JP5142247B2 - 植物ウイルス抵抗性植物の製造方法及びその利用 - Google Patents
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Description
(a)配列番号1もしくは2に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(b)配列番号1もしくは2に示されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列において、1個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ植物ウイルス増殖抑制活性を有するポリペプチド。
(c)配列番号3もしくは4に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(d)配列番号3もしくは4に示される塩基配列において、1個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(e)配列番号3もしくは4に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
本発明に係る植物ウイルス抵抗性植物の製造方法は、植物体内において、植物ウイルスのゲノムRNAに結合して植物ウイルスの増殖を抑制するポリペプチドによる、植物ウイルスの増殖抑制活性を昂進させる工程を含めばよい。
本発明において、トバモウイルスのゲノムRNAに結合するポリペプチド(BTRポリペプチド)とは、トバモウイルスのゲノムRNAに結合してトバモウイルスの増殖を抑制する活性を示すものである限り、限定されるものではない。
(a)配列番号1もしくは2に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(b)配列番号1もしくは2に示されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列において、1個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつトバモウイルス増殖抑制活性を有するポリペプチド。
(c)配列番号3もしくは4に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(d)配列番号3もしくは4に示される塩基配列において、1個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(e)配列番号3もしくは4に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
本実施の形態に係るトバモウイルス抵抗性植物の製造方法は、上述のように、BTRポリペプチドによるトバモウイルスの増殖抑制活性を、昂進させる工程を包含していればよい。
本発明はまた、植物ウイルス抵抗性植物の製造キットを提供する。本発明に係る植物ウイルス抵抗性植物の製造キットは、植物体内における植物ウイルス増殖抑制活性を昂進させることが可能なものを備えていればよいが、植物ウイルスのゲノムRNAに結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを備えていることが好ましい。例えば、トバモウイルス抵抗性植物の製造キットであれば、btrポリヌクレオチドを備えているものが好ましい。
〔3−1.本発明に係る植物ウイルス抵抗性植物のスクリーニング方法〕
本発明に係る植物ウイルス抵抗性植物のスクリーニング方法は、植物体内の、植物ウイルスのゲノムRNAに結合するポリペプチドの蓄積量及び植物ウイルスのゲノムRNAに結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現量のうち、少なくとも一方の量を測定する工程を含めばよい。例えば、トバモウイルス抵抗性植物のスクリーニング方法であれば、植物体内の、BTRポリペプチドの蓄積量及びbtrポリヌクレオチドの発現量のうち、少なくとも一方の量を測定する工程(以下、「測定工程」ともいう)を含めばよい。本発明に係る植物ウイルス抵抗性植物のスクリーニング方法でスクリーニングされた植物は、天然であっても、形質転換体であっても、変異体であってもよい。
本実施の形態に係るトバモウイルス抵抗性植物のスクリーニング方法において、上記測定工程としては、例えば、目的の植物から抽出したBTRポリペプチド(粗抽出物であってもよいし、部分精製物であってもよいし、精製物であってもよい)を、BTRポリペプチドに対する抗体と反応させて、植物体内におけるBTRポリペプチドの蓄積量を測定する工程を挙げることができる。より具体的には、ウエスタンブロット法や、ELISA法を用いて、植物体内におけるBTRポリペプチドの蓄積量を測定する工程を行なえばよい。当該工程によれば、野生株との比較により、植物体内におけるBTRポリペプチドの蓄積量が高い植物体を容易に検出(スクリーニング)することができる。このようなBTRポリペプチドの蓄積量が高い植物体は、多くの場合、植物におけるトバモウイルス増殖抑制活性が昂進している。そのため、当該工程により、トバモウイルスに対する抵抗性が向上した植物を容易にスクリーニングできる。上記工程において用いる抗体としては、後述する抗体を用いることができる。
本発明はまた、植物ウイルス抵抗性植物のスクリーニングキットを提供する。本発明に係る植物ウイルス抵抗性植物のスクリーニングキットは、植物ウイルスのゲノムRNAに結合するポリペプチドと特異的に結合する抗体及び植物ウイルスのゲノムRNAに結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと特異的に結合するプローブのうち、少なくとも一方を備えていればよい。例えば、トバモウイルス抵抗性植物のスクリーニングキットであれば、BTRポリペプチドと特異的に結合する抗体、及びbtrポリヌクレオチドと特異的に結合するプローブのうち、少なくとも一方を備えていればよい。
本実施の形態に係るトバモウイルス抵抗性植物のスクリーニングキットは、BTRポリペプチドと特異的に結合する抗体や、btrポリヌクレオチドと特異的に結合するプローブ以外に、上述したトバモウイルス抵抗性植物のスクリーニング方法を実行するために必要とされる試薬などを備えていることが好ましい。例えば、上記抗体及び/又は上記プローブと、スクリーニングされる植物組織とを混合する際に用いる緩衝液を備えてもよく、上記抗体及び/又は上記プローブを安定に保持するための試薬や緩衝液を備えてもよい。
ここで、BTRポリペプチドと特異的に結合する抗体について説明する。BTRポリペプチドと特異的に結合する抗体は、本実施の形態に係るスクリーニングキットに包含するのみでなく、種々の利用が可能である。例えば、上述の本発明の一実施形態に係るトバモウイルス抵抗性植物の製造方法により製造した植物から、トバモウイルス増殖抑制活性が昂進した植物を選抜するときや、製造したトバモウイルス抵抗性植物体内における、BTRポリペプチドの蓄積又はbtrポリヌクレオチドの発現の確認にも利用可能である。
プラス鎖RNAウイルスのゲノムRNAの5’及び3’末端領域はウイルスRNAの翻訳及び複製に重要な役割を果たしている。本発明者らは、本実施例において、トバモウイルスの増殖制御に関わる宿主因子を同定するため、これら末端領域と結合する植物細胞由来因子の同定を試みた。
本実施例では、ToMVのゲノムRNAに結合するタンパク質を得るため、ToMVのゲノムRNAのうち5’末端又は3’末端の領域を含むRNAをストレプトタグに結合させたRNAプローブ(以下、「ストレプトタグ付加RNAプローブ」を用いた。
細胞抽出液の材料として、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)エコタイプ Col‐0株(以下、単に「Col‐0」と表記する)を用いた。
次に、Col‐0の細胞抽出液と、L5、LR、L3のそれぞれのRNAプローブとを以下の条件で混合して、RNA‐タンパク質複合体を形成させた。
上記それぞれのRNAプローブから得たRNA‐タンパク質複合体を、ストレプトマイシンを結合したセファロースビーズを用いてアフィニティー精製した。
図2の黒三角印に示したバンドのタンパク質をLC‐MS/MSにより解析した。当該タンパク質としては、SDS‐PAGEゲルより切り出して、トリプシン処理して得たサンプルを用いた。LC‐MS/MSによる解析はアプロサイエンス株式会社の受託解析サービスを利用した。
本実施例では、大腸菌で発現させたBTR1Sの、ToMVのゲノムRNAに対する結合性をゲルシフトアッセイによって評価した。ToMVのゲノムRNAの塩基配列としては、実施例1と同様にGenBankにアクセッションナンバーX02144で登録されている配列を用いた。
ToMVの5’末端領域300塩基を有する転写物及びToMVの3’末端領域218塩基を有する転写物を、以下の方法で作製した。
ヒスチジンタグをN末端に融合したBTR1Sを、pDEST‐Hisベクター(Tsunoda et al.,2005)を用いて、大腸菌(BL21(DE3)、Novagen社製)において発現させた。
20μlの反応液(50mM Tris‐HCl (pH7.5)、100mM NaCl、3mM MgCl2、2mM DTT、100mM イミダゾール、5% Glycerol、2mg/mlヘパリン)に、上述の大腸菌に発現させたBTR1Sを終濃度0、200、400、600nMとなるように添加した。次に、30℃で10分静置後、32P標識したToMV5’、ToMV3’又はluc5’(0.1pmol/μl)を1μl、及び2.5μlのGlycerol‐BPB液(50% Glycerol、0.05% ブロムフェノールブルー)を加えた。
植物体内における、BTR1のウイルス増殖に対する関与を、BTR1のノックアウト株及びBTR1Sを過剰発現させた株を用いて確認した。
シロイヌナズナのBTR1ノックアウト株は、Arabidopsis Biological Resource Centre(ABRC)のT−DNAタグラインより入手した(SALK_007924)。以下このBTR1ノックアウト株を、単に「SALK_007924」と表記する。SALK_007924は、Locus tag At5g04430の位置にT‐DNAが挿入されている。これにより、BTR1がノックアウトされている。
シロイヌナズナのBTR1過剰発現株は以下のようにして作製した。植物材料としては、シロイヌナズナの野生株であるCol‐0を用いた。
ウイルス増殖の測定には、各形質転換植物を、カナマイシン選抜することで得たT2世代のものを用いた。
BTR1の発現が、シロイヌナズナの植物体の形成に与える影響について確認した。
Claims (11)
- 植物生体内において、下記ポリペプチド(a)又は(b)による、トマトモザイクウイルスの増殖抑制活性を昂進させる工程、および
トマトモザイクウイルスの増殖抑制活性が昂進した植物を選抜する工程
を含むことを特徴とするトマトモザイクウイルス抵抗性植物の製造方法:
(a)配列番号1もしくは2に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(b)配列番号1もしくは2に示されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列において、1個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつトマトモザイクウイルス増殖抑制活性を有するポリペプチド。 - 上記選抜する工程が、植物体内の、上記ポリペプチド(a)又は(b)の蓄積量を測定することを含む、請求項1に記載の製造方法。
- 上記昂進させる工程は、植物体内において、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入することにより行うことを特徴とする請求項1または2に記載の製造方法。
- 上記ポリヌクレオチドは、以下の(c)、(d)又は(e)に記載のポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項3に記載の製造方法:
(c)配列番号3もしくは4に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(d)配列番号3もしくは4に示される塩基配列において、1個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(e)配列番号3もしくは4に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。 - 上記選抜する工程が、上記ポリヌクレオチド(c)、(d)又は(e)の発現量を測定することを含む、請求項4に記載の製造方法。
- 下記ポリヌクレオチドを備えていることを特徴とするトマトモザイクウイルス抵抗性植物を製造するためのキット:
(c)配列番号3もしくは4に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(d)配列番号3もしくは4に示される塩基配列において、1個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(e)配列番号3もしくは4に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。 - 植物体内の、下記ポリペプチド(a)又は(b)の蓄積量及び下記ポリヌクレオチド(c)、(d)又は(e)の発現量のうち、少なくとも一方の量を測定する工程を含むことを特徴とするトマトモザイクウイルス抵抗性植物のスクリーニング方法:
(a)配列番号1もしくは2に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(b)配列番号1もしくは2に示されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列において、1個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつトマトモザイクウイルス増殖抑制活性を有するポリペプチド;
(c)配列番号3もしくは4に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(d)配列番号3もしくは4に示される塩基配列において、1個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(e)配列番号3もしくは4に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。 - 野生株と比較して、上記植物体内における上記ポリペプチドの蓄積量または上記ポリヌクレオチドの発現量が高い植物体をスクリーニングする工程をさらに含む、請求項7に記載のスクリーニング方法。
- 下記ポリペプチド(a)又は(b)と特徴的に結合する抗体及び下記ポリヌクレオチド(c)、(d)又は(e)と特異的に結合するプローブのうち、少なくとも一方を備えることを特徴とするトマトモザイクウイルス抵抗性植物のスクリーニングキット;
(a)配列番号1もしくは2に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(b)配列番号1もしくは2に示されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列において、1個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつトマトモザイクウイルス増殖抑制活性を有するポリペプチド;
(c)配列番号3もしくは4に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(d)配列番号3もしくは4に示される塩基配列において、1個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(e)配列番号3もしくは4に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。 - 植物体内において、下記ポリペプチド(a)又は(b)による、トマトモザイクウイルスの増殖抑制活性を昂進させる工程を含むことを特徴とするトマトモザイクウイルス抵抗性植物の製造方法:
(a)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(b)配列番号2に示されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列において、1個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつトマトモザイクウイルス増殖抑制活性を有するポリペプチド。 - 請求項10に記載の製造方法により製造されることを特徴とするトマトモザイクウイルス抵抗性植物。
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