAGAAGC	TGCAGCGACG	GCATGGGGAC
CTGGATTTGG	CCGCCGTCAG	GAAGGACGCC	ATCGATTGGA	TTTGGAAGGT	CATTGAGCAT
TACAATTTCG	CACCGTTGAC	TGCCGTTTTG	TCTGTGAACT	ACCTCGATAG	ATTCCTCTCC
ACGTATGAGT	TCCCTGAAGG	CAGAGCTTGG	ATGACTCAGC	TCTTGGCAGT	GGCTTGCTTG
TCTTTGGCTT	CGAAAATCGA	AGAGACTTTT	GTGCCACTCC	CCTTGGATTT	GCAGGTAGCG
GAGGCAAAGT	TTGTTTTTGA	GGGAAGGACC	ATAAAAAGGA	TGGAGCTTCT	GGTGCTAAGC
ACCTTAAAGT	GGAGGATGCA	TGCTGTTACT	GCTTGCTCAT	TTGTTGAATA	CTTTCTTCAT
AAATTGAGTG	ATCATGGTGC	ACCCTCCTTG	CTTGCACGCT	CTCGCTCTTC	GGACCTTGTC
TTGAGCACCG	CTAAAGGTGC	TGAATTCGTG	GTATTCAGAC	CCTCCGAGAT	TGCTGCCAGT
GTTGCACTTG	CTGCTATCGG	CGAATGCAGG	AGTTCTGTAA	TTGAGAGAGC	TGCTAGTAGC

TGCAAATATT TGGACAAGGA GAGGGTTTTA

ACTGCGGGAA GCATTGTCCT AAAG7CTGCT

CCAATAGGTG TCCTGGACGC TGCAGCCTGT

GGGTCTCCTG CAGTATGTTA CCATAGTTCT

CGTCTACTCT AATTGTGGTA CGCT7CAGGT

TGGTTCAAAC ATCTTAAATT TAGTTTGGCC

GCTGAATGGA CAACAAAACA CGCACACTAC

AGCGTCCCGC GAGCCAGCGC TGCA'.TCCAG

TGCTGGTGTA GGTAGAGAGG GAACAAGGCA

CTCGTATGTT TTGTACTTTT GCTCC7TCAG

CT7GGGGCAG 7GAACAT7TG TCGGA7GAAA

AGATGCCATG AAATGATTCA AGAGAAGATT

GGA7CATCAA TCTCCTCTGT GCCACAAAGC

CTGAGTCAAC AAAGCGATGA CGCTACTGTC

TCCACAAGCA AGAGGAGAAG GATCACTAQA

G7GC7CC7CA CCGCTCTAGG AGTTTTTGAT

GCTGGAGGAT 7ATGGTTTAG TCAAGTAGTT

T7GG7CCATA AAGACAAGAA AATAACTGGC

T7CA7GCAAG ACCCTAGAGT CCAGGGGGGG

T7CACA7ACG CCGTAGAGAT GAGAGAGCC7

T77GCAATGA ACTATATAAA CAAGGATTGC

I

AGAATCAAAA AGGATGGGGG TCGGCAGAGG

AATAGAACAA T7TGATATAT TTCCATAAAC ΤΑΑΑΑΑΑΑΑΑ AAAAAA

Claims (42)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Spôsob na získanie rastliny s pozmenenými rastovými charakteristikami alebo pozmenenou architektúrou, vyznačujúci sa tým, že obsahuje krok * » pózmenenia hladiny alebo funkčnej hladiny proteínu kontrolujúceho bunkové delenie vo vnútri rastlinných buniek, kde uvedený proteín kontrolujúci bunkové delenie je schopný väzby alebo fosforylácie proteínu podobnému Rb
2. 2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že proteín kontrolujúci bunkové delenie obsahuje väzbový motív proteínu podobného Rb v Nterminálnej časti proteínu.
3. 3. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že väzbový motív proteínu podobného Rb je LxCxE.

   í ’ I
4. 4. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že proteín kontrolujúci bunkové delenie je cyklín D-typu.
5. 5. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že hladina alebo funkčná hladina uvedeného proteínu kontrolujúceho delenie je pozmenená expresiou v uvedených bunkách uvedených rastlín, chimérický gén obsahuje nasledujúce použiteľné viazané DNA: a) oblasť promótora expresie rastliny, b) transkribovanú DNA oblasť kódujúcu RNA alebo proteín, ktorý keď sa prejaví zvyšuje alebo znižuje uvedenú hladinu alebo funkčnú hladinu proteínu kontrolujúceho bunkové delenie a voliteľne c) 3' koniec tvoriaci a polyadenylačný signál funkčný v rastlinných bunkách.
6. 6. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že uvedená transkribovaná oblasť DNA kóduje antisense RNA, ribozóm alebo sense RNA vlákno, ktorá keď sa prejaví redukuje, inhibuje alebo predchádza expresii uvedeného proteínu kontrolujúceho bunkové delenie.
7. 7. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že uvedená transkribovaná DNA oblasť kóduje antisense RNA, ktorá keď sa prejaví redukuje alebo predchádza expresii endogénnych cyklínov D-typu.
8. 8. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že transkribovaná DNA oblasť ¹ * » . kóduje proteín kontrolujúci bunkové delenie schopný viazať alebo fosforylovať proteín podobný Rb.
9. 9. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že transkribovaná DNA oblasť kóduje proteín kontrolujúci bunkové delenie obsahujúci väzbový motív proteínu podobného Rb.
10. 10. Spôsob podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že uvedený väzbový motív je LxCxE.

    t . · (
11. 11. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým', že uvedenú .transkribovaná oblasť kóduje cyklín D-typu.
12. 12. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že uvedený cyklín D-typu je cyklín D-typu z rastlín.
13. 13. Spôsob podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že uvedený cyklín D-typu je vybraný z Arabidopsis thaliana CYCD1, Arabidopsis thaliana CYCD2, Arabidopsis thaliana CYCD3, Nicotiana tabacum CYCD3;1, Nicotiana tabacum CYCD2;1, Nicotiana tabacum CYCD3;2, Helianthus tuberosus CYCD1;1, Zea mays CYCD2 a Helianthus tuberosus CYCD3.
14. 14. Spôsob podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že uvedená transkribovaná oblasť DNA obsahuje nukleotidovú sekvenciu vybranú z nukleotidovej sekvencie EMBL prístupové číslo X83369 od nukleotidovej polohy 104 až do nukleotidovej polohy 1108, nukleotidovú sekvenciu EMBL prístupové číslo X83370 od nukleotidovej polohy 195 až do nukleotidovej polohy

    1346, nukleotidovú sekvenciu EMBL prístupové číslo X83371 od nukleotidovej polohy 266 až do nukleotidovej polohy 1396, nukleotidovú sekvenciu SEQ ID N° 1 od nukleotidovej polohy 182 až do nukleotidovej polohy 1243, nukleotidovú sekvenciu SEQ ID N° 2 od nukleotidovej polohy 181 až do nukleotidovej polohy 1299, nukleotidovú sekvenciu SEQ * « I

    ID N°3 od nukleotidovej polohy 198 až do nukleotidovej polohy 1298, nukleotidovú sekvenciu SEQ ID N°4 od nukleotidovej polohy 165 až do nukleotidovej polohy 1109, nukleotidovú sekvenciu SEQ ID N° 5 od nukleotidovej polohy 48 až do nukleotidovej polohy 1118 alebo nukleotidovú sekvenciu SEQ ID N° 21 od nukleotidovej polohy 316 až do nukleotidovej polohy 1389.
15. 15. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že uvedená transkribovaná oblasť kóduje proteín alebo peptid, ktorý keď sa prejaví zvyšuje uvedenú funkčnú hladinu uvedeného proteínu kontrolujúceho bunkové delenie.

    ’ I
16. 16. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že uvedené transkribovaná DNA oblasť kóduje proteín alebo peptid vybraný z: mutantného cyklínu Dtypu, časti cyklínu D-typu, cyklínu D-typu, ktorý má mutáciu v cyklínovom boxe, cyklínu D2-typu, ktorý má substitúciu aminokyseliny 185 alebo aminokyseliny 155, cyklínu D2-typu, ktorý má mutáciu E185A aleboK155a, cyklínu D-typu, kde PEST sekvencie sú odstránené, cyklínu D-typu, kde LxCxE väzbový motív bol zmenený alebo vymazaný alebo cyklínu D-typu, kde C-zvyšok z LxCxE väzbového motívu bol vymazaný.
17. 17. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 5 až 16, vyznačujúci sa tým, že promótorová oblasť expresie rastliny je CaMV35S promótorová oblasť.
18. 18. Spôsob podľa nároku 6 alebo 7, vyznačujúci sa tým, že pozmenená rastová charakteristika obsahuje redukovanú rastovú rýchlosť.
19. 19. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 8 až 17, vyznačujúci sa tým, že uvedená pozmenená rastová charakteristika obsahuje zvýšenie rastovej rýchlosti.
20. 20. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 8 až 17, vyznačujúci sa~ tým, že pozmenená rastová charakteristika obsahuje rýchlejšie klíčenie.
21. 21. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 8 až 17, vyznačujúci sa tým, že uvedená pozmenená rastová charakteristika obsahuje redukciu času požadovanú na kvitnutie.
22. 22. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 8 až 17, vyznačujúci sa tým, že pozmenená architektúra obsahuje zvýšenie počtu kvetov na rastlinu alebo zvýšenie počtu semien na rastlinu alebo zvýšenie počtu ovocia na rastlinu.
23. 23. Chimérický gén ako je opísaný podľa ktorýchkoľvek'nárokov 5 až 17.

    * ,
24. 24. Rastlinná bunka, vyznačujúca sa tým, že obsahuje chimérické gény podľa nároku 23.
25. 25. Rastlina, vyznačujúca sa tým, že sa skladá v podstate z rastlinných buniek podľa nároku 24.
26. 26. Rastlina podľa nároku 25, vyznačujúca sa tým, že je rastúca v skleníku.
27. 27. Rastlina podľa nároku 23, vyznačujúca sa tým, že je vybraná z borovice, topoľa, eukalyptusu, ďateliny, strukovín, tráv, repky olejnej, ľanu, pšenice, brassica vegetable, rajčiny, šalátu, ryže, jačmeňa, zemiaku, tabaku, cukrovej repy, slnečnice, karafiátu, chryzantémy, ruže alebo tulipánu.
28. 28. Semeno podľa ktoréhokoľvek z nárokov 25 až 27, vyznačujúce sa tým, že obsahuje chimérické gény podľa nároku 23.
29. 29. Izolovaný DNA fragment, vyznačujúci sa tým, že obsahuje nukleotidovú sekvenciu od SEQ _t ID N° '2 od nukleotidovej polohy 181 . až do nukleotidovej polohy 1299.
30. 30. Izolovaný DNA fragment, vyznačujúci sa tým, že obsahuje nukleotidovú sekvenciu od SEQ ID N° 2 od nukleotidovej polohy 181 až do nukleotidovej polohy 1299.
31. 31. Izolovaný DNA fragment, vyznačujúci sa tým, že obsahuje nukleotidovú sekvenciu z SEQ ID N° 3 od nukleotidovej polohy 198 až do nukleotidovej polohy 1298.

    I ' , ‘ I * , *
32. 32. Izolovaný DNA fragment, vyznačujúci sa tým, že obsahuje nukleotidovú sekvenciu SEQ ID N°4 od nukleotidovej polohy 165 až do nukleotidovej polohy 1109.
33. 33. Izolovaný DNA fragment, vyznačujúci sa tým, že obsahuje nukleotidovú sekvenciu SEQ ID N°5 od nukleotidovej polohy 48 až do nukleotidovej polohy 1118.
34. 34. Izolovaný DNA fragment, vyznačujúci sa tým, že obsahuje nukleotidovú sekvenciu SEQ ID N°21 od nukleotidovej polohy 316 až do nukleotidovej polohy 1389.
35. 35. Použitie proteinu kontrolujúceho bunkové delenie schopného viazať vreckovú doménu alebo proteín podobný Rb alebo schopného fosforylácie proteinu podobného Rb na pozmenenie rastových charakteristík alebo architektúry rastliny.
36. 36. Použitie podľa nároku 25, vyznačujúce sa tým, že proteín kontrolujúci bunkové delenie obsahuje LxCxE väzbový motív v N-terminálnej časti proteínu.
37. 37. Použitie podľa nároku 36, vyznačujúce sa týfti, že uvedený proteín kontrolujúci bunkové delenie je cyklín D-typu.
38. 38. Použitie podľa nároku 37, vyznačujúce sa tým, že uvedený proteín kontrolujúci bunkové delenie je cyklín D-typu vybraný z Arabidopsis thaliana CYCD1, Arabidopsis thaliana CYCD2, Arabidopsis thaliana CYCD3, Nicotiana tabacum CYCD3;1, Nicotiana tabacum CYCD2;1, Nicotiana tabacum CYCD3;2, Helianthus tuberosus CYCD1;1, Zea mays CYCD2 a Helianthus tuberosus CYCD3.
39. 39. Použitie ktoréhokoľvek z nárokov 34 až 37, vyznačujúce sa tým, že > _t proteín kontrolujúci bunkové delenie je kódovaný chimérickým génom začleneným do genómu buniek rastliny.
40. 40. Použitie DNA kódujúcej proteín kontrolujúci bunkové delenie, ktorý je schopný viazať alebo fosforylovať proteín podobný Rb na pozmenenie rastových charakteristík alebo architektúry rastliny.
41. 41. Použitie podľa nároku 40, vyznačujúce sa tým, že proteín kontrolujúci bunkové delenie je cyklín D-typu.
42. 42. Použitie podľa nároku 41, vyznačujúce sa tým, že uvedená DNA obsahuje nukleotidovú sekvenciu vybranú z nukleotidovej sekvencie EMBL prístupové číslo X83369 od nukleotidovej polohy 104 až do nukleotidovej polohy 1108, nukleotidovú sekvenciu EMBL prístupové číslo X83370 od nukleotidovej polohy 195 až do nukleotidovej polohy 1346, nukleotidovú polohu EMBL prístupové číslo X83371 od nukleotidovej polohy 266 až do nukleotidovej polohy 1396, nukleotidovú sekvenciu SEQ ID N°1 od nukleotidovej polohy 182 až do nukleotidovej polohy 1243, nukleotidovú sekvenciu SEQ ID N°2 od nukleotidovej polohy 181 až do nukleotidovej polohy 1299, nukleotidovú sekvenciu SEQ ID N°3 od nukleotidovej polohy

    198 až do nukleotidovej polohy 1298, nukleotidovú sekvenciu SEQ ID N°4 od nukleotidovej polohy 165 až do nukleotidovej polohy 1109, * » nukleotidovú sekvenciu SEQ ID N°5 od nukleotidovej polohy 48 až do nukleotidovej polohy 1118 alebo nukleotidovú sekvenciu SEQ ID N°21 od * nukleotidovej polohy 316 až do nukleotidovej polohy 1389.