WO2010055837A1 - 植物のバイオマス量を増産させる遺伝子及びその利用方法 - Google Patents

植物のバイオマス量を増産させる遺伝子及びその利用方法 Download PDF

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WO2010055837A1
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plant
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leucine
rich repeat
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聡 近藤
悦子 服部
徳 大音
典宏 光川
健一 小川
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トヨタ自動車株式会社
岡山県
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    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Definitions

  • the present invention relates to a plant in which a predetermined gene has been introduced or the expression control region of the endogenous gene is modified, and the amount of biomass obtained by introducing the predetermined gene or by modifying the endogenous gene expression control region.
  • the present invention relates to a method for increasing production and a method for producing a plant with increased biomass.
  • Biomass generally refers to the total amount of organisms that inhabit or exist per certain area, and in particular when plants are targeted, it means the dry weight per unit area.
  • the unit of biomass is quantified by mass or energy amount.
  • biomass and “biomass” are synonymous with the expression “biomass”.
  • Standing crop is sometimes used. Since plant biomass is generated by fixing carbon dioxide in the atmosphere using solar energy, it can be captured as so-called carbon neutral energy. Therefore, increasing plant biomass has the effects of global environmental conservation, prevention of global warming, and reduction of greenhouse gas emissions. Therefore, the technology for increasing plant biomass production is highly industrially important.
  • plants are cultivated for the purpose of part of the tissue itself (seed, root, leaf stem, etc.) or for the purpose of producing various substances such as fats and oils.
  • fats and oils produced by plants soybean oil, sesame oil, olive oil, coconut oil, rice oil, cottonseed oil, sunflower oil, corn oil, bean flower oil, palm oil, rapeseed oil, etc. have been known since ancient times. Widely used in industrial applications.
  • oils and fats produced by plants are also used as raw materials for biodiesel fuel and bioplastics, and their applicability is expanding as petroleum alternative energy.
  • Patent Documents 1 to 7 As techniques for increasing plant biomass production, various gene transfer techniques such as those disclosed in Patent Documents 1 to 7 have been known. However, in the techniques disclosed in Patent Documents 1 to 5, only a partial biomass increase effect such as plant seeds, tubers, roots and leaves is obtained. In addition, the techniques disclosed in Patent Documents 6 and 7 disclose only the biomass production effect under the nitrogen non-limited growth condition and only the biomass production effect by delaying the flowering time and extending the growth period. In other words, Patent Documents 1 to 7 do not disclose a technique for achieving the effect of increasing biomass in the whole plant by applying normal culture and growth conditions. Special table 2001-505410 Special table 2001-519659 Special table 2007-530063 JP 2005-130770 A Special table 2000-515020 Special table hei 9-503389 JP 2005-52114 A
  • the present inventors have intensively studied, and as a result, introduced a gene encoding a protein having a characteristic domain, which is a receptor-like protein having a leucine-rich repeat structure in the molecule, Alternatively, the inventors have found a novel finding that the amount of plant biomass can be significantly improved by modifying the expression control region of the gene concerned, and have completed the present invention.
  • the plant according to the present invention introduces an AT3G05660 gene encoding a receptor-like protein having a leucine-rich repeat structure or a gene functionally equivalent to the gene, or modifies the expression control region of the endogenous gene. It is a thing.
  • the method for increasing the amount of biomass introduces an AT3G05660 gene encoding a receptor-like protein having a leucine rich repeat structure or a gene functionally equivalent to the gene, or expression of the endogenous gene. This is a method of modifying a control region.
  • the method for producing a plant according to the present invention introduces an AT3G05660 gene encoding a receptor-like protein having a leucine-rich repeat structure or a gene functionally equivalent to the gene, or controls expression of the endogenous gene.
  • the method includes a step of preparing a transformed plant having a modified region, and a step of measuring a biomass amount of a progeny plant of the transformed plant and selecting a line in which the biomass amount is significantly improved.
  • the gene preferably encodes one of the following proteins (a) to (c).
  • A a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3
  • a leucine rich repeat structure comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, added or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3
  • a receptor-like protein having a leucine-rich repeat structure encoded by a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to a polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 2
  • the functionally equivalent gene includes a gene encoding a receptor-like protein derived from an organism other than Arabidopsis thaliana and having a leucine-rich repeat structure.
  • Examples of plants targeted in the present invention include dicotyledonous plants such as Arabidopsis plants and Brassicaceae plants.
  • the target plant in the present invention includes monocotyledonous plants such as rice and sugar cane among grasses and gramineous plants.
  • the plant according to the present invention has significantly improved biomass compared to the wild type. Moreover, the method of increasing the biomass amount according to the present invention can significantly increase the biomass as compared with the wild type of the target plant. Furthermore, the manufacturing method of the plant body which concerns on this invention can manufacture the plant body in which the biomass amount improved significantly compared with the wild type. Therefore, by applying the present invention, for example, cost reduction can be achieved by achieving an improvement in productivity when the plant itself is a product.
  • FIG. 4 is a characteristic diagram showing the results of alignment analysis of the amino acid sequences encoded by AT3G05660 and AT3G05650 using the CLUSTAL W (1.83) multiple sequence alignment program.
  • FIG. 5 is a characteristic diagram showing the results of alignment analysis of the amino acid sequences encoded by AT3G05660, AT2G33080 and AT3G05650 using the CLUSTAL W (1.83) multiple sequence alignment program.
  • FIG. 5 is a characteristic diagram showing the results of alignment analysis of the amino acid sequences encoded by AT3G05660, AT2G33080 and AT3G05650 using the CLUSTAL W (1.83) multiple sequence alignment program.
  • FIG. 3 is a characteristic diagram showing the results of measuring the total biomass amount in the above-ground part of the plant, the transformed plant into which the LRR protein gene (AT2G33080) was introduced, and the transformed plant into which the protein gene (AT3G05660) was introduced.
  • the plant according to the present invention is a plant in which an AT3G05660 gene encoding a receptor-like protein having a leucine-rich repeat structure (hereinafter abbreviated as LRR-RLP) or a gene functionally equivalent to the gene is introduced into the plant.
  • LRR-RLP leucine-rich repeat structure
  • the expression control region of the gene of interest is modified, and the amount of biomass is significantly improved compared to the wild type.
  • the plant according to the present invention may be one in which the above LRR-RLP gene is expressed throughout the plant tissue, or may be expressed in at least a part of the plant tissue.
  • the plant tissue is meant to include plant organs such as leaves, stems, seeds, roots and flowers.
  • the expression control region means a promoter region to which RNA polymerase binds and a region to which other transcription factors bind.
  • the transcription control region it is preferable to replace, for example, the promoter region in the endogenous transcription control region with a promoter region capable of higher expression.
  • the LRR-RLP gene is the AT3G05660 gene or a gene functionally equivalent to the gene.
  • LRR-RLP is involved in receptor-like kinase (RLK) signal as described in Reference 1 (Plant Physiology, June 2003, Vol. 132, pp. 530-543). It is a protein similar to the extracellular domain.
  • the LRR-RLP encoded by the AT3G05660 gene has a characteristic domain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • LRR-RLP (AT2G33080 and AT3G05650) having high homology to LRR-RLP encoded by the AT3G05660 gene and AT3G05660 are compared at the amino acid sequence level, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is specific in AT3G05660. It is understood that there is.
  • FIG. 2 shows the result of the same alignment analysis for AT3G05660, AT2G33080, and AT3G05650.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (denoted as region A in the figure) is found to be a specific domain that can distinguish AT2G33080 and AT3G05650 from AT3G05660.
  • AT3G05660 which has a domain which consists of an amino acid sequence shown to sequence number 1, it has become clear that it has the effect which improves biomass significantly in the Example mentioned later.
  • the base sequence of the coding region in the AT3G05660 gene is shown in SEQ ID NO: 2
  • the amino acid sequence of LRR-RLP encoded by the AT3G05660 gene is shown in SEQ ID NO: 3.
  • a gene functionally equivalent to the AT3G05660 gene may be introduced into the plant body.
  • the functionally equivalent gene means, for example, a gene derived from an organism other than Arabidopsis thaliana and corresponding to the AT3G05660 gene encoding LRR-RLP.
  • the gene functionally equivalent to the AT3G05660 gene derived from organisms other than the above Arabidopsis thaliana is not particularly limited, and can be specified by searching a database storing gene sequences relating to various organisms. That is, for example, the DDBJ / EMBL / GenBank international base sequence database or SWISS-PROT database is searched using the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 as a query sequence, and can be easily searched from known databases. -Can be identified.
  • the LRR-RLP gene is not limited to the LRR-RLP gene consisting of the base sequence and amino acid sequence specified by the sequence numbers as described above. That is, the LRR-RLP gene includes an amino acid sequence in which one or a plurality of amino acid sequences are deleted, substituted, added or inserted in the amino acid sequence specified by the SEQ ID NO as described above, and the LRR-RLP It may have an activity that functions as:
  • the plurality of amino acids for example, 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 7, further preferably 1 to 5, particularly preferably 1 to 3 are used. means.
  • amino acid deletion, substitution, or addition can be performed by modifying the base sequence encoding the LRR-RLP gene by a technique known in the art.
  • Mutation can be introduced into a nucleotide sequence by a known method such as Kunkel method or Gapped duplex method or a method according thereto, for example, a mutation introduction kit using site-directed mutagenesis (for example, Mutant- Mutations are introduced using K, Mutant-G (both trade names, manufactured by TAKARA Bio Inc.) or the like, or using LA PCR-in-vitro Mutagenesis series kits (trade name, manufactured by TAKARA Bio Inc.).
  • EMS ethyl methanesulfonic acid
  • 5-bromouracil 2-aminopurine
  • hydroxylamine N-methyl-N'-nitro-N nitrosoguanidine
  • other carcinogenic compounds are representative.
  • a method using a chemical mutagen such as that described above may be used, or a method using radiation treatment or ultraviolet treatment represented by X-rays, alpha rays, beta rays, gamma rays and ion beams may be used.
  • the LRR-RLP gene may be a homologous gene of the LRR-RLP gene consisting of the base sequence and amino acid sequence specified by the sequence numbers as described above.
  • the homologous gene generally means a gene that has evolved and branched from a common ancestral gene, and is generated by two kinds of homologous genes (ortholog) and duplicated branching within the same species. It means to include homologous genes (paralog).
  • the above-mentioned “functionally equivalent gene” includes homologous genes such as orthologs and paralogs.
  • the above-mentioned “functionally equivalent genes” include genes that do not evolve from a common gene but simply have similar functions.
  • the similarity to these amino acid sequences is, for example, 70% or more, preferably 80% or more, more
  • a gene encoding a protein having an LRR-RLP activity having an amino acid sequence of preferably 90% or more, most preferably 95% or more and having a common sequence consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 can be mentioned.
  • the similarity value means a value obtained by default setting using a computer program in which a BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) program is implemented and a database storing gene sequence information.
  • the genome is extracted from the target plant if the plant genome information is not clear Or constructing a cDNA library of the target plant and subjecting at least a part of the LRR-RLP gene consisting of the base sequence and amino acid sequence specified by SEQ ID NO as described above under stringent conditions. It can be identified by isolating the hybridizing genomic region or cDNA.
  • stringent conditions refer to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. For example, hybridization at 45 ° C.
  • Hybridization can be performed by a conventionally known method such as the method described in J. Sambrook et al. OleMolecular lonCloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1989).
  • the plant according to the present invention has an amount of biomass in comparison with that of the wild type by introducing the AT3G05660 gene or a gene functionally equivalent to the gene into the plant or by modifying the expression control region of the gene of interest.
  • a method for introducing the LRR-RLP gene into a plant a method for introducing an expression vector in which an exogenous LRR-RLP gene is arranged under the control of a promoter that enables expression in the plant can be mentioned.
  • Examples of the technique for modifying the expression control region of the gene of interest include a technique for modifying the promoter of the endogenous LRR-RLP gene in the target plant.
  • a method of introducing an expression vector in which the above-described LRR-RLP gene is arranged under the control of a promoter capable of expression in a plant is preferable.
  • the expression vector expression vector is constructed so as to contain a promoter that enables expression in a plant and the above-mentioned LRR-RLP gene.
  • Various vectors known in the art can be used as the base vector for the expression vector.
  • a plasmid, phage, cosmid or the like can be used, and can be appropriately selected according to the plant cell to be introduced and the introduction method.
  • Specific examples include pBR322, pBR325, pUC19, pUC119, pBluescript, pBluescriptSK, and pBI vectors.
  • the method for introducing a vector into a plant is a method using Agrobacterium, it is preferable to use a pBI binary vector.
  • Specific examples of the pBI binary vector include pBIG, pBIN19, pBI101, pBI121, pBI221, and the like.
  • the promoter is not particularly limited as long as it is a promoter capable of expressing the LRR-RLP gene in a plant body, and a known promoter can be suitably used.
  • promoters include cauliflower mosaic virus 35S promoter (CaMV35S), various actin gene promoters, various ubiquitin gene promoters, nopaline synthase gene promoter, tobacco PR1a gene promoter, tomato ribulose 1,5-diphosphate carboxylase Oxidase small subunit gene promoter, napin gene promoter, oleosin gene promoter and the like.
  • cauliflower mosaic virus 35S promoter, actin gene promoter, or ubiquitin gene promoter can be more preferably used. When each of the above promoters is used, any gene can be strongly expressed when introduced into a plant cell.
  • a promoter having a function of expressing in a site-specific manner in a plant can be used.
  • any conventionally known promoter can be used.
  • the expressed plant organ can be increased as compared with the wild type.
  • the expression vector may further contain other DNA segments in addition to the promoter and the LRR-RLP gene.
  • the other DNA segment is not particularly limited, and examples thereof include a terminator, a selection marker, an enhancer, and a base sequence for improving translation efficiency.
  • the recombinant expression vector may further have a T-DNA region.
  • the T-DNA region can increase the efficiency of gene transfer particularly when Agrobacterium is used to introduce the recombinant expression vector into a plant body.
  • the transcription terminator is not particularly limited as long as it has a function as a transcription termination site, and may be a known one.
  • the transcription termination region (Nos terminator) of the nopaline synthase gene the transcription termination region of the cauliflower mosaic virus 35S (CaMV35S terminator) and the like can be preferably used. Of these, the Nos terminator can be more preferably used.
  • the transcription terminator is placed at an appropriate position, and after being introduced into a plant cell, an unnecessarily long transcript is synthesized, and a strong promoter reduces the copy number of the plasmid. Can be prevented.
  • a transformant selection marker for example, a drug resistance gene can be used.
  • drug resistance genes include drug resistance genes for hygromycin, bleomycin, kanamycin, gentamicin, chloramphenicol and the like.
  • Examples of the base sequence for improving the translation efficiency include an omega sequence derived from tobacco mosaic virus. By placing this omega sequence in the untranslated region (5′UTR) of the promoter, the translation efficiency of the fusion gene can be increased.
  • the recombinant expression vector can contain various DNA segments depending on the purpose.
  • the method for constructing the recombinant expression vector is not particularly limited, and the promoter, the LRR-RLP gene, the transcription repressor conversion polynucleotide, and the above-described other as necessary may be used as a base vector appropriately selected. These DNA segments may be introduced in a predetermined order.
  • an expression cassette may be constructed by linking the above LRR-RLP gene and a promoter (such as a transcription terminator if necessary), and this may be introduced into a vector.
  • the order of the DNA segments can be defined by setting the cleavage sites of each DNA segment as complementary protruding ends and reacting with a ligation enzyme.
  • the promoter, the LRR-RLP gene, and the terminator may be in order from the upstream.
  • the types of reagents for constructing the expression vector that is, the types of restriction enzymes and ligation enzymes are not particularly limited, and commercially available ones may be appropriately selected and used.
  • the method for producing the above expression vector is not particularly limited, and a conventionally known method can be used.
  • Escherichia coli may be used as a host and propagated in the E. coli.
  • a preferred E. coli type may be selected according to the type of vector.
  • the expression vector described above is introduced into a target plant by a general transformation method.
  • the method (transformation method) for introducing the expression vector into the plant cell is not particularly limited, and any conventionally known method suitable for the plant cell can be used. Specifically, for example, a method using Agrobacterium or a method of directly introducing into plant cells can be used.
  • a method using Agrobacterium for example, Bechtold, E., Ellis, J. and Pelletier, G. (1993) In Planta Agrobacterium-mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis plants. CR Acad. Sci. Paris Sci. Vie, 316, 1194-1199.
  • a method for directly introducing an expression vector into a plant cell for example, a microinjection method, an electroporation method (electroporation method), a polyethylene glycol method, a particle gun method, a protoplast fusion method, a calcium phosphate method, or the like can be used.
  • a transcription unit necessary for expression of the target gene such as a promoter or transcription terminator, and DNA containing the target gene are sufficient, and the vector function Is not mandatory.
  • the DNA contains only the protein coding region of the gene of interest that does not have a transcription unit, it is sufficient if it can be integrated without the transcription unit of the host and the gene of interest can be expressed.
  • Examples of the plant cell into which the expression vector or the expression cassette containing the gene of interest without the expression vector is introduced include, for example, cells of each tissue in plant organs such as flowers, leaves, roots, callus, suspension culture, etc. A cell etc. can be mentioned.
  • the expression vector may be appropriately constructed according to the type of plant to be produced, but a general-purpose expression vector is constructed in advance and introduced into plant cells. Also good.
  • the plant to which the expression vector is introduced in other words, the plant to be increased in biomass production is not particularly limited. That is, by increasing the above-described LRR-RLP gene, it is possible to expect an increase in biomass production for any plant.
  • Examples of the target plant include dicotyledonous plants and monocotyledonous plants, for example, plants belonging to the family Brassicaceae, Gramineae, Eggplant, Legume, Willow, etc. (see below), but are limited to these plants. Is not to be done.
  • Brassicaceae Arabidopsis thaliana, Brassica (Brassica rapa, Brassica napus), Cabbage (Brassica oleracea var. Capitata), Rapeseed (Brassica rapa, Brassica napus), Nanohana (Brassica rapa, Brassica ⁇ napus) Pekinensis), Chingen rhinoceros (Brassica rapa var. (Brassica rapa var. Chinensis), Japanese radish (Brassica Raphanus sativus), Wasabi (Wasabia japonica), etc.
  • Eggplant family tobacco (Nicotiana tabacum), eggplant (Solanum melongena), potato (Solaneum tuberosum), tomato (Lycopersicon lycopersicum), capsicum (Capsicum annuum), petunia (Petunia), etc.
  • Legumes soybean (Glycinelymax), pea (Pisum sativum), broad bean (Vicia faba), wisteria (Wisteria floribunda), peanut (Arachis. Hypogaea), Lotus corniculatus var. Japonicus, common bean (gargo ul) (Vigna angularis), Acacia.
  • Asteraceae chrysanthemum (Chrysanthemum morifolium), sunflower (Helianthus annuus), etc.
  • Palms oil palm (Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), coconut (Cocos nucifera), date palm (Phoenix dactylifera), wax palm (Copernicia) Ursiaceae: Rhis succedanea, Cashew nutcrest (Anacardium occidentale), Urushi (Toxicodendron vernicifluum), Mango (Mangifera indica), Pistachio (Pistacia vera) Cucurbitaceae: pumpkins (Cucurbita maxima, Cucurbita moschata, Cucurbita pepo), cucumbers (Cucumis sativus), callas (Trichosanthes cucumeroides), gourds (Lagenaria siceraria var. Gourda) Rosaceae: Almond (Amygdalus communis), Rose (Rosa), Strawberry (Fragaria), Sakura (Prunus), Apple (Malus pumila var. Domestica
  • Dianthus Carnation (Dianthus caryophyllus).
  • Lily family Tulip (Tulipa), Lily (Lilium), etc.
  • biofuels such as sugarcane, corn, rapeseed, and sunflower.
  • biofuels such as sugarcane, corn, rapeseed, and sunflower.
  • biofuels such as bioethanol, biodiesel, biomethanol, bio DME, bio GTL (BTL) and biobutanol by increasing the biomass of energy crops.
  • the LRR-RLP gene that can be used in the present invention can be isolated from various plants and used, but can be appropriately selected and used depending on the type of the plant whose biomass is to be increased. Can do. That is, when the plant whose biomass production is to be increased is a monocotyledonous plant, it is preferable to express an LRR-RLP gene isolated from the monocotyledonous plant.
  • an LRR-RLP gene derived from a dicotyledonous plant may be introduced. That is, for example, the LRR-RLP gene (SEQ ID NO: 2) derived from Arabidopsis thaliana may be introduced so as to be expressed not only in dicotyledonous plants but also in plants widely classified as monocotyledonous plants.
  • a selection step for selecting an appropriate transformant from among plant bodies can be performed by a conventionally known method.
  • the selection method is not particularly limited.
  • the selection may be performed on the basis of drug resistance such as hygromycin resistance, and after growing the transformant, the plant itself, or any organ or tissue You may select the thing which measured weight and has increased significantly compared with the wild type.
  • progeny plants can be obtained from the transformed plants obtained by the transformation treatment according to a conventional method. Having the trait by selecting a progeny plant holding the trait into which the LRR-RLP gene has been introduced or the endogenous expression control region of the LRR-RLP gene has been modified, based on the biomass amount Can produce a stable plant line with increased biomass.
  • plant cells, seeds, fruits, strains, callus, tubers, cuttings, clumps, and other propagation materials are obtained from the transformed plants and their progeny, and the amount of biomass is increased by having the above traits based on these. It is also possible to mass-produce stable plant lines.
  • the plant body in the present invention includes at least one of a grown plant individual, a plant cell, a plant tissue, a callus, and a seed. That is, in this invention, if it is a state which can be made to grow finally to a plant individual, all will be considered as a plant body.
  • the plant cells include various forms of plant cells. Such plant cells include, for example, suspension culture cells, protoplasts, leaf sections and the like. Plants can be obtained by growing and differentiating these plant cells. In addition, the reproduction
  • the plant body in which the biomass amount per individual increased significantly can be provided.
  • the significant increase in the biomass amount means that the total weight per individual is statistically significantly larger than that of the wild type. At this time, even if some tissues of the plant body were specifically large and other tissues were equivalent to the wild type, if the total weight of the whole plant body was large, it was judged that the biomass amount increased. To do.
  • the biomass amount of the plant body is increased, either the case where the whole plant body is intended for production or the case where a part of the plant body (for example, seeds) or its contained component is intended for production.
  • productivity can be improved.
  • the fats and oils contained in plant seeds are intended for production, the amount of fats and oils that can be recovered per planted area can be greatly improved.
  • the fats and oils are not particularly limited, and examples thereof include plant-derived fats and oils such as soybean oil, sesame oil, olive oil, coconut oil, rice oil, cottonseed oil, sunflower oil, corn oil, benflower oil, and rapeseed oil. .
  • the manufactured fats and oils can be widely used for household use and industrial use, and can also be used as a raw material for biodiesel fuel. That is, according to the present invention, the above-mentioned fats and oils for home use or industrial use can be obtained by using a plant into which the above LRR-RLP gene has been introduced or whose expression control region of the LRR-RLP gene is modified. Or biodiesel fuel etc. can be manufactured at low cost.
  • Example 1 Materials and methods 1-1. Experimental Materials The seeds of Arabidopsis mutants (Activation-tag T-DNA lines: Weigel T-DNS lines, total 20072 lines) were used as experimental materials. The seeds were purchased from Nottingham Arabidopsis Stock Center (NASC). For seeds used as experimental materials, Weigel, D., et al., Plant Physiol., 122, 1003-1013 (2000) can be referred to.
  • NSC Nottingham Arabidopsis Stock Center
  • T-DNA insertion site into the genome of the selected salt-tolerant Arabidopsis thaliana strain was determined by the TAIL-PCR method. First, young leaves were collected from cultivated Arabidopsis thaliana and ground under liquid nitrogen freezing. DNA was prepared using a DNA preparation kit (DNeasy Plant Mini Kit) manufactured by QIAGEN according to the standard protocol attached to the kit.
  • Three kinds of specific primers TL1, TL2 and TL3 are set in the vicinity.
  • TAIL-PCR (supervised by Isao Shimamoto, Takuji Sasaki, new edition, plant PCR) using the optional primer P1 under the following PCR reaction solution and reaction conditions Experimental protocol, 2000, 83-89pp, Shujunsha, Tokyo, Genomics, 25, 674-681, 1995, Plant J., 8, 457-463, 1995) to amplify genomic DNA adjacent to T-DNA did.
  • primers TL1, TL2, TL3 and P1 are as follows.
  • TL1 5'-TGC TTT CGC CAT TAA ATA GCG ACG G-3 '(SEQ ID NO: 4)
  • TL2 5'-CGC TGC GGA CAT CTA CAT TTT TG-3 '(SEQ ID NO: 5)
  • TL3 5'-TCC CGG ACA TGA AGC CAT TTA C-3 '(SEQ ID NO: 6)
  • P1 5'-NGT CGA SWG ANA WGA A-3 '(SEQ ID NO: 7)
  • n represents a, g, c, or t (location: 1 and 11)
  • s represents g or c (location: 7)
  • w represents a or t is represented (location: 8 and 13).
  • the first PCR reaction solution composition and reaction conditions are shown in Table 1 and Table 2, respectively.
  • Tables 5 and 6 show the composition and reaction conditions of the third PCR reaction solution, respectively.
  • the amplification product of the third round was directly sequenced with BigDyeDTerminator Cycle Sequencing Kit Ver.3.1 (Applied Biosystems) using the specific primer TL3, and ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) ) To determine the nucleotide sequence.
  • TAIR The Arabidopsis Information Resource
  • AGI The abArabidopsis Genome Initiative gene code
  • AGI The Arabidopsis Genome Initiative gene code
  • At1g70000 the gene of Arabidopsis chromosome 5 [AGI (The Arabidopsis Genome code) : At5g39400]
  • Arabidopsis chromosome 3 gene Arabidopsis chromosome 3 gene
  • Arabidopsis chromosome 2 gene Arabidopsis Genome Initiative gene code
  • LRR-RLK leucine-rich repeat receptor-like protein kinase gene
  • a pair of primers was designed and synthesized based on the sequence information disclosed in TAIR (http://www.arabidopsis.org/home.html) (Table 7). The pair of primers was designed to add a restriction enzyme site necessary for introduction into an expression vector (Table 7).
  • Template DNA was prepared from wild-type Arabidopsis thaliana, Col-0 ecotype, according to the method described. Takara Ex Taq (manufactured by Takara Bio Inc.), Platinum Pfx DNA Polymerase (manufactured by Invitrogen) or Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (NEW ENGLAND BioLabs: NEB Corp.), and a pair of primers shown in Table 7 as primers Using. The PCR reaction solution composition and reaction conditions followed the protocol attached to each enzyme. Each PCR amplification product was electrophoresed on a 2% agarose gel (TAE buffer), and the fragment was stained with ethidium bromide.
  • TAE buffer 2% agarose gel
  • the gel containing the target fragment was excised with a scalpel, and the target DNA fragment was eluted and purified using GFX PCR DNA and GEL Purification Kit (Amersham). Adenine was added to the obtained DNA fragment using A-Addition Kit (manufactured by QIAGEN). Amplified DNA added with adenine was ligated to the pCR2.1 vector for TA-Cloning using TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen) and transformed into competent cells (E. coli TOP 10) attached to the kit. . After transformation, the cells were cultured in LB medium supplemented with 50 ⁇ l / ml kanamycin, and transformants were selected. The emerged colonies were liquid-cultured in LB medium supplemented with 50 ⁇ l / ml kanamycin, and plasmid DNA was prepared from the obtained cells using Plasmid Mini Mini Kit manufactured by QIAGEN®.
  • Vector obtained by cloning an ORF fragment of the obtained LRR-RLK gene (AT1G69990), a vector obtained by cloning an ORF fragment of the LRR-RLK gene (AT5G39390), an LRR (fragment containing an ORF of a protein gene (AT3G05650)
  • the cloned vector, the vector in which the ORF fragment of the LRR protein gene (AT2G33080) was cloned, and the vector in which the ORF fragment of the LRR protein gene (AT3G05660) was cloned were subjected to nucleotide sequencing and sequence analysis, respectively.
  • LBI-RLK gene (AT1G69990), LRR-RLK gene (AT5G39390), LRR protein gene (AT3G05650), LRR protein gene (AT2G33080) were added to the plant expression vector pBI121 containing an omega sequence derived from tobacco mosaic virus. ), A construct into which a fragment containing the ORF of the protein gene (AT3G05660) was inserted was prepared.
  • pBI121 containing the omega sequence was similarly treated with restriction enzymes SalSI and BsrG I. These restriction enzyme digests were subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis, and fragments of about 1850 bp LRR-RLK gene (AT1G69990) ORF sequence and omega sequence using GFX PCR DNA GEL Band Purification Kit (Amersham) PBI121 containing was fractionated and purified.
  • the mixture was mixed at a vector: insert ratio of 1:10, and equal amounts of TaKaRa Ligation Kit ver.
  • the ligation reaction was performed overnight at 16 ° C. using 2 (Takara Bio Inc.).
  • the total amount of the reaction solution was added to 100 ⁇ l of competent cells (E. coli strain DH5 ⁇ , TOYOBO), and transformation was performed according to the protocol attached to the kit. Apply to LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin and culture overnight. Appearance colonies are liquid-cultured in LB medium supplemented with 50 ⁇ g / ml kanamycin. From the obtained cells, Plasmid Mini Kit (manufactured by QIAGEN) ) was used to prepare plasmid DNA.
  • Plasmid Mini Kit manufactured by QIAGEN
  • the primers used were incorporated into an expression vector according to the method described above except that the primers listed in Table 7 were used. Analysis was performed.
  • the LRR protein gene (AT3G05650) is cloned into the TA-Cloning pCR2.1 vector, treated with the restriction enzyme EcoRI, blunt-ended using DNA Blunting Kit (Takara Bio), treated with phenolchloroform, and restricted. Treated with enzyme BsrG I.
  • pBI121 containing the omega sequence was treated with restriction enzyme SalSI, blunt-ended using DNA Blunting Kit (manufactured by Takara Bio Inc.), treated with phenol chloroform, and then treated with restriction enzyme BsrG I.
  • the DNA was incorporated into an expression vector according to the method described above, and nucleotide sequence determination and sequence analysis were performed.
  • the protein gene (AT3G05660) was treated with the restriction enzyme Not I, then blunt-ended using DNA Blunting Kit (Takara Bio Inc.), treated with phenol chloroform, and then treated with the restriction enzyme Sal I.
  • pBI121 containing the omega sequence was treated with the restriction enzyme BsrG I, then blunt-ended using DNA Blunting Kit (manufactured by Takara Bio Inc.), treated with phenol chloroform, and then treated with the restriction enzyme Sal I.
  • the DNA was incorporated into an expression vector according to the method described above, and nucleotide sequence determination and sequence analysis were performed.
  • a transformant was selected with a kanamycin-containing medium, and a T2 generation plant was produced by self-pollination.
  • FIG. 3 shows a photograph of the above-ground part of a transformed plant into which a wild-type and protein gene (AT3G05660) ORF-containing fragment was introduced as a result of the measurement of the biomass amount.
  • FIG. 4 shows the results of measuring the total biomass amount of the above-ground parts of the transformed plant, the transformed plant introduced with the LRR protein gene (AT2G33080) and the transformed plant introduced with the protein gene (AT3G05660).

Abstract

　植物バイオマス量を大幅に増産する技術を提供する。 　ロイシンリッチリピート構造を有する受容体様タンパク質をコードするAT3G05660遺伝子若しくは当該遺伝子に機能的に等価な遺伝子を導入する、又は内在する当該遺伝子の発現制御領域を改変する。

Description

植物のバイオマス量を増産させる遺伝子及びその利用方法
　本発明は、所定の遺伝子を導入した、又は内在する当該遺伝子の発現制御領域を改変した植物体、及び所定の遺伝子を導入する又は内在する当該遺伝子の発現制御領域を改変することによるバイオマス量を増産する方法、バイオマス量が増産した植物体の製造方法に関する。
　バイオマス（biomass）とは、一般的には一定面積あたりに生息または存在する生物の総量を指し、特に植物を対象とした場合は、単位面積あたりの乾重量を意味する。バイオマスの単位は、質量又はエネルギー量で数値化する。バイオマスという表現は、「生物体量」、「生物量」も同義語であり、植物バイオマスの場合には「現存量（Standing crop）」の語が使われることもある。植物バイオマスは、大気中の二酸化炭素を太陽エネルギーを用いて固定して生成されるため、いわゆるカーボンニュートラルなエネルギーとして捕らえることができる。したがって、植物のバイオマスを増加させることは、地球環境保全、地球温暖化防止、温室効果ガス排出低減の効果がある。従って、植物バイオマスを増産させる技術は産業上の重要性が高い。
　一方、植物は、その一部の組織自体（種子、根、葉茎など）を目的として栽培されたり、油脂などの種々の物質生産を目的として栽培されたりする。例えば、植物が生産する油脂としては、大豆油、ごま油、オリーブ油、椰子油、米油、綿実油、ひまわり油、コーン油、べに花油、パーム油及び菜種油等が古来より知られており、家庭用途や工業用途に広く利用されている。また、植物が生産する油脂は、バイオディーゼル燃料やバイオプラスチックの原料としても使用され、石油代替エネルギーとして適用性が広がっている。
　特に、サトウキビなどのエネルギー作物は、バイオ燃料の原料となるため、植物自体の総量（植物バイオマス量）を増産させることが期待されている。このような状況において、植物バイオマス量を増産させるには、単位耕地面積あたりの生産性の向上が必要となる。ここで単位耕地面積あたりの栽培個体数が一定であると仮定すると、個体あたりのバイオマス量の向上が必要であることが判る。
　しかしながら、植物バイオマス量には、多数の遺伝子が関与すると考えられており（いわゆる量的形質の一種）、個別の遺伝子導入、遺伝子操作では植物バイオマス量を効果的に増産できないと考えられている。一方、多数の遺伝子を望ましい状態で植物に導入することは非常に困難であり、また、導入できたとしても望ましい形質が確実に獲得できるわけではないといった問題があった。
　植物バイオマスを増産させる技術としては、例えば特許文献１～７に開示されるような種々の遺伝子導入技術が知られていた。しかしながら、特許文献１～５に開示された技術では、植物体の種子や塊茎、根、葉等の部分的なバイオマス増産効果しか得られていない。また、特許文献６及び７に開示された技術では、窒素非限定生育条件下におけるバイオマス増産効果や開花時期を遅延させて生育期間を延長することによるバイオマス増産効果しか開示していない。すなわち、特許文献１～７には、通常の培養・生育条件を適用して植物全体のバイオマス増産効果を達成する技術は開示されていない。
特表２００１－５０５４１０号 特表２００１－５１９６５９号 特表２００７－５３００６３号 特開２００５－１３０７７０号 特表２０００－５１５０２０号 特表平９－５０３３８９号 特開２００５－５２１１４号
　そこで、上述したような実情に鑑み、通常の培養・生育条件下であっても植物全体のバイオマス量を大幅に向上させる新規な機能を有する遺伝子を探索し、植物バイオマス量を大幅に増産できる技術を提供することを目的とする。
　上述した目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、分子内にロイシンリッチリピート構造を有する受容体様タンパク質であって、特徴的なドメインを有するタンパク質をコードする遺伝子を導入する、又は内在する当該遺伝子の発現制御領域を改変することで、植物バイオマス量を大幅に向上できるといった新規知見を見いだし、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明に係る植物体は、ロイシンリッチリピート構造を有する受容体様タンパク質をコードするAT3G05660遺伝子若しくは当該遺伝子に機能的に等価な遺伝子を導入した、又は内在する当該遺伝子の発現制御領域を改変したものである。
　また、本発明に係るバイオマス量を増産させる方法は、ロイシンリッチリピート構造を有する受容体様タンパク質をコードするAT3G05660遺伝子若しくは当該遺伝子に機能的に等価な遺伝子を導入する、又は内在する当該遺伝子の発現制御領域を改変する方法である。
　さらに、本発明に係る植物体の製造方法は、ロイシンリッチリピート構造を有する受容体様タンパク質をコードするAT3G05660遺伝子若しくは当該遺伝子に機能的に等価な遺伝子を導入した、又は内在する当該遺伝子の発現制御領域を改変した形質転換植物を準備する工程と、前記形質転換植物の後代植物のバイオマス量を測定し、当該バイオマス量が有意に向上した系統を選抜する工程とを含む方法である。
　本発明において、上記遺伝子は、以下の（a）～（c）のいずれかのタンパク質をコードするものであることが好ましい。
（a）配列番号３に示すアミノ酸配列を含むタンパク質
（b）配列番号３に示すアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み、ロイシンリッチリピート構造を有する受容体様タンパク質
（c）配列番号２に示す塩基配列の相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされロイシンリッチリピート構造を有する受容体様タンパク質
　また、本発明において、上記機能的に等価な遺伝子は、シロイヌナズナ以外の生物由来であってロイシンリッチリピート構造を有する受容体様タンパク質をコードする遺伝子を挙げることができる。
　本発明において対象とする植物は、双子葉植物、例えばアブラナ科植物、アブラナ科植物の中でもシロイヌナズナやナタネを挙げることができる。一方、本発明において対象とする植物は、単子葉植物、例えばイネ科植物、イネ科植物の中でもイネやサトウキビを挙げることができる。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2008-288869号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
　本発明に係る植物体は、野生型と比較してバイオマス量が有意に向上したものとなる。また、本発明に係るバイオマス量を増産させる方法は、対象とする植物の野生型と比較して大幅にバイオマスを増産することができる。さらに、本発明に係る植物体の製造方法は、野生型と比較してバイオマス量が大幅に向上した植物体を製造することができる。したがって、本発明を適用することによって、例えば、植物自体を生産物としたときの生産性の向上を達成することで低コスト化を達成することができる。
AT3G05660及びAT3G05650がコードするアミノ酸配列について、CLUSTAL W (1.83) multiple sequence alignmentプログラムを用いてアラインメント解析した結果を示す特性図である。 AT3G05660、AT2G33080及びAT3G05650がコードするアミノ酸配列について、CLUSTAL W (1.83) multiple sequence alignmentプログラムを用いてアラインメント解析した結果を示す特性図である。 AT3G05660、AT2G33080及びAT3G05650がコードするアミノ酸配列について、CLUSTAL W (1.83) multiple sequence alignmentプログラムを用いてアラインメント解析した結果を示す特性図である。 野生型及びAT3G05660のORFを含む断片を導入した形質転換植物体の地上部を撮影した写真である。 野生型の植物体、LRR-RLKタンパク質遺伝子(AT1G69990)を導入した形質転換植物体、LRR-RLKタンパク質遺伝子(AT5G39390)を導入した形質転換植物体、LRRタンパク質遺伝子(AT3G05650)を導入した形質転換植物体、LRRタンパク質遺伝子(AT2G33080)を導入した形質転換植物体及びタンパク質遺伝子(AT3G05660)を導入した形質転換植物体について、それぞれ地上部の全バイオマス量を測定した結果を示す特性図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明に係る植物体は、ロイシンリッチリピート構造を有する受容体様タンパク質（以下、LRR-RLPと略称する）をコードするAT3G05660遺伝子若しくは当該遺伝子に機能的に等価な遺伝子を植物体内に導入したもの、又は内在する当該遺伝子の発現制御領域を改変したものであり、野生型と比較してバイオマス量が有意に向上したものである。対象とする遺伝子を外来的に植物体内に導入するか、内在する遺伝子の発現制御領域を改変することによって、対象とする遺伝子の発現量を野生型における発現量と比較して有意に大とすることができる。本発明に係る植物体としては、上記LRR-RLP遺伝子を植物組織の全体に亘って発現させたものであっても良いが、植物組織の少なくとも一部において発現させたものであっても良い。ここで植物組織とは、葉、茎、種子、根及び花等の植物器官を含む意味である。
　また、発現制御領域とは、RNAポリメラーゼが結合するプロモーター領域及びその他の転写因子が結合する領域を含む意味である。転写制御領域の改変としては、内在する転写制御領域のうち例えばプロモーター領域を、より高発現が可能なプロモーター領域に置換することが好ましい。
LRR-RLP遺伝子
　本発明においてLRR-RLP遺伝子は、AT3G05660遺伝子若しくは当該遺伝子に機能的に等価な遺伝子である。なおLRR-RLPは、参考文献１（Plant Physiology, June 2003, Vol. 132, pp. 530-543）に記載されるように、受容体様キナーゼ（RLK）・シグナルに関与しており、RLKの細胞外ドメインに類似するタンパク質である。このAT3G05660遺伝子によりコードされるLRR-RLPは、配列番号１に示すアミノ酸配列からなる特徴的なドメインを有している。すなわち、AT3G05660遺伝子によりコードされるLRR-RLPに対する相同性が高いLRR-RLP（AT2G33080及びAT3G05650）と、AT3G05660とをアミノ酸配列のレベルで比較すると、配列番号１に示すアミノ酸配列がAT3G05660において特異的であることが理解される。
　AT3G05660及びAT3G05650についてCLUSTAL W (1.83) multiple sequence alignmentプログラム（国立遺伝学研究所のDDBJで使用できる（http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html））を用いてアラインメント解析した結果を図１に示す。また、AT3G05660、AT2G33080及びAT3G05650について同様にアライメント解析した結果を図２に示す。
　図１及び２に示すように、配列番号１に示すアミノ酸配列（図中、領域Aと表記）は、AT2G33080及びAT3G05650とAT3G05660とを区別することができる特異的なドメインであることが判る。配列番号１に示すアミノ酸配列からなるドメインを有するAT3G05660については、後述する実施例においてバイオマスを有意に向上させる効果を有することが明らかとなっている。AT3G05660遺伝子におけるコーディング領域の塩基配列を配列番号２に示し、AT3G05660遺伝子によりコードされるLRR-RLPのアミノ酸配列を配列番号３に示す。
　また、本発明においては、AT3G05660遺伝子と機能的に等価な遺伝子を植物体内に導入しても良い。ここで機能的に等価な遺伝子とは、例えばシロイヌナズナ以外の生物由来であって、LRR-RLPをコードするAT3G05660遺伝子に相当する遺伝子の意味である。
　上記シロイヌナズナ以外の生物に由来するAT3G05660遺伝子と機能的に等価な遺伝子は、特に限定されず、種々の生物に関する遺伝子配列を格納したデータベースを検索することで特定することができる。すなわち、配列番号２に示した塩基配列又は配列番号３に示した塩基配列をクエリー配列として、例えばDDBJ/EMBL/GenBank国際塩基配列データベースやSWISS-PROTデータベースを検索し、公知のデータベースから容易に検索・同定することができる。
　なお、本発明においてLRR-RLP遺伝子としては、上述したような配列番号で特定される塩基配列及びアミノ酸配列からなるLRR-RLP遺伝子に限定されるものではない。すなわち、LRR-RLP遺伝子としては、上述したような配列番号で特定されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸配列が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み、且つ、LRR-RLPとして機能する活性を有するものであっても良い。ここで、複数個のアミノ酸としては、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１個から５個、特に好ましくは１個から３個を意味する。なお、アミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、上記LRR-RLP遺伝子をコードする塩基配列を、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。塩基配列に変異を導入するには、Kunkel法またはGapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-KやMutant-G（何れも商品名、TAKARA Bio社製））等を用いて、あるいはLA PCR in vitro Mutagenesisシリーズキット（商品名、TAKARA Bio社製）を用いて変異が導入される。また、変異導入方法としては、EMS（エチルメタンスルホン酸）、5-ブロモウラシル、2-アミノプリン、ヒドロキシルアミン、N-メチル-N’-ニトロ-Nニトロソグアニジン、その他の発ガン性化合物に代表されるような化学的変異剤を使用する方法でも良いし、X線、アルファ線、ベータ線、ガンマ線、イオンビームに代表されるような放射線処理や紫外線処理による方法でも良い。
　また、LRR-RLP遺伝子としては、上述したような配列番号で特定される塩基配列及びアミノ酸配列からなるLRR-RLP遺伝子の相同遺伝子であってもよい。ここで、相同遺伝子とは、一般的に、共通の祖先遺伝子から進化分岐した遺伝子を意味しており、２種類の種の相同遺伝子（オルソログ（ortholog)）及び同一種内で重複分岐により生じた相同遺伝子（パラログ(paralog)）を含む意味である。換言すると、上述した「機能的に等価な遺伝子」にはオルソログやパラログといった相同遺伝子を含む意味である。但し、上述した「機能的に等価な遺伝子」には、共通遺伝子から進化せず、単に類似した機能を有する遺伝子も含まれている。
　上述したような配列番号で特定される塩基配列及びアミノ酸配列からなるLRR-RLP遺伝子に類似する遺伝子としては、これらアミノ酸配列に対する類似度(Similarity)が例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上であるアミノ酸配列を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなる共通配列を有するLRR-RLP活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を挙げることができる。ここで、類似度の値は、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）プログラムを実装したコンピュータプログラム及び遺伝子配列情報を格納したデータベースを用いてデフォルトの設定で求められる値を意味する。
　また、上述したような配列番号で特定される塩基配列及びアミノ酸配列からなるLRR-RLP遺伝子に類似する遺伝子は、植物ゲノム情報が明らかとなっていない場合には、対象となる植物からゲノムを抽出するか或いは対象となる植物のcDNAライブラリーを構築し、上述したような配列番号で特定される塩基配列及びアミノ酸配列からなるLRR-RLP遺伝子の少なくとも一部に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするゲノム領域或いはcDNAを単離することで同定することができる。ここで、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、45℃、6×SSC（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）でのハイブリダイゼーション、その後の50～65℃、0.2～1×SSC、0.1％SDSでの洗浄が挙げられ、或いはそのような条件として、65～70℃、1×SSCでのハイブリダイゼーション、その後の65～70℃、0.3×SSCでの洗浄を挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory(1989)に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。
　本発明に係る植物体は、AT3G05660遺伝子若しくは当該遺伝子に機能的に等価な遺伝子を植物体内に導入するか、内在する当該遺伝子の発現制御領域を改変することによって、バイオマス量が野生型と比較して有意に向上したものとなる。このLRR-RLP遺伝子を植物体内に導入する手法としては、植物体内で発現を可能とするプロモーターの制御下に外因性のLRR-RLP遺伝子を配置した発現ベクターを導入する手法をあげることができる。内在する当該遺伝子の発現制御領域を改変する手法としては、対象とする植物体における内在性のLRR-RLP遺伝子のプロモーターを改変する手法を挙げることができる。
　一例としては、植物体内で発現を可能とするプロモーターの制御下に上述したLRR-RLP遺伝子を配置した発現ベクターを対象の植物体に導入する手法が好ましい。
発現ベクター
　発現ベクターは、植物体内で発現を可能とするプロモーターと、上述したLRR-RLP遺伝子とを含むように構築する。発現ベクターの母体となるベクターとしては、従来公知の種々のベクターを用いることができる。例えば、プラスミド、ファージ、またはコスミド等を用いることができ、導入される植物細胞や導入方法に応じて適宜選択することができる。具体的には、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、pBluescript、pBluescriptSK、ｐＢＩ系のベクター等を挙げることができる。特に、植物体へのベクターの導入法がアグロバクテリウムを用いる方法である場合には、ｐＢＩ系のバイナリーベクターを用いることが好ましい。ｐＢＩ系のバイナリーベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＢＩＧ、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ２２１等を挙げることができる。
　プロモーターは、植物体内でLRR-RLP遺伝子を発現させることが可能なプロモーターであれば特に限定されるものではなく、公知のプロモーターを好適に用いることができる。かかるプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ）、各種アクチン遺伝子プロモーター、各種ユビキチン遺伝子プロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター、タバコのＰＲ１ａ遺伝子プロモーター、トマトのリブロース１，５－二リン酸カルボキシラーゼ・オキシダーゼ小サブユニット遺伝子プロモーター、ナピン遺伝子プロモーター、オレオシン遺伝子プロモーター等を挙げることができる。この中でも、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、アクチン遺伝子プロモーター又はユビキチン遺伝子プロモーターをより好ましく用いることができる。上記各プロモーターを用いれば、植物細胞内に導入されたときに任意の遺伝子を強く発現させることが可能となる。
　また、プロモーターとしては、植物における部位特異的に発現させる機能を有するものを使用することもできる。このようなプロモーターとしては、従来公知の如何なるプロモーターを使用することができる。このようなプロモーターを使用して、上記LRR-RLP遺伝子を部位特異的に発現させることによって、発現した植物器官を野生型と比較して増大させることができる。
　なお、発現ベクターは、プロモーター及び上記LRR-RLP遺伝子に加えて、さらに他のＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。当該他のＤＮＡセグメントは特に限定されるものではないが、ターミネーター、選別マーカー、エンハンサー、翻訳効率を高めるための塩基配列等を挙げることができる。また、上記組換え発現ベクターは、さらにＴ－ＤＮＡ領域を有していてもよい。Ｔ－ＤＮＡ領域は特にアグロバクテリウムを用いて上記組換え発現ベクターを植物体に導入する場合に遺伝子導入の効率を高めることができる。
　転写ターミネーターは転写終結部位としての機能を有していれば特に限定されるものではなく、公知のものであってもよい。例えば、具体的には、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終結領域（Ｎｏｓターミネーター）、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓの転写終結領域（ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター）等を好ましく用いることができる。この中でもＮｏｓターミネーターをより好ましく用いることできる。上記組換えベクターにおいては、転写ターミネーターを適当な位置に配置することにより、植物細胞に導入された後に、不必要に長い転写物を合成し、強力なプロモーターがプラスミドのコピー数を減少させるといった現象の発生を防止することができる。
　形質転換体選別マーカーとしては、例えば薬剤耐性遺伝子を用いることができる。かかる薬剤耐性遺伝子の具体的な一例としては、例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール等に対する薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。これにより、上記抗生物質を含む培地中で生育する植物体を選択することによって、形質転換された植物体を容易に選別することができる。
　翻訳効率を高めるための塩基配列としては、例えばタバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列を挙げることができる。このｏｍｅｇａ配列をプロモーターの非翻訳領域（５’ＵＴＲ）に配置させることによって、上記融合遺伝子の翻訳効率を高めることができる。このように、上記組換え発現ベクターには、その目的に応じて、さまざまなＤＮＡセグメントを含ませることができる。
　組換え発現ベクターの構築方法についても特に限定されるものではなく、適宜選択された母体となるベクターに、上記プロモーター、上記LRR-RLP遺伝子、および転写抑制転換ポリヌクレオチド、並びに必要に応じて上記他のＤＮＡセグメントを所定の順序となるように導入すればよい。例えば、上記LRR-RLP遺伝子とプロモーターと（必要に応じて転写ターミネーター等）とを連結して発現カセットを構築し、これをベクターに導入すればよい。発現カセットの構築では、例えば、各ＤＮＡセグメントの切断部位を互いに相補的な突出末端としておき、ライゲーション酵素で反応させることで、当該ＤＮＡセグメントの順序を規定することが可能となる。なお、発現カセットにターミネーターが含まれる場合には、上流から、プロモーター、上記LRR-RLP遺伝子、ターミネーターの順となっていればよい。また、発現ベクターを構築するための試薬類、すなわち制限酵素やライゲーション酵素等の種類についても特に限定されるものではなく、市販のものを適宜選択して用いればよい。
　また、上記発現ベクターの増殖方法（生産方法）も特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。一般的には大腸菌をホストとして当該大腸菌内で増殖させればよい。このとき、ベクターの種類に応じて、好ましい大腸菌の種類を選択してもよい。
形質転換
　上述した発現ベクターは、一般的な形質転換方法によって対象の植物内に導入される。発現ベクターを植物細胞に導入する方法（形質転換方法）は特に限定されるものではなく、植物細胞に応じた適切な従来公知の方法を用いることができる。具体的には、例えば、アグロバクテリウムを用いる方法や直接植物細胞に導入する方法を用いることができる。アグロバクテリウムを用いる方法としては、例えば、Bechtold, E., Ellis, J. and Pelletier, G. (1993) In Planta　Agrobacterium-mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis plants. C.R. Acad. Sci. Paris Sci. Vie, 316, 1194-1199. あるいは、Zyprian E, Kado Cl, Agrobacterium-mediated plant transformation by novel mini-T vectors in conjunction with a high-copy vir region helper plasmid. Plant Molecular Biology, 1990, 15(2), 245-256.に記載された方法を用いることができる。
　発現ベクターを直接植物細胞に導入する方法としては、例えば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、ポリエチレングリコール法、パーティクルガン法、プロトプラスト融合法、リン酸カルシウム法等を用いることができる。
　また、DNAを直接植物細胞に導入する方法を採るなら、対象とする遺伝子の発現に必要な転写ユニット、例えプロモーターや転写ターミネーターと、対象とする遺伝子を含んだDNAあれば十分であり、ベクター機能が必須ではない。さらに、転写ユニットを有さない対象とする遺伝子のタンパク質コード領域のみを含むDNAであっても、宿主の転写ユニット無いにインテグレートし、対象となる遺伝子を発現することができればよい。
　上記発現ベクターや、発現ベクターを含まず対象となる遺伝子を含んだ発現カセットが導入される植物細胞としては、例えば、花、葉、根等の植物器官における各組織の細胞、カルス、懸濁培養細胞等を挙げることができる。ここで、発現ベクターは、生産しようとする種類の植物体に合わせて適切なものを適宜構築してもよいが、汎用的な発現ベクターを予め構築しておき、それを植物細胞に導入してもよい。
　発現ベクターの導入対象となる植物、換言するとバイオマス増産対象の植物としては、特に限定されない。すなわち、上述したLRR-RLP遺伝子を発現させることによって、あらゆる植物体についてバイオマス増産効果を期待することができる。対象となる植物としては、例えば、双子葉植物、単子葉植物、例えばアブラナ科、イネ科、ナス科、マメ科、ヤナギ科等に属する植物（下記参照）が挙げられるが、これらの植物に限定されるものではない。
アブラナ科：シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、アブラナ（Brassica rapa、Brassica napus）、キャベツ(Brassica oleracea var. capitata)、ナタネ（Brassica rapa、Brassica napus）、ナノハナ（Brassica rapa、Brassica napus）、ハクサイ（Brassica rapa var. pekinensis）、チンゲンサイ（Brassica rapa var. chinensis）、カブ（Brassica rapa var. rapa）、ノザワナ（Brassica rapa var. hakabura）、ミズナ（Brassica rapa var. lancinifolia）、コマツナ（Brassica rapa var. peruviridis）、パクチョイ（Brassica rapa var. chinensis）、ダイコン（Brassica Raphanus sativus）、ワサビ（Wasabia japonica）など。
ナス科：タバコ（Nicotiana tabacum）、ナス(Solanum melongena)、ジャガイモ（Solaneum tuberosum）、トマト（Lycopersicon lycopersicum）、トウガラシ（Capsicum annuum）、ペチュニア（Petunia）など。
マメ科：ダイズ(Glycine max)、エンドウ（Pisum sativum）、ソラマメ（Vicia faba）、フジ（Wisteria floribunda）、ラッカセイ（Arachis. hypogaea）、ミヤコグサ（Lotus corniculatus var. japonicus）、インゲンマメ（Phaseolus vulgaris）、アズキ（Vigna angularis）、アカシア（Acacia）.など。
キク科：キク（Chrysanthemum morifolium）、ヒマワリ（Helianthus annuus）など。
ヤシ科：アブラヤシ（Elaeis guineensis、Elaeis oleifera）、ココヤシ（Cocos nucifera）、ナツメヤシ（Phoenix dactylifera）、ロウヤシ（Copernicia）
ウルシ科：ハゼノキ（Rhus succedanea）、カシューナットノキ（Anacardium occidentale）、ウルシ（Toxicodendron vernicifluum）、マンゴー（Mangifera indica）、ピスタチオ（Pistacia vera）
ウリ科：カボチャ（Cucurbita maxima、Cucurbita moschata、Cucurbita pepo）、キュウリ（Cucumis sativus）、カラスウリ（Trichosanthes cucumeroides）、ヒョウタン（Lagenaria siceraria var. gourda）
バラ科：アーモンド（Amygdalus communis）、バラ（Rosa）、イチゴ（Fragaria）、サクラ（Prunus）、リンゴ（Malus pumila var. domestica）など。
ナデシコ科：カーネーション（Dianthus caryophyllus）など。
ヤナギ科：ポプラ(Populus trichocarpa、Populus nigra、Populus tremula)
イネ科：トウモロコシ(Zea mays)、イネ(Oryza sativa)、オオムギ（Hordeum vulgare）、コムギ（Triticum aestivum）、タケ（Phyllostachys）、サトウキビ（Saccharum officinarum）、ネピアグラス（Pennisetum pupureum）、エリアンサス（Erianthus ravenae）、ミスキャンタス（ススキ）（Miscanthus virgatum）、ソルガム（Sorghum）スイッチグラス（Panicum）など。
ユリ科：チューリップ（Tulipa）、ユリ（Lilium）など。
　なかでも、サトウキビやトウモロコシ、ナタネ、ひまわり等のバイオ燃料の原料となりうるエネルギー作物を対象とすることが好ましい。エネルギー作物のバイオマスを増産することによって、バイオエタノール、バイオディーゼル、バイオメタノール、バイオDME、バイオGTL(BTL)及びバイオブタノール等のバイオ燃料の低コスト化を実現できるからである。
　また、上述したように、本発明で使用可能なLRR-RLP遺伝子は、種々の植物から単離して使用することができるが、バイオマス増産対象の植物の種類に応じて、適宜選択して用いることができる。すなわち、バイオマス増産対象の植物が単子葉植物である場合には、LRR-RLP遺伝子として単子葉植物から単離したものを発現させることが好ましい。
　なお、本発明においては、バイオマス増産対象の植物が単子葉植物であったとしても、双子葉植物由来のLRR-RLP遺伝子を導入しても良い。すなわち、例えば、シロイヌナズナ由来のLRR-RLP遺伝子（配列番号２）は、双子葉植物に限らず、広く単子葉植物に分類される植物に発現するように導入されてもよい。
その他の工程、その他の方法
　上述した形質転換処理後、植物体のなかから適切な形質転換体を選抜する選抜工程を、従来公知の方法で行うことができる。選抜の方法は特に限定されるものではなく、例えば、ハイグロマイシン耐性等の薬剤耐性を基準として選抜してもよいし、形質転換体を育成した後に、植物体そのもの、または任意の器官や組織の重量を測定して野生型と比較して有意に増産しているものを選抜してもよい。
　また、形質転換処理で得られた形質転換植物から定法に従って後代植物を得ることができる。上記LRR-RLP遺伝子が導入された形質又は内在する当該LRR-RLP遺伝子の発現制御領域が改変された形質を保持した後代植物を、そのバイオマス量を基準として選抜することによって、上記形質を有することでバイオマス量が増産された安定的な植物系統を作出することができる。なお、形質転換植物やその子孫から、植物細胞や種子、果実、株、カルス、塊茎、切穂、塊等の繁殖材料を得て、これらを基に上記形質を有することでバイオマス量が増産された安定的な植物系統を量産することも可能である。
　なお、本発明における植物体とは、成育した植物個体、植物細胞、植物組織、カルス、種子の少なくとも何れかが含まれる。つまり、本発明では、最終的に植物個体まで成育させることができる状態のものであれば、全て植物体とみなす。また、上記植物細胞には、種々の形態の植物細胞が含まれる。かかる植物細胞としては、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片等が含まれる。これらの植物細胞を増殖・分化させることにより植物体を得ることができる。なお、植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて、従来公知の方法を用いて行うことができる。
　以上説明したように、本発明によれば、上述した特定のドメインを有するLRR-RLP遺伝子を植物体内に導入する、又は内在する当該LRR-RLP遺伝子の発現制御領域を改変することで、野生型の植物体と比較して、個体あたりのバイオマス量が有意に増産した植物体を提供することができる。ここで、バイオマス量が有意に増産するとは、野生型と比較して一個体あたりの総重量が統計的に有意に大となっていることを意味する。このとき、植物体の一部の組織が特異的に大となり、他の組織が野生型と同等であったとしても、植物体全体についての総重量が大であればバイオマス量が増産したと判断する。
　本発明によれば、植物体のバイオマス量が増産するため、植物体全体を生産目的とした場合及び植物体の一部の組織（例えば種子など）やその含有成分を生産目的とした場合のいずれにおいても生産性の向上を達成することができる。例えば、植物種子に含まれる油脂を生産目的とした場合、作付け面積あたりで回収できる油脂量を大幅に向上させることができる。ここで油脂としては、特に限定されず、例えば、大豆油、ごま油、オリーブ油、椰子油、米油、綿実油、ひまわり油、コーン油、べに花油及び菜種油等の植物由来の油脂を例示することができる。また、製造した油脂は、家庭用途や工業用途に広く利用することができ、更にはバイオディーゼル燃料の原料としても使用することができる。すなわち、本発明によれば上記LRR-RLP遺伝子が導入された、又は内在する当該LRR-RLP遺伝子の発現制御領域が改変された植物体を利用することによって、上述した家庭用途又は工業用途の油脂や、バイオディーゼル燃料等を低コストに製造することができる。
　以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
1．材料および方法
1－1．実験材料
　実験材料にはシロイヌナズナ変異体（Activation-tag T-DNA lines: Weigel T-DNS lines、計20072系統）の種子を用いた。なお、種子はNottingham Arabidopsis Stock Centre(NASC) より購入した。実験材料として使用した種子についてはWeigel, D., et al., Plant Physiol., 122, 1003-1013 (2000)を参考とすることができる。
1－2．方法
1－2－1．塩耐性変異体の選抜
　Weigel T-DNA linesの種子を、NaCl 125 mMあるいは150 mMを含む改変MS寒天（1%）培地〔B5培地のビタミン、ショ糖10 g/l、寒天（細菌培地用；和光純薬工業社製）8 g/L〕に無菌播種し、22℃、30～100μmol/m2/secの照明下（16時間明期/8時間暗期のサイクル）で培養した。播種後2～4週間後、塩耐性変異体候補を選抜した。なお、MS培地はMurashige, T. et al. (1962)　Physiol. Plant., 15, 473-497を参照する。また、B5培地についてはGamborg, O.L. et al. (1968)　Experimental Cell Research, 50, 151-158を参照する。
1－2－2．DNA調製
　選抜した耐塩性シロイヌナズナ系統のゲノムへのT-DNA挿入部位を、TAIL-PCR法により決定した。まず、栽培したシロイヌナズナから幼葉を採取し、液体窒素凍結下で粉砕した。QIAGEN社製DNA調製キット（DNeasy Plant Mini Kit）を用いてキット添付の標準プロトコルに従ってDNAを調製した。
1－2－3．TAIL-PCR法及びT-DNA挿入部位の推定
　Weigel T-DNA linesで用いられているアクティベーションタギング用ベクター（pSKI015 : GenBank accession No.AF187951）の左のT-DNA配列（T-DNA left border）付近に3種類の特異的プライマーTL1、TL2及びTL3を設定し、任意プライマーP1を用いて、以下のPCR反応液及び反応条件下でTAIL-PCR（島本功、佐々木卓治監修, 新版, 植物のPCR実験プロトコル, 2000, 83-89pp, 秀潤社, 東京、 Genomics, 25, 674-681, 1995、 Plant J., 8, 457-463, 1995）を行い、T-DNAに隣接するゲノムDNAを増幅した。
　プライマーTL1、TL2、TL3及びP1の具体的な配列は以下の通りである。
　　　TL1: 5'-TGC TTT CGC CAT TAA ATA GCG ACG G-3‘（配列番号４）
　　　TL2: 5'-CGC TGC GGA CAT CTA CAT TTT TG-3‘（配列番号５）
　　　TL3: 5'-TCC CGG ACA TGA AGC CAT TTA C-3'（配列番号６）
　　　P1: 5'-NGT CGA SWG ANA WGA A-3‘（配列番号７）
　なお、配列番号７において、nは、a、g、c又はtを表し(存在位置：1及び11)、またsは、g又はcを表し(存在位置：7)、さらにwは、a又はtを表す(存在位置：8及び13)。
　１回目のPCR反応液組成及び反応条件をそれぞれ表１及び表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　２回目のPCR反応液組成及び反応条件をそれぞれ表３及び表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　３回目のPCR反応液組成及び反応条件をそれぞれ表５及び表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　次いで、2回目と3回目の反応産物をアガロースゲルで電気泳動した後、増幅の有無と反応産物の特異性を確認した。また、3回目の増幅産物は、特異的プライマーTL3を用いて、直接BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit Ver.3.1（アプライドバイオシステム社製）でシーケンス反応を行い、ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer（アプライドバイオシステム社製）によって塩基配列の決定を行った。
　その結果、５種類の塩基配列を決定した。すなわち、538bpの配列情報、311bpの配列情報、498bpの配列情報及び633bpの配列情報が得られた。得られた配列情報を、順に配列番号８～１１に示した。
　これら得られた配列情報を用いて、The Arabidopsis Information Resource（TAIR：http://www.arabidopsis.org/）のBLASTにより検索したところ、T-DNA挿入部位は、それぞれ順に、シロイヌナズナ１番染色体の遺伝子〔AGI（The Arabidopsis Genome Initiative gene code）コード：At1g69990〕と遺伝子〔AGI（The Arabidopsis Genome Initiative gene code）コード：At1g70000〕間、シロイヌナズナ5番染色体の遺伝子〔AGI（The Arabidopsis Genome Initiative gene code）コード：At5g39400〕、シロイヌナズナ3番染色体の遺伝子〔AGI（The Arabidopsis Genome Initiative gene code）コード：At3g05630〕及びシロイヌナズナ2番染色体の遺伝子〔AGI（The Arabidopsis Genome Initiative gene code）コード：At2g33110〕と判明した。
1－2－4．活性化されている遺伝子の予測
　アクティベートされている遺伝子を、1－2－3．により判明した各々のT-DNA挿入部位（At1g69990とAt1g70000間、At5g39400、At3g05630及びAt2g33110）近傍10Kb以内に存在する推定Open reading frame(ORF)遺伝子の配列から予測した。
1－2－5．予測した遺伝子を導入した変異体の作製
　1－2－4．でアクティベート（活性化）されていると予測した、LRR-RLK（leucine-rich repeat receptor-like protein kinase ）遺伝子 (AT1G69990)、LRR-RLK（leucine- rich repeat receptor-like protein kinase）遺伝子 (AT5G39390)、LRR（leucine-rich repeat）タンパク質遺伝子(AT3G05650)、 LRR（leucine-rich repeat）タンパク質遺伝子(AT2G33080) 及びLRR（leucine-rich repeat）タンパク質遺伝子(AT3G05660) ORF領域を含む断片を増幅するために、TAIR（http://www.arabidopsis.org/home.html）で公開されている配列情報を基にしてそれぞれ一対のプライマーを設計・合成した（表７）。なお、これら一対のプライマーには、発現ベクターへ導入するときに必要となる制限酵素サイトを付加するように設計した（表７）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　1－2－2．記載の方法に従って、野生型シロイヌナズナ、Col-0エコタイプから鋳型DNAを調製した。酵素としてTakara Ex Taq（タカラバイオ社製）、Platinum Pfx DNA Polymerase（Invitrogen社製）又はPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（NEW ENGLAND BioLabs：NEB社製）、プライマーとして、表７に示した一対のプライマーを用いた。PCRの反応液組成、および反応条件は、各酵素に添付のプロトコールに従った。各PCR増幅産物を2％アガロースゲル（TAEバッファー）で電気泳動し、エチジウムブロマイドにより断片を染色した。目的断片を含むゲルをメスで切り出し、 GFX PCR DNA and GEL Band Purification Kit （Amersham社製）を用いて目的のDNA断片を溶出・精製した。得られたDNA断片に、A-Ａddition Kit（QIAGEN社製）を用いてにアデニンを付加した。アデニンを付加した増幅DNAを、TOPO TA Cloning Kit（Invitrogen社製）を用いて、TA-Cloning用pCR2.1ベクターにライゲーション後、キット添付のコンピテントセル（E.coli　TOP 10）に形質転換した。形質転換後、50μl/mlのカナマイシンを添加したLB培地で培養し、形質転換体を選抜した。出現したコロニーを50μl/mlのカナマイシンを添加したLB培地で液体培養し、得られた菌体からQIAGEN 社製Plasmid Mini Kitを用いてプラスミドDNA を調製した。
　得られたLRR-RLK遺伝子 (AT1G69990)のORFを含む断片をクローニングしたベクター、LRR-RLK遺伝子 (AT5G39390)のORFを含む断片をクローニングしたベクター、LRR（タンパク質遺伝子(AT3G05650)のORFを含む断片をクローニングしたベクター、LRRタンパク質遺伝子(AT2G33080)のORFを含む断片をクローニングしたベクター及びLRRタンパク質遺伝子(AT3G05660)のORFを含む断片をクローニングしたベクターの塩基配列決定及び配列解析をそれぞれ行った。
1－2－6．植物発現用ベクターの作製
　タバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列を含む植物発現用ベクターpBI121に、LRR-RLK遺伝子 (AT1G69990)、LRR-RLK遺伝子 (AT5G39390)、LRRタンパク質遺伝子(AT3G05650)、LRRタンパク質遺伝子(AT2G33080)、タンパク質遺伝子(AT3G05660)のORFを含む断片を挿入したコンストラクトの作製を行った。
　まず、1－2－5．でLRR-RLK遺伝子 (AT1G69990)のORFを含む断片をクローニングしたpCR2.1ベクターを、制限酵素Sal I及びBsrG Iで処理した。
　次に、同様にｏｍｅｇａ配列を含むpBI121を制限酵素Sal I及びBsrG Iで処理した。これら制限酵素消化産物について0.8％アガロースゲル電気泳動を行い、GFX PCR DNA and GEL Band Purification Kit（Amersham）を用いて、ゲルより約1850bpのLRR-RLK遺伝子 (AT1G69990)のORFを含む断片及びｏｍｅｇａ配列を含むpBI121を、それぞれ分取・精製した。
　ｏｍｅｇａ配列を含むpBI121の断片をベクターとしてLRR-RLK遺伝子 (AT1G69990)のORFを含む断片を導入するため、ベクター：インサート比が1：10になるように混合し、等量のTaKaRa Ligation Kit ver.2（タカラバイオ社製）を用いて16℃で一晩ライゲーション反応を行った。
　反応液の全量を100μlのコンピテントセル（E.coli strain DH5α，TOYOBO）に添加し、キット添付のプロトコルに従って形質転換を行った。50μg/mlのカナマイシンを含むLB寒天培地に塗布し一晩培養し、出現したコロニーを50μg/mlのカナマイシンを添加したLB培地で液体培養し、得られた菌体からPlasmid Mini Kit（QIAGEN社製）を用いてプラスミドDNAを調製した。
　得られたLRR-RLK遺伝子 (AT1G69990)のORFを含む断片をサブクローニングした発現ベクターの塩基配列決定および配列解析を行った。
　なお、LRR-RLK遺伝子 (AT5G39390)及びLRRタンパク質遺伝子(AT2G33080)については、使用したプライマーを表７に記載したものを使用した以外は上述した方法に準じて発現ベクターに組み込み、塩基配列決定及び配列解析を行った。LRRタンパク質遺伝子(AT3G05650)については、TA-Cloning用pCR2.1ベクターにクローニング後、制限酵素EcoRIで処理後、DNA Blunting Kit （タカラバイオ社製）を用いて平滑末端化し、フェノールクロロフォルム処理後、制限酵素BsrG Iで処理した。ｏｍｅｇａ配列を含むpBI121は制限酵素Sal Iで処理後、DNA Blunting Kit （タカラバイオ社製）を用いて平滑末端化し、フェノールクロロフォルム処理後、制限酵素BsrG Iで処理した。上述した方法に準じて発現ベクターに組み込み、塩基配列決定及び配列解析を行った。タンパク質遺伝子(AT3G05660)については、制限酵素Not Iで処理後、DNA Blunting Kit （タカラバイオ社製）を用いて平滑末端化し、フェノールクロロフォルム処理後、制限酵素Sal Iで処理した。ｏｍｅｇａ配列を含むpBI121は制限酵素BsrG Iで処理後、DNA Blunting Kit （タカラバイオ社製）を用いて平滑末端化し、フェノールクロロフォルム処理後、制限酵素Sal Iで処理した。上述した方法に準じて発現ベクターに組み込み、塩基配列決定及び配列解析を行った。
1－2－7．アグロバクテリウム法を用いたシロイヌナズナへの遺伝子導入
　1－2－6．で作製した各植物発現用ベクターをエレクトロポレーション法（Plant Molecular Biology Manual, Second Edition , B. G. Stanton A. S. Robbert, Kluwer Acdemic Publishers 1994）により、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）C58C1株に導入した。次いで植物発現用ベクターが導入されたアグロバクテリウム・ツメファシエンスを、Cloughらにより記載された浸潤法（The Plant Journal 16：735-743, 1998）により、野生型シロイヌナズナ エコタイプCol-0に導入した。
　カナマイシン含有培地で形質転換体を選抜し、自家受粉によりT2世代の植物を作製した。
1－2－8．形質転換体の表現形の確認
　バイオマス量測定：
　1－2－7．で作製した各T2種子を50mg/Lのカナマイシンと0.5％ショ糖を含むMS寒天培地に無菌播種し、2週間後バーミキュライト混合土を入れた直径50mmのポットに移植した。対象には、0.5％ショ糖を含むMS寒天培地に無菌播種した非組換えシロイヌナズナを移植した。これを23℃、8時間明期16時間暗期（短日条件）、光強度約160μE/cm2で栽培し、移植後合計6週間栽培した。栽培後、地上部の植物体を紙袋に入れ、22℃、湿度60%の条件で2週間乾燥させた後に、全バイオマス量を電子天秤で秤量した。
2．結果
　上記1－2－8．のバイオマス量測定の結果として、野生型及びタンパク質遺伝子(AT3G05660)のORFを含む断片を導入した形質転換植物体の地上部を撮影した写真を図３に示す。また、野生型の植物体、LRR-RLKタンパク質遺伝子(AT1G69990)を導入した形質転換植物体、LRR-RLKタンパク質遺伝子(AT5G39390)を導入した形質転換植物体、LRRタンパク質遺伝子(AT3G05650)を導入した形質転換植物体、LRRタンパク質遺伝子(AT2G33080)を導入した形質転換植物体及びタンパク質遺伝子(AT3G05660)を導入した形質転換植物体について、それぞれ地上部の全バイオマス量を測定した結果を図４に示す。
　図３及び図４から、タンパク質遺伝子(AT3G05660）のORFを含む断片を導入した形質転換植物体では、地上部の全バイオマス量が野生型と比較して大幅（約1.5倍）に向上していることが明らかとなった。一方、LRR-RLK遺伝子(AT1G69990)、LRR-RLK遺伝子(AT5G39390)、LRR（タンパク質遺伝子(AT3G05650)又はLRRタンパク質遺伝子(AT2G33080)を導入した形質転換植物体では、野生型の植物体とほぼ同等のバイオマス量であることが明らかとなった。
　以上の結果から、AT3G05660遺伝子を導入した植物体は、バイオマス量が大幅に向上したものとなることが明らかとなった。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (18)

  1. 　ロイシンリッチリピート構造を有する受容体様タンパク質をコードするAT3G05660遺伝子若しくは当該遺伝子に機能的に等価な遺伝子を導入した、又は内在する当該遺伝子の発現制御領域を改変した植物体。
  2. 　上記遺伝子は、以下の（a）～（c）のいずれかのタンパク質をコードすることを特徴とする請求項１記載の植物体。
    （a）配列番号３に示すアミノ酸配列を含むタンパク質
    （b）配列番号３に示すアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み、ロイシンリッチリピート構造を有する受容体様タンパク質
    （c）配列番号２に示す塩基配列の相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされロイシンリッチリピート構造を有する受容体様タンパク質
  3. 　上記機能的に等価な遺伝子は、シロイヌナズナ以外の生物由来であってロイシンリッチリピート構造を有する受容体様タンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項１記載の植物体。
  4. 　双子葉植物であることを特徴とする請求項１乃至３いずれか一項記載の植物体。
  5. 　アブラナ科植物であることを特徴とする請求項１乃至３いずれか一項記載の植物体。
  6. 　シロイヌナズナであることを特徴とする請求項１乃至３いずれか一項記載の植物体。
  7. 　ロイシンリッチリピート構造を有する受容体様タンパク質をコードするAT3G05660遺伝子若しくは当該遺伝子に機能的に等価な遺伝子を導入する、又は内在する当該遺伝子の発現制御領域を改変する、バイオマス量を増産させる方法。
  8. 　上記遺伝子は、以下の（a）～（c）のいずれかのタンパク質をコードすることを特徴とする請求項７記載の方法。
    （a）配列番号３に示すアミノ酸配列を含むタンパク質
    （b）配列番号３に示すアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み、ロイシンリッチリピート構造を有する受容体様タンパク質
    （c）配列番号２に示す塩基配列の相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされロイシンリッチリピート構造を有する受容体様タンパク質
  9. 　上記機能的に等価な遺伝子は、シロイヌナズナ以外の生物由来であってロイシンリッチリピート構造を有する受容体様タンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項７記載の方法。
  10. 　双子葉植物であることを特徴とする請求項７乃至９いずれか一項記載の方法。
  11. 　アブラナ科植物であることを特徴とする請求項７乃至９いずれか一項記載の方法。
  12. 　シロイヌナズナであることを特徴とする請求項７乃至９いずれか一項記載の方法。
  13. 　ロイシンリッチリピート構造を有する受容体様タンパク質をコードするAT3G05660遺伝子若しくは当該遺伝子に機能的に等価な遺伝子を導入した、又は内在する当該遺伝子の発現制御領域を改変した形質転換植物を準備する工程と
    　前記形質転換植物の後代植物のバイオマス量を測定し、当該バイオマス量が有意に向上した系統を選抜する工程とを含む、植物体の製造方法。
  14. 　上記遺伝子は、以下の（a）～（c）のいずれかのタンパク質をコードすることを特徴とする請求項１３記載の製造方法。
    （a）配列番号３に示すアミノ酸配列を含むタンパク質
    （b）配列番号３に示すアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み、ロイシンリッチリピート構造を有する受容体様タンパク質
    （c）配列番号２に示す塩基配列の相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされロイシンリッチリピート構造を有する受容体様タンパク質
  15. 　上記機能的に等価な遺伝子は、シロイヌナズナ以外の生物由来であってロイシンリッチリピート構造を有する受容体様タンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項１３記載の製造方法。
  16. 　双子葉植物であることを特徴とする請求項１３乃至１５いずれか一項記載の製造方法。
  17. 　アブラナ科植物であることを特徴とする請求項１３乃至１５いずれか一項記載の製造方法。
  18. 　シロイヌナズナであることを特徴とする請求項１３乃至１５いずれか一項記載の製造方法。
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