KR20010005581A - 성장 변형 식물 - Google Patents

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KR20010005581A
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알. 씨. 제닝스
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Abstract

본 발명은 세포 분열 제어 단백질, 바람직하게는 망막아세포종 유사 단백질을 결합 또는 인산화시킬 수 있는 세포 분열 제어 단백질, 더욱 바람직하게는 시클린, 특히 식물의 세포내의 D형 시클린의 양 또는 작용량을 변화시켜 식물의 성장 또는 구조를 변형시키는 방법을 제공한다. 또한 발현시 세포 분열 제어 단백질의 양 또는 작용량을 증가 또는 감소시키는, RNA 또는 단백질을 암호하는 전사된 DNA 영역을 포함하는 키메라 유전자, 이러한 키메라 유전자를 발현할 수 있는 식물 세포 및 식물을 제공한다.

Description

성장 변형 식물{PLANTS WITH MODIFIED GROWTH}
모든 진핵 세포는 분열할 때 동일한 일련의 사건을 진행하며, "세포 주기"는 이들 사건의 순차적인 특성 및 보편성을 반영하는 용어이다. 진핵 세포 주기에서, DNA 복제 (S) 및 세포 분열 (M)은 보통 G1-S-G2-M의 순서로 "간극" 기(G1 및 G2)에 의해 일시적으로 분리된다. 이러한 배열로 DNA 복제 및 유사 분열의 중요한 과정이 시작되는 것을 정확하게 제어할 수 있다. 세포 주기의 세포학적 사건의 기초는 주기의 방향 및 순서를 한정하는 순차적인 일련의 일시적 및 공간적으로 조직화된 분자 및 세포 과정이다. 세포 주기 진행은 모든 진핵세포에서 G1-내지-S기 및 G2-내지-M기 경계선에서 작동하는 주요 제어물에 의해 조절되는 것으로 보인다. 이들 제어점을 통과하기 위해서는 시클린-의존성 키나아제(CDK)의 활성화가 필요하며, 이의 촉매적 활성 및 기질 특이성은 복합체의 인산화 단계를 조절하는 기타 단백질과 상호작용하고 시클린으로 알려진 특정 조절 서브유니트에 의해 결정된다(Atherton-Fessier et al., 1993; Solomon, 1993 참조). 출아 효모 및 분열 효모에서, G1-내지-S 및 G2-내지-M 기 전이는, 스키조사카로마이시즈 폼베 (Schizosaccharomyces pombe)에서 cdc2+ 유전자에 의해 암호되는 단일 CDK와 사카로마이시즈 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)에서 CDC28에 의해 제어된다. p34cdc2(출아 효모에서 p34CDC28)와 다른 시클린 파트너의 연합체에는 2가지 제어점이 두드러진다(Nasmyth, 1993 참조). 포유류 세포에서는 더욱 복합적인 상황이 나타나며, 6개 이상이 관련되어 있지만 개별적인 CDK(cdc2/cdk1, cdk2, cdk3, cdkain4, cdk5 및 cdk6에 의해 암호됨)는 별개의 역활을 가지며, 각각은 하나 이상의 동족의 시클린 파트너와 연합되어 있다(Fang and Newport, 1991; Meyerson et al., 1991, 1992; Xiong et al., 1992b; Tsai et al., 1993a; van den Heuvel and Harlow, 1993; Meyerson and Harlow, 1994). B형 시클린은 G2-내지-M 전이와 연관된 주요 부류이고, p34cdc2또는 이의 직접적인 상동체와 회합되어 있다(Nurse, 1990 참조). 시클린 B는 본래 중간기 동안에 무척추 동물의 알에 축적되고 유사 분열시에 급속하게 파괴되는 2종의 시클린 중 하나이며(Evans et al., 1983), 제노퍼스 성숙 촉진 인자의 성분이다(Murray et al., 1989). 그 후, 시클린 B 상동체가 다수의 진핵세포 종으로부터 동정되어 왔다. 시클린 A는 다세포 유기체에서 널리 발생하며, 이의 정확한 역할은 분명하지 않지만, 시클린 A가 가장 풍부할 때 S기에서 작용한다고 제안되어 있다(Pines, 1993 참조).
G1-내지-S 기로의 전이는 에스. 세레비시애에서 가장 잘 이해된다 유전자 연구는 START라고 불리우는 G1 후기 지점에 한정되어 있다. START를 통과한 후에, 세포는 S기에 접어들고 분열의 완전한 추가의 일순을 완결하며, 그 결과 G1 기에서 다시 2개의 딸세포가 생길 것이다(Hartwell, 1974; Nasmyth, 1993 참조). CLN1, CLN2 및 CLN3이라고 불리우는 3종의 에스. 세레비시애 G1 시클린 유전자의 생성물은 START를 통한 계대의 기본적인 제한 성분이다(Richardson et al., 1989; Wittenberg et al., 1990; Tyers et al., 1993). CLN1 및 CLN2의 전사는 G1기에서 활성화되며, 단백질 생성물을 양성 피드백 메카니즘에 의해 임계 역치로 축적시키면 START를 통한 p34CDC28키나아제의 활성화 및 전이가 유도된다(Dirick and Nasmyth, 1991). 그 다음 G1 시클린은 급속한 단백질 교체를 초래하는 것으로 보이는 1차 서열에서 PEST 모티프의 결과로서 분해된다(Rogers et al., 1986; Lew et al., 1991; Reed, 1991 참조).
에스. 세레비시애 G1 시클린은 최소한 부분적으로 과도하게 존재하는데, 그 이유는 3개의 G1 시클린 유전자 중 2개가 결실되어 있고 제3의 유전자는 갈락토스-조절된 프로모터의 제어하에 있는 효모 균주가 갈락토스 의존성 성장 표현형을 나타내기 때문이다. 존재하는 단일 효모 CLN 유전자가 억제되는 경우, 이러한 균주를 사용하여 글루코스 평판에서 조건적 cln-결핍 표현형을 회복한 드로소필라(Drosophila) 및 인간 cDNA 클론을 동정하였다(Koff et al., 1991; Lahue et al., 1991; Leopold and O'Farrell, 1991; Lew et al., 1991; Xiong et al., 1991). 3종의 새로운 부류의 시클린 C, D 및 E를 암호하는 인간 cDNA는 이러한 방법으로 동정하였다. 이들 시클린이 효모 CLN 단백질과 단지 제한된 상동성을 나타내지만, G1 동안에 포유류 세포와 G1-내지-S 기 경계의 제한 지점에서 작동하는 제어를 이해하는데 중요한 것으로 입증되었다(Pardee, 1989; Matsushime et al., 1992; Koff et al., 1992, 1993; Ando et al., 1993; Quelle et al., 1993; Tsai et al., 1993b). 시클린 E는 G1-내지-S기 경계에서 속도 제한 성분으로 작용할 수 있는 반면(Ohtsubo and Roberts, 1993; Wimmel et al., 1994), 혈청 성장 인자에 대한 시클린 D 농도의 의존성(Matsushime et al., 1991; Baldin et al., 1993; Sewing et al., 1993)은 D형의 시클린이 이들 시그널과 세포 주기 진행 사이에 연결을 형성할 수 있다는 것을 제안한다.
포유류에서 세포 주기 진행의 조절과 관련된 중요한 인자는 망막아세포종 단백질(Rb)을 암호하는 망막 아세포종 감수성 유전자이다. Rb는 E2F 계열의 전사 인자와 결합하여 불활성화시키고, Rb는 이러한 능력을 통하여 G1기에서 세포 분열을 억제하는데 유효한 대부분의 잠재력을 나타낸다. E2F 전사 인자는 시클린 E 및 S기 유전자를 개시시키는 것으로 알려져 있고, 시클린 E 및/또는 E2F의 레벨이 상승하면 복제가 개시된다(Nevins, 1992, Johnson et al., 1993). E2F를 불활성화시키는 Rb의 능력은 인산화 상태에 좌우된다. 대부분의 G1 과정에서, Rb는 저인산화 상태이지만, 후기 G1기에는 시클린 의존성 키나아제, 특히 필수 조절 서브유니트인 시클린 D(Pines, 1995)에 복합된 CDK4와 시클린 E(G1/S 경계에서) 또는 시클린 A(S기)에 복합된 CDK2에 의해 Rb의 인산화가 수행된다. 이들 Rb의 다중 인산화는 E2F의 방출을 유발하여, 궁극적으로 S기 유전자의 전사를 촉진할 수 있다.
식물 세포는 세포 성장 및 분열의 초기 연구에 사용하여 진핵 세포 주기의 개개의 기를 규명하였으나(Howard and Pelc, 1953), 식물계에서 분자 세포 주기 제어에 대한 자료가 부족하다. 생체내에서 휴지 상태로 인하여 또는 시험관내에서 영양 고갈로 인하여 분열을 정지한 식물 세포는 G1 및 G2의 기본적인 제어점에서 중단되며(van't Hof and Kovacs, 1972; Gould et al., 1981; van't Hof, 1985 검토); 이는 기타 진핵계에서 작용하는 제어와 일반적으로 일치한다. 성숙 식물 세포가 G1 또는 G2 DNA 함유물과 함께 발견될 수도 있지만(Evans and van't Hof, 1974; Gould et al., 1981), G1 군이 일반적으로 주를 이룬다. G1 제어점은 질소가 결핍된 상태로 배양된 식물 세포에서 더욱 엄격한 것으로 보인다. 이들 세포는 G1 기에서만 중지된다(Gould et al., 1981). 따라서, 강한 유사체가 식물 세포 주기의 G1에서 주요 제어점, 효모에서 START 제어 및 포유류 세포의 제한점 사이에 존재한다.
항체 또는 히스톤 HI 키나아제 분석은 식물 세포내에 활성 CDC2-관련 키나아제의 존재 및 위치를 나타내는데 사용되어 왔고(John et al., 1989, 1990, 1991, Mineyuki et al., 1991 Chiatante et al., 1993; Colasanti, et al., 1993; John et al., (1993) 참조), CDC2 키나아제의 기능적 상동체를 암호하는 cDNA는 완두(Feiler and Jacobs, 1990), 자두개자리(Hirt et al., 1991, 1993 참조), 아라비돕시스(Arabidopsis; Ferreira et al., 1991; Hirayama et al., 1991)), 대두(Miao et al., 1993), 금어초(Anthirrhinum; Fobert et al., 1994) 및 옥수수(Colasanti et al., 1991)를 비롯한 여러 식물종으로부터 엄중 하이브리드화 또는 과다한 폴리머라제 연쇄 반응으로 분리하여왔다. A형 또는 B형의 특성을 보유하거나 또는 A형 및 B형 혼합 특성을 보유한 식물의 유사 분열 시클린을 암호하는 각종 cDNA 서열을 당근(Hata et al., 1991), 대두(Hata et al., 1991), 아라비돕시스(Hemerly et al., Day and Reddy, 1994), 자두개자리(Hirt et al., 1992), 금어초(Fobert et al., 1994) 및 옥수수(Renaudin et al., 1994)를 비롯한 각종 종으로부터 분리하였다.
Soni 등(1995)은 G1 시클린이 결핍된 효모 균주의 보체에 의해 아라비돕시스에서 새로운 계열의 관련 시클린 3종을 동정하였다. 이들 계열의 개개 구성원은 조직 특이적 발현을 나타내며 기타 식물종에서 보존된다.
이들은 식물 시클린의 특징적인 군을 형성하며, 포유류 D형 시클린과 유사성을 나타내기 위해서 δ형 시클린이라고 칭하였다. δ시클린과 D 시클린 사이의 서열 관계는 N 말단 서열 LxCxE를 포함한다. 루이신은 산성 측쇄를 보유한 아미노산(D, E)보다 위치-1 또는 위치-2에 위치한다. 모티프는 본래 특정 바이러스 종양단백질에서 동정되었으며, 망막아세포종 단백질에 결합시 강하게 연루되어 있다. 포유류 시클린 D와 유사하여, 이들 식물 상동체는 성장 및 식물호르몬 시그널을 식물 세포 주기내로 매개할 수 있다. 이러한 관점에서, 현탁 배양된 세포의 재자극시 시클린 δ3은 식물 성장 조절인자 시토키닌에 의해 급속하게 유도되고 시클린 δ2는 탄소원에 의해서 유도되는 것으로 나타났다. Renaudin 등(1996)은 식물 시클린의 군 및 명명법을 규정하였으며, δ시클린은 현재 CycD 시클린이라고 부른다.
Dahl 등(1995)은 자두개자리중의 δ3과 관련된 시클린(cycMs4)를 자두개자리에서 동정하였다.
최근, Rb 유사 단백질이 식물에서 동정되었다. Xie 등(1996) 및 Grafi 등(1996)은 Rb 상동체를 옥수수로부터 분리하고 예비적으로 특성을 규명하였다.
Doerner 등(1996)은 아라비돕시스에서 cdc2a 유전자로부터 프로모터의 제어하에 B형 시클린(아라비돕시스에서 유래한 cyc1At)의 이소성(異所性) 발현을 개시하였다. 강하게 변이 유전자를 발현하는 "cdc2a" 변이 식물의 뿌리 성장 속도는 현저하게 증가하였다. 더구나, 측생 뿌리의 성장 및 발육은 대조 식물에 비하여 변이 식물에서 인돌아세트산을 사용한 유도 후에 가속화되었다.
Hemerly 등의 문헌(1995)에는 유사 분열시 작동하는 키나아제(CDC2a)의 야생형 또는 주요 변이체를 발현하는 변이 담배 또는 아라비돕시스 식물이 개시되어 있다. 세포 주기를 가속화시키는 것으로 예상되는 변이 형태 또는 야생형 CDC2a를 구조적으로 과생성하는 식물은 상당히 변형된 발육을 나타내지 않았다. 세포 주기를 중지시키는 것으로 추정되는 변이 CDC2a는 아라비돕시스에서 발현시 세포 분열을 폐지하였다. 변이 키나아제 CDC2a를 구조적으로 생성하는 일부 담배 식물을 회수하였다. 이들 식물은 상당히 적은 수이지만 거대한 세포를 함유하였다.
PCT 특허 공개공보 "WO" 92/09685에는 세포 분열을 제어하기에 충분한 조건하에 일정 시간 동안 식물내의 세포 주기 단백질량을 조절하는 단계를 포함하여 식물 세포 성장을 제어하는 방법이 개시되어 있다. 바람직한 단백질은 유사 분열시 작동하는 p34cdc2키나아제 등이며, 이를 실시예에서 동정하였다.
WO93/12239는 스키조사카로마이시즈 폼베(Schizosaccharomyces pombe)와 같은 효모에서 유래한 cdc25 유전자로 식물 게놈을 형질전환시켜 변경된 키 및 기타 표현형 효과, 특히 이른 개화 및 꽃의 수 증가를 나타내는 식물을 개시하고 있다.
WO97/47647은 망막아세포종 단백질을 암호하는 식물 DNA 서열의 분리 및 특성 규명, 식물 세포, 식물 및/또는 식물 바이러스에서의 성장 제어를 위한 이들 서열의 용도 이들 뿐 아니라 식물의 망막아세포 단백질계 제어 경로의 조작을 통해 변형된 벡터, 식물 또는 동물이나 동물 세포의 용도에 관한 것이다.
미국 특허 제5,514,571호에는 포유류 세포 증식의 음성 조절인자로서 시클린 D1의 용도가 개시되어 있다. 시클린 D1의 과발현이 포유류 세포 성장을 차단하지만 시클린 D1 발현 차단은 세포 증식을 촉진한다.
본 발명은 표현형이 변형된 식물, 특히 성장 속도가 변형된 식물이나 또는 성장 속도 및/또는 상대적인 크기가 변형된 단편을 포함하는 식물 또는 구조가 변형된 식물을 생산하기 위한 세포 분열 제어 단백질 또는 이의 단편, 바람직하게는 망막아세포종 유사 단백질을 결합시키는 세포 분열 제어 단백질, 더욱 바람직하게는 시클린, 특히 D형 시클린 및 이를 암호하는 유전자의 용도에 관한 것이다. 또한 본 발명은 이러한 DNA를 발현하는 식물 세포 및 식물에 관한 것이다.
발명의 개요
본 발명은, Rb 유사 단백질을 결합 및/또는 인산화시킬 수 있는 세포 분열 제어 단백질, 바람직하게는 식물의 세포내에서 단백질의 N 말단부내에 LxCxE 결합 모티프 또는 관련 모티프를 포함하는 세포 분열 제어 단백질, 특히 D형 시클린의 양 또는 작용량을 변경시키는 단계를 포함하여, 성장 특성이 변형되거나 구조가 변형된 식물, 특히 성장 속도가 감소 또는 증가된 식물, 이른 개화를 요하는 식물이나, 식물 1 그루당 꽃의 수가 증가된 식물 또는 기관의 크기를 증가시킨 식물을 얻을 수 있는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은,
a) 식물의 발현가능한 프로모터 영역, 특히 CaMV35S 프로모터 영역,
b) 발현시 세포 분열 제어 단백질의 양 또는 작용량을 증가 또는 감소시키는 RNA 또는 단백질을 암호하는 전사된 DNA 영역; 및 임의적으로
c) 식물 세포에서 작용하는 3' 단부 형성 및 폴리아데닐화 시그널이 작동가능하게 결합된 DNA 단편을 포함하는 키메라 유전자를 식물 세포의 게놈내로 통합하여 세포 분열 제어 단백질의 양 또는 작용량을 변경시키는 단계를 포함하여 성장 특성이 변형되거나 또는 구조가 변경된 식물을 얻는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 전사된 DNA는 발현시 세포 분열 제어 단백질, 특히 내인성 D형 시클린의 발현을 감소, 억제 또는 방지하는 안티센스 RNA, 리보자임 또는 센스 RNA 가닥을 암호한다.
또한 본 발명에 있어서, 전사된 DNA는 Rb 유사 단백질의 포켓 도메인을 결합시킬 수 있는 세포 분열 제어 단백질, 바람직하게는 LxCxE 결합 모티프를 포함하는 세포 분열 제어 단백질, 더욱 바람직하게는 D형 시클린, 구체적으로 식물에서 유래한 D형 시클린, 더욱 구체적으로 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) CYCD1, 아라비돕시스 탈리아나 CYCD2, 아라비돕시스 탈리아나 CYCD3, 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) CYCD2;1, 니코티아나 타바쿰 CYCD3;1, 니코티아나 타바쿰 CYCD3;2, 헬리안더스 투베로서스(Helianthus tuberosus) CYCD1;1, 제아 마이즈(Zea mays) CYCD2 및 헬리안더스 투베로서스 CYCD3;1로부터 선택된 D형 시클린을 암호한다.
또한 본 발명에 있어서, 전사된 DNA는 발현시 세포 분열 제어 단백질의 작용량을 증가시키는 단백질 또는 펩티드, 특히 변이 D형 시클린, D형 시클린의 일부, 시클린 박스에 변이를 보유한 D형 시클린, 아미노산 185 또는 아미노산 155를 치환한 D2형 시클린, 변이 E185A 또는 K155A를 보유한 D2형 시클린, PEST 서열이 제거된 D형 시클린, LxCxE 결합 모티프가 변형되거나 결실된 D형 시클린 또는 LxCxE 결합 모티프로부터 C잔기가 결실된 D형 시클린으로부터 선택된 단백질 또는 펩티드를 암호한다.
또한 본 발명의 목적은 키메라 유전자를 제공하는 것이다.
나아가, 본 발명의 키메라 유전자를 포함하고 변형된 성장 특성 및/또는 변형된 구조를 보유한 식물 세포, 식물 및 종자를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 식물의 성장 특성 또는 구조를 변형시키는데 있어서 Rb 유사 단백질의 포켓 도메인을 결합시킬 수 있는 세포 분열 제어 단백질 및/또는 Rb 유사 단백질을 인산화시킬 수 있는 세포 분열 제어 단백질, 특히 단백질의 N 말단부에서 LxCxE 결합 모티프를 포함하는 세포 분열 제어 단백질, 더욱 구체적으로는 D형 시클린 및 이를 암호하는 유전자의 용도를 제공하는 것이다.
발명의 상세한 설명
본 발명에서 사용된 식물의 "구조(architecture)"란 식물의 몇몇 부분의 상대적 크기, 위치 및 수(즉 기관, 비제한적인 예로서 잎기관, 꽃기관(inflorescences), 저장 기관, 예컨대 괴경, 뿌리, 줄기, 꽃, 또는 꽃잎, 꽃받침, 꽃밥, 주두, 화주(花柱) 및 잎꼭지와 같은 기관의 일부)에 의해 결정되는 일반적인 형태를 의미한다. 따라서, "식물의 구조 변형"은 변화의 결과로서 일반적인 형태, 예컨대 기관 또는 이 기관의 일부의 수, 크기 및 위치가 변하는 것을 의미한다. 전술한 바와 같이 하나의 기관 또는 기관의 일부나 몇몇 기관 또는 이 기관들의 일부를 변형시키면 식물 구조가 변형되는 것은 분명하다. 기존의 분열 조직 및/또는 기관 시원체에서 세포 분열 활성을 변경하거나(즉, 증진 또는 감소) 또는 새로운 분열 조직을 만들어 식물 구조를 변형시킬 수 있다.
"동시억제"는 서열 특이적 방식으로 RNA 축적을 전사 및/또는 전사후 억제하여 상동의 내인성 유전자 또는 변이 유전사의 발현을 억제하는 것을 의미한다. 내인성 유전자의 발현은 DNA 영역에 작동가능하게 결합된 강력한 프로모터를 포함하는 변이유전자를 도입하여 억제할 수 있으며, 그 결과 생성된 전사된 RNA는 발현이 억제된 유전자의 암호 또는 전사된 DNA 서열(센스)에 대해 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 구체적으로 85% 이상, 더욱 구체적으로 90% 이상, 특히 95% 이상 보유하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 센스 RNA이다. 전사된 DNA 영역은 기능 단백질을 암호하지 않는 것이 좋다. 특히, 전사된 영역은 단백질을 암호하지 않는다.
"식물 발현성 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 추진할 수 있는 프로모터를 의미한다. 이러한 프로모터는 식물 세포에서 전사를 유도할 수 있는 비식물 기원의 예컨대 CaMV35S 또는 T-DNA 유전자 프로모터와 같은 바이러스 또는 박테리아 기원의 특정 프로모터일 수 있다.
"유전자 발현"은 조절 영역의 제어하의 DNA 영역, 특히 프로모터가 생물학적으로 활성인, 즉 또 다른 핵산 또는 단백질과 상호작용하거나 또는 생물학적으로 활성인 폴리펩티드 또는 단백질로 해독될 수 있는 RNA로 전사되는 과정을 의미한다. 유전자 발현의 최종 생성물이 안티센스 RNA 또는 리보자임과 같은 생물학적으로 활성인 RNA인 경우 유전자는 RNA를 암호한다고 말한다.
"유전자"는 적절한 조절 영역, 예컨대 식물 발현 프로모터의 제어하에 있는 세포내에서 RNA 분자(예, mRNA)로 전사된 DNA 영역("전사된 DNA 영역")을 포함하는 임의의 DNA 단편을 의미한다. 따라서, 유전자는 프로모터, 5' 리더 서열, 암호 영역 및 폴리아데닐화 부위를 포함하는 3' 영역과 같은 몇개의 작동가능하게 결합된 DNA 단편을 포함할 수 있다. 내인성 식물 유전자는 식물종에서 자연적으로 발견되는 유전자이다. 키메라 유전자는 통상 식물종에서 발견되지 않는 임의의 유전자이거나, 또는 대안적으로 프로모터가 전사된 DNA 영역의 일부 또는 전부, 또는 유전자의 1종 이상의 기타 조절 영역과 자연적으로 관련이 없는 임의의 유전자를 의미한다.
본 발명은 식물 발현 프로모터의 제어하에 있는 Rb 유사 단백질을 결합시킬 수 있는 세포 분열 제어 단백질, 특히 D형 식물 시클린을 암호하는 DNA를 포함하는 키메라 유전자가 유해한 영향을 미치지 않고 식물 세포의 게놈내로 안정하게 통합되고, 더구나 식물 세포에서 이러한 세포 분열 제어 단백질, 특히 D형 시클린이 증가하면 생성 형질전환 식물의 성장 속도 및 구조가 특이적으로 변형된다는 예상외의 발견에 기초한 것이다.
따라서, 본 발명은 형질전환된 식물 및 이의 자손의 구조나 성장 속도 또는 이 두가지를 모두 변형시킨 식물의 식물 세포내에서 바람직하게는 안정한 방식으로 기능성 세포 분열 제어 단백질의 발현량 또는 활성을 조절하는 것이다. 따라서, 이들 세포 분열 제어 단백질을 암호하는 유전자 발현을 변경하여 유전자적으로 세포 분열 제어 단백질의 양 또는 작용량을 제어한다. 유전자적으로 세포 분열 제어 단백질의 양 또는 작용량은, 예컨대 암호 유전자(들)의 카피수를 조작하거나, 암호 유전자의 프로모터 영역을 변형시키거나, 또는 세포 분열 제어 단백질의 발현량을 직접 또는 간접적으로 조절하는 유전자 조작으로 증가시킬 수 있다. 대안적으로, 세포 분열 제어 단백질의 양은, 세포 분열 제어 단백질을 암호하는 mRNA를 안정화시키거나, 또는 예컨대 파괴 모티프 또는 소위 PEST라 불리우는 서열을 제거하여 세포 분열 제어 단백질을 안정화시키므로써 증가시킬 수 있다.
여러 기법을 통해 세포 분열 촉진 단백질의 길항물질 또는 억제인자의 레벨을 감소시키므로서 세포 분열 제어 단백질의 작용량 또는 활성을 증가시킬 수 있으며, 상기 기법의 비제한적인 예로는 작용량을 증가시키고자 하는 단백질과 유사한 불활성 세포 분열 제어 단백질, 또는 억제인자 또는 기타 조절 단백질을 결합시킬 수 있거나 또는 시클린 의존성 키나아제에 결합할 수 있는 세포 분열 제어 단백질의 일부와 같은 단백질을 보유한 세포를 제공하는 기법이 있다. 또한, 세포 분열에 관련된 단백질 활성의 길항물질 또는 억제인자의 결합을 감소 또는 제거하도록 세포 분열 제어 단백질을 변형 또는 변이시켜 세포 분열 제어 단백질의 작용량 또는 활성을 증가시킬 수 있다.
예컨대 안티센스 RNA, 리보자임 작용 또는 동시 억제와 같은 비제한적인 기법을 통해 해독에 이용할 수 있는 세포 분열 제어 단백질을 암호하는 mRNA 푸울을 감소시키므로써 세포 분열 제어 단백질의 작용량을 감소시킬 수 있다. 대안적으로, 세포 분열 촉진 단백질의 길항물질 또는 억제인자의 레벨을 증가시키므로써 세포 분열 제어 단백질의 작용량을 감소시킬 수 있다.
"세포 분열 제어 단백질"은 진핵 세포, 바람직하게는 식물 세포의 세포 주기를 통해 진행을 조절하는데 필요한 폴리펩티드나 단백질, 또는 세포 주기를 통해 진행을 조절하는데 필요한 단백질과 직접 상호작용을 하여 세포 주기를 통해 세포의 진행에 영향을 주거나 세포 주기내로의 세포 유입에 영향을 줄 수 있는 단백질, 또는 동일한 기능을 나타내지만 세포 주기의 조절에 필요하지 폴리펩티드나 단백질을 의미한다.
적절한 세포 분열 제어 단백질은 단독으로 또는 기타 단백질과 함께 Rb 유사 단백질을 인산화시킬 수 있는 단백질, 바람직하게는 G1-S 전이기에서 식물 세포중 Rb 유사 단백질을 인산화시킬 수 있거나, 또는 망막아세포종 유사(Rb 유사) 단백질의 포켓 도메인을 결합시킬 수 있는 단백질, 바람직하게는 LxCxE 또는 FxCxE(결합 모티프는 1글자 아미노산 코드로 나타내며, 여기서 x는 임의의 아미노산을 나타냄) 결합 모티프와 같은 관련 모티프 또는 아미노산 서열내에 함유된 LxCxE 결합 모티프를 보유한 단백질이다. 단백질의 N 말단 1/2, 바람직하게는 처음 50개 아미노산 잔기, 특히 처음 30개 아미노산 잔기내에 LxCxE 결합 모티프(및/또는 관련 모티프)를 포함하는 시클린, 예컨대, D형 시클린, 구체적으로 D형 식물 시클린, 특히 아라비돕시스 탈리아나 CYCD1, 아라비돕시스 탈리아나 CYCD2, 아라비돕시스 탈리아나 CYCD3, 니코티아나 타바쿰 CYCD3;1, 니코티아나 타바쿰 CYCD2;1, 니코티아나 타바쿰 CYCD3;2, 헬리안더스 투베로서스 CYCD1;1, 제아 마이즈 CYCD2 및 헬리안더스 투베로서스 CYCD3;1로 구성된 군에서 선택된 시클린 또는 거의 유사한 단백질 서열을 보유한 시클린이 특히 바람직하다.
전술한 D형 식물 시클린은 아라비돕시스 탈리아나 CYCD1에 대한 EMBL 수탁 번호 X83369의 뉴클레오티드 위치 104 내지 뉴클레오티드 위치 1108에 해당하는 DNA서열, 아라비돕시스 탈리아나 CYCD2에 대한 EMBL 수탁 번호 X83370의 뉴클레오티드 위치 195 내지 뉴클레오티드 위치 1346에 해당하는 DNA서열, 아라비돕시스 탈리아나 CYCD3에 대한 EMBL 수탁 번호 X83371의 뉴클레오티드 위치 266 내지 뉴클레오티드 위치 1396에 해당하는 DNA서열, 니코티아나 타바쿰 CYCD2;1에 대한 서열 번호 1의 뉴클레오티드 위치 182 내지 뉴클레오티드 위치 1243에 해당하는 뉴클레오티드 서열, 니코티아나 타바쿰 CYCD3;1의 서열 번호 2의 뉴클레오티드 위치 181 내지 뉴클레오티드 위치 1299에 해당하는 뉴클레오티드 서열, 니코티아나 타바쿰 CYCD3;2에 대한 서열 번호 3의 뉴클레오티드 위치 198 내지 뉴클레오티드 위치 1298에 해당하는 뉴클레오티드 서열, 헬리안더스 투베로서스 CYCD1;1에 대한 서열 번호 4의 뉴클레오티드 위치 165 내지 뉴클레오티드 위치 1109에 해당하는 뉴클레오티드 서열, 헬리안더스 투베로서스 CYCD3;1에 대한 서열 번호 5의 뉴클레오티드 위치 48 내지 뉴클레오티드 위치 1118에 해당하는 뉴클레오티드 서열 및 제아 마이즈 CYCD2에 대한 서열 번호 21의 뉴클레오티드 위치 316 내지 뉴클레오티드 위치 1389에 해당하는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호되는 아미노산에 의해 완전하게 특성 규명된다.
이들 세포 분열 제어 단백질의 양 또는 작용량 또는 활성을 증가시키면 특정 전사 인자를 불활성화시키는 Rb 유사 단백질의 능력에 영향을 주는 Rb 단백질과 상호작용하므로써 식물 세포에서 G1에서 S기로의 전이가 가속화되거나, 또는 활성적으로 분열하는 세포의 비가 증가하고, 이들 세포 분열 제어 단백질의 양 또는 작용량 또는 활성을 감소시키면 특정 전사 인자를 불활성화시키는 Rb 유사 단백질의 능력에 영향을 주는 Rb 단백질과 상호작용하므로써 식물 세포에서 G1에서 S기로의 전이가 지연되거나, 또는 활성적으로 분열하는 세포의 비가 감소한다.
"Rb 유사 단백질"은 인간 Rb-1 단백질(Lee et al., 1987; 수탁번호 P06400), 인간 p107(Ewen et al., 1991; 수탁 번호 L14812) 및 인간 p130(Hannon et al., 1993; 수탁 번호 A49370), 드롭소필라 RBF(Du et al., 1996; 암호 유전자의 DNA 유입용 수탁 번호 X96975), 마우스 RB(Bernards et al., 1989; 수탁 번호 P13405), 닭 RB(Boehmelt et al., 1994; 수탁 번호 X72218), 제노퍼스(Xenopus) Rb(Destree et al., 1992; 수탁 번호 A44879), 제아 마이즈에서 유래한 ZmRb 및 Rb1(Xie et al., 1996; Grafi et al., 1996; 암호 유전자의 DNA 유입용 수탁 번호 X98923; 젠뱅크 U52099)로 구성된 군에서 유래한 단백질 뿐 아니라 전술한 군의 3이상의 구성원에 대해 동시에 25∼30% 이상의 아미노산 서열 유사성(동일성)을 보유하는 임의의 단백질을 의미하며, 인간의 Rb-1의 위치 706 또는 기타 Rb 유사 단백질에서의 등가 위치에 있는 보전성 시스테인 잔기를 포함한다(예, Xie et al., 1996 참조).
Rb 유사 단백질은 "포켓 단백질"로 알려진 소계열의 구성원이다. 이 용어는 보전된 이분 도메인, 소위 말하는 "포켓 도메인"에서 유래한 것으로 전사 인자의 E2F 계열과 같은 몇개의 성장 제어 단백질, D형 시클린 및 바이러스 종양 단백질에 대한 결합 부위이다. 포켓 도메인의 A 및 B 서브도메인은 나머지 단백질보다 더 잘 보전되어 있고(A 및 B 서브도메인에 대하여 ∼50∼64%) 비보전 스페이서에 의해 분리되어 있다. 포켓 도메인은 인간 Rb의 위치 451 내지 766, 인간 p107의 위치 321 내지 811, 인간 p130의 위치 438 내지 962, 마우스 RB의 위치 445 내지 758, 닭 RB의 위치 441 내지 758, 제노퍼스 Rb의 위치 440 내지 767, 옥수수 ZmRb의 11 내지 382, 옥수수 Rb1의 89 내지 540의 아미노산 사이에 위치한다.
" Rb 유사 단백질에 결합" 또는 "Rb 유사 단백질의 포켓 도메인에 결합"은 시험관내 분석이나 생체내 분석, 또는 이의 조합으로 분석할 수 있다. 시험관내 분석에서,35S-메티오닌으로 표지한 해당 단백질과 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST) 및 인간 Rb와 같은 Rb 유사 단백질의 포켓 도메인의 융합 단백질 사이에서 분석한다. GST에 융합시키면 글루타티온 세파로스 비이드에서 융합 단백질을 쉽게 정제 및 고정할 수 있다. 분석된 단백질과 Rb 유사 단백질 사이의 상호 작용은 인간 Rb C706F와 같은 인간 Rb에서 시스테인 706에 동일한 위치에서 보존 시스테인에 변이가 있는 Rb 유사 단백질 및 GST의 융합 단백질과 동일한 단백질 사이의 결합과 비교한다. 이러한 분석은 Dowdy 등의 문헌(1993) 및 Ewen 등의 문헌(1993)에 개시되어 있다. 이 분석법의 변형에서, Rb 유사 단백질은 바큘로바이러스 감염된 곤충 세포에서 발현할 수 있다(Dowdy et al., 1993). 또 다른 변형예에서, Rb 유사 단백질 및 Rb 결합 단백질은 곤충 세포에서 동시 발현할 수 있고, 겔 여과 또는 동시 면역침전법으로 함께 검출할 수 있다(O'Reilly et al., 1992).
생체내 분석은 Rb 유사 단백질의 포켓 도메인에 대한 단백질 결합을 측정하는데 사용할 수 있으며, 효모의 2 하이브리드 시스템이다(Fields and Song, 1989). 이 분석은 각각 분석하고자 하는 단백질 및 Rb 유사 단백질의 포켓 도메인에 융합된 활성 도메인(GAL4AD) 및 DNA 결합 도메인(GALBD)을 함유하는 2개의 분리된 GAL4 융합 단백질로부터 기능적 GAL4 활성을 재구성하는 능력에 좌우된다. 이들 융합 단백질을 암호하는 키메라 유전자를 포함하는 발현 플라스미드를 적절한 GAL4 유도성 마커를 암호하는 효모 균주, 예컨대 GAL4-유도성 HIS3 및 LacZ 마커를 함유하는 균주 HF7c(Feilloter et al., 1994) 또는 균주 Y190(Harper et al., 1993)내로 도입한다. Rb 유사 단백질의 포켓 도메인에 결합하는 단백질은 히스티딘의 부재하에 성장할 수 있다. 단백질과 Rb 유사 단백질의 상호작용을 입증하는 2-하이브리드 분석의 예는 Durfee 등의 문헌(1993)에 개시되어 있다.
발현 플라스미드의 동일한 효모 균주내로 별도의 도입 또는 바람직하게는 C706 또는 등가 위치에서 변이된 Rb 유사 단백질의 포켓 도메인 융합된 DNA 결합 도메인(GAL4BD) 및 활성화 도메인(GAL4AD)을 함유하는 융합 단백질 및 각각 분석하고자 하는 단백질을 암호하는 발현 플라스미드의 도입과 같은 적절한 제어 실험이 바람직하다.
Rb 유사 단백질의 포켓 도메인에 대한 단백질 결합을 결정하는 대안적인 시험관내 분석법으로는 식물 세포, 바람직하게는 담배 원형질체내의 단백질의 일시적 발현 및 기타 단백질의 동시 침전을 측정하기 위해서 2개의 단백질 중 하나에 대해 유도된 항체를 사용한 면역 침전법이 있다.
"Rb 유사 단백질의 인산화"는 당업계에 공지된 바와 같이, 표적 단백질로 표지된 인산염 군을 전달하기 위해서 단백질(또는 시클린 및 시클린 의존성 키나아제와 같은 단백질의 조합체)의 능력을 모니터할 수 있는 감마32P-표지된 아데노신-트리포스페이트의 사용에 좌우되는 시험관내 분석으로 분석할 수 있다.
"시클린"은 "시클린 박스"로서 알려진 약 100 아미노산의 단백질 도메인을 포함하는 조절 단백질로 규정할 수 있다. 시클린 박스는 시클린 의존성 키나아제에 대한 결합 부위로서, 시클린이 CDK의 키나아제 활성에 대한 조절 효과를 발휘하도록 한다.
시클린 박스는 아라비돕시스 탈리아나에서 유래한 CYCD1의 위치 81∼186, 아라비돕시스 탈리아나에서 유래한 CYCD2의 위치 96∼201, 아라비돕시스 탈리아나에서 유래한 CYCD3의 위치 86∼191의 아미노산 서열과 같은 기존의 시클린 박스와 단백질의 아미노산 서열을 비교하여 동정할 수 있으며, 이 시클린 박스는 Renaudin 등(1994; 1996), Soni 등(1995) 및 Hemerly 등(1992)의 문헌에 개시되어 있다. 서열 비교를 근거로 시클린 박스로서 동정된 아미노산 서열은 동일 위치에서 시클린 활성에 필요한 5개 이상의 보존된 잔기, 즉 R(97), D(126), L(144), K(155), E(185)(지정 위치는 아라비돕시스 탈리아나의 CYCD2 서열에서 유래한 것임)를 보유해야 한다[예컨대 Soni et al., (1995) 및 Renaudin et al., (1996)].
D형 시클린(시클린 D 또는 CycD)은, Rb 유사 단백질을 결합시키기 위한 LxCxE 모티프 또는 관련 모티프와 같은 추가의 특징적 서열의 존재하에 특성 규명된 시클린이며, 바람직하게는 N 말단과 시클린 박스, 특히 개시 메티오닌 잔기의 처음 50 아미노산, 더욱 구체적으로 처음 30 아미노산 사이에 위치한 단백질의 N 말단부내에서 발견된다. 결합 모티프의 루이신은 산성 측쇄를 보유한 아미노산(D,E)보다 위치 -1 또는 위치 -2에 앞서 존재하는 것이 좋다. 대안적으로 LxSxE 또는 FxCxE와 같은 결합 모티프가 발견될 수 있다. 실제로, Phelps 등(1992)은 인간의 파필로마바이러스 E7내의 결합 모티프 LxCxE를 LxSxE로 변이시키는 것은 유사 단백질에 결합하는 단백질의 능력에 영향을 주지 않는다는 것을 확인하였다. D형 시클린의 3가지 군은 서열 상동성을 기초로 동정하였다; CYCD1(아라비돕시스 탈리아나 CycD1 및 헬리안더스 투베로서스 CYCD1;1 비교), CycD2(아라비돕시스 탈리아나 CYCD2 및 니코티아나 타바쿰 CYCD2;1, 제아 마이즈 CYCD2 비교), CycD3(아라비돕시스 탈리아나 CycD3, 니코티아나 타바쿰 CYCD3;1, 니코티아나 타바쿰 CYCD3;2 및 헬리안더스 투베로서스 CYCD3;1 비교).
D형 시클린을 비롯한 식물 시클린의 상이한 유형 및 군에 대한 명명법 및 공통 서열은 Renaudin 등의 문헌(1996)에 개시되어 있으며, 아미노산 서열을 기초로한 새로운 시클린을 분류하는데 이용할 수 있다.
직접적으로 세포 분열 제어 단백질의 존재하에 원형질체의 일렉트로포레이션(electroporation)에 의해, 또는 간접적으로 일시적으로나 안정하게 원형질체내의 게놈에 통합되는 시험하고자 하는 단백질을 암호하는 식물 발현 키메라 유전자로 식물 세포를 형질전환시켜 세포 분열 단백질을 세포에 제공할 수 있다.
본 발명의 일양태에서,
a) 식물의 발현가능한 프로모터 영역, 특히 CaMV35S 프로모터 영역,
b) 발현시 세포 분열 제어 단백질의 양 또는 작용량을 증가 또는 감소시키는 단백질을 암호하는 전사된 DNA 영역; 및 임의적으로
c) 식물 세포에서 작용하는 3' 단부 형성 및 폴리아데닐화 시그널이 작동가능하게 결합된 DNA 단편을 보유하는 키메라 유전자를 식물 세포의 게놈내로 통합하여, RB 유사 단백질을 인산화시키거나 또는 Rb 유사 단백질의 포켓 도메인을 결합시킬 수 있는 세포 분열 제어 단백질의 양 또는 작용량을 증가시켜 성장 속도가 변형되거나 또는 구조가 변형된 식물을 얻을 수 있다.
바람직한 구체예에서, 식물 발현 프로모터의 제어하에 식물 세포의 게놈내로 시클린 D를 암호하는 전사된 DNA 영역을 포함하는 키메라 유전자를 도입하여 시클린 D의 발현량을 증가시킨다. 전사된 DNA 영역은 EMBL 수탁 번호 X83369의 뉴클레오티드 위치 104 내지 뉴클레오티드 위치 1108에 해당하는 뉴클레오티드 서열, EMBL 수탁 번호 X83370의 뉴클레오티드 위치 195 내지 뉴클레오티드 위치 1346에 해당하는 뉴클레오티드 서열, EMBL 수탁 번호 X83371의 뉴클레오티드 위치 266 내지 뉴클레오티드 위치 1396에 해당하는 뉴클레오티드 서열, 서열 번호 1의 뉴클레오티드 위치 182 내지 뉴클레오티드 위치 1243에 해당하는 뉴클레오티드 서열, 서열 번호 2의 뉴클레오티드 서열에 해당하는 뉴클레오티드 위치 181 내지 뉴클레오티드 위치 1299에 해당하는 뉴클레오티드 서열, 서열 번호 3의 뉴클레오티드 위치 198 내지 뉴클레오티드 위치 1298에 해당하는 뉴클레오티드 서열, 서열 번호 4의 뉴클레오티드 위치 165 내지 뉴클레오티드 위치 1109에 해당하는 뉴클레오티드 서열, 서열 번호 5의 뉴클레오티드 위치 48 내지 뉴클레오티드 위치 1118에 해당하는 뉴클레오티드 서열 및 제아 마이즈 CYCD2의 서열 번호 21의 뉴클레오티드 위치 316 내지 뉴클레오티드 위치 1389에 해당하는 뉴클레오티드 서열에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이 좋다.
특히 바람직한 구체예에서, 식물 발현 프로모터, 바람직하게는 구조 프로모터, 특히 CaMV35S 프로모터 제어하에 플라스미드 pCEC1의 키메라 cycD2 유전자와 같은 CycD2 형의 시클린을 암호하는 전사된 DNA 영역을 포함하는 "키메라 cycD2 유전자"를 식물 세포의 게놈내로 도입하므로써 CycD2 형의 시클린 발현량을 변경하여 변이 식물의 형태, 구조 및 성장 특성을 변형시키고, 특히 변이 식물의 영양 성장을 증가시키며, 더욱 구체적으로는 변이 식물의 성장 속도를 변형시킨다.
측정 가능한 표현 형질의 "증가" 또는 "감소"는 하나의 변이 식물주의 여러 식물에서 형질과 관련이 있는 측정의 평균과 야생형 식물의 해당 형질 측정의 평균 사이의 차이를 야생형 식물의 해당 형질 측정치로 나누어 백분율로 표시하여 정량하고, 변이 식물 및 대조(야생형) 식물은 영양 공급, 광선, 수분, 온도 등의 동일한 조건하에, 바람직하게는 표준 조건하에 성장시킨다. 바람직한 증가량 또는 감소량은, 예컨대 단차원 분산 분석(예, Sendecor and Cochran의 Statistical Methods에 개시됨)에 의해 바람직하게는 0.05 신뢰도, 특히 0.01 신뢰도에서 통계적으로 유의적이다.
변이 식물의 영양 성장 증가는 성장 기간 동안 건식 중량의 증가를 측정하여 모니터링하는 것이 좋다. 건식 중량의 평균 증가는 변이 식물의 평균 건식 중량과 야생형 식물의 건식 중량의 차이에 100을 곱하고 야생형 식물의 평균 건식 중량으로 나누어 구할 수 있다. 본 발명의 키메라 cycD2 유전자를 도입하므로써 생기는 건식 중량의 통상적인 증가, 특히 초기 성장 기간에서의 중량 증가는 약 39% 이상 내지 약 350%, 바람직하게는 약 68% 이상 내지 약 150%이다.
사용된 키메라 유전자 또는 식물 종에 따라 본 발명의 키메라 유전자의 도입 결과 생기는 건식 중량 증가는 다양할 수 있고, 변이 식물에서의 건식 중량의 임의의 상당한 증가, 특히 형질전환되지 않은 대조 식물의 건식 중량의 약 1.4 배 이상 내지 약 4.5배 이상, 구체적으로는 형질전환되지 않은 대조 식물의 건식 중량의 약 1.8배 이상 내지 약 2.7배 이상의 건식 중량 증가가 본 발명에 포함되는 것은 분명하다. 임의의 경우, 변이 식물의 평균 건식 중량은 형질전환되지 않은 식물의 평균 중량과 통계학적으로 상당히 다르다.
변이 식물의 성장에서의 증가는 임의의 시점에서 대조 야생형 식물 및 변이 식물에서 보이는 잎의 수를 비교하여 측정할 수 있다. 성장 중간에 변이 식물 잎의 수의 차이는 형질전환되지 않은 식물 잎의 수의 약 1.1배 이상 내지 약 3배 이상, 특히 약 1.5배 이상 내지 약 2배 이상이 될 것으로 예상된다.
변이 식물의 영양 성장의 증가는 성장 기간 동안 줄기의 높이를 측정하여(지면에서 성장점의 상단까지 측정) 모니터할 수도 있다. 줄기 높이의 평균 증가는 변이 식물의 줄기 높이와 야생형 식물의 줄기 높이의 차이에 100을 곱한 뒤 야생형 식물의 평균 높이로 나누어서 결정한다. 본 발명의 키메라 cycD 유전자를 도입하여 생긴 줄기 높이의 증가는 초기 성장 기간에 약 65% 이상, 중간 성장 기간에 약 20∼30% 이상, 개화 시기에 약 10% 이상이지만, 초기 성장 기간에 약 120%∼190%, 중간 성장 기간에 약 40∼50% 내지 약 75%, 및 개화 단계의 말에 약 15∼20%로 높을 수 있다.
사용된 키메라 유전자 또는 식물 종에 따라 본 발명의 키메라 유전자의 도입 결과 생기는 줄기 높이 증가는 다양할 수 있고, 변이 식물에서의 줄기 높이의 임의의 상당한 증가, 특히 형질전환되지 않은 대조 식물의 줄기 높이의 약 1.1 배 이상 내지 약 3배 이상, 구체적으로는 형질전환되지 않은 대조 식물의 줄기 높이의 약 1.5배 이상 내지 약 2배 이상의 줄기 높이 증가가 본 발명에 포함되는 것은 분명하다.
개화하는 식물에서는 성장 속도가 감소하기 때문에, 성장이 진행됨에 따라 변이 식물 및 대조 식물 사이의 줄기 높이의 차이가 감소한다. 따라서 변이 식물의 끝 높이는 변이되지 않은 식물의 끝 높이와 유사할 수 있다.
본 발명의 키메라 cycD2 유전자를 포함하는 변이 식물은, 형질전환되지 않은 식물과 비교할 때 증가된 성장 속도를 보유하여, 따라서 소정의 건식 중량 또는 줄기 높이에 도달하는데 필요한 시간이 적다. "성장 속도"는 매일 식물 또는 식물의 일부에서의 크기 증가, 특히 매일 줄기 높이의 증가를 의미하는 것이며, 수일, 특히 6 내지 8일을 포함하는 기간의 시작 및 말에 식물 또는 식물의 일부의 크기 차이를 일수로 나누어서 계산한다. 성장 속도 증가는 측정가능한 표현형의 증가의 일반적인 정의에 따라 표현하는 것이 좋지만, 동일한 조건하에 동일한 기간 동안 변이 식물의 성장 속도 대 형질전환되지 않은 대조 식물의 성장 속도 사이의 비율로서 나타낼 수 있다.
전술한 바와 같이, 키메라 유전자, 특히 본 발명의 키메라 cycD2 유전자의 도입 결과 생기는 성장 속도 증가는 사용된 식물 종 또는 키메라 유전자에 따라 달라질 수 있으며, 변이 식물에서의 상당한 성장 속도 증가, 특히 구체적으로 4%∼약 85%, 더욱 구체적으로 약 20%∼약 60%, 특히 약 30% 내지 약 50%의 증가는 본 발명에 속한다.
변이 식물의 영양 성장 증가는 잎이 계속 팽창하는 성장 기간 동안 여러 시점에서 최대 잎의 크기 또는 길이를 측정하여 모니터링할 수 있다. 이러한 측정 가능한 표현형은 변이 식물의 성숙도 증가의 척도이다. 본 발명의 키메라 유전자를 도입하여 얻은 최대 잎의 길이의 평균 증가(변이 식물의 최대 잎의 평균 길이와 야생형 식물의 최대 잎의 평균 길이의 차이에 100을 곱하고 야생형 식물의 최대 잎의 평균 길이로 나눈 값)는 성장 초기에 약 7∼31%(평균 약 17%)이고 성장 중기에 약 3∼14%(평균 약 7%)이다.
또한, 본 발명의 키메라 유전자를 도입하여 생기는 최대 잎의 크기 증가는 사용된 식물 종 또는 키메라 유전자에 따라 달라질 수 있고, 변이 식물에서 잎 성장 또는 크기의 상당한 증가도 본 발명에 속한다.
본 발명의 또 다른 목적은 키메라 세포 분열 제어 유전자, 특히 키메라 cycD2 유전자를 식물에 도입하여 뿌리 발육, 특히 평균 뿌리 길이를 증가시키는 것이다. 일반적으로, 뿌리 발육 증가는 지면 위의 영양 부분(줄기, 잎, 꽃)의 증가와 같이 일어나고 약 40% 내지 약 70% 범위일 수 있지만, 이들 증가는 사용된 식물 종 또는 키메라 유전자에 따라 달라질 수 있고, 상당한 증가, 특히 뿌리 발육에서의 통계학적으로 유의적인 증가는 본 발명에 속한다.
본 발명의 또 다른 목적으로서, 키메라 세포 분열 제어 유전자, 특히 키메라 cycD2 유전자를 식물에 도입하여 꽃의 크기 뿐 아니라 꽃의 수, 특히 수분(受粉)된 꽃의 수와 각 꽃에서 수분된 배주의 수를 증가시킬 수 있다. 수분된 꽃 및 각 꽃에서 수분된 배주의 수를 증가시키면(일반적으로 식물 1 그루당 종자의 수를 증가시킴), 식물 1 그루당 종가 수율이 증가될 수 있는 것이 확실하다. 꽃의 수 및 꽃당 배주의 수의 증가 뿐 아니라 종자 수율의 증가는 사용된 키메라 유전자 또는 본 발명의 키메라 세포 분열 제어 유전자로 형질전환시킨 식물 종에 따라 달라질 수 있다. CaMV35S 프로모터의 제어하에 CycD2를 암호하는 DNA 영역을 포함하는 키메라 유전자를 도입하여 생기는 꽃의 크기 증가는 통상 약 4% 이상 내지 약 30% 이상, 특히 약 10% 이상 내지 약 20% 이상이다. 꽃의 수의 증가는 통상 약 20% 이상 내지 약 50% 이상, 특히 약 24% 내지 약 45%이지만, 종자/식물의 수의 증가(중량을 기준으로)는 약 5% 이상 내지 약 55% 이상, 특히 약 10% 이상 내지 약 30% 이상, 더욱 구체적으로 약 25%이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 키메라 세포 분열 제어 유전자, 특히 키메라 cycD2 유전자를 식물 또는 그 종자에 도입하여 발아를 가속화시킬 수 있다. 본 발명의 키메라 cycD2 유전자를 포함하는 변이 종자는 야생형 대조군보다 약 8 내지 약 16 시간 더 빨리 발아할 수 있다.
더구나, 전술한 키메라 유전자를 식물내로 도입하여 꽃기관이 발육하는데 필요한 평균 일수를 줄일 수 있으며, 따라서 개화를 개시하는데 필요한 시간을 효과적으로 줄일 수 있다. 본 발명의 키메라 cycD2 유전자를 포함하는 변이 식물이, 특히 개화 단계에서 조기에 성숙해지지만, 개화 식물의 평균 크기를 보유한다. 개화 단계에 도달하는데 필요한 시간의 실질적인 감소는 사용된 키메라 유전자 또는 식물종에 따라 달라질 수 있다. 통상적으로, CaMV35S 프로모터의 제어하에 CycD2 암호 DNA 영역을 포함하는 키메라 유전자를 보유하는 변이 식물은 약 3% 내지 11∼12% 이상, 특히 약 4% 이상 내지 7% 개화에 필요한 시간을 감소시키는 것으로 나타났다.
특히 바람직한 양태에서, 식물 발현 프로모터, 바람직하게는 구조 프로모터, 특히 CaMV35S 프로모터의 제어하에 CycD3을 암호하는 전사된 DNA 영역을 포함하는 키메라 유전자, 예컨대 pCRK9의 키메라 cycD3 유전자의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 키메라 유전자를 식물내로 도입하여 형태적 형질 또는 구조가 변형된 변이 식물, 구체적으로 특정 식물의 일부 또는 기관의 크기가 변형된 변이 식물, 더욱 구체적으로 연장 및/또는 확대된 꽃잎을 보유한 꽃과 같이 꽃의 크기 및 형태가 변형된 변이 식물을 얻을 수 있다. 식물 발현 프로모터의 제어하에 Cyc3을 암호하는 DNA 영역을 포함하는 키메라 유전자로 형질전환시킨 변이 식물(및 이의 자손)의 꽃의 크기 증가율은 약 31% 내지 약 44%이다. 더구나, 이들 변이 식물은, 약 5% 내지 약 20%, 특히 약 8% 내지 약 16% 개화 시간이 증가하여 야생 식물보다 더 늦게 꽃이 핀다.
또 다른 양태에서,
a) 식물 발현 프로모터 영역, 특히 CaMV35S 프로모터 영역,
b) 발현시 세포 분열 제어 단백질의 작용량을 증가시키는 단백질을 암호하는 전사된 DNA 영역, 바람직하게는 변이 세포 분열 제어 단백질 또는 변이 세포 분열 제어 단백질의 일부를 암호하는 전사된 DNA 영역, 더욱 바람직하게는 변이 D형 시클린 또는 D형 시클린의 일부를 암호하는 전사된 DNA 영역, 구체적으로 시클린 박스에서 변이를 보유하는 D형 시클린(매우 구체적으로는 아미노산 185 또는 아미노산 155가 치환된 D2형 시클린, 특히 E185A 또는 K155A를 보유한 D2형 시클린), 또는 PEST 서열이 제거된, 특히 PEST 서열을 제거하도록 C말단 결실된 D형 시클린, 또는 LxCxE 결합 모티프가 변화되거나 결실되고, 특히 LxCxE 결합 모티프로부터 C 잔기가 결실된 D형 시클린을 암호하는 전사된 DNA 영역, 및 임의적으로
c) 식물 세포에서 작용하는 3' 말단 및 폴리아데닐화 시그널이 작동가능하게 결합된 DNA 단편을 포함하는 키메라 유전자를 식물 세포의 게놈내로 통합하여 RB 유사 단백질을 인산화시키거나 또는 Rb 유사 단백질의 포켓 도메인을 결합시킬 수 있는 세포 분열 제어 단백질, 특히 D형 시클린의 작용량을 증가시켜 성장 속도 또는 구조가 변형된 식물을 얻을 수 있다.
본 발명의 작용 방식을 제한하려는 것은 아니지만, 변이 세포 분열 제어 단백질은 통상의 기능성 세포 분열 제어 단백질의 길항 물질 또는 억제제를 제거하므로써 효과를 발휘하는 것으로 생각된다.
기타 D형 시클린, 특히 CycD군의 식물에서 유도된 시클린을 암호하는 전사된 DNA 영역을 포함하는 키메라 유전자를 사용하여 유사한 효과를 얻을 수 있다. 이들 유전자는, 프로브로서 CycD1, CycD2 또는 CycD3 암호 DNA와 엄중도가 감소된 하이브리드화 조건을 이용한 하이브리드화 방법, 또는 D형 시클린의 뉴클레오티드 서열을 기준으로 올리고뉴클레오티드, 바람직하게는 공통 아미노산 서열을 암호하는 서열에 해당하는 뉴클레오티드 서열을 보유한 올리고뉴클레오티드, 특히 시클린의 각 그룹에 대하여 시클린 박스내의 보전된 아미노산 서열을 암호하는 서열에 해당하는 뉴클레오티드 서열을 보유한 올리고뉴클레오티드를 사용한 폴리머라제 연쇄 반응계 방법을 비롯한 여러 방법으로 식물종 또는 변종으로부터 얻을 수 있다. 이들 보존된 아미노산 서열은 이러한 아미노산 서열을 암호하는 정렬된 DNA로부터 추론할 수 있다. D1형의 식물 시클린의 PCR 증폭에 특히 바람직한 조합의 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 7, 서열 번호 8 또는 서열 번호 9의 DNA 서열을 보유한 올리고뉴클레오티드의 군에서 선택된 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 10 또는 서열 번호 11의 DNA 서열을 보유한 올리고뉴클레오티드의 군에서 선택된 올리고뉴클레오티드이다.
D2형의 식물 시클린의 PCR 증폭에 특히 바람직한 조합의 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 12 또는 서열 번호 13의 DNA 서열을 보유한 올리고뉴클레오티드의 군에서 선택된 올리고뉴클레오티드 및 서열 번호 14 또는 서열 번호 15의 DNA 서열을 보유한 올리고뉴클레오티드의 군에서 선택된 올리고뉴클레오티드이다. D3형의 식물 시클린의 PCR 증폭에 특히 바람직한 조합의 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 16, 서열 번호 17 또는 서열 번호 18의 DNA 서열을 보유한 올리고뉴클레오티드의 군에서 선택된 올리고뉴클레오티드와 서열 번호 19 또는 서열 번호 20의 DNA 서열을 보유한 올리고뉴클레오티드의 군에서 선택된 올리고뉴클레오티드이다. 증폭된 DNA 단편은 cDNA 또는 게놈 라이브러리(엄중 조건하)를 검색하는데 사용하여 전장 클론을 분리한다.
대안적으로, 추가의 식물 유래의 시클린을 암호하는 유전자는, 이에 한정되는 것은 아니지만 Soni 등(1995) 및 Dahl 등(1995)의 문헌에 개시된 바와 같은 조정 G1-S 시클린 결핍 효모 균주의 기능적 상보성과 같은 방법 또는 상기 문헌에 개시된 바와 같이 Rb 유사 단백질의 포켓 도메인에 결합하는 시클린을 암호하는 DNA 서열을 분리하기 위한 효모 2-하이브리드계(Fields and Song, 1989)를 사용하여 얻을 수 있다.
일부 식물은 동일한 아군의 D형 시클린을 암호하는 1종 이상의 유전자를 포함(예, 담배는 CycD3 아군의 2 이상의 유전자를 포함함)하는 것이 추가로 알려져 있으며, 이들 변형도 본 발명의 범위내에서 사용할 수 있다.
더구나, 변이 D형 시클린과 같은 본 발명에 개시된 것과 거의 유사한 아미노산 서열을 보유한 D형 시클린을 동일한 효과를 제공하기 위해서 사용할 수 있다. 거의 유사한 "아미노산 서열"은 2개의 관련 서열을 정렬시킨 경우 서열 동일성(%)(즉, 동일한 아미노산 잔기를 보유한 위치의 수를 2 서열의 더 짧은 잔기의 수로 나눈 값)이 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상인 것을 의미한다. 2개의 아미노산 서열의 정렬은 20 아미노산의 윈도우 사이즈, 2 아미노산의 단어 길이, 4의 간극 페널티(gap penalty)를 사용하여 Wilbur and Lipman 알고리즘(Wilbur and Lipmann, 1983)으로 수행하였다. 전술한 바와 같이 서열 정렬을 비롯한 컴퓨터 보조 분석 및 서열 자료의 해석은 통상적으로 IntelligeneticsTMSuite(미국 캘리포니아주 인텔리제네틱스)의 프로그램을 사용하여 수행할 수 있다.
세포 분열 제어 단백질, 특히 D형 시클린을 암호하는 임의의 DNA 서열을 사용하여 본 발명의 키메라 세포 분열 제어 유전자, 특히 사람이 부분적으로 또는 완전히 합성한 DNA 서열을 작제하는데 사용할 수 있다.
기타 식물 발현 프로모터, 특히 아그로박테리움(Agrobacterium) Ti 또는 Ri 플라스미드의 오핀 신타아제 프로모터, 특히 토팔린 신타아제 프로모터와 같은 구조 프로모터를 사용하여 유사한 효과를 얻을 수 있다는 것이 확실하다. 더구나, 당업계에 공지된 바와 같이 CaMV35S 프로모터의 변형 형태의 존재의 견지에서, 본 발명의 목적은 Hull 및 Howell 등의 문헌[Virology, 86, p482(1978)]에 개시된 바와 같이 이들 대안적인 CaMV35S 프로모터를 사용하여 동일하게 달성할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포 분열 제어 단백질, 특히 D형 시클린을 암호하는 DNA의 발현을 제어하기 위해서 조직 특이적 또는 기관 특이적 프로모터를 사용하여 특정 기관 또는 조직에 제한된 형태 또는 구조가 변형된 식물을 제공하는 것이다. 이러한 조직 특이적 또는 기관 특이적 프로모터는 당업계에 공지되어 있으며, 비제한적인 예로서 종자 특이적 프로모터(예, WO89/03887), 기관 시원체 특이적 프로모터(An et al., 1996), 줄기 특이적 프로모터(Kaller et al., 1988), 잎 특이적 프로모터(Hudspeth et al., 1989), 엽육 특이적 프로모터(예, 광선 유도성 루비스코 프로모터), 뿌리 특이적 프로모터(Keller et al., 1989), 괴경 특이적 프로모터(Keil et al., 1989), 도관 조직 특이적 프로모터(Peleman et al., 1989), 분열 조직 특이적 프로모터(예, SHOOTMERISTEMLESS(STM) 유전자의 프로모터, Long et al., 1996), 시원체 특이적 프로모터(예, 금어초 CycD3a 유전자의 프로모터, Doonan et al., 1998) 등이 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 세포 분열 제어 단백질을 암호하는 키메라 유전자의 발현은 유럽 특허 공보 "EP" 0332104에 개시된 유전자의 프로모터 또는 WO 90/08826에 개시된 유전자의 프로모터와 같은 화학적 화합물에 의해 발현이 유도되는 프로모터에 세포 분열 제어 단백질을 암호하는 DNA 영역을 작동가능하게 결합하여 적절한 화학적 유도인자를 적용하므로써 제어할 수 있다.
또 다른 본 발명의 일양태에서, 세포 분열 제어 단백질을 암호하는 키메라 유전자는, 부위 특이적 조환효소(recomninase) 및 이의 해당 시스 작용성 서열을 사용하여, 예컨대 식물 발현성 프로모터 및 세포 분열 제어 단백질을 암호하는 전사된 영역 사이에 부위 특이적 조환효소가 인식하는 시스 작용성 서열에 인접한 비관련 뉴클레오티드 서열(바람직하게는 전사 및/또는 해독 말단 시그널을 보유하는 서열)을 삽입하고; 부위 특이적 조환효소(예, Cre 또는 FLP)를 보유한 키메라 유전자를 포함하는 식물 세포를 제공하여 삽입된 비관련 뉴클레오티드 서열을 재조합으로 제거하고, 따라서 키메라 세포 분열 제어 단백질을 발현시켜 제어할 수 있다.
세포 분열 제어 단백질, 특히 세포 분열 제어 단백질을 암호하는 DNA 영역을 포함하는 키메라 유전자의 도입에 의한 식물에서의 D형 시클린, 특히 식물 발현 프로모터의 제어하에 D형 시클린의 발현을 증가시켜 얻은 형태 변형은, PEST 서열의 제거, 개조 또는 불활성화로 증진시킬 수 있다고 생각된다. PEST 서열은 양으로 하전된 인접 잔기 사이에 위치한 프롤린, 글루타메이트 또는 아스파라테이트 및 세린 또는 트레오닌이 풍부하고, 이러한 서열을 포함하는 단백질의 급속한 교체와 관련된 아미노산 서열이다(Tyers et al., 1992; Cross, 1988; Wittenberg and Reed, 1988; Salama et al., 1994). 효모 시클린에서 이들 PEST 서열을 제거하면 생체내 시클린을 안정화시킨다(Pines, 1995). PEST 영역은 PESTFIND과 같은 소프트웨어 패키지를 사용하여 컴퓨터 분석으로 동정할 수 있다(Rogers et al., 1986; Rechsteiner, 1990). PEST 서열이 변형된 세포 분열 제어 단백질을 암호하는 DNA의 변이는 Sambrook 등(1989)의 문헌에 개시된 방법을 사용하여 당업자가 실시할 수 있다.
표현형 변형의 정량적 효과는 세포 분열 제어 단백질을 암호하는 키메라 유전자, 특히 기타 식물에서 유래한 유사한 단백질을 암호하는 이종 유전자를 사용하는 대신에 내인성 CycD 암호 키메라 유전자를 발현하여 조절, 즉 증진 또는 억제할 수 있는 것으로 예상된다. 이종 유전자, 특히 내인성 세포 분열 제어 단백질에 약 65% 미만, 바람직하게는 약 75% 미만, 더욱 바람직하게는 약 65% 미만 유사한 단백질을 암호하는 이종 유전자를 사용하는 것이 좋다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 기능성 세포 분열 제어 단백질, 특히 D형 시클린의 발현을 감소시켜 식물의 형태를 변형시킬 수 있다. 이는, 예컨대 안티센스 RNA, 리보자임, 또는 동시 억제 기법을 사용하여 수행할 수 있다. 이를 위해서, 세포 분열 제어 단백질, 특히 식물 세포내의 D형 시클린의 발현을 감소, 억제 또는 방지하는 생성물인 RNA로 전사되는 전사된 DNA 영역을 포함하는 키메라 유전자를 식물 세포내로 도입하며, 특히 식물 세포의 게놈내로 안정하게 통합시킨다.
본 발명의 일양태에서, 키메라 유전자의 전사된 DNA 영역은 세포 분열 제어 단백질, 특히 D형 시클린을 암호하는 센스 mRNA의 최소한 일부에 상보적인 안티센스 RNA를 암호한다. 따라서 안티센스 RNA는 센스 mRNA의 일부에, 바람직하게는 길이가 50개 이상인 염기, 특히 최소한 길이가 100 내지 1000 염기인 연속 연신물에 상보적인 영역을 포함한다. 안티센스 RNA는 mRNA 서열의 일부에 상보적일 수 있다. 이는 5' 말단 또는 캡핑 부위, 리더 영역의 부분 또는 전체, 센스 프리-mRNA의 인트론 또는 엑손 영역(또는 엑손 및 인트론을 가교시키는 영역), 비암호 및 암호 영역을 가교시키는 영역, 암호 영역의 3' 말단을 포함하는 암호 영역의 전체 또는 일부, 및/또는 3' 또는 트레일러(trailer) 영역에 인접한 서열에 상보적일 수 있다. 안티센스 RNA 및 세포 분열 제어 단백질을 암호하는 센스 RNA의 보체 사이의 서열 유사성은 약 75% 이상 내지 약 100%이어야 한다.
또 다른 양태에서, 키메라 유전자의 전사된 DNA 영역은 세포 분열 제어 단백질, 특히 D형 시클린을 암호하는 센스 mRNA가 고도로 특이적 분열을 할 수 있는 특이적 RNA 효소 또는 소위 말하는 리보자임(WO 89/05852)를 암호한다.
또 다른 양태에서, 기능성 세포 분열 제어 단백질, 특히 D형 시클린의 양은 식물 세포내에서 기능을 발휘하기 위해서 발현시 세포 분열 제어 단백질, 특히 D형 시클린의 양을 감소시키거나, 또는 세포 분열 제어 단백질, 특히 D형 시클린을 억제하는 단백질 또는 폴리펩티드를 암호하는 DNA 영역을 포함하는 키메라 유전자 발현에 의해 감소시킬 수 있다. 키메라 유전자는 세포 분열 단백질, 특히 D형 시클린에 결합하는 항체를 암호하는 것이 좋다.
세포 분열 제어 단백질, 특히 본 발명의 일양태의 키메라 유전자를 포함하는 변이 식물의 세포내의 D형 시클린의 양 또는 작용량을 감소시키면, 동일한 조건하에 성장한 형질전환되지 않은 식물과 비교하여 구조 변형, 특히 줄기 높이 감소, 성장 속도 감소 또는 개화 지연이 변이 식물에서 초래된다. 얻은 효과는 사용된 식물 종 또는 키메라 유전자에 따라 달라지며, 구조 및/또는 성장 속도, 특히 줄기 높이 또는 성장 속도의 감소 또는 꽃기관을 형성하는데 필요한 시간 증가에 대한 임의의 영향도 본 발명에 속한다.
세포 분열 제어 단백질, 바람직하게는 D형 시클린, 특히 CYCD2형 시클린의 양 감소로 인한 성장 감소는 약 30% 내지 약 60%, 특히 약 35% 내지 약 50%이다.
세포 분열 제어 단백질, 바람직하게는 D형 시클린, 특히 CYCD2형 시클린의 양 감소로 인한 줄기 높이 감소는 약 10% 내지 약 60%, 특히 약 30% 내지 약 50%, 더욱 구체적으로는 약 40%이다.
세포 분열 제어 단백질, 바람직하게는 D형 시클린, 특히 D2형 시클린의 양 감소로 인한 개화 시간의 증가는 약 10% 내지 약 40%, 특히 약 15% 내지 약 38%이다.
키메라 세포 분열 제어 유전자는 이 유전자의 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 결합된 리더 서열[예, 페투니아에서 유래한 cab22L 리더 또는 TMV에서 유래한 오메가 리더(Gallie et al., 1987)], 노팔린 신타아제 유전자[Depicker et al., 1982] 또는 T-DNA 유전자 7 [Velten and Schell, 1985] 등[Guerineau et al., 1991; Proudfoot, 1991; Safacon et al., 1991; Mogen et al., 1990; Munroe et al., 1990; Ballas et al., 1989; Joshi et al., 1987]의 3' 전사 종결 및 폴리아데닐화 시그널, 식물 해독 개시 공통 서열[Joshi, 1987], 인트론[Luehrsen and Walbot, 1991] 등을 포함할 수 있다.
키메라 세포 분열 제어 유전자를 포함하는 재조합 DNA는 키메라 마커 유전자를 수반한다. 키메라 마커 유전자는 5' 말단에서 식물 발현성 프로모터, 바람직하게는 구조 프로모터, 예컨대 CaMV 35S 프로모터 또는 광 유도성 프로모터, 예컨대 루비스코의 소서브유닛을 암호하는 유전자의 프로모터에 작동가능하게 결합되고; 3' 말단에서 적절한 식물 전사 3' 말단 형성 및 폴리아데닐화 시그널에 작동가능하게 결합된 마커 DNA를 포함할 수 있다. 마커 DNA의 선택은 중요하지 않아 임의의 적절한 마커 DNA를 사용할 수 있을 것으로 예상된다. 예를 들어, 마커 DNA는 A1 유전자(Meyer et al., 1987)와 같은 형질전환된 식물 세포에 특징적인 색상을 제공하는 단백질을 암호할 수 있거나, 포스피노트리신에 대한 내성을 암호하는 bar 유전자와 같이 형질 전환된 세포에 제초제 내성을 제공할 수 있거나(EP 0,242,246), 또는 젠타마이신에 대한 내성을 암호하는 aac(6') 유전자와 같이 형질 전환된 세포에 항생제 내성을 제공할 수 있다(WO94/01560).
본 발명은 모든 식물 종에 필수적으로 적용할 수 있지만, 특히 상업적 가치를 보유한 식물의 성장 속도를 증가시키거나 구조를 변형시키는데 적합하다. 영양 성장에서의 증진은 대부분 신속한 영양 성장에 대한 선별 및 광범위한 품종 개발을 진행하지 않은 식물에서 이루어질 것으로 예상된다. 본 발명은 온실에서 성장하는 식물, 특히 온실 식물이 소정의 발육 단계, 비제한적인 예로서 개화, 착과 또는 결실에 도달하는데 필요한 사건을 감소시키는 것에 관한 것이다. 본 발명은 나무, 특히 소나무, 포플라, 유카립터스 나무 등과 같은 침엽수 나무의 성장 속도 증가와 관련이 있다. 본 발명의 또 다른 중요한 용도는 식물이 경제적으로 중요한 발육 단계에 도달하는데 필요한 시간을 감소시켜 재배할 수 있는 유효 면적을 확장하는 것을 포함한다. 본 발명을 적용할 수 있는 특히 바람직한 식물로는 옥수수, 종유 평지(oil seed rape), 아마씨, 밀, 잔디, 자두 개자리, 콩과 식물, 유채속 식물, 토마토, 상추, 쌀, 보리, 감자, 담배, 사탕무, 해바라기와 카네이션, 국화, 장미, 튜울립 등과 같은 장식용 식물이 있다.
키메라 세포 분열 제어 단백질을 포함하는 재조합 DNA는 식물 세포의 핵 게놈내로 안정하게 도입할 수 있다. 본 발명의 키메라 유전자를 포함하는 디스암(disarmed) Ti 플라스미드이고 아그로박테리움에 의해 운반되는 벡터를 사용하여 유전자 전달을 수행할 수 있다. 이러한 형질 전환은 EP 0,116,718에 개시된 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 대안적으로, 직접 유전자 전달법(EP 0,233,247에 개시), 화분 매개된 형질전환법(EP 0,270,356, WO 85/01856 및 US 4,684,611), 식물 RNA 바이러스 매개된 형질전환법(EP 0,067,553 및 US 4,407,956), 리포좀 매개된 형질 전환법(US 4,536,475) 등의 방법을 적용하여 임의 유형의 벡터를 사용하여 식물 세포를 형질전환시킬 수 있다.
Fromm 등(1990) 및 Gordon-Kamm 등(1990)의 문헌에 의해 개시된 바와 같은 옥수수에 대한 미소투사 충격법과 같은 기타 방법도 적절하다. 주요 곡물과 같이 자엽이 있는 식물의 세포는 치밀한 배형성 칼루스를 형성할 수 있는 상처난 및/또는 효소 분해된 치밀한 배형성 조직, 또는 WO92/09696에 개시된 바와 같이 상처난 및/또는 분해된 미성숙 배아를 사용하여 형질전환시킬 수 있다. 그 결과 형질전환된 식물 세포를 사용하여 종래의 방식으로 형질전환된 식물을 재생시킬 수 있다.
얻은 형질 전환 식물을 종래의 육종법에 사용하여 동일한 특성을 보유한 더 많은 형질전환된 식물을 생성하거나 또는 동일하거나 관련된 식물 종의 기타 변종에 본 발명의 키메라 세포 분열 제어 단백질을 도입할 수 있다. 형질 전환된 식물로부터 얻은 종자는 안정한 게놈 삽입체로서 본 발명의 키메라 세포 분열 제어 유전자를 포함한다.
다음의 비제한적인 예는 키메라 세포 분열 제어 유전자의 작제 및 식물의 구조 및 성장 속도의 변형에 대한 유전자의 용도를 개시하고 있다. 실시예에서 언급하지 않으면, 모든 재조합 DNA 기법은 Sambrook 등(1989)의 문헌[Molecular Cloning; A Laboratroy Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY and in Volumes 1 and 2 of Ausubel et al., (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA]에 개시된 바와 같은 표준 프로토콜에 따라 수행한다. 식물 분자 작업을 위한 표준 물질 및 방법은 영국 BIOS 사이언티픽 퍼블리케이션스 리미티드(영국) 및 블랙웰 사이언티픽 퍼블리케이션즈가 공동 출판한 R.D.D. Croy의 문헌 Plant Molecular Labfax(1993)에 개시되어 있다.
상세한 설명 및 실시예에서, 다음과 같은 서열을 참조하였다.
서열 번호 1: 니코티아나 타바쿰 CYCD2;1를 암호하는 cDNA
서열 번호 2: 니코티아나 타바쿰 CYCD3;1를 암호하는 cDNA
서열 번호 3: 니코티아나 타바쿰 CYCD3;2를 암호하는 cDNA
서열 번호 4: 헬리안더스 투베로서스 CYCD1;1를 암호하는 cDNA
서열 번호 5: 헬리안더스 투베로서스 CYCD3;1를 암호하는 cDNA
서열 번호 6: pGSV5의 T-DNA
서열 번호 7: PCR 프라이머 1
서열 번호 8: PCR 프라이머 2
서열 번호 9: PCR 프라이머 3
서열 번호 10: PCR 프라이머 4
서열 번호 11: PCR 프라이머 5
서열 번호 12: PCR 프라이머 6
서열 번호 13: PCR 프라이머 7
서열 번호 14: PCR 프라이머 8
서열 번호 15: PCR 프라이머 9
서열 번호 16: PCR 프라이머 10
서열 번호 17: PCR 프라이머 11
서열 번호 18: PCR 프라이머 12
서열 번호 19: PCR 프라이머 13
서열 번호 20: PCR 프라이머 14
서열 번호 21: 제아 마이즈 CYCD2를 암호하는 cDNA
플라스미드 pCEC1 및 pCRK9는
MC1061(pCEC1): BCCM/LMBP 3657
DH5α(pCRK9): BCCM/LMBP 3656의 기탁 번호로 1997년 3월 11일에 벨기에, 비-9000 겐트 케이.엘.레데간크슈트라트 35 겐트 대학의
벨기에 미생물 합성 수집소(Belgian Coordinated Collections of Microorganisms ; BCCM)
분자 생물학-플라스미드수집 연구소(Laboratorium voor Moleculaire Biologie-Plasmidecollectie; LMBP)에 기탁되었다.
플라스미드 p블루스크립트-ZM18은
BCCM/LMBP 3866의 기탁 번호로
1997년 3월 19일에 벨기에, 비-9000 겐트 케이.엘.레데간크슈트라트 35 겐트 대학의
벨기에 미생물 합성 수집소(Belgian Coordinated Collections of Microorganisms ; BCCM)
분자 생물학-플라스미드수집 연구소(Laboratorium voor Moleculaire Biologie-Plasmidecollectie; LMBP)에 기탁되었다.
실시예 1. 키메라 유전자의 작제
1.1 CaMV35S-AthCycD2 키메라 유전자의 작제 및 T-DNA 벡터내에 도입
에이. 탈리아나에서 유래한 CYCD2를 암호하는 DNA를 포함하는 1298 bp NcoI-SacI 단편(EMBL 수탁 번호 X83370의 뉴클레오티드 위치 194 내지 1332에 해당하는 뉴클레오티드 서열을 보유함)을 클레노우 폴리머라제로 처리하여 돌출한 말단을 평활하게 하고 SmaI 선형화된 pART7(Gleave, 1992)에 결찰시켜 플라스미드 pCEC1을 형성하였다. 이러한 방식으로, Notl 부위에 인접한 키메라 유전자를 작제하고, CYCD2를 암호하는 DNA를 CabbB-J1 분리물(Harpster et al., 1988) 및 3'ocs 영역(MacDonald et al., 1991)의 CaMV 35S 프로모터에 작동가능하게 결합시켰다. 그 다음 키메라 유전자를 선별성 키메라 마커 유전자도 포함하는 T-DNA 벡터의 T-DNA 경계 사이에 삽입하였다.
이를 위해서, 키메라 cycD2 유전자는 NotI를 사용하여 pCEC1로부터 절제하고, NotI 선형화된 pART27(Gleave, 1992)에 결찰시켜 pCEC5를 형성하였다. pART27은 노팔린 신타아제 유전자 프로모터, neo 암호 영역 및 노팔린 신타아제 유전자의 3' 말단을 작동가능하게 결합시킨 단편을 포함하는 키메라 선별성 마커 유전자를 포함한다(An et al., 1988).
대안적으로, 키메라 cycD2 유전자를 적절한 제한 효소(예, NotI)로 pCEC1로부터 절제하고, 선별성 키메라 마커 유전자(pSSU-bar-3'ocs; De Almeida et al., 1989)와 함께 T-DNA 벡터 pGSV5의 T-DNA 경계 서열 사이의 폴리링커에 도입하여 pCEC5b를 얻는다.
pGSV5는 플라스미드 pGSC1700(Cornelissen and Vandewiele, 1989)로부터 유도하였으나, 베타 락타마제 유전자를 함유하지 않으며 T-DNA가 서열 번호 6의 서열에 의해 특성 규명되지 않는다는 점에서 pGSC1700과는 다르다.
1.2 CaMV35S-AthcycD3 키메라 유전자의 작제 및 T-DNA 벡터내에 도입
cycD3 cDNA를 클레노우 폴리머라제로 처리하여 평활 말단으로 만든 1335 bp BslI-DraI 단편(EMBL 수탁 번호 X83371의 뉴클레오티드 위치 104 내지 뉴클레오티드 위치 1439에 해당하는 뉴클레오티드 서열 보유)으로 분리하고, pUC18의 SmaI 부위내로 삽입하여 pRS14a를 얻었다. 이 클론은 cycD3의 전체 암호 서열을 보유하며, pUC18의 SacI 부위는 cycD3 cDNA의 5' 말단에 있고 BamHI 부위는 3' 말단에 있는 방향으로 절단된 pUV18의 SmaI 부위에 바로 인접하여 위치한 해독 개시 코돈이 있다. pRS14a의 1.35 kb SacI-BamHI 단편을 분리하고 pSLJ94(Jones et al., 1992)의 약 2.6 kb SacI-BamHI 단편에 결찰시켜 pCRK9를 얻었다. 이러한 방법에서, 키메라 유전자는 에이.탈리아나에서 유래하는 cycD3 암호 영역을 암호하는 DNA가 CaMV35S 프로모터 및 3'osc 암호 영역에 작동가능하게 결합되도록 작제하였다. pCRK9에서, 키메라 유전자는 키메라 선별성 neo 유전자에 의해 수반되는 T-DNA 경계사이에 위치한다(Jones et al., 1992).
대안적으로, 키메라 cycD3 유전자를 적절한 제한 효소로 pRS14a로부터 절제하고, 선별성 키메라 마커 유전자(pSSU-bar-3'ocs; De Almeide et al., 1989)와 함께 T-DNA 벡터 pGSV5의 T-DNA 경계 서열 사이의 폴리링커에 도입하여 pPCRK9b를 얻는다.
실시예 2. 실시예 1의 T-DNA 벡터를 사용한 아그로박테리움 매개된 담배 식물의 형질전환
T-DNA 벡터 PCE5 및 pCRK9를 Walkerpeach 및 Velten(1995)의 문헌에 개시된바와 같은 일렉트로포레이션으로 아그로박테리움 투메페이션스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404(Klapwijk et al., 1980)에 도입하고, 각각 스펙티노마이신 및 테트라시클린을 사용하여 형질 전환체를 선별하였다.
T-DNA 벡터 pCEC5b 및 pCRK9b를 삼친(triparental) 교배로 에이.투메페이션스 C58C1RifR에 도입한다.
An 등의 문헌(1985)에 개시된 잎 디스크 형질전환법을 적용하여 생성 아그로박테리움 균주를 사용하여 니코티아나 타바쿰 종 크산티(Xanthi)를 형질전환시켰다.
pCRK9로 형질전환시킨 8개의 담배 식물(1K9, 2K9, 3K9, 4K9, 8K9, 10K9, 17K9, 19K9 및 28K9로 명명)을 생성하고 11개의 담배 식물을 pCEC5로 형질전환시켰다(C8주 1 내지 3 및 5 내지 12로 명명).
프로브로서 pSR14a의 표지된 cDNA 삽입체를 사용한 서던 하이브리드화로 삽입된 변이 유전자의 커피수에 대해 pCRK9 T-DNA로 형질전환시킨 식물을 분석하였다. 주 2K9, 3K9 및 4K9 각각에서 변이 유전자 1카피를 얻은 반면 주 1K9는 변이 유전자 3 카피를 포함하였다.
이들 식물로부터 제조한 BamHI 분해된 DNA와 J22 cDNA(cycD2 암호 영역의 일부를 포함; Soni et al., 1995)로부터의 표지된 0.7 kb NcoI-EcoRI 단편을 사용하여 서던 하이브리드화로 삽입된 변이 유전자의 카피수에 대하여 pCEC5 T-DNA로 형질전환된 식물을 분석하였다. 주 C8-2, C8-3, C8-5, C8-8, C8-1, C8-9, C8-10, C8-11, C8-12는 모두 변이 유전자 1 카피를, 주C8-7은 2카피를, 주C8-6은 3 카피를, 주 C8-1은 변이 유전자 4 카피를 보유하였다.
TO(1차 형질전환체)를 자가 수분하여 종자(T1 종자)를 뿌렸다. T1 종자에서 자란 식물을 C8-T1-X라고 명명하였으며, 여기서 X는 원래 형질 전환체의 주(line)수이다. T1 식물에서 얻은 종자를 T2 종자라고 불렀다. 이 종자에서 자란 식물을 C8-T2-X라고 명명하였으며, 여기서 X는 또한 원래 형질 전환체의 주(line) 수이다. 세대를 언급하지 않은 경우, 식물은 T1 종자로부터 성장한 것이다.
노던 분석으로 최소한 주 C8-1, C8-3, C8-7, 3K9, 4K9 및 8K9에 변이 유전자의 전사를 확인하였다.
실시예 3. 형질전환된 담배 식물의 표현형 분석
3.1. CaMV35S-AthCycD2 키메라 유전자를 포함하는 담배 식물
1차 형질전환체로부터 얻은 종자(T0 식물)는 15 분 동안 10% 표백제로 표면 멸균시키고 멸균수로 철저하게 세척하였다. 표면 멸균된 종자를 최종 농도가 100 ㎍/㎖인 카나마이신을 함유하는 GM 배지에서 발아시켰다. 평판상의 종자를 4℃에서 5일 동안 놓고(춘화처리), 그 다음 성장 챔버내에 23℃로 옮겼다. 모든 시점은 성장 챔버에 둔 날을 의미한다. 성장 챔버로 옮긴 후 18일 동안(즉 총 23일 후에), 카나마이신 내성 묘목을 종자를 함유하는 토양내로 이식하고 성장실에서 18시간의 광주기하에 성장시켰다. 10일 후에, 이들 식물을 3인치 식물분으로 옮기고, 15일 후에 8일치 식물분으로 옮겨 여기서 나머지 실험을 행하였다. 18시간의 광주기를 제공하도록 추가로 빛을 보충한 온실에서 3인치 및 8인치 식물분을 항온처리하였다. 식물은 온실내에 무작위적인 모양으로 두었다.
2일 후(즉, 토양에서 45일 후 또는 27일 후)에 측정을 시작하고, 7주 동안 매주 반복하였다. 다음과 같은 그루수의 식물을 각 주에 대해 분석하였다: 주 C8-1에 대해 22그루, 주 C8-2에 대해 22 그루, 주 C8-3에 대해 22 그루, 주 C8-5에 대해 8 그루, 주 C8-6에 대해 6 그루, 주 C8-7에 대해 22 그루, 주 C8-8에 대해 5 그루, 주 C8-9에 대해 6 그루, 주 C8-10에 대해 4 그루, 주 C8-11에 대해 6 그루, 주 C8-12에 대해 5 그루, 형질전환되지 않은 대조 식물(야생형)에 대해 34 그루.
다음과 같은 변수를 분석하였다. 지면에서 최고점 까지의 식물의 높이(즉, 성장 끝점; 평균 높이 ±표준 편차(cm)로 표 1에 요약되어 있음); 한정된 시간에서 최대 잎의 길이(평균 길이 ±표준 편차(cm)로 표 2에 요약되어 있음); 꽃기관 분열 조직을 육안으로 관찰할 수 있는(꽃기관이 0.25∼1 cm) 시간(평균 시간 ±표준 편차(일)로 표 3A 및 3B에 요약되어 있음); 꽃기관 분열 조직을 볼 수 있는 높이(평균 높이 ±표준 편차(cm)로 표 3A 및 3B에 요약되어 있음); 꽃의 꽃잎관 길이; 꽃잎관의 경령 폭(평균 폭 ±표준 편차(cm)로 표 3A 및 3B에 요약되어 있음); 식물 1 그루당 종자 꼬투리의 총수; 및 식물 1 그루당 평균 종자 수율(중량 기준).
변이 식물은 묘목 단계에서 분명하게 증가된 성장 속도를 나타내어, 그 결과 평균 줄기 높이가 더 컸다(표 1). 3주의 시점에서, 변이주의 모든 개체군은 형질전환되지 않은 대조군보다 상당히 큰 반면(t-테스트; 신뢰도 95%), 주 C8-1, C8-2, C8-3, C8-5, C8-11은 99% 신뢰도에서 형질 전환되지 않은 대조군보다 상당히 더 크다. 성장 속도 증가로 잎이 계속 확장되고(표 2) 꽃이 커지는 기간에 해당하는 지정 시간에서 잎이 평균적으로 더 크며, 이 때 변이 식물의 꽃잎관은 형질전환되지 않은 식물에서 꽃으로부터 형성된 꽃잎관보다 평균적으로 더 길다.
변이 식물에서 꽃의 수가 증가될 뿐 아니라 수분된 꽃의 수도 증가되어, 식물 1 그루당 더 많은 수의 종자 꼬투리와 더 큰 종자 수율을 형성하였다(표 4A 및 4B에 요약된 자료). 더구나, 꼬투리당 종자의 수는 야생형 대조 식물에서 보다 변이 식물에서 더 많다. C8-T1-6에서의 이상한 종자 수율은 꽃 이탈율이 과도하게 높아서 생기는 것이다.
따라서, AthCycD2을 암호하는 DNA의 구조적 발현은 식물 1 그루당 종자 꼬투리의 수 및 종자의 총 수율을 모두 증가시킨다.
마지막으로, 야생형 묘목 및 변이 묘목에서 뿌리 발육을 비교하였다(표 4B). 종자를 멸균하고, 선별하지 않고 GM 배지 평판에 뿌린 후, 춘화처리한 다음 성장실에서 수직 위치에 저장하였다. 춘화처리 9일 및 13일 후에 뿌리 길이를 측정하고 측생 뿌리의 존재를 기록하였다. C8-T1-7 및 C8-T2-2(동종접합형)의 종자를 사용하였다. 주 C8-T1-7은 카나마이신 평판에서 약 15:1로 분리되는 2개의 삽입체를 보유한다. 35 그루의 묘목을 이 주(line)로부터 성장시켰으며, 이중 3개의 묘목은 야생형 묘목에서 관찰되는 성장 속도를 나타내는 것으로 보인다. 이들 묘목으로부터 얻은 자료를 춘화처리 후에 별도의 9일 동안 기록하였다. t-테스트를 적용하여 평균 차이의 유의도를 결정하고 유의 수준을 표에 제시하였다. ns는 샘플 사이에 유의할만한 차이가 없다는 뜻이다. 따라서, 정상 부분에서의 영양 성장 증가는 뿌리 발육에서의 동일한 증가에 의해 균형을 이루는 것으로 보인다.
CaMV35S-AtcycD2를 포함하는 형질전환된 담배 식물의 평균 높이(cm)
주 1주(45일) 2주(51일) 3주(59일) 4주(65일) 5주(73일) 6주(81)일 7주(89일)
C8-T1-1 5.86 ±2.45 13.71 ±3.43 38.91 ±6.61 63.09 ±9.69 99.42 ±10.25 123.30 ±24.60 137.09 ±31.90
C8-T1-2 8.50 ±1.23 18.29 ±2.21 49.86 ±4.73 77.64 ±4.73 117.14 ±10.71 147.71 ±17.75 168.00 9.93
C8-T1-3 8.61 ±2.59 17.41 ±4.94 43.14 ±9.08 66.61 ±11.04 100.41 ±15.57 134.95 ±21.17 145.73 ±22.15
C8-T1-5 6.81 ±1.16 16.31 ±1.89 44.38 ±3.66 70.69 ±5.30 106.50 ±6.12 143.63 ±12.33 159.88 ±9.88
C8-T1-6 4.83 ±1.75 10.75±2.51 33.10 ±6.47 52.67 ±5.83 84.83 ±8.08 120.50 ±13.73 141.80 ±5.63
C8-T1-7 8.64 ±3.04 18.82 ±4.56 48.32 ±6.12 74.66 ±7.12 111.50 ±8.38 149.59 ±11.05 169.14 ±11.99
C8-T1-8 5.50 ±1.41 13.2 ±2.41 41.2 ±2.17 62.40 ±3.98 97.40 ±8.08 134.20 ±5.63 156.80 ±11.86
C8-T1-9 3.75 ±1.44 10.58 ±3.32 35.67 ±6.80 62.17 ±9.72 100.67 ±12.24 137.83 ±20.34 162.17 ±18.67
C8-T1-10 9.88 ±1.89 21.00 ±4.08 47.75 ±8.02 75.38 ±7.11 113.75 ±9.21 152.75 ±11.99 164.50 ±177.21
C8-T1-11 10.00 ±2.30 19.51 ±3.82 45.17 ±5.63 72.25 ±5.50 103.33 ±11.52 144.58 ±5.63 152.83 ±18.28
C8-T1-12 9.20 ±2.66 17.9 ±5.15 42.8 ±11.01 68.6 ±13.32 103.40 ±14.40 140.80 ±12.16 161.8 ±10.76
야생형 4.48 ±1.63 10.50 ±3.33 31.82 ±6.62 54.00 ±7.89 86.56 ±10.91 121.81 ±18.28 145.18 ±19.44
CaMV35S-AtcycD2를 포함하는 형질전환된 담배 식물의 최대 잎의 평균 잎 길이(cm)
주(line) 주1 주2 주3
C8-T1-1 13.500 ±1.846 19.909 ±2.004 27.114 ±2.182
C8-T1-2 16.643 ±1.282 23.500 ±1.354 29.643 ±1.842
C8-T1-3 15.955 ±2.400 20.951 ±3.737 27.341 ±3.095
C8-T1-5 15.062 ±1.635 21.563 ±1.741 28.875 ±2.372
C8-T1-6 14.667 ±1.402 20.833 ±1.807 29.927 ±1.201
C8-T1-7 15.886 ±1.718 22.000 ±1.498 28.909 ±1.974
C8-T1-8 14.167 ±2.229 20.000 ±1.871 27.583 ±1.856
C8-T1-9 12.417 ±2.035 18.917 ±2.010 26.333 ±2.113
C8-T1-10 14.750 ±2.693 20.167 ±2.825 27.583 ±2.635
C8-T1-11 15.833 ±2.113 21.333 ±1.602 28.333 ±1.722
C8-T1-12 14.600 ±1.432 21.400 ±1.475 28.100 ±2.608
야생형 12.676 ±1.846 18.691 ±2.280 26.352 ±1.960
CaMV35SAthcycD2로 형질전환된 담배에서의 꽃 발육[0.25 cm 또는 1 cm의 꽃기관에 대한 평균 높이, 0.25 또는 1cm의 꽃기관 발육에 도달하는데 필요한 평균 시간(춘화처리 후 일수)]
주(line) 0.25 cm의 꽃기관에 대한 평균 시간(일수) 1 cm의 꽃기관에 대한 평균 시간(일수) 1 cm의 꽃기관에서의 평균 높이
C8-T1-1 67.35 ±4.580 74.75 ±4.541 105.5 ±21.670
C8-T1-2 65.42 ±2.573 72.00 ±3.546 110.6 ±21.439
C8-T1-3 68.77 ±3.436 74.32 ±3.414 106.5 ±14.134
C8-T1-5 70.25 ±2.712 76.63 ±2.387 122.4 ±6.737
C8-T1-6 68.00 ±2.828 73.33 ±2.944 117.0 ±5.550
C8-T1-7 70.95 ±3.034 77.15 ±2.852 133.4 ±14.497
C8-T1-8 72.60 ±3.286 77.60 ±2.793 116.1 ±5.482
C8-T1-9 73.17 ±3.251 79.50 ±2.429 129.25 ±10.324
C8-T1-10 72.50 ±2.517 77.75 ±2.986 127.7 ±19.202
C8-T1-11 66.67 ±1.033 73.17 ±2.137 104.6 ±4.924
C8-T1-12 70.00 ±4.000 76.40 ±3.715 121.6 ±7.893
평균값 69.61 ±2.587 75.69 ±2.329 117.70 ±10.082
야생형 74.90 ±3.222 79.09 ±2.342 111 ±10.020
CaMV35SAthCycD2로 형질전환된 담배에서의 꽃 발육[평균 꽃 크기, 즉 길이 및 폭(mm)]. 각 식물에서 5개 꽃의 길이 및 폭을 측정하고, 각 변이주에 대한 평균 꽃 길이 또는 폭을 계산하였다. 각각의 독립적인 변이주에 대한 값을 t-테스트를 사용하여 야생형과 비교하였다. 표는 결과가 야생형과 비교하여 통계학적으로 유의적인 확률도를 나타낸다. ns는 유의적인 값이 아니라는 것을 의미한다.
주(line) 평균 꽃 길이(mm) 유의 수준 평균 꽃의 폭(mm) 유의 수준
C8-T1-1 47.22 ±2.261 P 〈 0.001 33.45 ±1.668 P 〈 0.001
C8-T1-2 44.19 ±1.848 P 〈 0.01 31.14 ±1.486 P 〈 0.001
C8-T1-3 41.30 ±1.720 ns 31.04 ±1.360 P 〈 0.001
C8-T1-5 47.30 ±2.822 P 〈 0.002 33.30 ±1.945 P 〈 0.001
C8-T1-6 50.78 ±1.990 P 〈 0.001 34.25 ±1.467 P 〈 0.001
C8-T1-7 48.04 ±2.604 P 〈 0.001 33.19 ±1.391 P 〈 0.001
C8-T1-8 42.90 ±1.252 ns 30.13 ±2.270 ns
C8-T1-9 45.12 ±1.906 P 〈 0.01 30.56 ±1.333 P 〈 0.002
C8-T1-10 44.60 ±1.627 P 〈 0.01 30.93 ±2.002 P 〈 0.01
C8-T1-11 42.40 ±1.891 ns 29.10 ±2.998 ns
C8-T1-12 42.57 ±0.978 P 〈 0.05 28.55 ±1.190 P 〈 0.05
평균값 45.093 ±2.877 P 〈 0.002 31.43 ±1.886 P 〈 0.001
야생형 41.22 ±1.005 - 26.76 ±1.099
CaMV35SAthCycD2로 형질전환된 담배에서 식물 1그루당 종자 꼬투리의 평균 수, 6개의 꼬투리의 종자 함량의 평균 중량(g), 식물 1 그루당 평균 종자 수율(g)
주(line) 종자 꼬투리의 평균수 6개의 꼬투리의 종자 함량의 평균 중량(g) 식물 1 그루당 평균 종자 수율(g)
C8-T1-1 105.15 ±14.96 1.085 ±0.174 19.015
C8-T1-2 127.29 ±7.82 0.824 ±0.137 17.481
C8-T1-3 110.46 ±16.30 1.106 ±0.179 20.361
C8-T1-5 97.86 ±10.81 1.105 ±0.178 18.023
C8-T1-6 78.60 ±12.97 1.078 ±0.150 14.123
C8-T1-7 118.17 ±15.64 1.131 ±0.253 22.275
C8-T1-8 123.75 ±4.78 1.123 ±0.165 23.162
C8-T1-9 110.83 ±20.91 1.090 ±0.218 20.134
C8-T1-10 104.20 ±10.99 1.122 ±0.311 19.485
C8-T1-11 138.20 ±8.35 1.116 ±0.222 25.705
C8-T1-12 106.20 ±12.62 1.134 ±0.056 20.072
야생형 106.73 ±16.47 0.938 ±0.118 16.685
야생형 및 변이 묘목에서의 뿌리 발육 비교
주(line) 식물의 수 측생 뿌리(%) 평균 뿌리 길이(mm) 유의 수준
춘화처리 후 9일
WT 23 36 15.326 ±1.893
C8-T1-7 25 100 26.520 ±1.971 0.001
3 33 14.000 ±3.464 ns
C8-T2-2 28 100 26.911 ±2.064 0.001
춘화처리 후 13일
WT 16 100 28.188 ±1.893
C8-T1-7 13 100 53.846 ±1.971 0.001
C8-T2-2 15 100 51.267 ±3.464 0.001
3.2 CaMV35S-AthCycD3 키메라 유전자를 포함하는 담배 식물
CaMV35S-AthCycD3 키메라 유전자를 포함하는 식물을 T1 종자로부터 성장시키고 3.1에 개시한 바와 같이 처리하였다. 약 7일의 간격을 두고 발아 49일 후에 측정하였다. 1K9주에 대해 11그루, 3K9주에 대해 19 그루, 4K9주에 대해 20 그루 및 형질전환되지 않은 대조군에 대해 18 그루를 분석하였다.
최소한 꽃기관이 분명하게 발육하는 단계에 도달한 식물이 75% 이상일 때 꽃잎관 길이 및 폭(cm)과 시간(일)의 변수를 분석하여, 표 5에 요약하였다.
CaMV35S-AthCycD3 키메라 유전자를 포함하는 담배 식물의 측정치 요약
주(line) 꽃잎관의 평균 길이(cm) 꽃잎관의 평균 폭(cm) 꽃기관이 1 cm에 도달하는데 필요한 평균 시간(일)
1K9 5.66 ±0.46 3.44 ±0.27 100
3K9 5.18 ±0.37 3.20 ±0.35 100
4K9 5.48 ±0.38 2.90 ±0.35 93
야생형 3.96 ±0.12 2.39 ±0.10 84
이들 변이 식물은 더 큰 꽃을 보유하며, 변이 식물의 꽃잎관은 형질전환되지 않은 식물의 꽃에서 얻은 꽃잎관보다 평균적으로 더 길며, 꽃기관이 분명하게 발육하는 단계에 도달하는데 더 많은 시간이 필요하였다.
실시예 4. 기타 식물에서 얻은 cycD-상동성 유전자의 분리
지수 함수에 따라 성장하는 담배 BY-2 세포로부터 만든 c-DNA 라이브러리를 람다 Zap Express 벡터(스트라타젠)에서 작제하였다. 대략 7.5 ×105라이브러리 클론을 평판배양하고, 2시간 동안 80℃에서 구워 고정된 Hybond N+나일론막(Amersham Int.)을 사용하여 각 평판으로부터 레플리카 블롯을 하였다. 랜덤 프라이머 작용에 의해 α-32P dCTP로 표지한 cycD2 또는 cycD3 이종 프로브와 막을 하이브리드화시켰다. cycD3 프로브는 에이.탈리아나에서 유래한 cycD3 단편(405 bp HincII-KpnI 단편; EMBL 수탁 번호 X83371의 뉴클레오티드 위치 557 내지 뉴클레오티드 위치 962에 해당하는 뉴클레오티드 서열을 보유함)을 포함하였다. cycD2 프로브는 에이.탈리아나에서 유래한 cycD2의 1298 bp NcoI-SacI 단편(EMBL 수탁 번호 X83371의 뉴클레오티드 위치 194 내지 뉴클레오티드 위치 1332에 해당하는 뉴클레오티드 서열을 보유함)을 포함하였다. cycD3 하이브리드화를 55℃에서 수행하고, 막을 2 ×SSC/0.1% SDS로 2회 10분 동안 세척한 후 0.1 SSC/0.1% SDS에서 10분 동안 1회 세척하고 그 다음 자가방사법을 수행하였다. cycD2 하이브리드화를 48℃에서 수행하였다. 막을 2 ×SSC/0.1% SDS에서 10분 동안 3회 세척하였다 모든 세척은 실온에서 수행하였다, 분리된 라이브러리 클론을 생체내에서 절제하여(제조업자의 프로토콜에 따라) pBK-CMV 파지미드(스트라타젠)에서 서브클론을 형성하였으며 DNA 서열은 표준 방법으로 결정하였다. 서열 정보는 GCG(제네틱 컴퓨터 그룹) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다(1994). 담배에서 유래한 cycD2;1, cycD3;1 및 cycD3;2 cDNA를 각각 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3으로 나타낸다.
또 다른 cDNA 라이브러리를 헬리안더스 투베로서스의 괴경, 뿌리 및 잎에서 분리된 폴리아데닐화된 RNA로부터 제조하였다. cDNA를 올리고(dT) 프라이머를 사용하여 합성하여 EcoRI 부위에서 람다 ZAPII 벡터내로 결찰시켰다.
약 1.25 ×106클론을 평판배양하고, 레플리카 플라크 블롯을 전술한 바와 같이 수행하였으며 전술한 표지 프로브를 사용하여 하이브리드화하였다. 또한, 에이.탈리아나의 cycD1 유전자의 401 bp XbaI-AvaI 단편(EMBL 수탁 번호 X83369의 뉴클레오티드 위치 312 내지 뉴클레오티드 위치 713에 해당하는 뉴클레오티드 서열 보유)를 포함하는 cycD1 프로브를 사용하여 블롯을 검색하였다. 분리된 클론을 상기와 같이 분석하였다. 헬리안더스 투베로서스로부터 얻은 cycD1;1 및 cycD3;1 유전자 서열을 각각 서열 번호 4 및 서열 번호 5로 나타낸다.
또 다른 cDNA 라이브러리를 제아 마이즈(Pa91 ×H99)×H99의 칼러스 물질로부터 분리된 폴리아데닐화된 RNA로부터 만들었다. cDNA를 올리고(dT) 프라이머를 사용하여 합성하여 EcoRI 부위에서 람다 ZAPII 벡터내로 결찰시켰다. 약 1.25 ×106클론을 평판배양하고, 레플리카 플라크 블롯을 전술한 바와 같이 수행하였으며 전술한 표지 프로브를 사용하여 하이브리드화하였다. 분리된 클론을 상기와 같이 분석하였다. 제아 마이즈로부터 얻은 cycD2 cDNA 서열을 서열 번호 21로 나타낸다.
실시예 5. 안티센스 키메라 유전자의 작제 및 담배의 형질 전환체
에이. 탈리아나에서 유래한 CYCD2를 암호하는 DNA를 포함하는 1298 bp NcoI-SacI 단편(EMBL 수탁 번호 X83370의 뉴클레오티드 위치 194 내지 뉴클레오티드 위치 1332에 해당하는 뉴클레오티드 서열을 보유함)을 클레노우 폴리머라제로 처리하여 돌출한 말단을 평활하게 하고 SmaI 선형화된 pART7(Gleave, 1992)에 결찰시켰다. 삽입된 DNA 단편이 CYCD2를 암호하는 DNA를 CabbB-J1 분리물(Harpster et al., 1988) 및 3'ocs 영역(MacDonald et al., 1991)의 CaMV35S 프로모터에 역방식으로 도입되는 방향으로 존재하도록 플라스미드를 선별하여, 발현시 안티센스 RNA을 생성하였다.
선별성 키메라 마커 유전자도 포함하는 키메라 안티센스 유전자를 T-DNA 벡터의 T-DNA 경계사이에 삽입하였다. 이를 위해서, 키메라 cycD2 유전자는 NotI를 사용하여 pCEC2로부터 절제하고, NotI 선형화된 pART27(Gleave, 1992)에 결찰시켜 pCEC6를 형성하였다.
이 키메라 유전자를 사용하여 실시예 2에 개시된 바와 같이 담배 식물을 형질전환시켰다.
실시예 6. 형질전환체의 분석
실시예 5의 키메라 유전자로 형질전환된 식물을 실시예 3.1에 개시된 바와 같이 처리하고, 주 C9-2에 대해 7 그루 및 C9-6에 대해 6 그루의 식물을 분석하였다.
다음과 같은 변수를 분석하였다. 지면에서 최고점 까지의 식물의 높이(평균 높이 ±표준 편차(cm)로 표 6에 요약되어 있음); 한정된 시간에서 최대 잎의 길이(평균 길이 ±표준 편차(cm)로 표 8A 및 8B에 요약되어 있음); 꽃기관 분열 조직을 육안으로 관찰할 수 있는 시간(평균 시간 ±표준 편차(일)로 표 8A 및 8B에 요약되어 있음); 꽃기관 분열 조직을 볼 수 있는 높이(평균 높이 ±표준 편차(cm)로 표 8A 및 8B에 요약되어 있음).
변이 식물은 묘목 단계에서부터 명백한 성장 속도 감소를 나타내며, 그 결과 평균 줄기 높이가 작아진다(표 6). 성장 속도의 감소로 잎 확장이 계속되는 기간에 해당하는 지정 시간 동안 잎의 평균 크기가 작아진다(표 7).
CaMV35S-안티센스 cycD2를 포함하는 형질전환된 담배 식물의 평균 높이(cm)
주(line) C9-2 C9-7 형질전환되지 않은 대조군
주(week) 1 2.64 ±1.22 2.75 ±0.89 4.48 ±1.63
주(week) 2 6.64 ±1.68 6.07 ±1.43 10.50 ±3.33
주(week) 3 20.00 ±3.74 17.21 ±6.47 31.82 ±7.89
주(week) 4 34.07 ±6.13 28.50 ±5.83 54.00 ±7.89
주(week) 5 54.00 ±8.87 45.14 ±8.46 86.56 ±10.91
주(week) 6 74.29 ±9.97 61.29 ±5.11 121.80 ±18.28
주(week) 7 85.92 ±12.03 71.50 ±23.19 145.80 ±19.44
CaMV35S-안티센스 cycD2를 포함하는 형질전환된 담배 식물의 최대 잎의 평균 길이와 형질전환되지 않은 담배 식물의 최대 잎의 평균 길이의 차(cm)
주(line) C9-2 C9-7 형질전환되지 않은 대조군
주(week) 1 -2.31 -4.30 0
주(week) 2 -3.26 -6.44 0
주(week) 3 -4.35 -8.91 0
CaMV35S-안티센스 cycD2를 포함하는 형질전환된 담배 식물에서 평균 꽃 크기(mm), 꽃기관의 평균 높이(cm),꽃기관 발육에 도달하는데 필요한 평균 시간(일)
주(line) 꽃기관에 대한 평균 시간(일) 꽃기관에 대한 평균 높이(cm) 평균 꽃 길이(mm)
C9-2 102a 95 NA
C9-7 89 ±7.95 68.57 ±9.62 38.31
형질전환되지 않은 대조군 79 ±2.39 111 ±10.02 41.22
a모니터하는 동안 하나의 식물만이 꽃기관을 발육시켰다.
변이 담배의 꽃 길이에 대한 안티센스 CycD2 발현의 효과를 기타 주(T1 세대)에서 분석하고, 스튜던트 t-테스트를 사용하여 야생형과 통계학적으로 비교하였다. 각 식물에서 얻은 5개 꽃의 길이를 측정하고 각 변이주에 대한 평균 꽃 길이를 계산하였다. 각 독립적인 변이주에 대한 값을 t-테스트를 사용하여 야생형에 비교하였다. 이 표는 결과가 야생형과 비교하여 통계학적으로 유의적이라는 확률도를 나타낸다.
주(line) 평균 꽃 길이(mm) 유의 수준
C9-T1-1 41.05 ±1.558 ns
C9-T1-3 40.68 ±1.574 ns
C9-T1-7 38.68 ±1.991 ns
C9-T1-10 39.78 ±1.024 P 〈 0.05
C9-T1-12 39.55 ±1.568 P 〈 0.05
평균값 40 ±1.301 P 〈 0.05
야생형 41.22 ±1.005 -
실시예 7. 실시예 1의 T-DNA 및 유사한 벡터를 이용한 종유 평지의 형질 전환 및 형질전환된 식물 분석
다음과 같이 변형시킨 것을 제외하고는 De Block 등의 문헌(1989)에 개시된 방법과 거의 동일하게 브라씨카 나푸스(Brassica napus)의 배축 외식편을 수득하고, 배양한 후 형질전환시켰다.
- 배축 외식편을 A2 배지[MS, 0.5 g/ℓMes(pH5.7), 1.2% 글루코스, 0.5% 아가로스, 1 ㎎/ℓ 2,4-D, 0.25 ㎎/ℓ 나프탈렌 아세트산(NAA) 및 1 ㎎/ℓ 6-벤질아미노푸린 (BAP)]에서 1일 동안 예비배양한다.
- 감염 배지 A3은 MS, 0.5 g/ℓMes(pH5.7), 1.2% 글루코스, 0.1 ㎎/ℓ NAA, 0.75 ㎎/ℓ BAP 및 0.01 ㎎/ℓ지베레린산(GA3)이다.
-선별 배지 A5G는 3주 동안 MS, 0.5 g/ℓMes(pH5.7), 1.2% 글루코스, 40 ㎎/ℓ 아데닌.SO4, 0.5 g/ℓ 폴리비닐피롤리돈(PVP), 0.5% 아가로스, 0.1 ㎎/ℓNAA, 0.75 ㎎/ℓ BAP, 0.01 ㎎/ℓ GA3, 250 ㎎/ℓ카베니실린, 250 ㎎/ℓ트리아실린, 5 ㎎/ℓAgNO3이다. 이 기간 후에 선별은 A5J 배지(3% 수크로즈를 제외하고는 A5G와 유사)에서 계속된다.
-재생 배지 A6은 MS, 0.5 g/ℓMes(pH5.7), 2% 수크로스, 40 ㎎/ℓ 아데닌.SO4, 0.5 g/ℓ PVP, 0.5% 아가로스, 0.0025 ㎎/ℓBAP 및 250 ㎎/ℓ 트리아실린이다.
- 건강한 새순을 A9였던 뿌리를 내리게 하는 배지[1ℓ용기내에 1/2로 농축된 MS, 1.5% 수크로스(pH5.8), 100 ㎎/ℓ 트리아실린, 0.6% 아가]로 옮긴다. MS는 Murashige 및 Skoog 배지를 의미한다(Murashige and Skoog, 1962).
T-DAN 벡터 pGSV5와 상동성을 보유하는 2.5 kb 단편에 결합된 박테리아 클로람페니콜 내성 유전자를 pMP90내로 삽입하여 얻은 pMP90의 유도체인 pGV4000과 같은 헬퍼 Ti-플라스미드를 보유하는 아그로박테리움 투메페이션스 균주 C58C1RifR로 배축 이식편을 감염시킨다. 상기 pGSV5로부터 유도된 T-DNA 벡터는 T-DNA 경계 사이에 실시예 1의 키메라 유전자 및 키메라 마커 유전자(pCEC5b 및 pCRK9b)를 포함한다.
본 발명의 키메라 유전자를 포함하는 변이 종유 평지 식물은 영양 프로그램 가속화(성장 속도 증가), 개화 단계에 도달하는데 필요한 시간 감소, 꽃의 수 증가 및 식물 1그루당 종자 수율 증가를 나타낸다.
실시예 8. 실시예 1의 벡터 및 유사한 벡터를 이용한 옥수수 식물의 형질 전환 및 형질전환된 식물 분석
WO92/09696에 따라 실시예 1의 벡터로 옥수수 식물을 형질전환시킨다. 본 발명의 키메라 유전자를 포함하는 변이 옥수수는 영양 프로그램 가속화(성장 속도 증가), 개화 단계에 도달하는데 필요한 시간 감소, 꽃의 수 증가 및 식물 1그루당 종자 수율 증가를 나타낸다.
실시예 9. 실시예 1의 벡터 및 유사한 벡터를 이용한 토마토 식물의 형질 전환 및 형질전환된 식물 분석
De Block 등의 문헌(1987)에 개시된 방법에 따라 실시예 1의 벡터로 토마토 식물을 형질전환시킨다. 본 발명의 키메라 유전자를 포함하는 변이 토마토는 영양 프로그램 가속화(성장 속도 증가), 개화 단계에 도달하는데 필요한 시간 감소, 꽃의 수 증가 및 식물 1그루당 과실 수율 증가를 나타낸다.
실시예 10. 실시예 1의 벡터 및 유사한 벡터를 이용한 상추의 형질 전환 및 형질전환된 식물 분석
Micheimore 등의 문헌(1987)에 개시된 방법에 따라 실시예 1의 벡터로 상추 식물을 형질전환시킨다. 본 발명의 키메라 유전자를 포함하는 변이 상추는 영양 프로그램 가속화(성장 속도 증가), 개화 단계에 도달하는데 필요한 시간 감소, 꽃의 수 증가 및 식물 1그루당 종자 수율 증가를 나타낸다.
실시예 11. 분리 개체군 및 비분리 개체군에서 실시예 3의 CaMV35SAthCycD2 작제물로 형질전환시킨 변이 담배주의 자손의 추가 표현형 분석
CaMV35SAthCycD2 작제물(실시예 3의 주2 및 주5)로 형질전환시킨 2개의 변이 담배주로부터 얻은 식물의 자손 개체군(분리 또는 비분리)을 줄기의 평균 높이 또는 식물의 평균 건식 중량을 측정하여 개화에 필요한 시간 길이 및 영양 성장의 증가에 대해 분석하였다.
카나마이신에 대한 내성을 확인하여 변이 유전자의 분리를 모니터하였다. 분리 개체군의 경우 32 그루의 식물을 분석한 반면, 비분리 개체군의 경우 12 그루의 식물을 분석하였다. 비형질전환된 개체군은 모두 12 그루였다.
다음과 같은 개체군을 사용하였다.
분리 개체군:
주(Line) 2
C8-T1-2[C8-2 1차 형질전환체에서 얻은 T1 종자: T-DNA에 대해 3:1 분리]
C8-T2-2[자가수분된 C8-T1-2 식물 #3에서 얻은 T2 종자, 이는 반접합체이고 따라서 종자는 T-DNA에 대해 3:1 분리]
C8-T2-2[화분 모체로서 야생형을 사용하여 야생형 식물에 C8-T1-2 식물 #3의 교배에서 얻은 T2 종자. 이 종자는 T-DNA에 대해 1:1로 분리하고, 모든 T-DNA 함유 식물은 반접합체이다]
주(Line) 5
C8-T1-5[C8-5 1차 형질전환체에서 얻은 T1 종자: T-DNA에 대해 3:1 분리]
C8-T2-5[자가수분된 C8-T1-5 식물 #304에서 얻은 T2 종자, 이는 반접합체이고 따라서 종자는 T-DNA에 대해 3:1 분리]
비분리 개체군:
주(Line) 2
C8-T2-2[자가수분된 C8-T1-2 식물 #302에서 얻은 T2 종자, 이는 T-DNA에 대해 동종접합체임]
주(Line) 5
C8-T2-5[화분 모체로서 야생형을 사용하여 야생형 식물에 교배한 C8-T1-5 식물 #121에서 얻은 T2 종자. 식물 #121은 T-DNA에 대해 동종접합체이고, 모든 T2 종자는 T-DNA에 대해 반접합체이다]
C8-T2-5[자가수분된 C8-T1-5 식물 #121에서 얻은 T2 종자. 식물 #121은 T-DNA에 대해 동종접합체이고, 모든 T2 종자는 T-DNA에 대해 동종접합체이다].
변이 담배 식물에서 꽃기관 발육을 개시하는데 걸리는 시간 길이에 대한 CycD2 과발현의 영향을 측정하고, 야생형 및 변이 개체군의 변종은 동일하다고 가정하지 않는 비변수 t-테스트를 사용하여 야생형 대조 개체군에 대해 측정된 동일한 변수에 대한 값과 통계학적으로 비교하였다. 0.5 cm의 꽃기관을 발육하기 위해 각 식물에서 필요한 시간을 기록하고, 춘화처리후 평균 일수를 계산하였다. 각 변이 개체군에 대한 값을 t-테스트로 야생 개체군의 값과 비교하였다. 분리주에 대한 자료는 카나마이신 내성 개체군 및 카나마이신 감수성 개체군에 대해 분류하였다. 카나마이신 내성 개체군에 대한 자료는 동종접합 카나마이신 내성 아개체군(더 이상 분리되지 않음) 및 반접합 카나마이신 내성 아개체군(추가로 3:1로 분리)에 대해 별도로 제시하였다. 표 9에 이들 자료를 요약하였다. 춘화처리후 여러 시점에서 변이 비분리주의 줄기 높이의 평균값을 야생형 개체군과 비교하여 표 10에 요약하였다(통계적으로 분석). 0.05 미만의 유의 수준은 대조군의 평균 높이와 각 변이주의 평균 높이 사이에 차이가 상당히 있다는 것을 보여준다. ns는 개체군 사이에 상당한 차이가 없다는 것을 의미한다. 또한, 언급한 비분리 개체군으로부터의 묘목의 생물량을초기 영양 성장 과정에서 야생형 묘목의 생물량과 비교하였다. 춘화처리후에 지정된 날에 묘목을 수거하고 2일 동안 70℃에서 건조시키기 전에 칭량하였다. 묘목의 평균 건식 중량 및 표준 편차를 계산하고 그 결과를 표 11에 제시하였다.
변이 담배에서 꽃기관 발육을 개시하는데 필요한 시간에 대한 CycD2 과발현의 영향
개체군 0.5 cm 꽃기관에 대한 평균 시간(일) 표준 편차 유의 수준
비분리주
WTC8-T2-2(자가수분된 302)C8-T1-5(자가수분된 121)C8-T1-5(121 ×WT)평균값 72.12563.6267.7864.1865.19 2.2583.8632.4381.9912.258 -0.0010.020.0010.001
분리주
자가수분된 C8-T1-2 모두 카나마이신 내성 반접합체 동종접합체카나마이신 감수성 59.0459.3278.5073.00 2.9733.1102.5075.944 0.0010.0010.001ns
C8-T2-2 pl3 ×야생형모두 카나마이신 내성카나마이신 감수성 59.4469.10 2.7562.846 0.001ns
자가수분된 C8-T2-2 pl3 모두 카나마이신 내성 반접합체 동종접합체카나마이신 감수성 59.2059.2559.3873.50 2.1411.6533.0215.431 0.0010.0010.001ns
C8-T1-5는 모두 카나마이신 내성카나마이신 감수성 62.6771.50 3.3675.782 0.001ns
자가수분된 C8-T2-5 pl304 반접합체 동종접합체카나마이신 감수성 64.5065.8374.50 3.0302.4837.764 0.0010.002ns
CaMV35SAthCycD2를 포함하는 변이 담배 식물의 줄기 높이를 야생형의 경우과 통계학적으로 비교
개체군 34일 37일 41일 45일 49일 55일 63일 70일 77일 최종 높이
야생형 1.48±0.238 3.50±0.831 7.59±1.932 14.59±3.816 25.81±6.030 58.24±8.423 107.06±8.306 136.75±7.105 153.94±7.430 177.71±13.129
C8-T2-2(자가수분된 302) 3.55±0.451 6.02±1.662 11.11±3.823 19.35 ±6.528 32.81±9.181 67.50±12.281 120.12±12.829 151.46±15.253 165.23±14.696 177.23±13.935
유의수준 0.002 0.001 0.01 0.05 0.05 0.05 0.01 0.01 0.05 ns
C8-T2-5(자가수분된 121) 4.25±0.507 6.02±1.662 11.11±3.823 19.35±6.528 32.81±9.181 71.82±7.604 119.86±10.675 152.82±11.297 170.73±11.130 192.18±7.846
유의 수준 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.01 0.001 0.001 0.01
C8-T2-5(121 ×야생형) 4.37±0.378 8.14±1.914 14.76±2.550 25.18±3.314 39.91±4.898 75.04±6.258 117.83±9.808 146.54±13.422 160.71±15.183 174.1±14.963
유의 수준 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.01 0.05 ns ns
춘화처리후 상이한 시점에서 야생형(WT) 묘목과 CycD2를 과발현하는 변이 묘목의 비분리 개체군에서 얻은 건식 중량 측정(㎎)의 요약. 모든 경우에, t-테스트는 각 변이주의 평균 생물량과 대조군의 평균 생물량 사이에 상당한 차이가 있음을 보여준다.
개체군 17일 23일 28일 34일 38일
C8-T2-2(자가수분된 302) 3.75 ±1.462 22.11 ±6.59 53.19 ±9.97 337 ±58.3 530 ±60.0
C8-T2-5(자가수분된 121) 4.30 ±1.623 29.05 ±10.50 49.14 ±8.51 351 ±67.6 547 ±24.9
C8-T2-5(121 ×WT) 5.48 ±1.130 39.51 ±10.13 79.81 ±20.36 476 ±120.2 946 ±154
야생형 1.2 ±0.510 13.16 ±3.09 29.88 ±14.89 135 ±60.72 382 ±90.3
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서열 목록
(1) 일반 정보 :
(i) 출원인 :
(A) 성명 : 캠브리지 유니버시티 테크니칼 서비스 리미티드
(B) 스트리트 : 트리니티 레인 더 올드 스쿨스
(C) 도시 : 캠브리지
(E) 국가 : 영국
(F) 우편번호(ZIP) : 씨비2 1티에스
(G) 전화 : 44-1223334755
(H) 팩스 : 44-1223332797
(ii) 발명의 명칭 : 성장이 변형된 식물
(iii) 서열의 수 : 21
(iv) 컴퓨터 판독 형태 :
(A) 매체 유형 : 플로피 디스크
(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환기종
(C) 작동 체계 : PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어 : PatentIn Release #1.0, Version #1.30(EPO)
(2) 서열 번호 1 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 1284 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 2본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자의 타입 : cDNA 내지 mRNA
(iii) 추정 서열 : 아니오
(iv) 안티센스 : 아니오
(vi) 기원
(A) 유기체 : 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)
(ix) 서열의 특징
(A) 명칭/키 : -
(B) 존재위치 : 182..1243
(D) 기타 정보 : /주 = "시클린 CYCD2;1을 암호하는 cDNA"
(xi) 서열 번호 1:
[서열 1a]
[서열 1b]
(2) 서열 번호 2 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 1679 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 2본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자의 타입 : cDNA 내지 mRNA
(iii) 추정 서열 : 아니오
(iv) 안티센스 : 아니오
(vi) 기원
(A) 유기체 : 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)
(ix) 서열의 특징
(A) 명칭/키 : -
(B) 존재위치 : 181..1299
(D) 기타 정보 : /주 = "시클린 CYCD3;1을 암호하는 cDNA"
(xi) 서열 번호 2:
[서열 2a]
[서열 2b]
(2) 서열 번호 3 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 1431 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 2본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자의 타입 : cDNA 내지 mRNA
(iii) 추정 서열 : 아니오
(iv) 안티센스 : 아니오
(vi) 기원
(A) 유기체 : 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)
(ix) 서열의 특징
(A) 명칭/키 : -
(B) 존재위치 : 198..1298
(D) 기타 정보 : /주 = "시클린 CYCD3;2를 암호하는 cDNA"
(xi) 서열 번호 3:
[서열 3a]
[서열 3b]
(2) 서열 번호 4 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 1788 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자의 타입 : cDNA 내지 mRNA
(iii) 추정 서열 : 아니오
(iv) 안티센스 : 아니오
(vi) 기원
(A) 유기체 : 헬리안더스 투베로서스(Helianthus tuberosus)
(ix) 서열의 특징
(A) 명칭/키 : -
(B) 존재위치 : 165..1109
(D) 기타 정보 : /주 = "시클린 CycD1;1을 암호하는 cDNA"
(xi) 서열 번호 4:
[서열 4a]
[서열 4b]
(2) 서열 번호 5 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 1414 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 2본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자의 타입 : cDNA 내지 mRNA
(iii) 추정 서열 : 아니오
(iv) 안티센스 : 아니오
(vi) 기원
(A) 유기체 : 헬리안더스 투베로서스(Helianthus tuberosus)
(ix) 서열의 특징
(A) 명칭/키 : -
(B) 존재위치 : 48..1118
(D) 기타 정보 : /주 = "CYCD3;1을 암호하는 cDNA"
(xi) 서열 번호 5:
[서열 5]
(2) 서열 번호 6 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 100 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 2본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자의 타입 : 기타 핵산
(A) 특성; /desc="PGSV5의 T-DNA의 DNA 서열"
(iii) 추정 서열 : 아니오
(iv) 안티센스 : 아니오
(ix) 서열의 특징
(A) 명칭/키 : -
(B) 존재위치 : 1..25
(D) 기타 정보 : /라벨=RB
/주 = "PGSV5의 T-DNA에서 유래한 우측 경계 서열"
(ix) 서열의 특징
(A) 명칭/키 : -
(B) 존재위치 : 26..75
(D) 기타 정보 : /라벨=MCS
/주 = "다중 클로닝 부위"
(ix) 서열의 특징
(A) 명칭/키 : -
(B) 존재위치 : 76..100
(D) 기타 정보 : /라벨=LB
/주 = "PGSV5의 T-DNA에서 유래한 좌측 경계 서열"
(xi) 서열 번호 6:
[서열 6]
(2) 서열 번호 7 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 17 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자의 타입 : 기타 핵산
(A) 특성/ desc="PCR을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 1"
(xi) 서열 번호 7:
[서열 7]
(2) 서열 번호 8 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 17 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자의 타입 : 기타 핵산
(A) 특성/ desc="PCR을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 2"
(xi) 서열 번호 8:
[서열 8]
(2) 서열 번호 9 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 18 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자의 타입 : 기타 핵산
(A) 특성/ desc="PCR을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 3"
(xi) 서열 번호 9:
[서열 9]
(2) 서열 번호 10 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 19 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자의 타입 : 기타 핵산
(A) 특성/ desc="PCR을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 4"
(xi) 서열 번호 10:
[서열 10]
(2) 서열 번호 11 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 19 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자의 타입 : 기타 핵산
(A) 특성/ desc="PCR을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 5"
(xi) 서열 번호 11:
[서열 11]
(2) 서열 번호 12 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 16 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자의 타입 : 기타 핵산
(A) 특성/ desc="PCR을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 6"
(xi) 서열 번호 12:
[서열 12]
(2) 서열 번호 13 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 17 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자의 타입 : 기타 핵산
(A) 특성/ desc="PCR을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 7"
(xi) 서열 번호 13:
[서열 13]
(2) 서열 번호 14 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 19 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자의 타입 : 기타 핵산
(A) 특성/ desc="PCR을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 8"
(xi) 서열 번호 14:
[서열 14]
(2) 서열 번호 15 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 17 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자의 타입 : 기타 핵산
(A) 특성/ desc="PCR을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 9"
(xi) 서열 번호 15:
[서열 15]
(2) 서열 번호 16 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 17 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자의 타입 : 기타 핵산
(A) 특성/ desc="PCR을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 10"
(xi) 서열 번호 16:
[서열 16]
(2) 서열 번호 17 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 17 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자의 타입 : 기타 핵산
(A) 특성/ desc="PCR을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 11"
(xi) 서열 번호 17:
[서열 17]
(2) 서열 번호 18 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 20 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자의 타입 : 기타 핵산
(A) 특성/ desc="PCR을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 12"
(xi) 서열 번호 18:
[서열 18]
(2) 서열 번호 19 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 24 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자의 타입 : 기타 핵산
(A) 특성/ desc="PCR을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 13"
(xi) 서열 번호 19:
[서열 19]
(2) 서열 번호 20 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 20 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자의 타입 : 기타 핵산
(A) 특성/ desc= "PCR을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 PR 14"
(xi) 서열 번호 20:
[서열 20]
(2) 서열 번호 21 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 1846 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 2본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자의 타입 : cDNA 내지 mRNA
(iii) 추정 서열 : 아니오
(iv) 안티센스 : 아니오
(vi) 기원:
(A) 유기체 : 제아 마이즈(Zea mays)
(ix) 서열의 특징
(A) 명칭/키 : -
(B) 존재위치 : 316..1389
(D) 기타 정보 : /주 = ."시클린 CYCD2를 암호하는 cDNA"
(xi) 서열 번호 21 :
[서열 21]

Claims (42)

  1. Rb 유사 단백질을 결합 또는 인산화시킬 수 있는 식물의 세포내의 세포 분열 제어 단백질의 양 또는 작용량을 변형시키는 단계를 포함하여, 성장 특성이 변형되거나 또는 구조가 변형된 식물을 얻는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포 분열 제어 단백질이 단백질의 N-말단부내에 Rb 유사 단백질 결합 모티프를 포함하는 것이 특징인 방법.
  3. 제2항에 있어서, Rb 유사 단백질 결합 모티프가 LxCxE인 것이 특징인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 세포 분열 제어 단백질이 D형 시클린인 것이 특징인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서,
    a) 식물의 발현가능한 프로모터 영역
    b) 발현시 세포 분열 제어 단백질의 양 또는 작용량을 증가 또는 감소시키는 RNA 또는 단백질을 암호하는 전사된 DNA 영역; 및 임의적으로
    c) 식물 세포에서 작용하는 3' 단부 형성 및 폴리아데닐화 시그널이 작동가능하게 결합된 DNA 단편을 포함하는 키메라 유전자를 식물 세포내에서 발현시켜 상기 세포 분열 제어 단백질의 양 또는 작용량을 변형시키는 것이 특징인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 전사된 DNA 영역이 발현시 세포 분열 제어 단백질의 발현을 감소, 억제 또는 방지하는 안티센스 RNA, 리보자임 또는 센스 RNA 가닥을 암호하는 것이 특징인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 전사된 DNA 영역이 발현시 내인성 D형 시클린의 발현을 감소, 억제 또는 방지하는 안티센스 RNA를 암호하는 것이 특징인 방법.
  8. 제5항에 있어서, 전사된 DNA 영역이 Rb 유사 단백질을 결합 또는 인산화시킬 수 있는 세포 분열 제어 단백질을 암호하는 것이 특징인 방법.
  9. 제5항에 있어서, 전사된 DNA 영역이 Rb 유사 단백질 결합 모티프를 포함하는세포 분열 제어 단백질을 암호하는 것이 특징인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 결합 모티프가 LxCxE인 것이 특징인 방법.
  11. 제5항에 있어서, 전사된 DNA 영역이 D형 시클린을 암호하는 것이 특징인 방법.
  12. 제11항에 있어서, D형 시클린이 식물에서 유래한 D형 시클린인 것이 특징인 방법.
  13. 제12항에 있어서, D형 시클린이 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) CYCD1, 아라비돕시스 탈리아나 CYCD2, 아라비돕시스 탈리아나 CYCD3, 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) CYCD3;1, 니코티아나 타바쿰 CYCD2;1, 니코티아나 타바쿰 CYCD3;2, 헬리안더스 투베로서스(Helianthus tuberosus) CYCD1;1, 제아 마이즈(Zea mays) CYCD2 및 헬리안더스 투베로서스 CYCD3에서 선택된 것이 특징인 방법.
  14. 제12항에 있어서, 전사된 DNA 영역이 EMBL 수탁 번호 X83369의 뉴클레오티드 위치 104 내지 뉴클레오티드 위치 1108에 해당하는 뉴클레오티드 서열, EMBL 수탁 번호 X83370의 뉴클레오티드 위치 195 내지 뉴클레오티드 위치 1346에 해당하는 뉴클레오티드 서열, EMBL 수탁 번호 X83371의 뉴클레오티드 위치 266 내지 뉴클레오티드 위치 1396에 해당하는 뉴클레오티드 서열, 서열 번호 1의 뉴클레오티드 위치 182 내지 뉴클레오티드 위치 1243에 해당하는 뉴클레오티드 서열, 서열 번호 2의 뉴클레오티드 위치 181 내지 뉴클레오티드 위치 1299에 해당하는 뉴클레오티드 서열, 서열 번호 3의 뉴클레오티드 위치 198 내지 뉴클레오티드 위치 1298에 해당하는 뉴클레오티드 서열, 서열 번호 4의 뉴클레오티드 위치 165 내지 뉴클레오티드 위치 1109에 해당하는 뉴클레오티드 서열, 서열 번호 5의 뉴클레오티드 위치 48 내지 뉴클레오티드 위치 1118에 해당하는 뉴클레오티드 서열 및 서열 번호 21의 뉴클레오티드 위치 316 내지 뉴클레오티드 위치 1389에 해당하는 뉴클레오티드 서열에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이 특징인 방법.
  15. 제5항에 있어서, 전사된 DNA 영역이 발현시 세포 분열 제어 단백질의 작용량을 증가시키는 단백질 또는 펩티드를 암호하는 것이 특징인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 전사된 DNA 영역이 변이 D형 시클린, D형 시클린의 일부, 시클린 박스에 변이를 보유한 D형 시클린, 아미노산 185 또는 아미노산 155가 치환된 D2형 시클린, 변이 E185A 또는 K155A를 보유한 D2형 시클린, PEST 서열이 제거된 D형 시클린, LxCxE 결합 모티프가 변화되거나 결실된 D형 시클린, 또는 LxCxE 결합 모티프로부터 C 잔기가 결실된 D형 시클린으로부터 선택된 단백질 또는 펩티드를 암호하는 것이 특징인 방법.
  17. 제5항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 있어서, 식물 발현 프로모터 영역이 CaMV35S 프로모터 영역인 것이 특징인 방법.
  18. 제6항 또는 제7항에 있어서, 변형된 성장 특성이 감소된 성장 속도를 포함하는 것이 특징인 방법.
  19. 제8항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 있어서, 변형된 성장 특성이 증가된 성장 속도를 포함하는 것이 특징인 방법.
  20. 제8항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 있어서, 변형된 성장 특성이 더 신속한 발아를 포함하는 것이 특징인 방법.
  21. 제8항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 있어서, 변형된 성장 특성이 개화에 필요한 시간의 감소를 포함하는 것이 특징인 방법.
  22. 제8항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 있어서, 변형된 구조가 식물 1 그루당 꽃의 수 증가 또는 식물 1 그루당 종자 수의 증가 또는 식물 1 그루당 과실 수의 증가를 포함하는 것이 특징인 방법.
  23. 제5항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 기재된 키메라 유전자.
  24. 제23항에 기재된 키메라 유전자를 포함하는 식물 세포.
  25. 제24항에 기재된 식물 세포를 실질적으로 포함하는 식물.
  26. 제25항에 있어서, 온실에서 성장하는 것이 특징인 식물.
  27. 제23항에 있어서, 식물이 소나무, 포플라, 유칼립터스 나무, 자두개자리, 콩과 식물, 잔디, 옥수수, 종유 평지(oil seed rape), 아마씨, 밀, 유채속 식물, 토마토, 상추, 쌀, 보리, 감자, 담배, 사탕무, 해바라기, 카네이션, 국화, 장미 또는 튜울립에서 선택되는 것이 특징인 식물.
  28. 제23항에 기재된 키메라 유전자를 포함하는 제25항 내지 제27항 중 어느 하나의 항에 기재된 식물의 종자.
  29. 서열 번호 1의 뉴클레오티드 위치 182 내지 뉴클레오티드 위치 1243에 해당하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 DNA 단편.
  30. 서열 번호 2의 뉴클레오티드 위치 181 내지 뉴클레오티드 위치 1299에 해당하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 DNA 단편.
  31. 서열 번호 3의 뉴클레오티드 위치 198 내지 뉴클레오티드 위치 1298에 해당하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 DNA 단편.
  32. 서열 번호 4의 뉴클레오티드 위치 165 내지 뉴클레오티드 위치 1109에 해당하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 DNA 단편.
  33. 서열 번호 5의 뉴클레오티드 위치 48 내지 뉴클레오티드 위치 1118에 해당하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 DNA 단편.
  34. 서열 번호 21의 뉴클레오티드 위치 316 내지 뉴클레오티드 위치 1389에 해당하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 DNA 단편.
  35. 식물의 성장 특성 또는 구조를 변형시키는데 있어서 Rb 유사 단백질의 포켓 도메인을 결합시킬 수 있거나 Rb 유사 단백질을 인산화시킬 수 있는 세포 분열 제어 단백질의 용도.
  36. 제35항에 있어서, 상기 세포 분열 제어 단백질이 단백질의 N-말단부내에 LxCxE 결합 모티프를 포함하는 것이 특징인 용도.
  37. 제36항에 있어서, 상기 세포 분열 제어 단백질이 D형 시클린인 것이 특징인 용도.
  38. 제37항에 있어서, 세포 분열 제어 단백질이 아라비돕시스 탈리아나 CYCD1, 아라비돕시스 탈리아나 CYCD2, 아라비돕시스 탈리아나 CYCD3, 니코티아나 타바쿰 CYCD3;1, 니코티아나 타바쿰 CYCD2;1, 니코티아나 타바쿰 CYCD3;2, 헬리안더스 투베로서스 CYCD1;1, 제아 마이즈 CYCD2 및 헬리안더스 투베로서스 CYCD3에서 선택된 D형 시클린인 것이 특징인 용도.
  39. 제34항 내지 제37항 중 어느 하나의 항에 있어서, 세포 분열 제어 단백질이 식물 세포의 게놈내로 통합된 키메라 유전자에 의해 암호되는 것이 특징인 용도.
  40. 식물의 성장 특성 또는 구조를 변형시키는데 있어서 Rb 유사 단백질을 결합 또는 인산화시킬 수 있는 세포 분열 제어 단백질을 암호하는 DNA의 용도.
  41. 제40항에 있어서, 세포 분열 제어 단백질이 D형 시클린인 것이 특징인 용도.
  42. 제41항에 있어서, DNA가 EMBL 수탁 번호 X83369의 뉴클레오티드 위치 104 내지 뉴클레오티드 위치 1108에 해당하는 뉴클레오티드 서열, EMBL 수탁 번호 X83370의 뉴클레오티드 위치 195 내지 뉴클레오티드 위치 1346에 해당하는 뉴클레오티드 서열, EMBL 수탁 번호 X83371의 뉴클레오티드 위치 266 내지 뉴클레오티드 위치 1396에 해당하는 뉴클레오티드 서열, 서열 번호 1의 뉴클레오티드 위치 182 내지 뉴클레오티드 위치 1243에 해당하는 뉴클레오티드 서열, 서열 번호 2의 뉴클레오티드 위치 181 내지 뉴클레오티드 위치 1299에 해당하는 뉴클레오티드 서열, 서열 번호 3의 뉴클레오티드 위치 198 내지 뉴클레오티드 위치 1298에 해당하는 뉴클레오티드 서열, 서열 번호 4의 뉴클레오티드 위치 165 내지 뉴클레오티드 위치 1109에 해당하는 뉴클레오티드 서열, 서열 번호 5의 뉴클레오티드 위치 48 내지 뉴클레오티드 위치 1118에 해당하는 뉴클레오티드 서열 및 서열 번호 21의 뉴클레오티드 위치 316 내지 뉴클레오티드 위치 1389에 해당하는 뉴클레오티드 서열에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이 특징인 용도.
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