KR20040015044A - 식물 바이러스 이동 단백질에 결합하는 식물 단백질을이용한 바이러스-저항성 부여 - Google Patents

식물 바이러스 이동 단백질에 결합하는 식물 단백질을이용한 바이러스-저항성 부여 Download PDF

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Abstract

식물에 식물 바이러스-저항성을 부여하는 방법. 이러한 방법은 식물 바이러스 이동 단백질에 결합하는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 식물 세포 내로 도입시키는 단계를 포함한다. 하나의 실시태양에서 상기-기술된 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코드된 단백질은 서열번호: 2의 1- 내지 86-포지션에 나타난 서열 또는 하나 또는 수개의 아미노산의 치환, 삭제 또는 첨가에 의해 이러한 서열에 의해 유도된 서열을 포함하고 식물 바이러스의 이동 단백질에 결합한다. 하나의 실시태양에서 상기-기술된 폴리뉴클레오타이드는 스트린전트 조건하에서 서열번호: 1의 14- 내지 271-포지션에 나타난 서열 또는 이러한 뉴클레오타이드 서열과 하이브리다이즈 하는 것이 가능한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

Description

식물 바이러스 이동 단백질에 결합하는 식물 단백질을 이용한 바이러스-저항성 부여{Impartment of virus-resistance with the use of plant protein binding to plant virus transport protein}
일부 몰드(mold) 및 박테리아는 세포벽-분해 효소를 분비함으로서 식물에 침입한다. 반면에 RNA 바이러스에 속하는 담배 모자이크 바이러스(TMV) 및 토마토 모자이크 바이러스(ToMV)와 같은 식물 바이러스는 세포벽-분해 효소의 유전자를 인코드하지 않고 물리적 흉터를 통해 진입하거나 곤충 또는 진균에 의해 이동된 후에만 세포벽을 통해 진입할 수 있다.
높은 감염성 바이러스, 예를 들어 담배 모자이크 바이러스는 하루 당 106개 자손의 생산과 같은 대규모 증식 활성을 나타낸다. 이러한 증식 레벨은 항상 질병을 유발하지는 않는다. 초기에 감염된 세포는 전체 식물의 단지 일부분이고 대부분의 세포는 침해되지 않는다. 많은 경우 잎의 표면 상의 세포는 먼저 바이러스로 감염되고 바이러스는 바이러스가 증식하는 엽육세포 내로 이동한다. 증식된 바이러스는 주변 엽육세포 내로 유포된다. 이러한 방식으로 바이러스는 식물 조직을 통해 유포된다. 이러한 이웃 세포로의 식물 바이러스 유포의 과정은 셀-투-셀 이동(cell-to-cell movement)라고 불린다. 유관속초(vascular bundle sheath), 사부유조직(sieve parenchyma) 및 동반세포로 이동하고 뒤이어 사부요소를 통해 조직에서 조직으로 이동하기 시작한다(Saibo-Kogaku[Cellular Engineering], Special Issue, Syokubuktu-Saibo-Kogaku[Plant Cellular Engineering] series, Vol. 8, Shujyunsha, pp. 146-155, Chapter 3 "Uirius-Teikosei-no-tame-no-Senryaku[Stratagy for Virus Resistance]", p. 2, Yuichiro Watanabe, "Syokubutsu-Uirusu-no-Saibokan-Iko[Cell-to-Cell Movement of Plant Virus]").
바이러스 감염에 대한 숙주 식물의 저항성 반응의 예는 : (1) 바이러스 증식량의 억제 또는 바이러스 증식에도 불구한 실질적인 질병 징후의 부재(내성) ; (2)바이러스가 처음 진입한 세포에서만의 바이러스 증식 및 바이러스가 식물에 걸쳐 유포될 수 없도록 하는 주변 세포로의 바이러스의 이동 방지(역치하의(subliminal) 감염) ; (3) 감염된 잎에서의 바이러스 증식 및 감염된 잎에서 상부 잎으로의 장거리 이동의 억제 ; 및 (4) 어떤 조직적 감염을 유발하지 않는 바이러스 감염 초기 단계에서의 감염 사이트 조직의 빠른 회저(necrosis)이다. 바이러스가 회저 조직 또는 그의 주변부에 위치하여 조직적 감염을 회피한다(고감도 반응). 이들 발견에 기초하여 저항성 메카니즘을 더욱 설명하려는 노력이 이루어져 왔다. 이러한 노력으로 바이러스 저항성의 분자적 연구는 바이러스 감염 및 숙주 식물의 관점에서 생리적 생화학적 분석 및 유전적 분석에 의해 수행되었다(Saibo-Kogaku[Cellular Engineering], Special Issue, Syokubuktu-Saibo-Kogaku[Plant Cellular Engineering] series, Vol. 8, Shujyunsha, pp. 166-176, Chapter 3 "Uirius-Teikosei-no-tame-no-Senryaku [Stratagy for Virus Resistance]", p. 3, Hideki Takahashi, "Uirusu-ni-tai- suru-Syunkusyu-Teikosei[Host Resistance to Virus]").
개별 세포 내에서의 게놈 복제, 플라스모데스마타(plamodesmata)를 통한 셀-투-셀 이동 및 사관을 통한 장거리 이동과 같은 연속적인 감염 단계를 통해 증식한다(Carrington et al., (1996) Plant Cell 8, 1669-1681; Baker et al., (1997) Science 276, 726-733). 이들 단계에서 바이러스 이동은 하나 이상의 이동 단백질(MPs)라고 불리는 바이러스-인코드된 단백질에 의해 촉진된다(Deom etal.(1002) Cell 69, 221-224). 이들은 다양한 숙주 인자와 상호작용해야 한다(Carrington et al., 상동 ; Baker et al., 상동). 기능성 도메인은 많은 식물 바이러스의 MPs 내에서 특성화되었다. 이들은 담배 모자이크 바이러스(TMV) 및 오이 모자이크 바이러스(CMV)를 포함한다. TMV에서 2개의 RNA 결합 도메인은 MP의 C 말단 반(half) 내에서 확인된 반면(Citovsky et al., (1990) Cell 60, 637-647) 이러한 도메인의 단 하나만이 CMV MP의 세 번째 C 말단에서 발견되었다(3a 단백질; Vaquero et al., (1997) J. Gen. Virol. 78, 2095-2099). 이러한 RNA 결합력의 장점에 의해 바이러스가 핵단백질 복합물로서 세포에서 세포로 이동되는 것으로 여겨진다(Lazarowitz and Beachy, (1999) Plant Cell 11, 535-548). 바이러스 패밀리와 달리 MPs는 관 구조를 형성하고(van Lent et al., (1991) J. Gen. Virol. 72, 2615-2623; Storms et al., (1995) Virology 214, 485-493; Huang et al., (2000) Virology 271, 58-64); 플라스모데스마타의 크기 배제 한계를 증가시킨다(Wolf et al., (1989) Science 246, 377-379). MPs는 소포체, 세포체질(cytoskeleton) 및 플라스모데스마타를 포함한 다양한 하위세포 구조와 관련하여 발견되었다(Tomenius et al., (1987) Virology 160, 363-371; Atkins et al., (1991) J. Gen. Virol. 72, 209-211; Heinlein et al., (1995) Science 270, 1983-1985; McLean et al., (1995) Plant Cell 7, 2101-2114; Reichel et al., (1999) Trends Plant Sci. 4, 458-463).
최근 바이러스 MPs와 상호작용하는 숙주 인자가 관심대상이 되어왔다. 토마토에서 Tm-2 및 Tm-22는 토마토 모자이크 바이러스(ToMV)에 대한 저항성 유전자로서 보고된다(Hall, (1980). Euphytica 29, 189-197; Fraser(1990) Annu. Rev. Phytopathol. 28, 179-200. 25). Tm-2 또는 Tm-22표현형을 정복하는 돌연변이 바이러스 균주는 MP 내에 아미노산 치환을 지닌다. 이는 MP와 저항성 유전자 생성물 사이의 상호작용을 제안한다(Meshi et al., (1989) Plant Cell 1, 515-522; Weber et al., (1993) J. Virol. 67, 6432-6438). 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 및 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) Dan J 패밀리 내의 2개의 상동성 단백질이 토마토 반점 장승병(wilt) 바이러스(TSMV) MP와 상호작용하는 효모 2-하이브리드 스크린 내에서 확인되었다(Soellick et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 2373-2378). 플라스모데스마타에 위치한 펙틴 메틸에스테라제는 TMV MP와 상호작용하는 것으로 발견되었다. 이는 이러한 효소가 MP 및/또는 MP/RNA 복합물을 플라스모데스마타로 유도함을 제안한다(Dorokhov et al., (1999) FEBS Lett. 461, 223-228; Chen et al., (2000) EMBO J. 19, 913-920). 장거리 바이러스 이동에 요구되는 CMV 2b 단백질(Ding et al., (1995) EMBO J. 14, 5762-5772)은 박테리아 내에서 페니실린 내성과 관련된 진행세포성 단백질 LytB과 유사한 담배 단백질과 상호작용하는 것으로 보고되었다(Ham et al., (1999) Mol. Cells 9, 548-555). Bringeti et al. (1998) EMBO J 17, 6739-6746은 CMV 2b가 숙주 식물 내에서 후번역적 유전자 사일런싱(silencing)의 억제자로서 기능함을 제안하였다. 최근 Voinnet et al., (2000) Cell 103, 157-167은 감자 바이러스 XMP가 N. benthamiana 내에서 유전자 사일런싱 신호의 유포를 방지함을 보고하였다.
따라서 식물 바이러스 MPs 상의 많은 발견이 있다. 그럼에도 불구하고 식물 바이러스 감염 방지 및 식물로의 바이러스 저항성 부여에 관한 보고가 없다.
발명의 개요
본 발명자는 본 발명자에 의해 확인된 식물 바이러스의 이동 단백질에 결합가능한 단백질이 식물 내에서 발현되도록 유발함으로서 식물 바이러스 이동 단백질이 바이러스 감염에 대해 식물 숙주의 단백질과의 상호작용을 방지하여 식물 바이러스의 셀-투-셀 이동을 봉쇄하고 따라서 숙주 식물에 식물 바이러스에 대한 저항성을 부여한다.
하나의 관점에서 본 발명은 식물에 식물 바이러스에 대한 저항성을 부여하기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 식물 바이러스의 이동 단백질에 결합가능한 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 식물의 세포 내로 도입시키는 단계로 구성된다.
하나의 실시태양에서 상기 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코드된 단백질은 서열번호: 2의 포지션 1 내지 86에 나타난 서열을 포함하거나 일부의 아미노산 치환,삭제 및/또는 첨가를 지닌 서열을 포함하고, 식물 바이러스의 이동 단백질에 결합한다.
또 다른 실시태양에서 폴리뉴클레오타이드는 스트린전트(stringent) 조건 하에서 서열번호: 1의 포지션 14 내지 271에 나타난 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이즈 가능한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
하나의 실시태양에서 식물 바이러스는 토바모바이러스(Tobamovirus)이고, 바람직하게는 토마토 모자이크 바이러스(ToMV)이다.
하나의 실시태양에서 폴리뉴클레오타이드는 브라시카 캄페스트리스(Brassica campestris) 또는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)로부터 유도된다.
또 다른 관점에 따라 본 발명의 방법에 의해 생성된 식물도 제공된다.
하나의 실시태양에서 식물은 단자엽식물 또는 쌍자엽식물이다. 하나의 실시태양에서 식물은 담배이다.
본 발명은 식물에 식물 바이러스 저항성을 부여하기 위한 방법에 관한 것이다. 더욱 바람직하게는 본 발명은 식물 내에서 식물 바이러스 이동 단백질에 결합하는 것이 가능한 단백질을 발현함으로서 식물에 바이러스 저항성을 부여하기 위한 방법에 관한 것이다.
도 1은 MIP102에 대한 ToMV MP의 결합을 나타내는 전기영동 사진이다. (A) pGEX-Bc2 플라스미드를 지닌E. coli가 IPTG 없이(레인 1) 또는 IPTG 있는 곳에서 생장되었다. 박테리아로부터 추출된 총 단백질은 10% SDS-폴리아크릴아마이드 겔 내에서 전기영동되었고 CBB로 염색되었다. (B) MP 결합은 복원돈 단백질 블럿 상에서 분석되었다. (A)로 분석된 단백질은 PVDF 멤브레인 상에서 분석되었고32P-표지된 GST-PKA-MP로 프로브되었다. (C) 어피니티-정제된 GST-MIP102(레인 1) 및 GST(레인 2)가 10% 겔 상에서 전기영동되었고 염색되었다. (C)로 분석된 단백질은 PVDF 멤브레인 상에서 블럿되었고 (B)로서32P-표지된 GST-PKA-MP로 분석되었다. 분자량 마커의 포지션은 좌측에 나타나 있다.
도 2는 MIP102 cDNA의 뉴클레오타이드 서열 및 그의 추정되는 아미노산 서열을 나타내는 도면이다. 밑줄친 아미노산 서열은 도 3의 정령에 사용되는 추정 단일-나선 DNA 결합 도메인을 나타낸다. 서던 블럿팅 분석에 사용되는 독특한 HindⅢ 및 EcoRI 사이트가 이중 밑줄에 의해 확인된다. 화살표 1과 2는 게놈 DNA 분석에 의해 나타난 인트론의 위치를 나타낸다.
도 3은 유전자은행 데이터베이스 내의 MIP102 및 AtKELP의 다수의 서열 정렬 및 유사한 서열을 나타내는 도면이다. 상위 정렬은 아라비돕시스 탈리아나의 MIP102와 KELP(AtKELP)의 추정 아미노산 서열의 비교를 나타낸다. ★는 MIP102와 AtKELP 사이의 매치된 아미노산 잔기를 나타낸다. 하위 정렬은 추정 단일-나선 결합 도메인 내의 다양한 단백질의 비교를 나타낸다. MIP102, AtKELP 및 KIWI는 인간(PC4/p15)과 같은 다른 생물체에서 확인된 상동 서열과 정렬되었다(Ge and Roeder, 1994; Kretzshmar et al., (1994) Cell 78, 525-534).C. elegans(T13F2.2 protein, GenBank gene number Z81122), andS. pombe(CAB10003.1 protein, GenBank gene number Z97185-2)).
도 4는 MIP102의 게놈 서던 하이브리디제이션을 나타내는 전기영동 사진이다.B. campestris게놈 DNA는 HindⅢ(레인 1), EcoRI(레인 2) 또는 EcoRV(레인 3)로 분해되었고 10.% 아가로스 겔을 통해 프랙션화되었고 나일론 멤브레인으로 옮겨졌다. 이러한 블럿은 pGEX-Bc2의32P-표지된 440-bp PstⅠ-HindⅢ 단편과 하이브리다이즈되었다(도 2에 나타난 cDNA 삽입의 뉴클레오타이드 1 내지 428 포함). 사이즈(bp) 마커의 위치는 좌측에 나타나 있다.
도 5는 MIP102의 N 말단으로의 ToMV MP의 결합을 나타내는 전기영동 사진이다. (A) 어피니티-정제된 GST-MIP102(레인 1), GST-MIP102dN(레인 2), GST-MIP102dc(레인 3) 및 GST(레인 4)는 10%의 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 내에서 분석되었고 PVDF 멤브레인 상에서 블럿되었다. 단백질의 복원 후 블럿은2P-표지된 PKA-MP로 프로브되었다. (B) (A)에서 사용된 겔 내의 단백질 프로파일이 CBB 염색에 의해 드러났다. 화살표는 재조합 단백질의 위치를 나타낸다. 점선 화살표는 단백질 분해의 발생을 나타낸다. 분자량(kDa) 마커의 위치는 좌측에 나타나 있다.
도 6은 바이러스 셀-투-셀 이동을 위한 수용체 단백질에 기인한 식물 세포의 녹색 형광을 나타내는 사진이다. (A) 바이러스 게놈이 이웃 세포로 이동하면 녹색 형광 단백질이 세포 내에서 생성되어 녹색광을 방출한다("다수 세포"로 명명된 사진). (B) 반대로 바이러스가 셀-투-셀 이동을 수행하지 않으면 형광은 단지 단일 세포 내에서만 생성된다("하나의 세포"로 명명된 사진).
도 7은 셀-투-셀 이동시 pART7-Bc2dc-HA 및 piL.G3의 동시-도입의 영향을 나타낸 그래프이다. 도 7에서 세로축은 형광 스팟 비율에 의해 표현된 셀-투-셀 이동의 비율을 나타낸 반면(다수 세포/총 세포수) 가로축은 플라스미드의 몰비율을 나타낸다(pART7-Bc2dc-HA/piL.G3).
도 8은 셀-투-셀 이동시 pART7-Bc2dc-HA 및 piL.erG3(ER 위치된 GFP 발현 플라스미드)의 동시-도입의 영향을 나타낸 그래프이다. 도 8에서 세로축은 형광 스팟 비율에 의해 표현된 셀-투-셀 이동의 비율을 나타낸 반면(다수 세포/총 세포수) 가로축은 플라스미드의 몰비율을 나타낸다(pART7-Bc2dc-HA/piL.erG3).
도 9는 MIP102의 N-말단 결합 구역을 생성하는 발현 플라스미드 pART7-Bc2dc-HA를 나타내는 구조 도면이다.
도 10은 형질전환된 담배의 목적 단백질의 발현을 나타낸 전기영동 사진이다. 하기의 순서로 오른쪽부터, (A) 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue(CBB)-염색된 겔, (B) HA 태그(tag) 항체의 이용 결과 및 (C) KELP 항체의 이용 결과. 각각의 결과의 레인에서 최좌측 레인은 분자량 마커를 나타내고 나머지 레인은 좌측으로부터 순서대로 형질전환된 담배 균주 101, 102, 105 및 118을 나타낸다. 최우측 레인은 비-형질전환된 담배(대조군)을 나타낸다.
도 11은 ToMV 입자 감염에 기인한 바이러스 저항성 연구 결과를 나타낸 전기영동 사진이다. 반대편 끝 레인은 분자량 마커를 나타내고 나머지 레인은 좌측으로부터 순서대로 형질전환된 담배 균주 101r, 102r, 105r 및 118r(이들은 형질전환된 담배 균주 101, 102, 105 및 118로부터 재생되었음) 및 비-형질전환된 담배(SR1)를 나타낸다. 각 균주에 있어서 좌측 레인은 상부 잎(U)을 나타내는 반면 우측 레인은 감염된 잎(I)을 나타낸다. 화살표로 나타낸 밴드는 코트(coat) 단백질에 상응한다.
도 12는 AtKELP로의 ToMV MP의 결합을 나타내는 전기영동 사진을 나타낸다. (A) 어피니티-정제된 GST-AtKELP(레인 1), GST-MIP102(레인 2) 및 GST(레인 3)이 10%의 SDS 폴리아크릴아마이드 겔에서 분석되었고 PVDF 멤프레인 상에서 블럿되었다. 단백질의 복원후32P-표지된 PKA-MP로 프로브되었다. (B) (A)에서 사용된 겔 내의 단백질 프로파일은 CBB 염색에 의해 드러났다. 화살표는 재조합 단백질의 위치를 나타낸다. GST-MIP102의 크기는 GST와 MIP102 사이의 여분의 15 아미노산에 기인하여 GST-AtKELP보다 더 크다. 분자량(kDa) 마커의 위치는 좌측에 나타나 있다.
도 13은 다양한 조직의 MPs로의 AtKELP의 결합을 나타내는 전기영동 사진이다. 동일한 양(1㎍)의 어피니티-정제된 GST-MP(ToMV), GST 및 소혈청 알부민이니트로셀룰로스 멤브레인 상에 고정되었고32P-표지된 PKA-AtKELP로 프로브되었다.
본 발명에 따라 식물에 식물 바이러스 저항성을 부여하기 위한 방법이 제공된다. "식물에 식물 바이러스 저항성을 부여하는 것"에 의해 식물이 바이러스로 감염된 때조차 질병 손상이 방지되거나 최소화된다. 본 발명의 방법은 식물 바이러스 이동 단백질에 결합가능한 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 식물 세포 내로 도입시키는 단계로 구성된다.
본 발명의 방법에서 사용된 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코드된 단백질은 감염 식물 바이러스의 이동 단백질(MP)에 결합한다. 이러한 상호작용은 감염 바이러스 이동 단백질과 바이러스 이동에 관련된 숙주 세포 내에 존재하는 인자의 상호작용을 봉쇄한다. 따라서 플라스모데스마타를 통한 세포에서 세포로의 바이러스 이동이 봉쇄된다. 상기-기술된 단백질은 식물 내에서 발현되고 식물 바이러스 셀-투-셀 이동 및 이에 따른 티슈-투-티슈 이동(장거리 이동)이 봉쇄된다. 그 결과로서 바이러스 질병 손상이 방지되거나 최소화된다. 따라서 본 발명의 방법에서 사용된 폴리뉴클레오타이드는 식물 내에서 식물 바이러스 이동 단백질에 결합가능한 단백질을 발현하여 식물에 식물 바이러스 저항성을 부여한다.
본 발명의 방법에 사용된 폴리뉴클레오타이드는 식물 바이러스 RNA 게놈 내에서 인코드된 이동 단백질(MP)에 결합가능한 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드로서 식물 cDNA 라이브러리로부터 스크린된다. 이후 이러한 이동 단백질에 결합가능한 단백질은 이동 단백질 상호작용 단백질(MIP)로 표기된다. 이동 단백질 상호작용 단백질(MIPs)은 알려진 단백질에 결합가능한 알려지지 않은 단백질에 대해 검색할 수 있는 웨스트 웨스턴 방법에 의해 확인된다. 예를 들어 토마토 모자이크 바이러스(ToMV)의 RNA 게놈 내에서 인코드된 이동 단백질(MP)에 결합가능한 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 니코티아나 타바쿰, 아라비돕시스 탈리아나 및 브라시카 캄페스트리스와 같은 식물의 cDNA 라이브러리로부터 스크린된다. 이러한 MIP는 예를 들어 니코티아나 타바쿰 라이브러리로부터 유도된 MIP204 및 브라시카 캄페스트리스 라이브러리로부터 유도된 MIP102, MIP105 및 MIP106을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 이들 MIPs 중에서 MIP102가 토마토 모자이크 바이러스 이동 단백질에 대해 가장 높은 결합을 나타낸다. MIP102의 아미노산 서열과 동일한 것을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호: 2 및 서열번호: 1에 나타나 있다.
실례의 이동 단백질 상호작용 단백질 MIP102는 MIP102의 전체 길이 및 N 말단 부분을 통해 이동 단백질에 결합한다. 따라서 하나의 실시태양에서 본 발명의 방법의 폴리뉴클레오타이드는 서열목록 내의 서열번호: 2의 포지션 1에서의 메티오닌(Met)에서부터 포지션 86에서의 글리신(Gly)까지의 아미노산 서열을 포함한 단백질을 인코드한다. 또 다른 실시태양에서 본 발명의 방법에서 사용된 폴리뉴클레오타이드는 서열목록 내의 서열번호: 2의 포지션 1에서의 메티오닌(Met)에서부터 포지션 165에서의 발린(Val)까지의 아미노산 서열을 포함한 단백질을 인코드한다. 본 발명의 방법에 사용된 폴리뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코드된 부분이 바이러스 이동 단백질에 결합하는 기능을 지니는 한 하나 이상의 아미노산 삭제, 치환 및/또는 첨가를 지닌 아미노산 서열을 포함한 단백질을 인코드한다.
하나의 실시태양에서 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열목록 내의 서열번호: 1에 나타난 포지션 14 내지 포지션 271의 뉴클레오타이드 서열을 지닌 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 하나의 실시태양에서 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열목록 내의 서열번호: 1에 나타난 포지션 14 내지 포지션 508의 뉴클레오타이드 서열을 지닌 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
여기 개시된 뉴클레오타이드 서열뿐만 아니라 이들 서열에 의해 인코드된 단백질의 단편 및 변이체가 본 발명에 포함된다. "단편"은 뉴클레오타이드 서열의 일부분, 아미노산 서열의 일부분 및 서열에 의해 인코드된 단백질을 의미한다. 뉴클레오타이드 서열의 단편은 하나 이상의 고유 단백질의 기능적인 생물활성을 유지하는 단백질 단편을 인코드한다. 본 발명의 방법에서 개시된 뉴클레오타이드 서열 및 서열에 의해 인코드된 단백질의 단편은 바이러스 이동 단백질에 결합하는 한 사용될 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코드된 단백질의 변이체는 단백질의 N 말단 및/또는 C 말단에서의 하나 이상의 아미노산 삭제(소위 축소) 또는 첨가 ; 단백질의 하나 이상의 사이트에서의 아미노산 삭제 또는 첨가 ; 또는 단백질의 하나 이상의 사이트에서의 아미노산 치환에 의해 고유 단백질로부터 유도된 단백질을 의미한다. 이러한 변이체는 예를 들어 다형현상 또는 인공 조작에 의해 생성된다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코드된 단백질은 다양한 방법(아미노산 치환, 삭제, 축소 및 삽입을 포함)에 의해 변형된다. 이러한 조작의 방법은 일반적으로 당분야에 알려져 있다. 예를 들어 본 발명에 따른 스트레스 저항성을 조절하는 것이 가능한 식물 유전자에 의해 인코드된 단백질의 아미노산 서열 변이체가 DNA의 돌연변이에 의해 제조된다. 돌연변이화 및 뉴클레오타이드 서열 변화의 방법은 당분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어 Kunkel(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel et al.(1987) Methods in Ezymol. 154:367-382; US Patent No. 4,873,192; Walker and Gastra, editors, (1983) Techniques in Molecular Biology(MacMillian Publishing Company, New York) 및 참고문헌 참조. 목적 단백질의 생물활성에 영향을 미치지 않는 적당한 아미노산 치환으로서의 안내는 Dayhoff et al. (1987) Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl. Biomed. Res. Found. Washington D.C., 참고문헌 내에 통합됨)의 모델에서 발견된다. 하나의 아미노산을 유사한 성질을 지닌 다른 것과 교환하는 것과 같은 보존적 치환이 바람직하다. 보존적 치환의 예는 소수성 아미노산(Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Tyr, Val) ; 친수성 아미노산(Arg, Asp, Asn, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Lys, Ser, Thr) ; 지방성 사이드 체인을 지닌 아미노산(Gly, Ala, Val, Leu,Ile, Pro) ; 하이드록실 그룹 함유 사이드 체인을 지닌 아미노산(Ser, Thr, Tyr) ; 황 원자 함유 사이드 체인을 지닌 아미노산(Cys, Met) ; 카르복실산 및 아미드 함유 사이드 체인을 지닌 아미노산(Asp, Asn, Glu, Gln) ; 염기 함유 사이드 체인을 지닌 아미노산(Arg, Lys, His) ; 방향족 함유 사이드 체인을 지닌 아미노산(His, Phe, Tyr, Trp)을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
따라서 "하나 이상의 삭제, 치환 및/또는 첨가를 지닌다"라는 것은 다형현상 또는 인공 조작(상기 기술된 잘 알려진 방법을 포함)에 의해 치환, 삭제 및/또는 첨가된 많은 아미노산이 치환, 삭제 및/또는 첨가됨을 의미한다. 또한 "하나 이상의 삭제, 치환 및/또는 첨가를 지닌다"라는 것은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코드된 단백질의 기능이 발현될 수 있는 한 많은 아미노산이 상기-기술된 아미노산 서열 내에서 삭제, 첨가 및/또는 치환됨을 의미한다. 아미노산 치환, 삭제 및/또는 첨가와 같은 변화의 활성상의 영향은 변화되는 아미노산의 위치, 정도, 타입 등에 따라 달라짐은 당업자에게 분명히 인식될 것이다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코드된 단백질은 상기-기술된 아미노산 서열 내에 많은 삭제, 치환 및/또는 첨가를 지니고, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 단백질의 기능이 발현되는 한 이들의 숫자는 하기의 아미노산 서열 동일성을 만족시킨다.
본 발명의 방법에 사용된 폴리뉴클레오타이드는 이러한 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코드된 단백질이 바이러스 이동 단백질에 결합하도록 서열목록 내의 서열번호: 2의 포지션 1의 Met에서 포지션 86의 Gly까지의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 적어도 75% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 90% 이상, 더욱 더 바람직하게는 95% 이상 및 가장 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 지닌 아미노산 서열을 지닌 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 지닌 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 본 발명의 방법에 사용된 폴리뉴클레오타이드는 이러한 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코드된 단백질이 바이러스 이동 단백질에 결합하도록 서열목록 내의 서열번호: 2의 포지션 1의 Met에서 포지션 165의 Val까지의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 적어도 75% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 90% 이상, 더욱 더 바람직하게는 95% 이상 및 가장 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 지닌 아미노산 서열을 지닌 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 지닌 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명의 방법에 사용된 폴리뉴클레오타이드는 이러한 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코드된 단백질이 바이러스 이동 단백질에 결합하도록 서열목록 내의 서열번호: 2의 포지션 1의 Met에서 포지션 86의 Gly까지의 아미노산 서열과 적어도 75% 이상, 바람직하게는 적어도 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 90% 이상, 더욱 더 바람직하게는 95% 이상 및 가장 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 지닌 아미노산 서열을 지닌 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열(바람직하게는 서열번호: 1의 포지션 14의 A에서 포지션 271의 A까지의뉴클레오타이드 서열)을 지닌 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 본 발명의 방법에 사용된 폴리뉴클레오타이드는 이러한 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코드된 단백질이 바이러스 이동 단백질에 결합하도록 서열목록 내의 서열번호: 2의 포지션 1의 Met에서 포지션 165의 Val까지의 아미노산 서열과 적어도 75% 이상, 바람직하게는 적어도 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 90% 이상, 더욱 더 바람직하게는 95% 이상 및 가장 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 지닌 아미노산 서열을 지닌 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열(바람직하게는 서열번호: 1의 포지션 14의 A에서 포지션 508의 C까지의 뉴클레오타이드 서열)을 지닌 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 상기-기술된 구역의 아미노산 서열을 포함한 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 아웃사이드(즉, 5' 또는 3' 말단)에 부가적인 뉴클레오타이드 서열(즉, 비-번역된 구역)을 포함한다. 바람직하게는 본 발명의 방법에 사용된 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 1의 포지션 1 내지 913의 전체 길이 서열로 구성된다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 1의 모든 퇴화한 이성질체를 포함한다. 여기에 사용된 바와 같이 "퇴화한 이성질체"라는 용어는 퇴화한 코돈(들)만 다른 동일한 폴리펩타이드를 인코딩하는 것이 가능한 DNA를 나타낸다. 예를 들어 DNA는 서열번호: 1의 염기 서열을 지닌 DNA와 관련한 아미노산에 상응하는 코돈이 그의 퇴화한 코돈(즉, 코돈 AAT)로 대치된 퇴화한 이성질체로 불린다.
여기 사용된 바와 같이 "참조 서열"은 서열 비교를 위한 기초로서 사용된 한정된 서열이다. 참조 서열은 특별화된 서열의 서브세트(subset) 또는 전체 : 예를 들어 전체-길이 cDNA 또는 폴리뉴클레오타이드 서열의 세그먼트(segment) 또는 완전한 cDNA 또는 폴리뉴클레오타이드 서열이다.
여기 사용된 바와 같이 "비교 창(comparison window)" 수단은 참조 서열과 비교되고 비교 창 내의 그의 일부분이 2개의 서열의 최적 정렬에 대해 참조 서열(첨가 또는 삭제로 구성되지 않음)과 비교하여 첨가 또는 삭제(즉, 갭)로 구성된 폴리뉴클레오타이드 서열의 인접하고 특정화된 세그먼트에 대한 참조를 포함한다. 일반적으로 비교 창은 길이로 적어도 20개 이상의 인접한 뉴클레오타이드이고, 선택적으로는 30, 40, 50, 100 또는 더 길 수 있다. 당업자는 폴리뉴클레오타이드 서열 내의 갭의 포함에 기인한 참조 서열에 대한 높은 유사성을 피하기 위해 갭 패널티(penalty)가 일반적으로 도입되고 매치의 수로부터 공제된다.
비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당분야에 잘 알려져 있다. 참조 서열(본 발명의 서열)과 실험 서열 사이의 최상의 전체 매치를 결정하기 위한 바람직한 방법은 BLAST를 이용한 상동성 분석이다(Altshul et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25, 3389-3402). 서열 정렬시 참조 서열 및 실험 서열은 모두 DNA 서열이다. RNA 서열은 U's를 T's로 전환함으로서 비교된다. 상기 전체적인 서열 정렬의 결과는 퍼센트 동일성으로 나타난다. 퍼센트 동일성을 계산하기 위해 DNA 서열 정렬이 BLAST의 디폴트 파라미터를 이용하여 수행된다.
여기에 사용된 바와 같이 2개의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열의 컨텍스트(context) 내의 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 특정화된 비교 창에 대한 최대 일치성으로 정렬될 때 동일한 2개의 서열 내의 잔기에 대한 참조를 포함한다. 서열 동일성의 백분율이 단백질에 대한 참조로 사용될 때 아미노산 잔기가 유사한 화학적 성질(즉, 전하 또는 소수성)을 지닌 다른 아미노산 잔기로 치환되고 따라서 분자의 기능적 성질을 변화시키지 않는 보존적 아미노산 치환에 의해 동일하지 않은 잔기 위치가 종종 달라진다. 보존적 치환에서 서열이 다른 경우 퍼센트 서열 동일성은 치환의 보존적 성질을 보정하는 방향으로 조정된다. 이러한 보존적 치환에 의해 달라진 서열은 "서열 유사성" 또는 "유사성"을 지닌다. 이러한 조정을 하기 위한 수단은 당업자에게 잘 알려져 있다. 일반적으로 이는 전체 미스매치(mismatch) 보다는 부분적으로 보존적 치환을 스코어링(scoring)하는 것을 포함하여 서열 동일성의 백분율을 증가시킨다. 따라서 예를 들어 동일한 아미노산이 1의 스코어가 주어지고 비-보존적 치환이 0의 스코어가 주어지면 보존적 치환은 0과 1 사이의 스코어가 주어진다. 보존적 치환의 스코어링은 프로그램 PC/GENE에서 실행되어 계산된다(Intelligenetics, Mountain View, California).
여기에 사용된 바와 같이 "서열 동일성의 백분율"은 비교 창 내의 폴리뉴클레오타이드 서열의 일부분이 2개의 서열의 최적 정렬에 대해 참조 서열(첨가 또는 삭제로 구성되지 않음)과 비교하여 첨가 또는 삭제(즉 갭)로 구성된 비교 창에서의 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로서 측정된 수치를 의미한다. 백분율은 매치된 포지션의 수를 산출하기 위해 둘 모두의 서열에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 발생하는 위치의 수를 측정하고, 비교 창 내의 포지션의 총 수로 매치된 포지션 수를 나누고, 서열 동일성의 백분율을 산출하기 위해 그 결과에 100을 곱함으로서 계산된다.
폴리뉴클레오타이드 서열의 "실질적인 동일성"이라는 용어는 표준 파라미터를 이용하여 기술된 정렬 프로그램의 하나를 이용하여 참조 서열과 비교시 적어도 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 지닌 서열로 구성됨을 의미한다. 당업자는 이들 수치가 코돈 퇴화, 아미노산 유사성, 리딩 프레임 위치를 고려함으로서 2개의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코드된 단백질에 상응하는 동일성을 측정하는데 적당하게 조정됨이 인식될 것이다. 이들 목적을 위한 아미노산 서열의 실질적인 동일성은 일반적으로 적어도 70% 이상, 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 90% 이상, 가장 바람직하게는 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 의미한다.
펩타이드의 컨텍스트 내의 "실질적인 동일성"이라는 용어는 펩타이드가 특정화된 비교 창에서 참조 서열에 대해 적어도 70% 이상, 바람직하게는 적어도 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 또는 95% 이상의 서열 동일성을 지닌 서열로 구성된다. 바람직하게는 최적 정렬은 Needleman et al., J. Mol. Biol. 48: 443(1970)의 상동성 정렬 알고리즘을 이용하여 수행되었다. 따라서 하나의 펩타이드는 예를 들어 2개의 펩타이드가 단지 보존적 치환에 의해서만 달라진 경우 두 번째 펩타이드와 실질적으로 동일하다. "실질적으로 유사한" 펩타이드는 동일하지 않은 잔기 위치가 보존적 아미노산 교환에 의해서만 달라진 점을 제외하고는 상기에 주지된 바와 같이 서열을 공유한다. 펩타이드 동일성 비교에 있어서 GENETYX 프로그램이 사용된다. 이러한 경우 프로그램의 디폴트 파라미터가 사용된다.
본 발명의 방법에 사용된 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코드된 생물학적으로 활성적인 단백질 부분을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 단편은 적어도 15, 25, 30, 50, 100, 125, 150, 175, 200 또는 250개의 인접한 아미노산 또는 본 발명의 방법에 사용된 전체 길이 단백질의 아미노산의 총 수를 인코드한다(즉, 서열번호: 2의 243개 아미노산). 일반적으로 PCR 프라이머의 하이브리디제이션 프로브로 사용되는 식물에 바이러스 저항성을 부여하는 것이 가능한 뉴클레오타이드 서열의 단편은 식물 바이러스 저항성을 부여하는 것이 가능한 폴리뉴클레오타이드에 의해 발현된 단백질의 생물적으로 활성적인 부분을 인코드한다.
단백질 MIP102와 상호작용하는 전형적인 이동 단백질은 브라시카 캄페스트리스로부터 유도된다. 또한 본 발명의 방법에 사용된 폴리뉴클레오타이드는 브라시카 캄페스트리스 이외의 식물로부터 유도된 단백질과 상호작용하는 이동 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 이러한 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어 주형으로서 개시된 뉴클레오타이드의 전체 또는 부분 및 선택된 식물의 게놈 DNA에 기초하여 고안된 프라이머를 이용한 PCR을 수행하고 이후 프로브로서 결과적인 증폭된 DNA 단편을 이용하고 동일한 식물의 게놈 DNA 또는 cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로서 분리된다. 이러한 방식으로 PCR, 하이브리디제이션 등과 같은 방법이 여기 발표된 서열에 대한 서열 동일성에 기초한 서열을 확인하는데 사용된다. 여기 발표된 서열 전체 또는 그의 단편에 대한 그들의 서열 동일성에 기초하여 분리된 서열은 본 발명에 포함된다.
하이브리디제이션 방법에서 알려진 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부는 클론된 게놈 DNA 단편 또는 선택된 생물체로부터 유도된 cDNA 단편(즉, 게놈 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리)의 그룹 내에 존재하는 다른 상응하는 뉴클레오타이드 서열에 선택적으로 하이브리다이즈하는 프로브로서 사용될 수 있다. 이들 하이브리디제이션 프로브는 게놈 DNA 단편, cDNA 단편, RAN 단편 또는 다른 올리고뉴클레오타이드이고,32P 또는 다른 검출가능한 마커와 같은 검출가능 그룹으로 표지된다. cDNA 라이브러리 및 게놈 라이브러리의 하이브리디제이션 및 구조를 위한 프로브의 제조는 일반적으로 당분야에 알려져 있고 Sambrook et al.(1989)에 개시되어 있다. 분자 클로닝 : A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring HarborLaboratory Press, Plainview, New York).
예를 들어 여기에 발표된 식물 바이러스 저항성을 부여하는 것이 가능한 식물 유전자의 뉴클레오타이드 서열의 전체 또는 하나 이상의 부분은 식물에 바이러스 저항성을 부여하는 것이 가능한 식물 유전자 및 그의 메신저 RNA의 서열에 특이적으로 하이브리다이즈 가능한 프로브로서 사용된다. 다양한 조건 하에서 특이적인 하이브리디제이션을 달성하기 위해 이러한 프로브는 식물에 바이러스 저항성을 부여하는 것이 가능한 식물 유전자의 서열들 사이에서 유일하고, 바람직하게는 길이로 적어도 10 뉴클레오타이드 이상, 가장 바람직하게는 20 뉴클레오타이드 이상의 서열을 포함한다. 이러한 프로브는 선택된 생물체로부터 식물에 바이러스 저항성을 부여하는 것이 가능한 식물 유전자의 서열을 PCR 증폭시키기 위해 사용된다. PCR 증폭 방법은 당분야에 잘 알려져 있다(PCR Technology : Principles and Applications for DAN Amplification, HA Erlich ed., Freeman Press, New York, NY(1992); PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications, Innis, Gelfland, Snisky, and White, eds., Academic Press, San Diego, CA (1990); Mattila et al., (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4967; Eckert, K.A. and Kunkel, T.A. (1991) PCR Methods and Applications 1: 17; PCR, McPherson, Quirkes, and Taylor, IRL Press, Oxford). 이러한 기술은 원하는 생물체로부터 부가적인 코딩 서열을 분리하거나 생물체 내의 코딩 서열의 존재를 측정하기 위한 진단 분석으로 사용된다. 하이브리디제이션 기술은 플레이트된 DNA 라이브러리의 하이브리디제이션 스크리닝을 포함한다(플라크 또는 콜로니 : 즉, Sambrook et al.(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)).
이러한 서열 하이브리디제이션은 스트린전트 조건 하에서 수행된다. "스트린전트 조건" 또는 "스트린전트 하이브리디제이션 조건"이라는 용어는 프로브가 다른 서열보다 검출가능하게 더 큰 정도(즉 백그라운드보다 적어도 2배 이상)로 그의 타겟 서열에 하이브리다이즈할 조건을 포함한다. 스트린전트 조건은 서열-의존적이고 다른 상황에서는 달라질 것이다. 하이브리디제이션 및/또는 세척 조건의 스트린젠시(stringency)를 제어함으로서 프로브에 100% 상보적인 타겟 서열이 확인될 것이다. 또한 스트린젠시 조건은 더 낮은 정도의 유사성이 검출되도록 서열 내에서 일부 미스매칭을 허용하도록 조정될 수 있다. 일반적으로 프로브는 길이로 약 1000 뉴클레오타이드 이하, 바람직하게는 500 뉴클레오타이드 이하이다.
일반적으로 스트린전트 조건은 염 농도가 약 1.5M Na 이온 이하, 일반적으로 약 0.01∼1.0M Na 이온 농도이고(또는 다른 염), 온도는 짧은 프로브의 경우(즉, 10∼50 뉴클레오타이드) 적어도 약 30℃ 이상(pH 7.0∼8.0), 긴 프로브의 경우(즉, 50 뉴클레오타이드 이상) 적어도 약 60℃ 이상일 것이다. 또한 스트린전트 조건은 포름아마이드와 같은 불안정화제의 첨가로 달성된다. 전형적인 낮은 스트린전트 조건은 50% 포름아마이드, 4.4x SSC, 20mM 인산염 완충액(pH 6.8), 1xDenhardt's 용액, 0.2% SDS 및 변성된 연어 정자 DNA(0.1mg/ml)를 함유한 용액에서 42℃로 하이브리디제이션 및 0.1% SDS를 함유한 2x SSC 내에서 상온에서의 세척 및 0.1% SDS를 함유한 0.2x SSC 내에서 42℃에서의 최종 세척을 포함한다.
일반적으로 특이성은 후-하이브리디제이션 세척의 기능, 이온 강도가 되는 중요한 인자 및 최종 세척 용액의 온도이다. DNA-DNA 하이브리드의 경우 Tm은 Meinkoth and Wahl, Anal. Biochem., 138: 267-284(1984)의 방정식으로부터 가늠될 수 있다 : Tm= 81.5℃ + 16.6(log M) + 0.41(% GC) - 061(% 포름) - 500/L ; M은 1가 양이온의 몰이고, % GC는 DNA 내의 구아닌과 시토신 뉴클레오타이드의 백분율이고, % 포름은 하이브리디제이션 용액 내의 포름아마이드의 백분율이고, L은 염기쌍 내의 하이브리드의 길이다. Tm은 상보적 타겟 서열의 50%가 완벽하게 매치된 프로브에 하이브리다이즈하는 온도이다(한정된 이온 강도 및 pH 하에서). Tm은 각각의 1%의 미스매칭에 대해 약 1℃씩 감소한다 ; 따라서 Tm, 하이브리디제이션 및/또는 세척 조건은 원하는 동일성의 서열에 하이브리다이즈하도록 조정될 수 있다. 예를 들어 > 90% 동일성을 지닌 서열이 탐색되면 Tm은 10℃로 감소될 수 있다. 일반적으로 스트리전트 조건은 한정된 이온 강도 및 pH에서 특이적 서열 및 그의 상보성에 대해 열 녹는점(Tm)보다 약 5℃ 더 낮도록 선택된다. 그러나 심한 스트린전트 조건은 열 녹는점(Tm) 보다 1, 2, 3 또는 4℃ 더 낮은 온도에서 하이브리디제이션및/또는 세척을 이용할 수 있고 ; 보통의 스트린전트 조건은 열 녹는점(Tm) 보다 6, 7, 8, 9 또는 10℃ 더 낮은 온도에서 하이브리디제이션 및/또는 세척을 이용할 수 있고 ; 낮은 스트린전트 조건은 열 녹는점(Tm) 보다 11, 12, 13, 14, 15 또는 20℃ 더 낮은 온도에서 하이브리디제이션 및/또는 세척을 이용할 수 있다. 방정식, 하이브리디제이션 및 세척 조성 및 원하는 Tm을 이용하여 당업자는 하이브리디제이션 및 세척 용액의 다양한 스트린젠시가 고유하게 기술됨을 이해할 것이다. 원하는 정도의 미스매칭이 45℃(수용액) 또는 32℃(포름아마이드 용액) 보다 낮은Tm을 초래한다면 더 높은 온도가 사용되도록 SSC 농도를 증가시키는 것이 바람직하다. 핵산의 하이브리디제이션에 대한 광범위한 지침은 Tijssen(1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Moleculuar Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part Ⅰ, Chapter 2 (Elsevier, New York); 및 Ausubel, et al., Eds. (1995), Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2(Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York)에서 발견된다. 또한 Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning : A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plaineview, New York) 참조(이들은 참고문헌에 통합됨).
수득된 유전자의 염기 서열은 당분야에 알려진 뉴클레오타이드 서열 분석 또는 통상적으로 이용 가능한 자동 서열기에 의해 결정된다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 일반적으로 여기 발표된 방법에 따라 수득되거나 여기 개시된 서열에 기초한 화학 합성에 의해 수득된다. 예를 들어 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 제조사의 지침에 따라 폴리뉴클레오타이드 합성기(Applied BioSystem(at present, Perkin Elmer))를 이용하여 합성된다.
상기 기술된 바와 같이 유전공학기술 또는 화학적으로 합성하는 기술과 같은 절차에 따라 생성된 폴리펩타이드는 원하는 활성 즉, 하기와 같이 바이러스 저항성을 부여하는 활성을 지니는지가 확인된다. 폴리뉴클레오타이드를 함유한 발현 벡터가 생성된다. 이러한 발현 벡터는 단백질을 생성하는 적당한 세포 내에서 발현된다. 하기 실시예 1에 기술된 것과 실질적으로 동일한 절차가 단백질이 목적 식물 바이러스 이동 단백질(MP)에 결합하는지를 측정하는데 사용된다. 하기 실시예 4에 기술된 것과 실질적으로 동일한 절차가 단백질이 바이러스와 함께 식물 세포 내로 도입될 때 단백질이 녹색 형광 유전자와 같은 수용체 유전자가 지표로 사용되는 바이러스의 셀-투-셀 이동을 억제하는지를 확인하는데 사용된다.
본 발명의 방법에 사용된 폴리뉴클레오타이드는 식물에 식물 바이러스 저항성을 부여한다. 식물 바이러스는 항상 특이적이지는 않다. 특정한 바이러스의 이동 단백질과 결합하는 것이 가능한 이동 단백질 상호작용 단백질은 또 다른 바이러스의 이동 단백질에 결합한다. 또한 예를 들어 토마토 모자이크 바이러스 이동단백질에 결합하는 것이 가능한 일반적인 단백질인 MIP102 및 AtKELP(MIP102의 전체 길이에 약 75% 아미노산 서열 동일성을 지닌 단백질)도 브라시카세에(Brassicaceae) 모자이크 바이러스(crucifer tobamovirus) 및 오이 모자이크 바이러스에 결합한다.
여기에 발표된 실시예에서 토마토 모자이크 바이러스(ToMV)에 대한 바이러스 저항성은 예증의 목적으로 나타나 있다. 또한 본 발명의 방법은 식물에 다른 식물 바이러스에 대한 저항성도 부여한다. 저항성이 탐색된 식물 바이러스의 예는 토바모바이러스속(Tobamovirus), 토브라바이러스속(Tobravirus), 디안토바이러스속(Dianthovirus), 알파모바이러스속(Alfamovirus), 브로모바이러스속(Bromovirus), 쿠쿠모바이러스속(Cucumovirus), 코모바이러스속(Comovirus), 네포바이러스속(Nepovirus), 콜리모바이러스속(Caulimovirus), 제미니바이러스속(Geminivirus), 포티바이러스속(Potivirus) 및 토스포바이러스속(Tospovirus)의 바이러스를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 본 발명의 방법에서 사용된 폴리뉴클레오타이드는 저항성이 부여되는 식물의 식물 바이러스 이동 단백질을 확인하고, 실시예 1에 기술된 바와 같은 웨스트 웨스턴 스크리닝 방법에 의해 확인된 이동 단백질에 결합가능한 단백질을 스크리닝함으로서 수득된다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 당업자에게 잘 알려진 방법을 이용하여 적당한 식물 발현 벡터에 연결되고 알려진 재조합 기술에 의해 식물 세포 내로 벡터를 도입시킨다. 도입된 유전자는 식물 세포 내의 DNA 내에 통합된다. 식물 세포 내의 DNA는 식물 세포 내의 다양한 세포기관(즉, 미토콘드리아, 엽록체 등) 내에 함유된 DNA 뿐만 아니라 염색체를 포함한다.
여기에 사용된 바와 같이 "식물 발현 벡터"는 본 발명의 유전자 발현을 조절하는 프로모터와 같은 다양한 조절 서열이 숙주 식물 세포 내에서 실시적으로 연결된 핵산 서열을 나타낸다. 여기 사용된 "대조군 서열"이라는 용어는 기능적 프로모터 및 어떤 관련된 전사요소(즉, 인핸서(enhancer), CCAAT 박스, TATA 박스 및 SPI 사이트)를 지닌 DNA 서열을 나타낸다. 여기 사용된 "실시적으로 연결된"이라는 용어는 폴리뉴클레오타이드가 유전자가 발현될 수 있도록 프로모터 또는 인핸서와 같은 유전자 발현을 조절하는 조절요소에 연결되는 것을 나타낸다. 식물 발현 벡터는 바람직하게는 식물 유전자 프로모터, 종결자, 약물-저항성 유전자 및 인핸서를 포함한다. 사용되는 발현 벡터의 타입 및 조절요소의 타입이 숙주 세포에 따라 달라짐은 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 발명에 사용된 식물 발현 벡터는 T-DNA 구역을 지닌다. T-DNA 구역은 특히 아그로박테리움이 식물을 형질전환하는데 사용될 때 유전자 도입의 효율성을 강화할 수 있다.
여기 사용된 "식물 유전자 프로모터"라는 용어는 식물에서 발현되는 프로모터를 나타낸다. 재생된 식물의 모든 조직 내에서 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 발현을 지시할 식물 프로모터 단편이 사용될 수 있다. 구조적 발현을 위한 프로모터의 예는 노팔린 신타제 유전자의 프로모터(Langride, 1985, Plant Cell Rep. 4, 355), 콜리플라워 모자이크 바이러스 19S-RAN를 생성하기 위한 프로모터(Guilley, 1982, Cell 30, 763), 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S-RNA를 생성하기 위한 프로모터(Odell, 1985, Nature 313, 810), 쌀 액틴 프로모터(Zhang, 1991, Plant Cell 3, 1155), 옥수수 유비퀴틴 프로모터(Cornejo 1993, Plant Mol. Biol. 23, 567) 및 REXφ 프로모터(Mitsuhara, 1996, Plant Cell Physiol. 37, 49)를 포함한다.
또한 식물 프로모터는 특정한 식물 내에서 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 발현을 지시할 수 있거나 그렇지 않은 경우 더욱 정밀한 환경적 또는 발달적 제어하에 있게 된다. 이러한 프로모터는 여기서 "유도가능한" 프로모터로 나타나 있다. 유도가능한 프로모터의 예는 감염 또는 병원균 침입, 식물 상처, 광, 낮은 온도, 높은 온도, 건조, 자외선 조사, 특정한 화합물의 분사 등과 같은 환경적 조건에 의해 유도가능한 프로모터를 포함한다. 이러한 프로모터의 예는 광 조사에 의해 유도된 리불로스(ribulose)-1,5-다이포스페이트(diphosphate) 카르복실라제(carboxylase) 스몰 서브유니트(small subunit)를 인코딩하는 유전자의 프로모터(Fluhr, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 2358), 감염 또는 몰드의 침입, 박테리아 또는 바이러스에 의해 발현된 쌀 키티나제(chitinase) 유전자의 프로모터(Xu, 1996, Plant Mol. Biol. 30, 387), 담배 PR 단백질 유전자의 프로모터(Ohsima, 1990, Plant Cell 2, 95), 낮은 온도에 의해 유도가능한 쌀 립(lip)19 유전자의 프로모터(Aguan, 1993, Mol. Gen. Genet. 240, 1), 높은 온도에 의해 유도가능한 쌀 hsp72 및 hsp80 유전자의 프로모터(Van Breusegem, 1994, Planta 193, 57), 건조에 의해 유도가능한 아라비돕시스 탈리아나의 rab16 유전자의 프로모터(Nundy, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1406) 및 자외선 조사에 의해 유도가능한 옥수수 알코올 탈수소효소 유전자의 프로모터(Schulze-Lefert, 1989, EMBO J. 8, 651)를 포함한다. rab16 유전자의 프로모터는 식물 호르몬인 앱시스산을 분사함으로서 유도가능하다.
"종결자"는 유전자의 일부분을 인코딩한 구역의 다운스트림에 위치하고 DNA가 mRNA로 전사될 때 전사의 종결 및 폴리 A 서열 첨가와 관련된 서열이다. 종결자는 mRNA 안정성에 기여하고 유전자 발현 레벨에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 이러한 종결자의 예는 CaMV35S 종결자 및 노팔린 신타제의 종결자(Tnos)를 포함하나 이에 한정적이지 않다.
"약물-저항성 유전자"는 바람직하게는 형질전환된 식물의 스크리닝을 촉진시키는 것이다. 바람직하게는 카나마이신 저항성을 부여하는 네오마이신 인산전이효소Ⅱ(NPTⅡ) 유전자, 하이그로마이신 저항성을 부여하는 하이그로마이신 인산전이효소 유전자 등이 사용된다. 본 발명은 이에 한정적이지 않다.
"인핸서"는 목적 유전자의 발현 효율성을 강화시키기 위해 사용된다. 인핸서로서 CaMV35S 프로모터 내 업스트림 서열을 함유한 인핸서 구역이 바람직하다. 다수의 인핸서는 각각의 식물 발현 벡터에 사용된다.
폴리펩타이드 발현이 요구되면 일반적으로 폴리뉴클레오타이드 코딩 구역의 3' 말단에서의 폴리아데닐레이션(polyadenylation) 구역을 포함하는 것이 바람직하다. 폴리아데닐레이션 구역은 천연 유전자, 다양한 다른 식물 유전자 또는 T-DNA로부터 유도될 수 있다. 첨가되는 3' 말단 서열은 예를 들어 노팔린 신타제 또는 옥토핀(octopine) 신타제 유전자 또는 다른 식물 유전자 또는 덜 바람직하게는 다른 진핵세포성 유전자로부터 유도될 수 있다.
상기에 기술된 바와 같이 식물 발현 벡터는 당업자에게 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조된다. 식물 발현 벡터의 구조시 pBI 벡터, pUC 벡터, pART 벡터 등이 바람직하게 사용된다. 본 발명은 이에 한정적이지 않다.
DNA 도입을 위한 식물 물질은 도입 방법에 따라 잎, 줄기, 뿌리, 괴경, 원형질체, 캘러스, 화분, 배아, 초기 슈트 등으로부터 적당히 선택될 수 있다. "식물 세포"는 어떠한 식물도 된다. "식물 세포"의 예는 잎과 뿌리와 같은 식물 기관 내 조직의 세포 ; 캘러스 ; 및 배양된 세포 현탁액을 포함한다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 식물의 어떤 형태도 된다. 바람직하게는 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관이다. 더욱 바람직하게는 식물 세포는 배양 세포이다.
DNA가 도입되는 식물 배양 세포는 일반적으로 원형질체이다. DNA는 일렉트로포레이션 방법, 폴리에틸렌 글리콜 방법 등과 같은 물리적/화학적 방법에 의해 식물 배양 세포 내로 도입된다. DNA가 도입되는 식물 조직은 잎, 줄기, 뿌리, 괴경, 캘러스, 화분, 배아, 초기 슈트, 바람직하게는 잎, 줄기 및 캘러스이다. DNA는 바이러스 또는 아그로박테리움을 이용한 생물학적 방법 또는 입자 총(particle gun) 방법과 같은 물리적/화학적 방법에 의해 식물 조직 내로 도입된다. 예를 들어 아그로박테리움을 이용한 방법이 Nagel et al.(Microbiol. Lett., 67, 325(1990))에 개시되어 있다. 이러한 방법에서 식물 발현 벡터는 먼저 아그로박테리움을 형질전환하는데 사용되고 이후 형질전환된 아그로박테리움이 잎 디스크 방법과 같이 잘 알려진 방법에 의해 식물 조직 내로 도입된다. 예를 들어 입자 총 방법은 Klein et al.(1987), Nature 327:70-73; 및 Christon, P. Plant J.(1992) 2, 275-281 내에 기술되어 있다. 형질전환의 프로토콜과 식물 내로의 뉴클레오타이드 서열의 도입 프로토콜은 형질전환되는 타겟 식물 또는 식물 세포의 타입(즉, 단자엽식물 또는 쌍자엽식물)에 따라 달라진다. 식물 세포 내로 뉴클레오타이드 서열을 도입하여 식물 게놈 내로 서열을 삽입하는 적당한 방법의 예는 마이크로인젝션(microinjection)(Crossway et al.(1986) Biotechniques 4:320-334), 일렉트로포레이션(Riggs et al.(1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606),아그로박테리움 매개 형질전환(Townsend et al., 미국 특허 제5,563,055), 직접적인 유전자 트랜스펙션(transfection)(Paszkowski et al.(1984) EMBO J. 3:2717-2722) 및 탄도입자가속(ballistic particle acceleration)(즉, Sanford et al., 미국 특허 제4,945,050; Tomesra, 미국 특허 제5,879,918; Tomes et al., 미국 특허 제5,886,244; Bideny et al., 미국 특허 제5,932,783; Tomes et al.(1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment", Plant Cell, Tissue, and Organ Culture : Fundamental Methods, Gamborg and Phillips ed., (Springer-Verlag, Berlin); and McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923-926)을 포함한다. 또한 하기 참고문헌을 참조 : Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (양파); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (대두); Finer and McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175-182 (대두); Singh et al. (1988) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (대두); Datta et al. (1990) Biotechnology 8:736-740 (쌀); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305-4309 (옥수수); Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559-563 (옥수수); Tomes, 미국 특허 제5,240,855; Buising et al., 미국 특허 제5,322,783 및 제5,324,646; Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment", Plant Cell, Tissue, and Organ Culture : Fundamental Methods, Gamborg ed. (Springer-Verlag, Berlin) (옥수수); Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91:440-444 (옥수수); Fromm et al. (1990)Biotechnology 8:833-839 (옥수수); Hooykaas-Van Slongteren et al. (1984) Nature (London) 311:763-764; Bowen et al., 미국 특허 제5,736,369 (작물 종); Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5345-5349 (백합과); De Wet et al. (1985) The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, Chapmann et al. eds. (Longman, New York) pp. 197-209 (화분); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 and Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (위스커(whisker) 매개 형질전환); D' Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (일렉트로포레이션); Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12:250-255 및 Christou and Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413 (쌀); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (옥수수 (아그로박테리움 튜메파시엔스를 통함))(이들 모두는 참고문헌에 통합됨). 이들 방법은 당분야에 잘 알려져 있다. 형질전환되는 식물에 적당한 방법은 적당히 선택될 수 있다.
식물 발현 벡터가 도입된 세포는 카나마이신 저항성과 같은 약물 저항성에 대해 선택된다. 형질전환된 세포는 통상적으로 사용되는 방법에 의해 재생될 수 있다. 예를 들어 McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84 참조.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드가 도입된 식물 세포는 재분화 배지, 호르몬-없는 MS 배지 내에서 식물 세포를 배양함으로서 식물로 재생될 수 있다. 어린뿌리가 자란 식물은 토양으로 옮겨서 재배함으로서 식물로 생장될 수 있다. 재분화방법은 식물 세포의 타입에 따라 달라진다. 다양한 식물에 대한 재분화 방법이 기술된다 : 쌀 (Fujimura, 1995, Plant Tissue Culture Lett. 2, 74); 옥수수 (Shillito, 1989, Bio/Technol. 7, 581; Gorden-Kamm, 1990, Plant Cell 2, 603); 감자 (Visser, 1989, Theor. Appl. Genet. 78, 594); 및 담배 (Nagata, 1971, Planta 99, 12).
재생된 식물 내에서의 본 발명의 도입된 유전자의 발현은 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 확인될 수 있다. 이러한 확인은 예를 들어 노던 블럿팅 분석을 이용하여 수행된다. 특히 총 RNA는 식물 잎으로부터 추출되고 변성 아가로스 상에서 전기영동되고 적당한 멤브레인으로 블럿된다. 이러한 블럿은 도입된 유전자 부분에 상보적인 표지된 RNA 프로브와 하이브리디제이션되어 본 발명의 유전자의 mRNA를 검출한다. 이후 이들 식물은 생장되고 동일한 형질전환된 스트레인(strain) 또는 다른 스트레인과 수분되고 원하는 표현형 특성을 지닌 결과적인 하이브리드가 확인된다. 2 이상의 세대가 생장되어 피실험체 표현형 특성이 안정하게 유지되고 유전되고 종자가 수확되어 원하는 표현형 또는 다른 성질이 달성됨을 확인시킨다.
본 발명의 방법에 의해 생성될 수 있는 식물은 유전자가 도입될 수 있는 어떠한 식물도 포함한다. 여기에 사용된 바와 같이 "식물"이라는 용어는 전체 식물, 식물 기관(즉, 잎, 줄기, 뿌리 등), 종자, 식물 번식자(즉, 화분) 및 식물 세포 및 그의 자손을 포함한다. 여기에 사용된 식물 세포는 종자, 배양 현탁액, 배아, 분열조직 부분, 캘러스 조직, 잎, 뿌리, 슈트, 배우체, 포자체, 화분 및 소포자를 포함하나 한정적이지 않다. "식물"이라는 용어는 단자엽식물 및 쌍자엽식물을 포함한다. 이러한 식물은 어떠한 유용한 식물 특히, 농작식물, 야채식물 및 정원종의 개화식물을 포함한다. 본 발명이 적용되는 가장 바람직한 식물은 담배이다.
본 발명에서 사용될 수 있는 식물 타입의 예는 가지과(Solanaceae), 화본과(Poaeae), 겨자과(Brassicaceae), 장미과(Rosaceae), 콩과(Leguminosae), 호박과(Cucurbitaceae), 꿀풀과(Lamiaceae), 백합과(Liliaceae), 명아주과(Chenopodiaceae) 및 산형과(Umbelliferae) 식물을 포함한다.
가지과 식물의 예는 니코티아나속(Nicotiana), 솔라눔속(Solanum), 다투라속(Datura), 리코페르시온속(Lycopersion) 및 페튜니아속 식물을 포함한다. 특별한 예는 담배, 가지나무, 감자, 토마토, 칠리페퍼 및 페튜니아를 포함한다.
화본과 식물의 예는 벼속, 보리속, 호밀속, 사탕수수속, 에키노클로아속(Echinochloa) 및 옥수수속 식물을 포함한다. 특별한 예는 쌀, 보리, 호밀, 돌피, 사탕수수 및 옥수수를 포함한다.
겨자과 식물의 예는 무속, 브라시카속, 아라비돕시스속, 와사비아속(Wasabia) 및 캅셀라속(Capsella) 식물을 포함한다. 특별한 예는 일본 백무(white radish), 평지씨, 아라비돕시스 탈리아나, 일본 양고추냉이 및 냉이를 포함한다.
장미과 식물이 예는 오루누스속(Orunus), 능금나무속, 피누스속(Pynus), 프라가리아속(Fragaria) 및 장미속 식물을 포함한다. 특별한 예는 서양자두, 복숭아, 사과, 배, 덴마크 딸기 및 장미를 포함한다.
콩과 식물이 예는 콩속, 비그나속(Vigna), 강낭콩속, 완두속, 갈퀴덩굴속, 낙화생속, 토끼풀속, 알팔파속(Alphalfa) 및 개자리속 식물을 포함한다. 특별한 예는 대두, 아드주키콩(adzuki bean), 강낭콩, 완두콩, 잠두, 땅콩, 클로버 및 버클로버(bur clover)를 포함한다.
호박과 식물은 수세미속(Luffa), 호박속 및 박속 식물을 포함한다. 특별한 예는 조롱박, 호박, 오이 및 메론을 포함한다.
꿀풀과 식물은 라반둘라속, 박하속 및 차즈기속 식물을 포함한다. 특별한 예는 라벤다, 페퍼민트 및 비프스테이크 식물을 포함한다.
백합과 식물은 마늘속, 나리속 및 튤립속 식물을 포함한다. 특별한 예는 양파, 마늘, 백합 및 튤립을 포함한다.
명아주과 식물은 시금치속(Spinacia) 식물을 포함한다. 특별한 예는 시금치이다.
산형과 식물은 구릿대속, 당근속, 크립토테니아속(Cryptotaenia) 및 샐러리속 식물을 포함한다. 특별한 예는 일본 우도(udo), 당근, 혼워트(honewort) 및 샐러리를 포함한다.
본 발명의 방법에 의해 부여된 바이러스 저항성은 식물의 다음 세대뿐만 아니라 형질전환된 식물의 초기 세대에 유전된다. 본 발명의 펩타이드에 의해 부여된 바이러스 저항성은 형질전환된 식물의 초기 세대 및 식물의 다음 세대, 그의 번식자(즉, 화분) 및 번식자로부터 생성된 종자 내에 나타난다. 본 발명의 방법에 사용된 폴리뉴클레오타이드의 다음 세대로의 유전성은 프로브로서 여기에 개시된 폴리뉴클레오타이드의 서열을 이용한 서던 블럿에 의해 확인된다.
이후 사용된 명칭 및 이후 기술된 실험 절차는 당분야에 잘 알려지고 통상적으로 사용되는 절차를 포함한다. 표준 기술이 재조합 방법, 폴리뉴클레오타이드 합성, 세포 배양, 형질전환 및 식물 재생에 사용된다. 일반적으로 기술 및 절차가 당분야의 통상적인 방법 및 다양한 일반 참고문헌에 따라 수행된다(일반적으로 Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 참조).
이후 본 발명은 실시예를 통해 설명될 것이다. 본 발명은 이에 한정적이지 않다. 실시예에 사용된 재료, 시약 등은 언급이 없는 한 통상적으로 사용되는 것이다.
(실시예 1) 이동 단백질 상호작용 단백질(MIP)의 파(Far)-웨스턴("웨스트 웨스턴") 스크리닝
ToMV MP에 결합하는 식물 단백질을 확인하기 위해 본 발명자들은 λGEX5.의N. tabacum과B. campestris발현 cDNA 라이브러리를 구조하였다. cDNA 라이브러리의 구조는 하기와 같다.N. tabacumcv. Samsun NN로부터의 잎,B. campestris로부터의 주두(stigma) 및A. thaliana생태형 콜롬비아로부터의 꽃봉오리의 구조가 QuickPrep Micro mRNA Purification Kit(Amersham Pharmacia Biotech)로 RNA 분리되어 TimeSaver cDNA Synthesis Kit(Amersham Pharmacia Biotech)로 cDNA 합성되었다. λ파지 벡터 λGEX5(Fukunaga et al., (1997) EMBO J. 16, 1921-1933; 이러한 벡터는 IPTG 유도성 프로모터 및 GST 리딩 프레임의 cDNA-클로닝 사이트 다운스트림을 지님)가 cDNA 발현 라이브러리의 구조에 사용되었다. 인산화된 올리고뉴클레오타이드 어댑터(5'-AGGTGCTGG-3', 5'-CCAGCACCTGCA-3')가 cDNA에 어닐(anneal)되고 라이게이트되어 SfiⅠ-컷(cut) 벡터와 양립성 말단을 만들었다. cDNA는 벡터 암(arm)과 라이게이트되어 인 비트로(in vitor) 팩키징(packaging)되었다. 파지 라이브러리는E. coli스트레인 BB4 내에서 증폭되었다.
MP 상호작용 단백질(MIP)의 파-웨스턴 스크리닝은 멤브레인 상에 고착된 각각의 GST-융합 cDNA 생성물과 프로빙을 위해 [γ-32P]ATP로 인산화된 GST-융합 ToMV MP(GST-PKA-MP) 사이의 단백질-단백질 결합에 기초하여 수행되었다.
[γ-32P]ATP로 인산화된 GST-융합 ToMV MP(GST-PKA-MP)는 하기와 같이 제조되었다.
먼저 ToMV MP 발현 플라스미드가 하기와 같이 제조되었다. 글루타티온(glutathione)-S-트랜스퍼라제(transferase)(GST)-융합 ToMV MP(GST-MP)의 발현을 위한 플라스미드 pGEX-30K는 앞서 기술되었다(Matsushita et al., (2000) J. Gen. Virol. 81, 2095-2102). GST와 MP 사이의 단백질 키나제 A를 위한 컨센서스(consensus) 인산화 서열을 첨가하기 위해 5개의 아미노산 RRASV를 코딩하는 합성 올리고뉴클레오타이드 30K-PKA1(5'-AATTCGTCGTGCATCTGTTGC-3') 및 30K-PKA2(5'-AAT TGCAACAGATGCACGACG-3')가 어닐되고 적당한 방향으로 pGEX-30K의 EcoRI 사이트 내로 삽입되어 pGEX-PKA-30K를 생성하였다. 이러한 플라스미드는 재조합 단백질 GST-PKA-MP의 생성에 사용되었다. pGEX-PKA-30K의 1.1-kb EcoRI-NotI 사이트 삽입은 pGEX-6P-2 벡터의 EcoRI 및 NotI 사이트들 사이에 위치하여pGEX-6P2-PKA-30K를 구조하였다. GST를 제거하고 재조합 단백질 PKA-MP를 제조하기 위해 PreScission Protease(Amersham Pharmacia Biotech)에 의해 분열될 수 있는 이러한 플라스미드는 GST-P-PKA MP 생성에 사용되었다.
pGEX-30KdA 및 pGEX-30KdSX 플라스미드의 구조는 앞서 기술되었다(Matsushita et al., 상동). pGEX-30KdA에 의해 인코드된 재조합 단백질 GST-MPdA는 벡터로부터 유도된 27개의 인공 잔기(QVALFGEMCAEPLFVYFSKYIQICIRS)에 의해 대체된 C-말단 9개 아미노산의 삭제를 지녔다. pGEX-30KdSX에 의해 인코드된 또다른 재조합 단백질 GST-MPdSX는 벡터로부터 유도된 7개의 잔기(LERPHRD)로 대체된 C-말단 31개 아미노산 삭제를 지녔다.
재조합 단백질의 생성 및 정제는 하기와 같이 수행되었다. 재조합 GST-융합 단백질이 적당한 플라스미드를 지닌E. coliXL10-Gold(Stratagene) 내에서 생성되었고 앞서 기술된 바와 같이 Glutathione Sepharose beads(Amersham Pharmacia Biotech)를 이용함으로서 정제되었다. Amersham Pharmacia Biotech사에서 구입한 항-GST 항체(염소)가 웨스턴 블럿팅 분석에 의한 융합 단백질을 확인하는데 사용되었다. 정제된 단백질은 NETN-D 완충액(50mM 트리스-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA, 150mM NaCl, 0.5% Nonidet P-40, 1mM DTT) 내에 보관되었다.
32P-표지된 단백질 프로브는 하기와 같이 제조되었다. 약 1㎍의 재조합 GST-융합 단백질과 컨쥬게이트된(conjugated) Glutathione Sepharose beads는 3.7 MBq의 [λ-32P]ATP(168 TBq/nmol)과 10 유니트의 단백질 키나제 A(New England BioLabs)의 촉매 서브유니트를 함유한 200㎕의 키나제 완충액(50mM 트리스-HCl, 10mM MgCl2, pH 8.5) 내에 현탁되었다. 이러한 반응은 30℃의 로테이터(rotator) 상에서 30분간 수행되었고 1ml의 50mM 트리스-HCl(pH 8.0) 완충액으로 4회 세척함으로서 종결되었다. 인산화된 단백질이 10mM의 글루타티온을 함유한 50mM 트리스-HCl 완충액(pH 8.0)으로 비즈(beads)로부터 용출되었다. 표지된 곳에서 인산화된 GST-융합 단백질이 PreScission Protease로 분해되어 결합 실험을 위한 프로브로서 사용하기 전에 GST 도메인을 제거하게 되었다. 프로브의 특이적인 방사성은 약 1 ×107 cmp/㎍ 단백질이었다.
cDNA 라이브러리의 파-웨스턴 스크리닝은 하기와 같이 수행되었다.E. coli스트레인 BB는 파지 라이브러리로의 감염을 위해 사용되었다. 박테리아는 100∼200/㎠의 밀도의 플라크를 수득하기 위해 42℃에서 3시간 동안 인큐베이트되었다. 박테리아 플레이트는 10mM IPTG로 적셔진 니트로셀룰로스 필터로 씌워졌고 37℃에서 3.5시간 동안 인큐베이트되었다. 필터는 세척되었고32P-표지된 GST-PKA-MP(2 ×105cpm/ml)로 4℃에서 16시간 동안 인큐베이션하기 전에 4℃에서 1시간동안 블록킹(blocking) 용액, Block Ace(Dainippon-Pharm Co.) 내에서 인큐베이트되었다. 이후 필터는 0.2% Triton X-100이 추가된 PBS(137mM NaCl, 2.68mM KCl, 10.14mM Na2HPO4, 1.76mM KH2PO4, pH 7.4) 내에서 각각 5분간 4회 세척되었고 BAS1500 system(Fuji Phto Film) 상에서 방사능사진 촬영되었다.
N. tabacum으로부터의 MIP204 및B. campestris로부터의 MIP102, MIP105 및 MIP106과 같은 일부 양성 클론이 분리되었다. 이들 양성 클론 중 MIP102가 가장 높은 결합 활성을 나타내었고 따라서 더한 분석을 위해 선택되었다.
MIP102 클론으로부터 분리된 파지 DNA는 단백질-결합 에세이에 사용된 GST-융합 MIP102 생성 발현 플라스미드 pGEX-Bc2를 재구조하는데 사용되었다(도 1).
단백질-단백질 상호작용은32P-표지된 단백질 프로브와 멤브레인 상에 고착된 타겟 단백질 사이의 결합 에세이에 의해 측정되었다. 타겟 단백질은 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분리되었고 PVDF 멤브레인(Millipore)로 옮겨졌다. 완충액 A(50mM 트리스-HCl, 20% 2-프로판올, pH 8.0) 및 완충액 B(50mM 트리스-HCl, 5mM β-멀캅토에탄올, pH 8.0)로 각각 상온에서 1시간 동안 세척한 후 멤브레인은 단백질을 변성시키기 위해 6M 구아니딘-HCl을 함유한 완충액 B 내에서 1시간 동안 상온에서 인큐베이트되었다. 재상(renaturation)을 위해 멤브레인은 5분간세척되었고 0.04% Tween 40을 함유한 완충액 B 내에서 밤새 4℃에서 인큐베이트되었다. 비-변성된 시스템을 위해 단백질은 슬롯-블럿터(slot-blotter)를 이용하여 니트로셀룰로스 멤브레인 상에 직접 고정되었다. 멤브레인은 Block Ace로 4℃에서 30분간 처리되었고 DNase Ⅰ(18㎍/ml) 및 Rnase A(60㎍/ml)이 추가된 Block Ace 내에서32P-표지된 단백질 프로브와 4℃에서 4시간 동안 인큐베이트되었다. 필터 멤브레인은 0.2% Triton X-100을 함유한 PBS로 각각 5분간 4회 세척되었고 방사능사진 분석되었다. 결과는 도 1에 나타나 있다.
Coomassie Brilliant Blue(CBB)-염색된 겔 상에서 IPTG로 유도될 때 48-kDa 단백질이 관찰된 반면(도 1A 레인 2) 유도되지 않은 레인에서는 어떤 시그널도 관찰되지 않았다(도 1B, 레인 1).
뒤이어 GST-MIP102 및 GST는 Glutathione Sepharose beads를 이용하여 정제되었고(도 1C), 동일한 프로브로 단백질-결합 에세이세 사용되었다(도 1D). 정제된 GST-MIP102는 양성 결합 시그널을 나타낸 반면(도 1D, 레인 1) 정제된 GST는 그렇지 않았다(도 1D, 레인 2). 이러한 결과는 MIP102 클론이 MP와의 특이적인 상호작용에 의해 분리되었고; GST-GST 상호작용에 의해 프로브되지 않았음을 나타내었다.
(실시예 2) MIP102의 cDNA 및 게놈 DNA의 분석
MIP102 cDNA의 뉴클레오타이드 서열 및 그의 추정 아미노산 서열이 하기와 같이 측정되었다.
파지 DNA는 QIAGEN λ키트를 이용함으로서 각각의 클론의 플레이트 용해질(lysate)로부터 제조되었다. cDNA의 더한 분석용으로 cDNA 삽입을 지닌 pGEX-PUC-3T 벡터에 상응하는 DNA 단편을 수득하기 위해 파지 DNA가 NotI로 분해되었다. 이러한 DNA 단편은 플라스미드 클론이 회복된E. coli를 형질전환시키기 위해 자가-라이게이트되었다. 파지 클론 MIP102로부터 회복된 플라스미드 pGEX-Bc2는 GST-융합 단백질 GST-MIP102을 생성하는데 사용되었다.
뉴클레오타이드 서열은 하기 프라이머를 이용함으로서 측정되었다 : pGEX1 프라이머(5'-GCAAGCCACGTTTGGTGGTG-3'), pGEX5 프라이머(5'-ATTTCCCCGAAAAGTGCCAC -3'), Bc2F03 프라이머(5'-GAGCTTCCTTCTTCTAAAGG-3'), Bc2R02 프라이머(5'-GCTTCGA TAGCTGGAATATT-3').
MIP102 cDNA의 뉴클레오타이드 서열은 도 2에 나타나 있다. BLAST를 이용한 상동성 검색은 추정 단백질이A. thaliana의 전사 동시활성제(coactivator)와 유사함을 나타내었다(AtKELP; Cormack et al., (1998) Plant J. 14, 685-692)(도3). 펩타이드 확인의 백분율의 평가를 위해 GENETYX 프로그램이 사용되었다. MIP102는A. thaliana의 KIWI에 대해 36%의 동일성을 지녔다(Cormack et al., (1998) Plant J. 14, 685-692)(도 3). 또한 관련된 단백질 인간(PC4/p15, 36% 동일성)(Ge and Roeder, (1994) Cell 78, 513-523; Kretzshmar et al., 상동)과 S. pombe(유전자은행 제Z97185호 내의 단백질 ID CAB10003.1을 지닌 단백질; 19% 동일성)과 같은 톡소노믹하게(toxonomically) 뚜렷한 다른 생물체 내에서도 발견되었다. AtKELP와의 N-말단 상동성에 기초하여 첫 번째 ATG 코돈은 MIP102의 개시 코돈으로 추정되었다. 오픈 리딩 프레임(ORF)은 19,227 Da의 계산된 분자량 및 pI 4.8을 지닌 165 아미노산 폴리펩타이드를 인코드하였다. PC4/p15의 단일-나선의 DNA-결합 활성에 관련된 매우 보존된 구역이 확인되었다(Kretzschmar et al., 상동)(도 3). MIP102의 중심 구역은 글루타민과 글로타민산이 풍부하다(아미노산 포지션 66 내지 81). 동일중합성(homopolymeric) 글루타민 스트레치(strech)는 전사 인자 잠재성이 증가함이 보고되었다(Gerber et al., (1994) Science 263, 808-811; Schwechheimer et al., (1998) Plant Mol. Biol. 36, 195-204).
MIP102의 유전자 조직화를 분석하기 위해 게놈 DNA 단편이 PCR에 의해 증폭되었고 그들의 뉴클레오타이드 서열이 측정되었다. 게놈 DNA는 페놀/SDS 방법에 의해B. campestris의 잎으로부터 분리되었다(Kingston, (1997) Phenol/SDS method for plant RNA preparation. In "Current Protocols In Molecular Biology"(V B Chanda Eds) Vol. 1, pp. 4.3.1-4.3.3. John Wiley & Sons, Inc., New York).Genomic Southern 하이브리디제이션이 Sambrook et al., (1989) "Molecular Cloning A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.에 기술된 바와 같이 수행되었다. DAN 표본(10㎍)은 적당한 제한효소로 분해되었고 1.0% 아가로스 겔을 통해 프랙션화되었고 양으로 하전된 나일론 멤브레인(Millipore) 상에 옮겨졌다. 블럿은 50% 포름알데하이드, 4.4x SSC, 20mM 인산나트륨 완충액(pH 6.8), 1x Denhardt's 용액, 0.2% SDS 및 변성된 연어 정자 DNA(0.1mg/ml)를 함유한 용액 내에서 16시간 동안 42℃로32P-표지된 프로브로 하이브리다이즈되었다. 멤브레인은 0.1% SDS를 함유한 0.2x SSC에서 30분간 42℃로 최종 세척하기 전에 상온에서 0.1% SDS를 함유한 2x SSC에서 여러번 세척되었다.
MIP102 cDNA에 상응하는 게놈 DNA 단편은 2 세트의 프라이머를 이용한 PCR에 의해 증폭되었다 : Bc2F04(5'-GAAAACCCTAAAGATGGAG-3') 및 Bc2R02(상기 기술됨); Bc2F05(5'-AATAAGCTTAACAGACGAAC-3') 및 Bc2R07(5'-GATTTTAAAAGATCATTTTTGTCAT-3') PCR 생성물은 TA 클로닝 벡터 pCR2.1(Invitrogen) 내로 클론되었고 뉴클레오타이드 서열은 벡터 프라이머를 이용하여 3개의 독립적인 클론으로 측정되었다 : 상기 기술된 내부 프라이머 Bc2F02와 Bc2R02 이외에 Forward-ABI(5'-TGTAAAACGA CGGCCAGT-3') 및 Reverse-1(5'-GGAAACAGCTATGACCATG-3').
게놈 DNA과 cDNA의 뉴클레오타이드 서열 비교는 MIP102 유전자가 2개의 인트론(도 2)(73 bp(인트론 1) 및 278 bp(인트론 2))을 포함하고 있음을 나타내었다. 이들 인트론의 위치는 AtKELP(Cormack et al., 상동)의 것과 동일하였다.B. campestris내에서 MIP102 상동체를 인코딩하는 유전자 수를 추정하기 위해 MIP102 cDNA의 440 bp 단편을 이용한 서던 블럿 하이브리디제이션이 수행되었다(도 4). DNA 프로브는 각각의 레인에서 하나의 밴드와 하이브리다이즈되었고 MIP102가B. campestris내에서 단일 카피 유전자에 의해 인코드됨을 나타내었다.
(실시예 3) MIP102의 삭제 돌연변이의 결합 에세이
MP 결합에 중요한 MIP102 도메인을 측정하기 위해 N- 또는 C-말단 삭제를 지닌 GST-융합 MIP102가 생성되었고 실시예 1에 기술된 바와 같은 단백질-결합 에세이에 사용되었다.
플라스미드 pGEX-P-Bc2는 파지 클론 MIP102로부터 유도되었다(상기 기술됨). pGEX-Bc2 BamHI-EcoRI 단편(842 bp)은 pGEX-P-Bc2를 생성하기 위해 pGEX-6P-Bc2(Amersham Pharmacia Biotech)의 BamHI와 EcoRI 사이트 사이에 삽입되었다.
pGEX-P-Bc2dN를 구조하기 위해 MIP102의 C-말단 반을 위한 DNA 단편이 Bc2F02 프라이머(5'-AAYAARGARTTYGAYGAYGA-3') 및 pGEX5 프라이머(상기 기술됨)를이용하여 pGEX-Bc2로부터 PCR에 의해 증폭되었고 T4 DNA 중합효소로 처리되었고 NotI로 분해되었다. 결과적인 679-bp 단편은 pGEX-6P-2의 SmaI과 NotI 사이트 사이에 삽입되었다.
pGEX-P-Bc2dc의 구조를 위해 MIP102의 N-말단 반을 위한 DNA 단편은 pGEX1 프라이머(상기 기술됨) 및 Bc2R05 프라이머(5'-GAGACTCGAGTCATCCCTCCTTAGCTCTTT -3')를 이용하여 pGEX-Bc2로부터 PCR에 의해 증폭되었고 BamHI와 XhoI로 분해되었다. 결과적인 331-bp 단편은 pGEX-6P-2의 BamHI와 XhoI 사이트 사이에 삽입되었다.
pGEX-P-Bc2은 GST-융합 MIP102의 발현에 사용되었다(GST-MIP102). pGEX-P-Bc2dN은 N-말단 86 아미노산 잔기의 삭제를 지닌 GST-융합 MIP102에 사용된 반면(GST-MIP102dN), pGEX-P-Bc2dC는 C-말단 79 아미노산 잔기의 삭제를 지닌 GST-융합 MIP102에 사용되었다(GST-MIP102dC). PCR 단편으로부터 유도된 코딩 서열은 어떤 오류도 없는 것으로 확인되었다.
도 5A에 나타난 바와 같이32P-표지된 PKA-MP는 GST-MIP102의 전체 길이(아미노산 1∼165)(레인 1)뿐만 아니라 MIP102의 N-말단 반(아미노산 1∼86)(레인 3)을 포함한 GST-MIP102dC에 결합되었다. GST-MIP102dC의 레인에서 관찰된 이중 밴드(도 5B, 레인 3)는 C-말단 가까이의 단백질 퇴화에 기인 한 것이고 ; 부가적인 삭제를 지닌 더 낮은 밴드는 결합 활성을 나타내었다. 반대로 GST(레인 4) 및 MIP102의 C-말단 반(아미노산 87∼165)을 포함한 GST-MIP102dN(레인 2)에서는 어떤 MP-결합 활성도 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 MIP102의 N-말단 반이 MP 결합 도메인을 포함함을 제안한다.
(실시예 4) MIP102의 N 말단 구역에 의한 셀-투-셀 이동의 억제
ToMV 이동의 시각적 관찰을 가능하게 하기 위해 바이러스 게놈의 코트 단백질(CP) 유전자가 삭제되고 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자가 CP 유전자 위치의 바이러스 게놈 내로 삽입된 플라스미드 piL.G3이 사용되었다. 이러한 플라스미드는 쿄토대학의 Tetsuo Meshi로부터 수득되었다(Tamai and Meshi, Mol. Plant-Microbe Interact. (2001) 14, 126-134). 플라스미드 pART7-Bc2dC-HA도 실시예 3에서 수득된 C-말단 삭제 MIP102(MIP102dC)를 발현하기 위해 제조되었다. 이들 제조 방법은 하기에 기술되어 있다.
MIP102dC를 발현하기 위해 식물 발현 이원(binary) 벡터 pART7이 사용되었다(Adrew P. Gleave, Plant Molecular Biology (1992) 20, 1203-1207). MIP102의 N-말단 반의 DNA 단편은 pGEX1 프라이머(상기 기술됨) 및 Bc2R06HA 프라이머(5'-TTGCTCTAGACTAAGCATAATCAGGAACATCATAAGGATATCCCTCCTTAGCTCTTTC-3'); 본Bc2R06HA 프라이머는 HA 태그 서열을 포함함)를 이용하여 pGEX-Bc2로부터 PCR에 의해 증폭되었고 SmaI과 XbaI으로 분해되었다. 결과적인 약 350-bp 단편은 그의 C 말단에 삽입된 헤마글루티닌(hemaglutinin) 에피토프(epitope)(HA) 단편 서열을 코딩하는 태그를 지녔다. 이러한 단편은 pART7의 CaMV35S 프로모터의 SmaI과 XbaI 사이트 다운스트림 사이에 삽입되어 pART7-Bc2dC-HA를 생성하였다. 대조군 플라스미드로서 GUS를 발현하는 플라스미드 pART7-GUS도 제조되었다.
플라스미드 piL.G3만 또는 piL.G3과 pART7-Bc2dC-HA 플라스미드 모두가 담배의 실제 잎의 잎 조각을 이용하여 입자 총 방법을 행하여 담배(N. benthamiana) 세포 내로 이들 플라스미드를 도입시켰다. 입자 총 방법에 의한 이러한 세포로의 유전자의 도입은 제조사의 지시에 따라 BioRad 유전자 도입 장치 PDS-1000/He 시스템을 이용하여 수행되었다. 녹색 형광은 형광 현미경하에서 관찰되었다. 바이러스 게놈이 이웃 세포로 이동되면 녹색 형광 단백질이 이동된 바이러스 게놈을 함유한 세포 내에서 생성되어 세포가 녹색광을 방출하게 된다(도 6, "다수 세포"). 반대로 바이러스의 셀-투-셀 이동이 없는 경우 형광은 단지 하나의 세포에서만 발생한다(도 6, "단일 세포"). 따라서 바이러스 이동은 형광 차이에 따라 검출될 수 있다.
다음으로 그의 양 비율을 변화시키면서 CP 유전자 대신 삽입된 GFP를 지닌 플라스미드 piL.G3. 및 GUS(pART-GUS)의 MP 결합 구역 또는 MIP102(pART7-Bc2dC-HA)를 발현하는 플라스미드가 담배의 실제 잎의 잎 조각을 이용하여 입자 총이 수행되어 담배 세포 내로 이들 플라스미드를 도입시켰다. 결과는 표 1에 나타나 있다.
입자 총에 의한N. benthamiana의 실제 잎 내로의 순간적 유전자 도입
플라스미드 조합 도입 당 DNA 양 반잎 당 형광 수a 다수 세포/총 수b
하나의 세포만광 방출(바이러스 이동 없는 부분) 다수의 세포가광 방출(바이러스 이동 있는 부분)
piL.G3 + pART-GUS(ToMV/GFP) (대조군) 1.0㎍ : 2.5㎍ 19 133 0.87 ±0.094
piL.G3 + pART-Bc2dC-HA(ToMV/GFP) (MIP102의 MP 결합 구역) 1.0㎍ : 2.5㎍ 109 110 0.050 ±0.11
0.5㎍ : 2.5㎍ 47 46 0.49 ±0.12
a3∼4개의 잎으로의 도입 결과로서의 총 수
b±다음의 수는 3∼4개의 잎으로의 도입 결과로부터 계산된 표준 편차를 나타냄.
표 1에 나타난 결과는 바이러스 게놈 이동의 신호인 녹색 형광의 확장이 pART7-Bc2dC-HA의 도입에 의해 억제됨을 나타내었다. 따라서 세포내 MIP102의 N 말단에서 단백질이 발현되면 바이러스 MP의 기능이 억제되어 바이러스 이동이 억제되는 것으로 여겨졌다.
셀-투-셀 이동의 비율은 pART7-Bc2dC-HA와 piL.G3의 몰 비율을 변화시키면서 관찰되었다. 그 결과는 도 7에 나타나 있다. 도 7에서 세로축은 형광 스팟 비율(다수 세포/총 수)로 나타나는 셀-투-셀 이동의 비율을 나타내는 반면 가로축은 플라스미드(pART7-Bc2dC-HA/piL.G3)의 몰 비율을 나타낸다. pART7-Bc2dC-HA가 상대적으로 증가함에 따라 다수 세포로의 녹색광의 확장은 감소되었다 즉, 이동의 억제가 인식되었다.
(실시예 5) ER 국소화된 GFP 발현 플라스미드가 사용될 때 MIP102 발현 플라스미드의 동시-도입의 효과
셀-투-셀 이동의 비율은 pART7-Bc2dC-HA와 piL.erG3(ER 국소화된 GFP 발현 플라스미드)의 몰 비율을 변화시키면서 관찰되었다. piL.erG3(ER 국소화된 GFP 발현 플라스미드)은 쿄토대학의 Tetsuo Meshi로부터 수득되었다(Jun Tami and Tetsuo Meshi, The Proceedings of Annual Meeting of Japanese Society of Plant Pathology (2000), Okayama University).
결과는 도 8에 나타나 있다. 도 8에서 세로축은 형광 스팟 비율(다수 세포/총 수)로 나타나는 셀-투-셀 이동의 비율을 나타내는 반면 가로축은 플라스미드(pART7-Bc2dC-HA/piL.erG3)의 몰 비율을 나타낸다. pART7-Bc2dC-HA가 상대적으로 증가함에 따라 다수 세포로의 녹색광의 확장은 감소되었다 즉, 이동의 억제가 인식되었다. 도8과 도 7을 비교하면 억제의 정도는 ER 비-국소화된 GFP 발현 플라스미드(piL.G3)가 사용될 때보다 piL.erG3(ER 국소화된 GFP 발현 플라스미드)이 사용되었을 때 더 큼을 나타내었다.
(실시예 6) MIP 유전자의 도입에 의한 형질전환된 식물을 생성하기 위한 플라스미드의 구조 및 플라스미드를 이용한 형질전환된 식물의 제조
형질전환된 식물을 생성하기 위해 MIP102 클론으로부터 분리된 파지 DNA가 MIP102의 N-말단 결합 구역을 생성하는 발현 플라스미드 pART27-Bc2dC-HA.a를 구조하는데 사용되었다. pART7-Bc2dC-HA로부터 유도된 2.45-kb NotI 단편(상기 기술됨)이 pART27의 NotI 사이트에서 삽입되어(Adrew P. Gleave, Plant Molecular Biology (1992) 20, 1203-1207) pART27-Bc2dC-HA.a를 생성하였다. 이러한 벡터의 구조 도면은 도 9에 나타나 있다.
pART27-Bc2dC-HA.a는 아그로박테리움 방법에 의해 담배의 잎 조각 내로 도입되었다. 아그로박테리움 방법은 Nagel et al. (Microbiol. Lett., 67, 325 (1990))에 따라 수행되었다. 상기-기술된 발현 벡터는 일렉트로포레이션에 의해 아그로박테리움을 형질전환시키는데 사용되었다. 다음으로 형질전환된 아그로박테리움은 잎 디스크 방법에 의해 식물 조직 내로 도입되었다(Rabo-Manyuru[Laboratory Maunal], Syokubutsu-Idenshi-no-Kino-Kaiseki[Fenctional Analysis of Plant Gene] Masaki Iwabuchi and Toshiro Shimura, eds., 1992, Maruzen, pp. 31-56). 2주마다 상기-기술된 잎 조각이 2차 배양되었고 상기-기술된 폴리뉴클레오타이드를 따라 담배 세포 내로 도입된 pART27로부터 유도된 카나마이신 저항성 유전자의 발현에 기인한 카나마이신 저항성의 존재 여부에 기초하여 형질전환된 담배 세포에 대해 스크린되었다. 선택된 형질전환된 담배 세포는 식물로 재분화되었다.
도입된 MIP102를 지닌 형질전환된 담배 잎이 액체 질소 내에서 분쇄되었고 SDS-PAGE 표본 완충액 내에서 4분간 100℃로 추출되었다. 추출물은 SDS-폴리아그릴아마이드 전기영동되었고(SDS-PAGE, 폴리아크릴아미드 겔 농도는 10∼20%), 프로브로서 항-KELP 항체(pGEX-P-KELP(생성은 하기 실시예 9에 기술됨)로부터 유도된 정제된 KELP로 토끼를 면역시킴으로서 생성됨) 및 항-HA 항체(MBL사로부터 수득됨)를 이용하여 통상적으로 사용되는 방법에 의해 웨스턴 블럿팅 분석되었다.
결과는 도 10에 나타나 있다. (A) Coomassie Brilliant Blue(CBB)-염색된 겔, (B) HA 태그 항체의 이용 결과 및 (C) KELP 항체의 이용 결과. 각 결과의 레인 중 최좌측 레인은 분자량 마커이고 나머지 레인은 좌측부터 순서대로 형질전환된 담배 스트레인 101, 102, 105 및 117를 나타낸다. 최우측 레인은 비-형질전환된 담배(대조군)을 나타낸다. 이들 결과에서 MIP102에 상응하는 것으로 사료되는14 kDa의 특이적인 밴드가 형질전환된 담배 스트레인 105 및 비-형질전환된 담배(대조군)이 아닌 101, 103 및 118에서 검출되었다.
(실시예 7) ToMV-△CP/GFP 전사 감염에 기인한 바이러스 셀-투-셀 이동의 조사
도입된 MIP102를 지닌 형질전환된 담배에서의 바이러스 이동을 관찰하기 위해 ToMV-△CP/GFP 전사 생성물(RNA)이 도입된 MIP102, 101, 103, 105 및 118을 지닌 형질전환된 담배 스트레인, 그들의 재생된 식물 101r, 103r, 105r 및 118r 및 비-형질전환된 식물(SR1)의 잎에 적용되었다. 통상적으로 사용되는 방법에 따라 잎 조각으로부터 재생된 식물이 생성됨을 주지해야 한다. 전사체의 적용은 하기와 같이 수행되었다. pTL.G3(쿄토대학의 Tetsuo Meshi로부터 수득 ; 이러한 플라스미드에서 T7 프로모터는 piL.G3의 CaMV 35S 프로모터 대신 바이러스 유전자의 업스트림으로 전사됨)은 RNA 전사체를 수득하기 위해 T7 RNA 중합효소로 처리되었다. 1㎍의 RAN 전사체가 3∼5cm의 폭을 지닌 담배 잎 내로 접종되었다. 2일 후 감염된 잎이 절단되고 GFP로부터 형광을 관찰하기 위해 형광 현미경으로 관찰되었다. 결과는 표 2에 나타나 있다.
형질전환된 담배로의 ToMV-△CP/GFP 전사체의 감염
형질전환된 담배 개체수 형광 스팟의 수 형질전환된 담배 개체수 형광 스팟의 수
한 세포 다수 세포 한 세포 다수 세포
101 0 0 101r 0 0
103 0 0 103r 0 0
105 0 51 105r 0 3
118 0 0 118r 0 0
101, 103 및 118은 MIP120dC고발현 식물임. 비-형질전환체 1 0 0
비-형질전환체 2 0 6
형질전환된 담배 개체수 형광 스팟의 수 형광 스팟의 수 101r, 103r, 105r 및 118r은 101, 103, 105 및 118로부터 재생됨.
한 세포 다수 세포 한 세포 다수 세포
101r 0 1 0 4
103r 0 0 0 0
비-형질전환체 1 0 48 0 45
비-형질전환체 2 0 108 0 108
표 2에 나타난 바와 같이 MIP102는 실시예 6의 형질전환체 101, 103 및 118 및 그들의 재생체 101r, 103r 및 118r에서 매우 높게 발현되었고 녹색 형광의 확장이 이들 식물에서 억제되었다. 높은 발현이 없는 식물 105, 그의 재생체 105r 및 비-형질전환된 식물(대조군)에서 녹색 형광의 확장이 관찰되었다. 따라서 바이러스 이동은 식물 발현 MIP102에 의해 억제됨을 나타내었다.
(실시예 8) ToMV 입자 감염에 의한 바이러스 감염의 조사
ToMV 감염에 대한 저항성이 도입된 MIP102을 지닌 형질전환된 담배에 의해 획득되었는지 여부를 조사하기 위해 바이러스 입자 감염이 수행되었고 감염된 잎과 상부 잎 내의 바이러스 코트 단백질(CP)의 축적이 조사되었다. 도입된 MIP102를지닌 형질전환된 담배 101, 103, 105 및 118의 재생체 101r, 103r, 105r 및 118r와 비-형질전환된 식물(대조군)의 잎이 0.06㎍의 ToMV 바이러스 입자로 감염되었다. 10일 후 감염된 잎과 상부 위치에 존재하는 잎(상부 잎)이 절단되었고 액체 질소 내에서 분쇄되었으며 SDS-PAGE 표본 완충액 내에서 100℃로 4분간 추출되었다. 추출물은 Comassie Brilliant Blue로의 겔 염색 전에 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동(SDS-PAGE, 폴리아크릴아미드 농도는 10∼20%임)되었다.
결과는 도 11에 나타나 있다. 반대편 끝 레인은 분자량 마커를 나타내고 나머지 레인은 좌측부터 순서대로 형질전환된 담배 스트레인 101r, 103r, 105r 및 118r(이들은 형질전환된 담배 스트레인 101, 103, 105 및 118로부터 재생됨) 및 비-형질전환된 담배(SR1)를 나타낸다. 각 스트레인에 있어서 좌측 레인은 상부 잎(U)을 나타내는 반면 우측 레인은 감염된 잎(I)을 나타낸다. 화살표로 표시된 밴드는 코트 단백질에 상응한다. 이러한 밴드는 비-형질전환체 SR1의 감염된 잎과 상부 잎 및 실시예 6에서 MIP102의 높은 레벨의 발현을 나타내지 않은 형질전환 105r에서 유의적으로 관찰되었다. MIP102가 높게 발현되고 바이러스 이동의 억제가 확인된 형질전환된 스트레인 101r, 103r 및 118r에서 코트 단백질의 축적이 감소되었고 바이러스 저항성이 예측되었다.
(실시예 9) AtKELP와의 결합 에세이
ToMV MP가 MIP102에 대해 높은 레벨의 상동성(75%)을 지닌 AtKELP에 결합하는지 여부를 조사하기 위해 AtKELP에 대한 cDNA가A. thalianacDNA 라이브러리로부터 분리되었다. GST-융합 AtKELP를 인코딩하는 플라스미드(GST-AtKELP)가 구조되었고 정제된 융합 단백질은 프로브로서 ToMV MP와 단백질-결합 에세이에 사용되었다. 단백질-결합 에세이는 실시예 3에 기술된 바와 같이 수행되었다.
AtKELP 발현 플라스미드는 하기와 같이 구조되었다. AtKELP의 코딩 서열(Cormack et al., 상동)은 KELP-F01 프라이머(5'-ACAGGAATTCCTAAAAATGGAGAAAGAGA- 3') 및 KELP-R01 프라이머(5'-TTGCCTCGAGTCAGACACGCGATTCCATTT-3')를 이용한 PCR에 의해A. thaliana5'-스트레치 cDNA 라이브러리(Clontech)로부터 증폭되었다. 증폭된 0.52-kb 단편은 EcoRI와 XhoI로 분해되었고 pGEX-6P-1의 EcoRI와 XhoI 사이트 사이에 삽입되어 pGEX-P-KELP를 생성하였다. KELP의 코딩 서열은 어떤 염기 변화도 없는 것으로 확인되었다. 단백질 키나제 A의 인산화 서열을 첨가하기 위해 한성 올리고뉴클레오타이드 KD-PKA1(5'-GATCACGTCGTGCATCTGTTG-3') 및 KD-PKA2(5'-GATCCAACAGATGCACGACGT-3')가 어닐되고 pGEX-6P-1의 BamHI 사이트 내로 삽입되어 올리고뉴클레오타이드의 3 세트가 GST ORF의 적당한 방향 다운스트림 내에 삽입된 pGEX-6P1-3PKA를 구조하였다. pGEX-P-3xPKA-KELP의 구조를 위해 pGEX-P-KELP의 0.52-kb EcoRI-XhoI 단편이 pGEX-6P1-3PKA의 EcoRI와 XhoI 사이트 사이에 클론되었다. pGEX-P-KELP 및 pGEX-P-3xPKA-KELP는 각각 GST-AtKELP 및 GST-PKA-AtKELP의 발현에 사용되었다.
도 12에 나타난 바와 같이 GST-AtKELP(레인 1) 및 양성 대조군 GST-MIP102(레인 2)는 MP-결합 활성을 나타낸 반면 음성 대조군 GST는 활성을 나타내지 않았다.
(실시예 10) CTMV-W와 CMV의 MPs의 결합 에세이
또한 본 발명자들은 다른 식물 바이러스의 MPs에 대한 MIP102 및 AtKELP의 결합 활성을 측정하였다. 이러한 경우 CTMV-W와 CMV의 MPs이 사용되었다. 단백질 결합 에세이는 실시예 3에 기술된 바와 같이 수행되었다.
CTMV-W MP 발현 플라스미드는 하기와 같이 수행되었다.Crucifer tobamovirus의 와사비(wasabi) 스트레인(CTMV-W)으로부터의 cDNA를 포함한 플라스미드 pTW62(Shimamoto et al., (1998) Arch. Virol. 143, 1801-1813)가 SalI로 분해되었다. MP의 코디 서열을 포함한 결과적인 1.4-kb 단편은 Gal4 유전자와 동일한 방향으로 pAS2-1(Clontech)의 SalI 사이트 내로 삽입되었다. 결과적인 플라스미드는 NcoI와 BamHI로 분해되었고 Klenow 단편으로 처리되고 자가-라이게이트되어 MP의 ORF가 Gal4에 연속적인 pAS-W30K를 생성하였다. 이러한 플라스미드의 1.4-kb BamHI-NotI 단편은 pGEX-5X-3(Amersham Pharmacia Biotech)의 BamHI와 NotI 사이트 사이에 삽입되어 pGEX-W30K를 생성하였다. CTMV-W MP 리딩 프레임을 GST와조정하기 위해 pGEX-W30K가 BamHI로 더욱 분해되었고 Klenow로 처리되고 자가-라이게이트되어 GST-융합 CTMV-W MP(GST-CTMMP)의 발현에 사용되는 pGEX-W30KfB를 생성하였다.
CMV MP 발현 플라스미드는 하기와 같이 수행되었다. CMV의 O 스트레인(CMV-O)으로부터 유도된 RNA 3 cDNA을 포함한 플라스미드 pUCMV03(Hayakawa et al., (1989) J. Gen. Virol. 70, 499-504)이 AvaI로 분해되었고 Klenow 단편으로 처리되고 SalI로 분해되어 1.2-kb AvaI(블런티드(blunted))-SalI 단편을 분리하였다. 3a ORF(MP)를 포함한 이러한 단편은 pGEX-6P-1의 SmaI와 XhoI 사이트 사이에 삽입되어 GST-융합 CMV MP(GST-CMVMP)를 인코드하는 pGEX-P-CMVOMP를 구조하였다.
도 13에 나타난 바와 같이32P-표지된 PKA AtKELP는 ToMV, CTMV-W 및 CMV-O에 결합되었다.32P-표지된 MIP102가 프로브로 사용될 때 유사한 결합 활성이 관찰되었다(데이터는 나타내지 않음).
상기-기술된 실시예는 본 발명의 다양한 관점 및 본 발명의 올리고뉴클레오타이드가 어떻게 생성되고 어떻게 이용되는지를 실례적으로 기술한다. 본 발명은 이에 한정적이지 않다.
식물 육종에 사용될 수 있는 바이러스 저항성을 부여하는 것이 가능한 폴리뉴클레오타이드 및 그의 폴리뉴클레오타이드를 이용한 식물에 바이러스 저항성을 부여하는 방법이 제공된다. 또한 폴리뉴클레오타이드가 도입되어 식물 바이러스에 대한 저항성이 부여된 식물이 제공된다.

Claims (9)

  1. 식물 내에서 발현되는 것이 가능한 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 식물의 세포 내로 도입하고 식물 바이러스의 이동 단백질과 상호작용하는 단계로 구성된 식물에 식물 바이러스에 대한 저항성을 부여하는 방법
  2. 제 1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코드된 단백질은 서열번호: 2의 포지션 1 내지 86에 나타나 서열을 포함하거나 하나 또는 수개의 아미노산 치환, 삭제 및/또는 첨가를 지닌 서열을 포함하고, 식물 바이러스의 이동 단백질에 결합함을 특징으로 하는 방법
  3. 제 1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 스트린전트 조건하에서 서열번호: 1의 포지션 14 내지 271에 나타난 서열 또는 상기 뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이즈 하는 것이 가능한 뉴클레오타이드 서열을 포함함을 특징으로 하는 방법
  4. 제 1항에 있어서, 상기 식물 바이러스는 토바모바이러스(Tobamovirus)임을 특징으로 하는 방법
  5. 제 1항에 있어서, 상기 식물 바이러스는 토마토 모자이크 바이러스(ToMV)임을 특징으로 하는 방법
  6. 제 1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 브라시카 캄페스트리스(Brassica campestris) 또는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법
  7. 제 1항에 따른 방법에 의해 생성된 식물
  8. 제 7항에 있어서, 상기 식물은 단자엽식물 또는 쌍자엽식물임을 특징으로 하는 식물
  9. 제 8항에 있어서, 상기 식물은 담배임을 특징으로 하는 식물
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