KR20000068498A

KR20000068498A - 키나제 단백질 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20000068498A
Application number: KR1019997001912A
Authority: KR
Inventors: 루소마르코스페르난도고도이; 채펠조셉
Original assignee: 유니버시티 오브 켄터키 리서치 화운데이션
Priority date: 1997-07-08
Filing date: 1998-07-07
Publication date: 2000-11-25
Also published as: JP2001500390A; CZ69899A3; IL128570A0; WO1999002655A1; CA2265441A1; WO1999002655A9; AU8568498A; PL332087A1; OA10990A; HUP0003564A2; AP9901469A0; ZA985999B; CN1234831A; EP0948599A1; ID21034A; EA199900184A1; BR9806183A

Abstract

본 발명은 병원균의 침입이나 유인제 처리 시 유도되는 핵산 분자에 관한 것이다. 이 분자는 식물, 식물 조직 및 식물 세포 중에서 유전자 발현을 유도하여 식물의 내병성 표현형을 변화시키는 기능을 한다. 이 분자는 칼슘 의존적인 키나제 단백질 유전자의 서열이거나 이 서열과 관련이 있다. 또한, 본 발명은 상기 핵산 분자를 함유하는 돌연변이 식물을 제조하는 방법 및 상기 분자를 사용하는 방법에 관한 것이다. 이와 같은 핵산에 의해 암호되는 폴리펩티드 역시 본 발명에 개시된다.

Description

키나제 단백질 및 이의 용도{PROTEIN KINASES AND USES THEREOF}

식물에 있어서 진균, 박테리아 및 바이러스 병원균에 대한 내병성은 과민 반응(HR)이라고 하는 식물 응답 반응과 관련이 있다. 과민 반응 시 잠재적 식물병원균이 침입한 식물 부위에는 국소적인 세포 사멸이 일어나며, 이와 같은 국소적인 식물 세포 사멸 부위에는 침입 미생물이나 바이러스가 존재하고 이것이 식물의 나머지 부분을 보호하는 것으로 추정된다. 기타 다른 식물 방어 반응으로는 피토알렉신 생성, 병원균 입구를 차단할 수 있는 용균 효소의 생성 및 물리적 공격 및/또는 효소적 공격에 대하여 식물을 강화시키는 세포벽의 변형을 포함한다.

식물의 HR은 미생물 침입에 대한 응답 반응의 일부로서 피토알렉신을 생성할수 있다. 예컨대, 담배[니코티아나 타바컴(Nicotiana tabacum)]는 미생물 침입체, 예컨대 슈도모나스 라크리만스(Pseudomonas lachrymans)에 대한 응답 반응으로 세스퀴테르펜을 생성한다.

식물 피토알렉신 합성의 유인제로는 다양한 조성물이 작용할 수 있다. 이 조성물로는 1종 이상의 독성 이온, 예컨대 수은 이온, 기타 다른 화학적 조성이 분명한 조성물, 대사 억제제, 세포벽 글리칸, 특정 당단백질, 특정 효소, 진균 포자, 키토산, 특정 지방산 및 식물 세포벽 유래의 특정 올리고사카라이드를 포함한다[본 명세서에 참고 인용된 문헌들과 Sequeira, L.(1983) Annu.Rev.Microbiol. 37: 51∼79 문헌을 참조하라]. 특정 피토프토라(Phytophthora) 종의 세포벽 단편과 트리코데르마 비리디(Trichoderma viride) 유래의 셀룰라제[아스퍼질러스 자포니컴(Aspergillus japonicum) 유래의 펙톨리아제는 제외]는 HR을 유도할 수 있다. 또한, 기타 다른 식물 병원균이나 비병원성의 근연 균주도 HR을 유도할 수 있다.

엘리시틴은 식물 병원균과 잠재적 식물 병원균에 의해 생성되는 단백질이다. 엘리시틴은 식물 중에서 HR을 유도할 수 있다. 보통 국소적 세포 사멸은 감염(또는 항원공격)된 식물 조직에서 나타나는 엘리시틴 유도 반응의 결과로서 일어나는 것이 일반적이며, 절대적인 것은 아니다. 이 반응은 침입된 강력한 식물 병원성 미생물에 의한 파괴적 감염에 대하여 완전한 내성이나 부분 내성을 매개한다. 피토프토라 파라시티카(Phytiphtora parasitica) 유래의 엘리시틴이 가진 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 암호 서열은 공지되어 있다[Kamoun et al.(1993) Mol. Plant-Microbe Interactions 6:573∼581].

담배 모자이크 바이러스(TMV)(이것에만 국한되는 것은 아님)를 비롯한 식물의 병원성 바이러스는 감염된 식물에서 HR을 유도한다. 또한, 식물을 감염시키는 박테리아는 HR을 유도하고, 따라서 내병성을 유도하며, 이러한 HR을 유도하는 대표적인 박테리아로는 예컨대 크산토모나스(Xanthomonas) 종 및 슈도모나스 시린제(Pseudomonas syringae)를 포함한다. 식물 병원성 진균은 보통 숙주 식물을 공격한 후 HR 반응을 유도하지 않는 것이 일반적이지만[예컨대, 담배 숙주에 대한 피토프토라 파라시티카 및 페로노스포라 타바시(Peronospora tabaci)], 비숙주 식물을 공격한 후에는 HR을 유도할 수 있다.

내병성 발현과 관련된 시그널 도입 기작에 대해서는 현재 연구 중이며 일부 유전자 특성과 생화학적 특성이 문헌[Staskawicz, B. et al., Science 268:661∼667(1995)]을 통해 개략되어 있다. 하지만, 시그널 도입 경로의 다양한 양태와 구체적인 다양한 성분들의 역할에 대해서는 아직 해명되어 있지 않다.

당해 기술 분야에는 식물 병원균에 의한 감염으로부터 식물, 구체적으로 농작물을 보호하는 방법이 오랫동안 절실히 필요로 되고 있다. 특히, 농작물에 주로 화학물질을 사용하는 방법 보다는 생물학적 방법 또는 "천연" 방법이 경제적, 환경적 측면에서 매우 중요하다. 또한, 당해 기술 분야에는 식물에 내병성을 향상시키고(또는) 증가시킬 수 있는 식물의 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 연구가 필요로 되고 있다.

본 발명은 미국 국립 과학 재단의 기금을 받아 일부 실시된 것이다. 따라서, 미국 정부는 본 발명에 일부 권리를 갖고 있다.

본 발명은 칼슘 의존적인 단백질 키나제를 암호하는 핵산, 이 핵산으로부터 생성되는 폴리펩티드 및 이 핵산을 발현하는 돌연변이 식물에 관한 것이다.

도 1은 프라이머 FokinB 및 RecalIV의 뉴클레오티드 서열을 도시한 것이다.

도 2는 엘리시틴 파라시티세인의 존재 하에 성장시킨 후의 담배 재배변종 KY14 외식체 유래의 세포 현탁 배양물로부터 분리된 부분 cDNA 클론의 DNA 서열(서열 번호 1)을 도시한 것이다.

도 3은 도 2에 기재된 DNA 서열로부터 추론된 표준 1문자 아미노산 코드의 아미노산 서열을 도시한 것이다.

도 4는 대두 CDPK의 아미노산 서열과 도 3에 기재된 아미노산 서열을 모식적으로 비교한 것이다.

상세한 설명

본 발명은 잠재적인 식물 병원균의 침입에 대한 응답 반응 및/또는 유인제 또는 유인제 유사 화합물 시그널에 의한 처리시 식물 세포에서 유도되는 분리된 폴리뉴클레오티드(핵산)에 관한 것이다. 이와 같은 핵산은 일반적으로 칼슘 의존적 단백질 키나제(CDPK) 폴리펩티드 또는 CDPK 관련 폴리펩티드를 암호한다. 본 명세서에 개시된 신규 폴리뉴클레오티드는 식물 방어 응답 반응 유전자의 유도에 대응하여 제때에 유도되는 반면, 기타 다른 CDPK 유전자는 충분히 신속하게 유도되지 못하는 것으로 나타난다. 이와 같은 신규 유전자는 식물에 있어 발생 조절 과정, 예컨대 꽃의 발생과 같은 발생 조절 과정에 관여하는 유전자가 발현 유도되는 것 보다 더 신속하게 유전자 발현이 유도된다. 본 명세서에 기재된 신규 CDPK 유전자는 무생물적 스트레스, 예컨대 염 스트레스 또는 수(水) 스트레스에 대한 응답 반응에 관여하는 많은 유전자 보다 더 신속하게 발현 유도된다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 cDNA, 합성 DNA 또는 게놈 DNA를 비롯한 DNA 형태 또는 RNA 형태일 수 있다. 이 DNA는 이본쇄 또는 일본쇄일 수 있으며, 일본쇄라면 암호 가닥이거나 비암호 가닥일 수 있다. 서열 번호 1에 기재된 RNA 유사체는 예컨대 mRNA이거나 리보뉴클레오티드와 데옥시리보뉴클레오티드의 조합체일 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 도 3에 기재된 서열과 실질적으로 유사하거나 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호할 수 있다. 다른 일부 구체예로서, 서열 번호 1에 기재된 핵산의 변형체일 수도 있는데, 예컨대 도 3에 기재된 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 암호하지만 유전자 코드의 축퇴로 인하여 다른 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 또 다른 핵산 서열을 더 포함할 수 있다. 예컨대, 분비 또는 리더 아미노산 서열을 암호하는 핵산 단편은 도 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 아미노 말단 단부에 프레임이 맞게 융합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 CDPK 폴리펩티드와 프레임이 맞게 융합시키기에 유용한 아미노산 서열을 암호하는 기타 다른 핵산 단편은 당해 기술 분야에 알려져 있다. 예컨대 미국 특허 제5,629,193호를 참조하라. 또한, 폴리뉴클레오티드는 본 명세서에 개시된 CDPK 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 결합된 1종 이상의 조절 인자를 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 명세서에 기재된 CDPK 폴리뉴클레오티드 서열과 선택적으로 하이브리드하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 하이브리드화는 표적 핵산 혼합물 중에 존재하는 DNA 서열을, 표지된 올리고뉴클레오티드 또는 DNA 단편 프로브와 하이브리드화하여 동정하는 방법인 서던 분석(서던 블롯팅)을 포함할 수 있다. 서던 분석은 문헌[Sambrook et al.,(1989) Molecular Cloning, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY]의 9.37 내지 9.52 장에 기재된 바와 같이 실시되는 아가로스 겔에서 DNA 분해물의 전기영동 분리, 전기영동 분리 후 DNA의 변성 및 방사능표지 프로브, 비오틴화된 프로브 또는 효소 표지된 프로브로 분석하기 위한 니트로셀룰로스, 나일론 또는 기타 다른 적합한 막 지지체로 DNA의 전이를 포함하는 것이 일반적이다.

폴리뉴클레오티드는 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오티드와 중간 엄중 조건 또는 높은 엄중 조건 하에서 하이브리드할 수 있다. 높은 엄중 조건은 프로브와 높은 상동성 또는 서열 동일성을 가진 핵산을 동정하는데 사용한다. 높은 엄중 조건은 하이브리드화 동안 포름아미드, 예컨대 50% 포름아미드 같은 변성제를 0.1% 소혈청 알부민/0.1% Ficoll/0.1% 폴리비닐피롤리돈/50 mM 인산나트륨 완충액(pH 6.5) 및 750 mM NaCl과 75 mM 구연산나트륨과 함께 42 ℃에서 사용하는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 예는 50% 포름아미드, 5 x SSC(0.75M NaCl, 0.075M 구연산 나트륨), 50 mM 인산 나트륨(pH 6.8), 0.1% 피로인산나트륨, 5x 덴하르트 용액, 초음파처리된 연어 정자 DNA(50 ㎍/㎖), 0.1% SDS 및 10% 덱스트란 설페이트를 42 ℃에서 사용하고, 0.2 x SSC와 0.1% SDS로 42 ℃에서 세척하는 것을 포함한다. 대안적으로, 세척시에는 저이온 강도와 고온을 이용할 수도 있는데, 예컨대 0.015M NaCl/0.0015M 구연산나트륨(0.1 x SSC); 0.1% 나트륨 라우릴 설페이트(SDS)를 65 ℃에서 사용할 수 있다.

중간 엄중 조건은 높은 엄중 조건에서 동정되는 핵산 보다는 프로브와 상동성이나 동일성이 적은 핵산을 동정하는데 사용되는 하이브리드화 조건을 의미한다. 중간 엄중 조건은 하이브리드화 막을 세척하는데 있어 높은 엄중도의 하이브리드화에 이용된 이온 강도와 온도에 비하여 높은 이온 강도 및/또는 낮은 온도를 사용하는 것을 포함할 수 있다. 예컨대, 0.060 M NaCl/0.0060 M 구연산나트륨(4x SSC) 및 0.1% 나트륨 라우릴 설페이트(SDS)를 함유하는 세척 용액을 50 ℃에서 사용할 수 있으며, 마지막 세척 시에는 1x SSC를 65 ℃에서 사용할 수 있다. 대안적으로, 37 ℃에서 1x SSC를 이용한 하이브리드화 세척을 이용할 수도 있다.

또한, 하이브리드화는 프로브와 하이브리드하는 RNA를 동정하는데 사용되는 방법인 노던 분석(노던 블롯팅)으로 실시할 수 있다. 프로브는³²P와 같은 방사능동위원소를 이용하거나, 비오틴화 또는 효소를 이용하여 표지한다. 분석할 RNA는 전술한 문헌 Sambrook et al.의 7.39 내지 7.52 장에 기재된 것과 같은 당해 기술 분야에 공지된 표준 기법을 사용하여 아가로스 겔 또는 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동으로 분리한 뒤, 니트로셀룰로스, 나일론 또는 기타 다른 적합한 막으로 전이시킨 다음 프로브와 하이브리드화할 수 있다.

프로브는 길이가 약 20개 이상인 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 50개 이상인 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 100개 이상인 뉴클레오티드를 사용하는 것이 통상 바람직하다. 비교적 짧은 프로브를 사용해야만 한다면, 프로브의 뉴클레오티드 서열은 식물의 CDPK 유전자 중에서 보전적 영역(예컨대 키나제 단백질 도메인 및 칼슘 결합 도메인)은 피하는 것이 좋은데, 그 이유는 본 명세서에 개시된 신속 유도성 CDPK 유전자를 보다 느린 유도성 CDPK 유전자, 구성적 CDPK 유전자 또는 저농도의 구성적 CDPK 유전자로부터 보다 용이하게 구별할 수 있도록 하기 위해서이다. 그렇지만, 본 명세서에 개시된 신규 폴리뉴클레오티드에 대해 보다 특이적인 비보전적 영역이 프로브 중에 충분히 존재한다면 보전적 영역을 함유하는 프로브도 사용할 수 있다.

본 발명에 기재된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 1에 기재된 서열과 약 70% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 약 80% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 것이다. 서열 동일성은 예컨대 단독 서열 정렬 및 다중 서열 정렬이 실행되도록 디자인된 컴퓨터 프로그램을 통해 측정할 수 있다. 서열 번호 1에 기재된 폴리뉴클레오티드와 약 70% 이상의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가진 폴리뉴클레오티드는 본 발명에 포함되며 중간 엄중도 조건 하에서 하이브리드화로 확인할 수 있다. 서열 번호 1에 기재된 폴리뉴클레오티드와 서열 동일성이 약 80% 이상, 약 90% 이상 또는 약 95% 이상인 폴리뉴클레오티드는 높은 엄중도 하이브리드화 조건하에서 확인할 수 있다.

본 발명에 기재된 폴리뉴클레오티드는 화학적 합성법, 식물 게놈 DNA로부터의 분리 및 클로닝, 또는 서열 번호 1에 기재된 서열의 일부에 해당하는 올리고뉴클레오티드를 이용하여 실시하는 폴리머라제 사슬 반응(PCR)의 이용을 비롯한 당해 기술 분야에 공지된 기타 다른 방법을 사용하여 얻을 수 있다. PCR은 본원에 참고 인용되는 미국 특허 제4,683,195호에 기재된 방법과 유사한 방법으로 표적 핵산을 증폭시키는 절차 또는 기법과 본 명세서에 기재된 절차의 후속 변형 방법을 의미한다. 일반적으로, 목적하는 영역의 단부에 있는 서열 정보 또는 그 이상의 서열 정보를 이용하면 증폭될 주형의 대향 가닥과 서열이 동일하거나 유사한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 디자인할 수 있다. PCR은 특정 RNA 서열, 총 게놈 DNA 유래의 특정 DNA 서열 및 총 세포 RNA, 박테리오파지 또는 플라스미드 서열로부터 전사된 cDNA 등을 증폭시키는데 사용할 수 있다. 대안적으로, 도 3에 기재된 CDPK 서열의 친수성 영역에서 유래된 펩티드 서열을 사용하여 제조한 CDPK 특이적 항체와 당해 기술 분야에 공지된 기법을 사용하여 cDNA 라이브러리(발현 벡터 중에 존재)를 선별할 수 있다.

본 발명의 신규 폴리뉴클레오티드는 실질적으로 모든 식물, 예컨대 레구미나시에(Leguminaceae)(예, 대두), 솔라나시에(Solanaceae, 예, N.타바컴), 브라시카시에(Brassicaceae) 과[예, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)] 및 그라미나시에[Graminacea, 예컨대 제아 메이스(Zea mays)]에 속하는 구성원들 중에서 분리될 수 있다. 특히, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 솔라나시에 과에서 분리 선택된 것이 바람직하다.

다른 구체예로서, 본 발명에 기재된 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 서열의 상동성과 유인제 또는 병원균 처리후 신속한 발현 유도를 기초로 하여 식물로부터 확인 및 분리한다. 예컨대, 중간 내지 높은 엄중도 조건하에서 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오티드 프로브를 이용한 DNA:DNA 하이브리드화를 실시하면 다른 식물 종에서 유래되는 대응하는 유전자를 확인할 수 있다. 또한, 방어 반응을 유도한 후 즉시 조직에서 분리된 표적 핵산(예, cDNA)을 이용하면 본 명세서에 기재된 신규 폴리뉴클레오티드를 분리할 수 있는데, 그 이유는 이와 같은 폴리뉴클레오티드가 다른 CDPK 유전자보다 신속하게 유도되기 때문이다.

핵산 작제물은 본 명세서에 개시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 일반적으로 다른 폴리뉴클레오티드와 결합되는 것이 보통이다. 예컨대, 전길이의 CDPK 암호 서열은 리더 서열, 분비 서열 또는 폴리펩티드 또는 펩티드 단편에 유용하게 결합될 수 있는 다른 아미노산 서열을 암호하는 핵산 단편에 프레임이 맞게 작동가능하게 융합될 수 있다.

다른 구체예로서, 핵산 작제물은 1개 이상의 적합한 조절 서열에 센스 또는 안티센스 배향으로 작동가능하게 결합된 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 조절 서열은 보통 유전자 생성물을 암호하지 않는 것이 일반적이다. 대신에, 조절 서열은 암호 서열의 발현율에 영향을 미친다. 조절 서열의 예는 당해 기술 분야에 공지된 것으로, 예컨대 유인제에 대한 응답 반응으로 유도된 유전자의 프로모터 및 최소 프로모터를 포함하며, 이것에만 국한되는 것은 아니다. 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드의 천연 조절 서열은 당업자라면 용이하게 분리하여 본 발명의 작제물 제조에 이용할 수 있다. 적합한 조절 서열의 다른 예로는 인헨서, 인헨서 유사 인자, 인트론, 폴리 A 서열 같은 3' 비암호 영역 및 본 명세서에 개시된 바와 같은 기타 다른 조절 서열을 포함한다. 이와 같은 키메라 유전자를 제조하는데 적합한 분자 생물학 기법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다.

본 발명에 기재된 폴리펩티드는 아미노산이 약 250개 내지 약 550개, 예컨대 약 300개 내지 약 508개 또는 약 308개 내지 약 500개일 수 있다. 본 발명에 기재된 폴리펩티드는 보통 칼슘 결합 부위 도메인 뿐만 아니라 키나제 단백질 도메인을 포함하는 것이 일반적이다. 이러한 도메인으로는 예컨대 도 3에 기재된 아미노산 2 내지 7, 42 내지 49, 191 내지 202, 227 내지 238, 264 내지 274 및 297 내지 307의 도메인을 포함한다.

폴리펩티드의 아미노산 서열은 도 3에 기재된 추론된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 다른 구체예로서, 본 발명에 기재된 폴리펩티드는 도 3에 기재된 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열, 예컨대 약 80% 이상의 서열 동일성 또는 약 90% 이상의 서열 동일성 또는 약 95% 이상의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다. 일반적으로, 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는다면 보존적 아미노산 치환이나 유사 아미노산으로의 치환도 허용된다. 유사 아미노산이란 크기 및/또는 하전의 성질이 유사한 것을 의미한다. 예컨대, 이소로이신과 발린은 유사 아미노산이다. 아미노산 쌍 간의 유사성은 다양한 방법으로 당해 기술 분야에서 평가되었다. 예컨대, 문헌[Dayhoff et al.(1978) in Atlas of Protein Sequence and Structure, Vol. 5, Suppl.3, pp. 345-352]은 아미노산 유사성의 척도로서 이용할 수 있는 아미노산 치환의 빈도 표를 제공한다. 키나제 단백질 도메인과 칼슘 결합 부위 도메인은 보전적 치환으로 변화될 수 있지만 보통 아미노산 서열은 변화되지 않고 보유되는 것이 일반적이다.

"분리된" 폴리펩티드는 폴리펩티드가 천연적으로 발현되어 생성되는 방식이나 환경과는 다른 방식이나 환경에서 발현시켜 얻는다. 예컨대, 폴리펩티드는 박테리아 또는 진균 중에서 발현 및 생성시켜 분리한다. 이와 유사한 양태로서, 폴리펩티드는 이 폴리펩티드를 암호하는 유전자를 키메라 조절 인자에 작동가능하게 결합시켜 이 폴리펩티드가 천연적으로 발현되지 않는 조직이나 종에서 발현시키면 얻어진다. 또한, 폴리펩티드는 이 폴리펩티드를 암호하는 유전자를 키메라 조절 인자에 작동가능하게 결합하여 이 폴리펩티드가 천연적으로 발현되는 조직 중에서 발현시키면 보다 고농도로 얻어진다. 또한, 본 발명에 기재된 폴리펩티드는 표준 정제 방법으로 분리하여 약 80% 이상의 순도, 약 90% 이상의 순도 또는 약 95% 이상의 순도로 얻을 수 있다.

다른 구체예로서, 본 발명에 기재된 폴리펩티드는 도 3에 기재된 추론된 아미노산 서열을 비롯한 폴리펩티드의 유사체 또는 변형체이다. 이와 같은 유사체 또는 변형체로는 폴리펩티드의 기능을 실질적으로 변화시키지 않는, 예컨대 천연 발생의 대립유전자 변형체, 비천연 발생의 대립유전자 변형체, 결실 변형체 및 삽입 변형체를 포함한다.

본 발명의 폴리펩티드는 도 3에 도시된 서열 뿐만 아니라 서열 번호 1에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 서열과 동일한 유전자에 의해 암호되는 인접 아미노 말단 및 카르복시 말단 서열을 포함할 수 있다. 또는, 제1 CDPK 유전자 중 5' 영역의 뉴클레오티드를 제2 CDPK 유전자 중 3' 영역의 뉴클레오티드에 프레임이 맞게 결합시켜 키메라 폴리펩티드를 암호하는 키메라 유전자를 만들면 키메라 폴리펩티드를 얻을 수 있다. 키메라 CDPK 폴리펩티드의 예시적인 일례는 프레임이 맞게 융합된, 대두 CDPK 유전자의 아미노 말단 영역 유래의 아미노산 1 내지 156(도 4)과, 그 다음 도 3에 기재된 아미노산 서열 및 이어서 동일한 대두 CDPK 유전자의 카르복시 말단 영역 유래의 아미노산 465 내지 508을 암호하는 폴리뉴클레오티드에 의해 발현되는 폴리펩티드이다.

본 발명에 기재된 돌연변이 식물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산 작제물을 포함한다. 이와 같은 작제물은 식물 세포 중으로 도입된 뒤 1종 이상의 돌연변이 식물이 된다. 이 돌연변이 식물에 의해 생성되는 종자는 생장하여 자가수정(또는 타가생식 및 자가수정)함으로써 작제물과 동형접합성인 식물이 될 수 있다. 종자는 분석하여 목적하는 작제물을 발현하는 동형접합체인지를 확인할 수 있다. 돌연변이 식물은 육종 프로그램을 통해, 예컨대 종자를 번식시키거나 신규 작제물을 다른 세포주 또는 종으로 유전질침투시키거나 또는 다른 바람직한 특성을 더 이입시킬 수 있다. 또는, 형질전환된 식물 세포의 생장 전파를 이 기법으로 처리되기 쉬운 종에게 실시함으로써 돌연변이 식물을 얻을 수도 있다.

본 명세서에 사용된 돌연변이 식물이란 1대 돌연변이 식물의 자손을 의미하기도 한다. 자손에는 특정 식물 또는 식물주의 후대, 예컨대 본 발명의 식물에서 발생된 종자를 포함한다. 또한, 본 발명에 따른 식물의 자손은 F₁, F₂, F₃및 후속 세대의 식물에서 형성되는 종자 또는 BC₁, BC₂, BC₃및 후속 세대의 식물에서 형성되는 종자를 포함한다.

다른 구체예로서, 돌연변이 식물은 적합한 조절 인자에 센스 배향으로 작동가능하게 결합된본 발명에 기재된 폴리뉴클레오티드를 함유하여 센스 mRNA를 생성하는 작제물을 포함한다. 필요하다면, 이 작제물에 선별용 마커 유전자를 병입시켜 형질전환된 세포 또는 조직의 확인을 용이하게 할 수도 있다.

또한, 식물에서 신규 CDPK 유전자를 억제하는 반응도 유용하게 사용될 수 있다. 예컨대, 종자 작물을 수확하기 바로 전에 CDPK 유전자의 발현을 억제하면 식물 병원균이 식물 생장 조직에 보다 용이하게 침입할 수 있어 기계적 종자 수확에 바람직하지 않은 식물의 생물량을 감소시킬 수 있다. CDPK 유전자 발현의 조절 억제는 본 발명에 기재된 폴리뉴클레오티드를 적합한 유도성 조절 서열에 안티센스 배향으로 작동가능하게 결합시키면 가능하다(예컨대 미국 특허 제5,453,566호 참조).또한, 이와 동일한 효과를 동시억제를 통해 얻을 수 있는데, 즉 신규 CDPK 유전자 전체 또는 부분 암호 서열이 센스 배향으로 발현되면 대응하는 내인성 CDPK 유전자가 억제될 수 있다. 예컨대 WO 94/11516을 참조하라.

다른 구체예로서, 핵산 작제물은 최소 프로모터에 작동가능하게 결합되고 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이와 같은 작제물은 식물에 도입되어 발현될 때 폴리뉴클레오티드를 저농도로 구성적 발현시키므로 식물은 향상된 전신 방어 반응을 나타낼 수 있다. 최소 프로모터는 RNA 폴리머라제 결합 및 전사 개시에 필요한 DNA 서열의 시그널을 포함한다. 보통 최소 프로모터에 의해 유도되는 전사는 저농도이어서 식물 조직 중의 환경적 또는 발생적 시그널에 대해 양성 또는 음성적으로 반응하지 않는다. 식물에 사용하기에 적합한 최소 프로모터의 예로는 35S 전사 유니트의 -90 내지 +8의 영역을 포함하는 절두형 CaMV 35S 프로모터이다.

전사 조절 서열은 현탁 배양물 중에서 유전자 발현을 조절하는데 사용될 수 있다. 예컨대, 전사 개시 시그널, 유도성 전사 조절 인자 및 전사 증강 인자를 포함하는 EAS4 프로모터를 사용하면 돌연변이 식물이나 현탁 세포 배양물 중에서 개시된 암호 서열의 유도성 발현을 매개할 수 있다. 미국 출원 일련 번호 08/577,483을 참조하라. 필요한 경우 목적 암호 서열은 유인제 또는 기타 다른 유도 시그널을 첨가하여 발현 유도할 수 있다.

본 발명에 사용되는 돌연변이 기법으로는 아그로박테리엄 매개의 형질전환법, 전기투과법 및 입자 총 형질전환법을 포함하며, 이것에 국한되는 것은 아니다. 형질전환법의 예는 미국 특허 제5,204,253호(입자 총) 및 미국 특허 제5,188,958호(아그로박테리엄)에 기재된 것이다. 아그로박테리엄 종에 함유된 Ti 플라스미드 및 Ri 플라스미드를 이용한 형질전환법은 보통 이중 벡터를 이용한다[Walkerpeach, C. et al., in Plant Molecular Biology Manual, S.Gelvin and R.Schilperoort, eds., Kluwer Dordrecht, C1:1-19(1994)].

다른 구체예로서, 유도성 전사 조절 서열은 식물 중에서 기능적인 프로모터 서열에 결합시킬 수 있는데, 이 때 두 유전자 모두 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 결합된다. 이와 같이 조절 인자가 프로모터에 결합되는 경우, 일반적으로 절두형(또는 최소) 프로모터로는 예컨대 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV)의 절두형 35S 프로모터를 이용한다. 기타 다른 구성형 프로모터의 절두 형태로서, 예컨대 nos, ocs 및 mas 같은 에이. 튜머페이션스 T-DNA 유전자 및 CaMV 19S 유전자 같은 식물 바이러스 유전자를 사용할 수 있다.

식물 조직을 배양하고 그 조직을 재생시키는 기법과 같이 단자엽 식물 뿐만 아니라 쌍자엽 식물로 DNA를 도입시키는 기법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 형질전환 및 재생이 성공된 바 있는 단자엽 식물로는 밀, 옥수수, 보리, 쌀 및 아스파라거스를 포함한다. 예컨대, 미국 특허 제5,484,956호 및 제5,550,318호를 참조하라. 돌연변이 아스펜 조직을 제조하여 돌연변이 식물을 재생시킨 경우도 있다. 또한, 포플라도 형질전환시킨 바 있다. 이 기법은 나자 식물의 조작, 형질전환 및 재생에도 이용가능하다. 예컨대, 미국 특허 제5,122,466호 및 미국 특허 제5,041,382호를 참조하라.

본 발명에 기재된 방법은 핵산 작제물을 식물 세포로 도입시키는 단계 및 이와 같이 형질전환된 세포로부터 식물을 생성시키는 단계를 포함한다. 이 작제물 중에 존재하는 폴리뉴클레오티드는 발현되어 식물의 내병성 표현형을 변화시키는데, 예컨대 신규한 내병성 표현형을 식물에 부여하거나 기존의 내병성 표현형을 향상시키기도 한다.

내병성 표현형에는 돌연변이 식물이 나타내는 숙주 방어 응답의 정도와 타이밍을 포함한다. 내병성이 변화되었는지를 확인하는 분석법은 일반적으로 돌연변이 식물에 방어 응답 반응을 통상 유인하는 화합물을 투여하고, 이와 동시에 대조군 식물에도 동일 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 대조군 식물은 보통 신규 핵산 작제물을 도입시킨 식물 주와 동일한 모식물 주이다. 내병성은 대조군 식물이 나타내는 대응하는 내성 보다 돌연변이 식물이 나타내는 내성의 정도가 더 높다면 본 발명에 기재된 폴리뉴클레오티드의 발현을 통해 식물에 부여되거나 향상된 것이다. 내병성은 참고적으로 특정 병원균, 예컨대 피토프토라 종을 사용하여 측정할 수 있다. 또한, 내병성은 참고적으로 여러 병원균에 대하여 측정하여 전신 방어 응답 반응을 확인할 수도 있다.

돌연변이 식물이 유인제 매개의 조절 인자에 작동가능하게 결합된 CDPK 암호 서열을 발현하기 위하여 유도되어야 하는 경우 유인제는 일반적으로 유도 효과를 나타내기 위하여 식물의 각피를 투과해야만 한다. 따라서, 식물 조직에 상처를 내면 식물 조직으로 유인제가 용이하게 흡수될 수 있다. 유인제 및 기타 다른 화학 시그널, 예컨대 에틸렌과 메틸 자스모네이트 조합물을 비롯한 각종 유도성 조성물을 사용하면 발현을 유도하는데 효과적이다.

본 발명에 기재된 폴리뉴클레오티드를 사용하는 방법은 식물 유래의 DNA 또는 RNA에 폴리뉴클레오티드를 하이브리드화하는 단계를 포함한다. 하이브리드화는 예컨대 전술한 바와 같이 실시할 수 있다. 또한, 이 방법은 폴리뉴클레오티드와 서열 동일성이 유의적인 정도, 예컨대 서열 동일성이 70%, 바람직하게는 서열 동일성이 80%, 서열 동일성이 90% 또는 서열 동일성이 95%인 식물 DNA 또는 RNA 분절을 확인하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이 분절은 식물 DNA 또는 RNA를 전기영동 분리하고 표지된 폴리뉴클레오티드 프로브를 이용하면 확인할 수 있는데, 그 결과로서 상동성 분절인 위치에서 가시적인 밴드가 나타난다. 분절은 예컨대 물리적 전단이나 제한 효소 분해를 통해 얻을 수 있다. 분절은 길이가 100 bp(뉴클레오티드) 만큼 짧을 수 있지만 보통 분절은 1000 bp 이상이며 10,000 bp 이상일 수도 있다.

상기 방법은 상동성 분절에 인접한 DNA 등을 비롯한 DNA 분절 또는 RNA 분절의 최소한 일부를 클로닝하는 단계를 포함할 수 있다. 이와 같은 인접 DNA는 프로모터, 인헨서, 전사 조절 인자 및 폴리 A 서열을 포함할 수 있다. 인접 DNA는 상동성 분절의 5' 또는 3'에 위치할 수 있고, 암호 서열 이외에 300 bp, 600 bp 또는 1000 bp의 DNA를 포함하는 것이 바람직한데, 그 이유는 이 범위 내에서 조절 인자들이 관찰되기 때문이다.

본 명세서에 개시된 신규 폴리뉴클레오티드에 인접한 프로모터 및 기타 다른 유인제 또는 병원균 응답성 조절 인자가 특히 유용한데, 그 이유는 이와 같은 인자들이 병원균이나 유인제로 처리 시 유전자 발현을 매우 신속하게 유도하기 때문이다. 이와 같은 조절 인자는 유용한 유전자에 작동가능하게 결합하여 목적 화합물을 신속하게 생성시킬 수 있다. 예컨대, 이와 같은 조절 인자는 항체, 혈액 응집 인자, 항원성 펩티드, 바이러스 레플리카제 또는 외피 단백질 및 2차 대사 산물 합성(예컨대, 이소프레노이드 생합성)에 관여하는 효소를 암호하는 유전자의 발현을 유도하는데 사용할 수 있다. 예컨대, 미국 특허 제5,612,487호, 제5,484,719호 및 1995년 12월 22일에 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 08/577,483호를 참조하라.

유인제 또는 병원균 응답성 인자를 가진 키메라 유전자를 식물에 도입한 후에는 적당한 병원균이나 유인제를 사용하면 키메라 유전자의 생성물을 발현 유도할 수 있다. 즉, 목적하는 유전자 생성물(또는 이것의 효소적 최종 생성물)을 신속하게 만들어 목적하는 생성물을 얻을 수 있다.

본 발명은 이하 실시예를 통해 상세히 설명되지만, 이 실시예에 의해 청구의 범위에 기재된 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 핵산은 신규 칼슘 의존적 단백질 키나제(CDPK) 유전자 및 이에 대응하는 단백질을 기본으로 한다. 이와 같은 신규 CDPK 유전자의 발현 유도는 놀라울 정도로 빠른데, 즉 이 유전자의 mRNA 전사는 유인제를 이용하여 식물 방어 반응을 유도한 지 30 분 후 즉시 관찰할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 개시된 신규 유전자는 침입성 식물 병원균의 지표인 시그널에 대한 응답 반응으로 가장 신속하게 유도되는 유전자 중의 1가지이다.

분리된 폴리뉴클레오티드는 본 명세서에 개시된 서열로서, 서열 번호 1의 뉴클레오티드 서열 및 이의 보체, 서열 번호 1에 기재된 RNA 유사체 또는 이것의 보체를 포함한다. 또한, 이 폴리뉴클레오티드는 길이가 20 개 이상인 뉴클레오티드이고 엄중 조건 하에서 도 3에 도시된 폴리펩티드를 암호하는 게놈 DNA와 하이브리드하는 상기 폴리뉴클레오티드의 핵산 단편일 수 있다. 이 폴리뉴클레오티드는 예컨대 도 2에 도시된 뉴클레오티드 1 내지 170, 뉴클레오티드 160 내지 560 또는 뉴클레오티드 550 내지 920을 포함할 수 있다.

본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산 작제물은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이 작제물에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 이 폴리뉴클레오티드의 전사를 조절하는 1종 이상의 인자, 예컨대 본 명세서에 기재된 바와 같은 진균(예, 피토프테라), 박테리아(예, 슈도모나스) 또는 바이러스(예, 담배 모자이크 바이러스)와 같은 식물 병원균에 대한 응답 반응으로 유도되는 조절 인자에 작동가능하게 결합될 수 있다. 다른 구체예로서, 이와 같은 유도 반응은 유인제(예, 진균 또는 박테리아 유인제)에 의해 매개된다.

또 다른 본 발명의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 예컨대 암호 서열이나 안티센스 서열을 포함하여 발현하도록 유전자 조작된 돌연변이 식물 세포, 식물 조직 및 식물을 제공한다. 이 작제물은 상기 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 결합된 조절 인자, 예컨대 유도성 조절 인자를 더 포함할 수 있다. 식물은 쌍자엽 식물, 예컨대 니코티아나 타바컴(Nicotiana tabacum)과 같은 솔라나시에(Solanaceae) 과의 구성원일 수 있다. 또한, 식물은 단자엽 식물, 나자 식물 또는 침엽수일 수 있다.

본 명세서에 개시된 돌연변이 식물은 아미노산 약 250개 내지 약 550개를 가진 폴리펩티드를 발현하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것이다. 이 폴리펩티드는 도 3에 기재된 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

폴리뉴클레오티드를 사용하는 방법 역시 본 명세서에 개시된다. 이 방법은 전술한 폴리뉴클레오티드를 식물 유래의 DNA 또는 RNA에 하이브리드하는 단계를 포함한다. 또한, 이 방법은 상기 폴리뉴클레오티드에 대해 약 70% 이상의 서열 동일성을 나타내는 식물의 DNA 또는 RNA 분절을 식별하는 단계 및 이 DNA 또는 RNA 분절 중 최소한 일부를 클로닝하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이와 같은 클로닝 부는 70% 이상의 서열 동일성을 가진 분절에 인접한 DNA를 더 포함할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 식물의 내병성을 변화시키는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 식물 세포 중에 도입시키는 단계 및 이 식물 세포로부터 상기 폴리뉴클레오티드를 함유하는 식물을 형성시키는 단계를 포함한다. 이 폴리뉴클레오티드는 발현을 통해 식물의 내병성을 변화시킨다. 핵산 작제물은, 예컨대 상기 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 결합된 유도성 조절 인자를 더 포함할 수 있고, 따라서 식물이 유인제 또는 식물 병원균에 노출되면 상기 조절 인자에 의해 발현이 유도될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 아미노산이 약 250개 내지 약 550개이고 아미노산 서열이 도 3에 기재된 서열과 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드를 특징으로 한다.

유도성 조절 인자는 조절 인자에 작동가능하게 결합된 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절하는데 효과적인 DNA 서열이다. 예컨대, 식물 방어 반응(예, 과민 반응)과 관련된 CDPK 유전자 생성물은 발생 조절형 조절 인자에 작동가능하게 결합될 수 있다. 또한, 이 용어에는 질병 관련 외부 시그널 또는 인자(예, 본 명세서에 기재된 바와 같은 병원균 또는 유인제 유도성 시그널 또는 인자)에 대한 응답 반응으로 유전자 발현이 유도되기에 충분한 조절 인자도 포함된다. 또한, 이 용어에는 신규의 CDPK 유전자에 인접해 있고 이 신규 유전자의 신속한 전사 유도와 관련이 있는 조절 인자를 포함한다. 일반적으로, 방어 응답 반응 조절 인자는 유전자의 암호 영역에 대해 5'쪽에 위치하지만, 이 위치에만 제한되는 것은 아니다.

"조직 특이적"이란 용어는 다른 조직(예, 체관)에 비해 한 조직(예, 물관 조직)에서의 유전자 생성물(예컨대, mRNA 분자 또는 폴리펩티드)의 발현이 우위적으로 증가할 수 있음을 의미한다. "세포 특이적"이란 용어는 다른 세포(예, 상피 세포)에 비해 한 세포(예, 유세포)에서의 유전자 생성물(예, mRNA 분자 또는 폴리펩티드)의 발현이 우위적으로 증가할 수 있음을 의미한다.

"병원균"이란 생 식물 조직 세포를 감염시키거나 결합하여 질병을 일으킬 수 있는 유기체를 의미한다. "유인제"란 식물 방어 응답 반응을 개시시킬 수 있는 임의의 분자를 의미한다. 유인제의 예로는 1종 이상의 독소 이온, 예컨대 수은 이온, 기타 다른 화학적 조성이 분명한 조성물, 대사 억제제, 세포벽 글리칸, 특정 당단백질, 특정 효소, 진균 포자, 키토산, 특정 지방산 및 식물 세포벽 유래의 특정 올리고사카라이드 및 엘리시틴(예, 하르핀, 크립토게인 및 파라시티세인)을 포함하며, 이것에 국한되는 것은 아니다.

"작동가능하게 결합된"이란 용어는 2개의 폴리뉴클레오티드가 목적하는 기능적 활성을 얻을 수 있는 방식으로 결합되어 있는 것을 의미하며, 예컨대 적당한 유도 인자가 존재하는 경우 유도성 조절 서열과 암호 서열이 유전자 발현될 수 있도록 결합되는 것을 의미한다.

본 명세서에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 별다른 표시가 없는 한 본 발명이 속하는 당해 기술 분야의 전문가들에게 통상적인 의미를 나타낸다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료를 사용하여 본 발명을 실시하거나 시험할 수 있지만, 적합한 방법 및 재료에 대하여 이하 상세히 설명하겠다. 본 명세서에 기재된 모든 공보, 특허 출원, 특허 및 기타 다른 참고 문헌들은 그 전부가 참고 인용된다. 또한, 재료, 방법 및 실시예는 단지 예시적으로 기재한 것이며 이것에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 기타 다른 특징과 장점은 다음과 같은 바람직한 구체예의 설명과 청구의 범위로부터 명백히 알 수 있다.

다음 실시예에서는 분자 생물학 기술 분야의 당업자에게 공지되고 실시용이한 식물 조직 중에서의 재조합 DNA 조작 및 돌연변이 식물의 배양 및 재생에 관한 다양한 기법들이 사용된다. 효소는 시판품을 제조자의 추천에 따라 사용하거나 당해 기술 분야에 공지된 기타 다른 변형 방법으로 사용하였다. 또한, 시약, 완충액 및 배양 조건들은 당업계에 공지된 것이다. 사용된 약어 및 명칭은 당해 분야의 표준 용어이며 본 명세서에 인용된 문헌들과 같은 전문 서적에 일반적으로 사용되는 것들이다.

실시예 1

담배 CDPK cDNA의 클로닝

유인제 파라시티세인은 이.콜리 세포에서 피토프토라 parA1 유전자를 발현시키고 그 유전자의 생성물을 페리플라슴 간극으로부터 분리하여 제조하였다.

피토프로라 O 형의 게놈 DNA는 문헌[Xu,J., et al., Trends in Genetics 10:226∼227(1994)]에 대부분 기재된 바와 같이 균사로부터 분리하였다. 이 DNA를 전단하고, 문헌[Kamoun,S.,et al.,Mol.Plant Microbe Interact. 6:573∼581(1993)]에 보고된 parA1 서열에 따라 디자인된 프라이머를 사용하여 parA1 유전자를 PCR 증폭하기 위한 주형으로 사용하였다. 이 parA1 PCR 생성물을 pBluescript(미국 캘리포니아주 산디에고에 소재하는 스트라타진 제품)로 클로닝하고 그 생성물의 서열을 디데옥시 사슬 종결 방법을 사용하는 이본쇄 DNA 서열결정법으로 분석하였다.

pBluescript 중의 parA1 삽입체는, N-말단에 히스티딘 태그와 이 유전자의 5' 말단에 키나제 단백질 부위를 만든 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭시켰다. 이 PCR 생성물을 발현 벡터 pET28b(미국 위스콘신주 매디슨에 소재하는 노바겐 제품)에 결찰시키고 parA1 융합체인 DNA 서열을 확인한 후 그 pET28b 작제물을 가지고 이.콜리 BL21을 형질전환시켰다.

parA1 융합체를 함유하는 BL21 배양물은 가나마이신 존재하에 37 ℃에서 증식시켜 OD₆₀₀이 0.3이 될 때까지 배양하였다. 여기에 IPTG(1 mM)를 첨가하고 배양물을 27 ℃에서 5 시간 동안 배양하였다.

페리플라슴의 단백질은 문헌[Ausubel,F., et al. in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons, New York(1989)]에 실질적으로 기재된 바와 같이 삼투압 쇼크를 통해 제조하였다. 먼저, 원심분리하여 세포(1.5 ㎖)를 수거하고, 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 20% 슈크로스, 1 mM EDTA를 함유하는 용액 500 ㎕에 재현탁하고 실온에서 10 분 동안 진탕시키면서 항온처리하였다. 이것을 원심분리한 후, 펠렛을 빙냉한 MgSO₄(5 mM) 200 ㎕ 중에 재현탁하고 4 ℃에서 10 분 동안 진탕하면서 항온처리하였다. 이 혼합물을 원심분리하고 얻어지는 상청액(페리플라슴 단백질)을 Ni⁺⁺컬럼에 장입하였다. 제조자의 지시에 따라 이 컬럼으로부터 parA1 단백질을 정제하였다. parA1 추출물 중에 존재하는 단백질 농도는 브래드포드법으로 측정하였다.

니코티아나 타바컴 엘. 재배변종 KY14 세포 현탁 배양물은 급속 증식 단계 중에 최종 농도가 2 ㎍/㎖인 파라시티세인으로 처리하여 스트레스 응답 유전자를 유도하였다. 이와 함께 파라시티세인으로 처리하지 않은 현탁 세포 배양물은 대조군으로 제공하였다. 유인제를 첨가한 후 0 분, 30 분, 60 분 및 120 분이 경과한 후 서서히 진공 여과하여 세포를 수거하였다.

이와 같이 처리된 담배 세포와 미처리된 담배 세포로부터 총 RNA를 분리하고, 표적화된 차동 디스플레이 역전사효소 PCR(TDDRT-PCR)의 주형으로 사용하였다. 제1 가닥의 cDNA는 인비트로겐(미국 캘리포니아주 산디에고 소재) 제품인 cDNA 사이클 키트를 사용하여 만들었다. 이 제1 가닥의 cDNA를 PCR의 주형으로 사용하였다. PCR 반응은 어닐링 온도를 58 ℃로 설정한 것을 제외하고는 문헌[PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis, M., Gelfand, D., Sminsky, J. and White,T., eds. Academic Press Inc., San Diego, CA(1990)]에 기재된 바와 같은 일반적인 조건을 사용하여 실시하였다. PCR 프라이머는 FokinB(GTTGACTCCCTACCCTCTT) 및 RecalIV(GGTACTTAGGAAGTGTTACGGG)를 사용하였다. 도 1을 참조하라. PCR 생성물은 1%(w/v) 아가로스 겔에서 전기영동으로 분리하고 60 분간 처리된 배양물에서 얻어지는 염기쌍(bp)이 약 800개 이상인 생성물은 DE-81 페이퍼(와트만)로의 전기용출로 정제하였다. 이와 같이 정제된 PCR 생성물의 말단은 클리나우 폴리머라제로 평활말단화하고 pBluescript의 EcoRV 부위에 결찰시킨 뒤, 이.콜리 TB1을 형질전환시켰다.

앰피실린 내성의 TB1 콜로니 중에서 pBluescript 중에 ≥800 bp DNA 단편이 삽입된 것을 선별하였다. 이와 같은 1가지 삽입체의 서열을 Sequenase(등록상표명) 키트(미국 오하이오주 클리브랜드에 소재하는 유나이티드 스테이츠 바이오케미칼 코포레이션 제품) 또는 자동화된 형광계 시스템(Applied Biosystems, Foster City, CA)을 사용하여 문헌[Sanger et al.(1977) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:8073-8077]에 기재된 디데옥시뉴클레오티드 사슬 종결법으로 측정하였다. 벡터 중에 존재하는 삽입체 서열의 분석은 양 가닥 모두에 대하여 실시하였다. 이 삽입체를 함유하는 플라스미드는 pCDPK-1이라 표시하였다.

pCDPK-1 중에 존재하는 삽입체의 뉴클레오티드 서열은 도 2에 도시하고, 이로부터 추론되는 삽입체의 아미노산 서열은 도 3에 도시하였다. 그 다음 추론된 아미노산 서열을 GenBank(EMBL) 및 Swiss Prot 데이타베이스에 들어있는 식물 유전자의 아미노산 서열과 비교하였다. 글리신 맥스(Glycine max), 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 비그나 라디아타(Vigna radiata), 제아 메이스(Zea mays) 및 큐커비타 페포(Cucurbita pepo) 유래의 폴리펩티드를 비롯하여 식물의 CDPK 폴리펩티드와 상동성이 있는 것으로 관찰되었다.

BLASTP 프로그램과 BLOSUM62 채점 매트릭스를 사용하여 상기 폴리펩티드의 아미노 말단 부에서 세린/트레오닌 단백질 키나제 도메인과 상동성이 있는 2개의 영역과 폴리펩티드의 카르복시 말단 부에서 Ca⁺⁺결합 도메인과 상동성이 있는 4개의 영역을 확인하였다. 도 4는 도 3에 도시된 아미노산 서열과 대두 CDPK 아미노산 서열(Genbank 수탁 번호 M64987)을 비교한 것이다. 담배 칼슘 결합 부위의 아미노산 서열은 대두 CDPK 중의 대응 부위에 존재하는 아미노산 서열과 유사하였다. 하지만, 기타 다른 서열 부위에서는 유의적인 차이가 나타났다. 즉, 대두 CDPK와 CDPK-1 간의 총 서열 동일성은 약 78%인 것으로 나타났다.

BLASTN 프로그램을 사용하여 pCDPK-1 뉴클레오티드 서열과 각종 데이타 베이스에 있는 핵산 서열을 비교하였다. 기타 다른 식물의 CDPK 유전자의 뉴클레오티드 서열과 이로부터 암호된 폴리펩티드의 길이를 기초로 한 결과 pCDPK-1에 존재하는 핵산 삽입체는 5' CDPK-1 암호 서열의 약 560 bp와 3' CDPK-1 암호 서열의 약 130 bp가 결실된 것으로 추정되었다.

실시예 2

전길이 cDNA 클론의 분리

전길이의 클론을 얻기 위하여 유인제로 유도한 후 담배 세포로부터 제조한 폴리A+ RNA를 주형으로 하여 RACE(cDNA 말단의 신속 증폭 방법) 접근법을 실시하였다. 폴리A+ RNA는 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였다.

서열 GAC AAG GAC GGG AGT GGG TAT를 가진 프라이머(CDPK-1에 내재하는 프라이머 A)와 서열 GAC TCG AGT CGA CAT CGA TTT TTT TTT TTT TTT TT를 가진 프라이머(dT₁₇어뎁터-프라이머)를 사용하여 CDPK 암호 서열의 3' 말단을 증폭시켰다. 그 다음 문헌[Frohman, M. in PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, 상기 문헌 설명 참조, pp 28∼38]에 기재된 바와 같이 총 부피 3.5 ㎕ 중에 함유된 10X RTC 완충액 2 ㎕, RNasin(프로메가 바이오테크) 10 유니트, dT₁₇어뎁터-프라이머 0.5 ㎍ 및 AMV 역전사효소(라이프 사이언시스) 10 유니트 중에서 역전사효소 반응을 실시하였다. PCR 증폭 반응은 10X PCR 완충액 5 ㎕, DMSO 5 ㎕, 10X dNTP(각각 15 mM) 5 ㎕, H₂O 30 ㎕, 어뎁터-프라이머(25 pmol, GAC TCG AGT CGA CAT CG) 1 ㎕, 프라이머 A 1 ㎕ 및 cDNA 1 내지 5 ㎕ 중에서 실시하였다. 사이클 시간은 상기 Frohman 문헌에 기재된 바와 같이 설정하였다.

CDPK 암호 서열의 5' 말단은 dT₁₇어뎁터-프라이머 대신에 프라이머 B(AGG GGC TAC GTA GTA AGG ACT)를 10 pmol 사용하여 역전사를 실시함으로써 클로닝하였다. cDNA 생성물은 전술한 Frohman 문헌에 기재된 바와 같이 말단 전이효소와 dATP를 사용하여 신장시키고, 그 다음 전술한 바와 같이 dT₁₇어뎁터-프라이머 10 pmol, 어뎁터-프라이머 10 pmol 및 프라이머 C(ATT CTC AGG CTT AAG GTC CCT) 10 pmol을 사용하여 PCR 증폭시켰다. PCR은 표준 조건에 따라 실시하였다[Back et al.(1994) Arch.Biochem.Biophys. 315:523-532]. 증폭된 3' 및 5' 생성물은 평활말단으로 pBluescript SK(스트라타진)에 클로닝하고 통상적인 분자생물학 기법에 따라 pCDPK-1 삽입체와 결합시켜 담배 CDPK 암호 서열의 전길이 cDNA를 만들었다.

전길이 cDNA의 DNA 서열은 실시예 1에 기재된 바와 같이 디데옥시뉴클레오티드 사슬 종결 방법으로 분석하였다.

실시예 3

담배 현탁 배양시 CDPK 상동성 RNA의 유도

유인제에 대한 응답 반응으로 유전자 발현을 유도하기 위하여 pCDPK-1 중의 DNA 삽입체를 프로브로 사용하였다. 구체적으로, 니코티아나 타바컴 L. 재배변종 KY14 세포 현탁 배양물을 실시예 1에 기재된 바와 같이 0 시간, ½시간, 1 시간, 2 시간, 6 시간 및 12 시간 동안 파라시티세인으로 처리하였다. 총 RNA를 분리하여 1% 아가로스 겔에서 전기영동하였다. pCDPK-1 유래의 삽입체는 무작위 프라이밍 방법으로 방사능표지시키고 문헌[Sambrook, J. et al., 상기 문헌 설명 참조]에 기재된 바와 같이 겔에서 분리한 RNA에 하이브리드화하였다. 유인제로 처리하기 이전에는 CDPK-1에 하이브리드하는 mRNA는 관찰되지 않았고, 유인제로 처리한 후에는 ½시간, 1 시간 및 2 시간이 경과한 후 쉽게 관찰되었다. 유인제로 처리한 후 6 시간과 12 시간이 경과한 후에는 CDPK-1에 하이브리드하는 mRNA가 관찰되지 않았는데, 이것은 CDPK-1 유전자의 발현률이 약 6 시간 경과 후 검측할 수 없는 수준으로 감소한다는 것을 시사한다.

실시예 4

키메라 CDPK 유전자의 작제

CDPK 유전자는 도 6에 기재된 대두 CDPK의 아미노산 1 내지 156을 암호하는 화학적으로 합성된 DNA, 도 6에 기재된 대두 CDPK의 아미노산 465 내지 508을 암호하는 화학적으로 합성된 DNA 및 pCDPK-1의 CDPK 삽입체로 작제하였다. 이 3가지 DNA를 통상적인 분자 생물학 기법에 따라 결찰시켜, 아미노 말단부에 위치한 대두 CDPK의 아미노산 1 내지 156, 그 다음 프레임에 맞게 융합된 담배 CDPK(도 3)의 아미노산 1 내지 307, 이어서 프레임에 맞게 융합된 카르복시 말단에 위치한 대두 CDPK의 아미노산 465 내지 508을 가진 키메라 CDPK 암호 서열을 얻었다.

이 키메라 암호 서열을 최소 35S 및 EAS4 유도성 조절 인자를 함유하는 아그로박테리움 이중 벡터에 센스 배향으로 삽입하였다. 조절 인자와 프로모터 및 암호 서열이 작동가능하게 결찰되었는지는 접합부의 DNA 서열을 분석하고 돌연변이 식물에서 발현되는지를 관찰하여 확인하였다.

실시예 5

돌연변이 식물 생성

변형된 아그로박테리움 튜머페이션스 형질전환법을 사용하여 형질전환된 식물 세포주를 얻었다. 먼저, 실시예 3에 기재된 전길이 CDPK cDNA 또는 실시예 4에 기재된 키메라 CDPK 암호 서열을 포함하는 핵산 작제물을 제조하였다. 이와 같이 식물에 도입할 서열을 함유하는 재조합 작제물은 이.콜리 TB1(pRK2013)과의 삼종 양친 교배를 통해 에이.튜머페이션스 균주 GV3850으로 전이시켰다. 여러 성장 단계에 있는 N.타바컴의 잎을 1 ㎠ 조각으로 절단하고 아그로박테리움 세포 현탁액(약 10⁴내지 10⁵세포/㎖)에 침지하였다. 3 내지 10 분 후, 잎 단편을 멸균수로 세척하여 과량의 박테리아 세포를 제거하고 처리된 잎 단편 상에서 박테리아가 과잉 증식하는 문제점을 감소시켰다. 짧은 건조 시간(30 내지 60 초) 후, 처리된 잎 단편을 항생제를 첨가하지 않은 식물 조직 배양 배지의 표면에 접종하여 조직의 감염과 박테리아에서 식물 조직으로 DNA의 전이를 촉진시켰다. 식물 조직 배양 배지는 1 리터 당 뮤라시지 및 스쿠그(Murashige and Skoog) 기본 염 혼합물(미국 미주리주 세인트 루이스에 소재하는 시그마 케미컬 컴패니 제품) 4.31 g, 벤질아미노퓨린(1 N NaOH 중에 용해) 2.5 ㎎, 0.1 ㎎/㎖ 인돌아세트산 용액 10 ㎖, 슈크로스 30g, 감보그(Gamborg) 비타민 용액(미국 미주리주 세인트 루이스에 소재하는 시그마 케미컬 컴패니 제품) 2 ㎖ 및 아가 8 g을 함유한다. pH는 NaOH를 사용하여 pH 5.5 내지 5.9로 조정하였다. 2 일 경과 후, 잎 단편을 가나마이신 300 ㎍/㎖과 메폭신(미국 뉴저지주 레이웨이에 소재하는 머크 제품) 500 ㎍/㎖을 함유하는 식물 조직 배양 배지로 전이시켰다. 가나마이신은 형질전환된 식물 조직의 선별용이며 메폭신은 아그로박테리움 선별 제거용이다.

병원균 유도성 조절 인자를 사용하는 경우에는 형질전환 절차 동안 외식 조직을 아그로박테리움 세포에 최소한으로 노출시키는 것이 바람직한데, 그 이유는 아그로박테리움 세포 자신이 식물 세포로 도입된 후 상기 조절 인자를 유도할 수 있기 때문이다. 따라서, 유도성 전사 조절 인자의 조절 제어하에 세포 자살 유전자를 함유하는 DNA를 도입시키는 바이오리스틱 기법이 상기 조절 인자의 제어하에 암호 서열을 유도할 수 있는 아그로박테리움 세포나 진균 세포벽 분해 효소(전기침투시 원형질 형성에 필수적임)를 사용하지 않기 때문에 대체 형질전환법으로 유용하다.

이와 같이 돌연변이된 식물은 문헌[Horsch et al.(1985) Science 227:1229-1231]에 대부분 기재된 바와 같이 재생시켰다.

실시예 6

돌연변이 담배에 존재하는 키메라 CDPK 유전자의 유인제 유도성 발현 및 병원균 유도성 발현

실시예 7에 기재된 CDPK 작제물의 활성은 유인제 또는 병원균으로 처리한 돌연변이 담배 식물 중에서 측정하였다. 대조군으로, 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV) 35S 프로모터의 조절 하에 GUS 리포터 유전자를 발현하는 돌연변이 담배 식물을 만들었다. 재생된 돌연변이 담배 식물에서 얻은 F₁종자는 가나마이신 100 ㎎/L을 함유하는 배지 상에서 발아시켰다. 생성되는 가나마이신 내성의 식물을 이어서 토양으로 이식하여 온실에서 성장시켰다. 식물의 절반을 가지고 유도 조건, 예컨대 돌연변이 식물에 유인제 또는 셀룰라제를 세포내 투여하여 CDPK 유전자가 발현되는지를 시험하였다. 유인제 또는 셀룰라제는 기계적 피페팅기로 투여하였다. 대조군으로 나머지 식물을 셀룰라제 또는 유인제를 첨가하지 않은 용액으로 모의처리하였다. 일부 실험에서는 메스로 담배 조직에 상처를 내어 유도 화합물에 노출되기 쉽게 하였다.

실시예 7

CDPK 상동성 서열의 확인

담배 잎의 게놈 DNA는 문헌[Murray and Thompson(1980) Nucleic Acids Research 8:4321∼4325]에 기재된 바와 같이 분리하였다. 일정량을 바람직한 제한 효소로 분해한 후 분해된 DNA 시료를 0.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동하고 크기별로 분리된 DNA를 나일론 막으로 전이시켰다. 이 DNA 블롯을, 무작위 프라이머법으로 방사능표지한 실시예 1에 기재된 900 bp CDPK cDNA 삽입체와 하이브리드하였다. 하이브리드화는 0.25 M 인산 나트륨 완충액(pH 8.0), 0.7% SDS, 1% 소혈청 알부민, 1mM EDTA 중에서 60 ℃하에 실시하였다. 그 다음 블롯을 2X SSC, 0.1% SDS로 45 ℃에서 2회 세척하고 그 다음 0.2X SSC, 0.1% SDS(1X SSC는 0.15 M NaCl, 0.015 M 구연산나트륨 용액, pH 7.0이다)로 2회 세척하였다. 막에 나타나는 각 밴드의 상대적인 하이브리드화 강도는 영상 농도계(MilliGen/Biosearch, 미국 미시간주 앤아버 소재)를 사용하여 자동방사능기록기로 측정하였다.

담배 CDPK와 상동성인 서열을 가진 폴리뉴클레오티드를 확인하고 이 서열의 게놈당 겉보기 복제수를 측정하기 위하여 여러 식물 종에서 분리한 표적 DNA와 담배 CDPK 프로브를 사용하여 서던 하이브리드화 실험을 실시하였다. 각 식물 종의 제한효소 분해된 게놈 DNA는 아가로스 겔 전기영동(0.8% 아가로스)으로 분리하고, 그 다음 Hybond-N⁺막(미국 일리노이주 알링톤 하이츠에 소재하는 아머샴 코포레이션 제품)으로 전이시켰다. pCDPK-1의 암호 서열을 함유하는 방사능표지된 프로브 단편은 문헌[Sambrook et al., (1989) 상기 문헌 참조]에 대부분 기재된 바와 같이 분해된 게놈 DNA에 하이브리드화하였다. 이 때 중간 엄중도 조건을 사용하였다(65 ℃ 하에 4X SSC 중에서 하이브리드화하고 마지막에 65 ℃ 에서 1X SSC로 세척).

대안적으로 PCR은 pCDPK-1 암호 서열의 고도 보존 영역에서 유도된 프라이머와 주형인 표적 게놈 DNA를 사용하여 실시하였다.

실시예 8

CDPK 암호 서열에 인접하는 게놈 DNA

실시예 1에 기재된 cDNA 클론을, γEMBL3 벡터(미국 캘리포니아주 팔로알토에 소재하는 클론테크 제품) 중의 N.타바컴 재배변종 NK326 게놈 라이브러리를 선별하기 위한 하이브리드화 프로브로 사용하였다. 실시예 1에 기재된 담배 CDPK와 서열 동일성이 70% 이상인 게놈 DNA 클론을 통상적인 서브클로닝 방법으로 확인하였다. 클로닝된 핵산 삽입체의 뉴클레오티드 서열은 통상적인 DNA 서열분석 방법으로 분석하였다.

게놈 DNA 클론 중 1개의 클론이 실시예 1에 기재된 담배 CDPK 암호 서열을 포함하는 전길이 암호 서열을 갖고 있었다. 이 클론은 또한 실시예 1에 기재된 암호 서열의 5'쪽에 접한 DNA를 함유하고 있었다. 이 클론에 존재하는 5' 인접 DNA의 뉴클레오티드 서열을 조사한 결과 추정상의 ATG 개시 코돈과 이 개시 코돈의 상류 쪽으로 이 개시 코돈으로부터 약 1000 bp 이내에 1개 이상의 추정상 조절 인자를 포함하는 것으로 관찰되었다.

기타 구체예

이상 상세한 설명을 통해 본 발명을 설명하였지만, 상기 설명은 첨부되는 청구의 범위를 통해 한정되는 본 발명의 영역을 제한하기 위한 것이 아니라 단지 예를 들어 설명한 것이다. 따라서, 다음 청구의 범위 영역 내에서 기타 다른 양태, 장점 및 변형이 가능하다.

〈110〉 UNIVERSITY OF KENTUCKY RESEARCH FOUNDATION

〈120〉 PROTEIN KINASES AND USES THEREOF

〈130〉 2

〈150〉 US 08/889,655

〈151〉 1997-07-08

〈160〉 11

〈170〉 KOPATIN 1.0

〈210〉 1

〈211〉 921

〈212〉 DNA

〈213〉 Tabacco cv.

〈400〉 1

agggacctta agcctgagaa tttccttttc agtgccgacg acttcatggt aaagagtaag 60

gccaccgact tcgggcttag tgtattctat aagcctgggc aaaagttcac ggacatagta 120

gggagtcctt actacgtagc ccctgaggta cttaggaagt gttacgggcc tgggagtgac 180

gtatggagtg ccggggtaat actttacacc cttctttgtg gggcccctcc tttcatggcc 240

gacagtgagc ctggggtagc ccttcaaata cttcatgggg accttgactt caagagtgac 300

ccttggccta ccataagtga gagtgccaag gaccttataa ggaagatgct tgagcaagac 360

cctaagagga ggcttaccgc ccatgaggta cttaggcatc cttggatagt agacgagaat 420

atagcccctg acaagcctct tgggcctgcc gtacttagta ggcttaagca attcagtgcc 480

atgaataaga taaagaagat ggcccttagg gtaatagccg agaggcttag tgaggaggag 540

atagtagggc ttaaggagat gttcaagatg gacaccgaca atagtgggac cgtaaccttc 600

ttccatctta agcaagggct taagagggta gggagtcaac ttggggagag tgagataaag 660

gaccttatgg acgccgccga cgtagacaat agtgggacca tagactatgg ggagttcgta 720

accgccgcca tgcatcttaa taagataaag agggaggacc atcttgtaag tgccttcagt 780

tatcatgaca aggacgggag tgggtatata gaggtagacg agcttaggca agcccttgag 840

gagttcgggg tacctgacac cagtcttgag gacatgataa aggaggtaga caccgacaat 900

gatgggcaaa tagattatgg g 921

〈210〉 2

〈211〉 307

〈212〉 PRT

〈213〉 Tabacco cv.

〈400〉 2

Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Phe Leu Phe Ser Ala Asp Asp Phe Met

1 5 10 15

Val Lys Ser Lys Ala Thr Asp Phe Gly Leu Ser Val Phe Tyr Lys Pro

20 25 30

Gly Gln Lys Phe Thr Asp Ile Val Gly Ser Pro Tyr Tyr Val Ala Pro

35 40 45

Glu Val Leu Arg Lys Cys Tyr Gly Pro Gly Ser Asp Val Trp Ser Ala

50 55 60

Gly Val Ile Leu Tyr Thr Leu Leu Cys Gly Ala Pro Pro Phe Met Ala

65 70 75 80

Asp Ser Glu Pro Gly Val Ala Leu Gln Ile Leu His Gly Asp Leu Asp

85 90 95

Phe Lys Ser Asp Pro Trp Pro Thr Ile Ser Glu Ser Ala Lys Asp Leu

100 105 110

Ile Arg Lys Met Leu Glu Gln Asp Pro Lys Arg Arg Leu Thr Ala His

115 120 125

Glu Val Leu Arg His Pro Trp Ile Val Asp Glu Asn Ile Ala Pro Asp

130 135 140

Lys Pro Leu Gly Pro Ala Val Leu Ser Arg Leu Lys Gln Phe Ser Ala

145 150 155 160

Met Asn Lys Ile Lys Lys Met Ala Leu Arg Val Ile Ala Glu Arg Leu

165 170 175

Ser Glu Glu Glu Ile Val Gly Leu Lys Glu Met Phe Lys Met Asp Thr

180 185 190

Asp Asn Ser Gly Thr Val Thr Phe Phe His Leu Lys Gln Gly Leu Lys

195 200 205

Arg Val Gly Ser Gln Leu Gly Glu Ser Glu Ile Lys Asp Leu Met Asp

210 215 220

Ala Ala Asp Val Asp Asn Ser Gly Thr Ile Asp Tyr Gly Glu Phe Val

225 230 235 240

Thr Ala Ala Met His Leu Asn Lys Ile Lys Arg Glu Asp His Leu Val

245 250 255

Ser Ala Phe Ser Tyr His Asp Lys Asp Gly Ser Gly Tyr Ile Glu Val

260 265 270

Asp Glu Leu Arg Gln Ala Leu Glu Glu Phe Gly Val Pro Asp Thr Ser

275 280 285

Leu Glu Asp Met Ile Lys Glu Val Asp Thr Asp Asn Asp Gly Gln Ile

290 295 300

Asp Tyr Gly

305

〈210〉 3

〈211〉 22

〈212〉 DNA

〈213〉 Tabacco cv.

〈400〉 3

ggtacttagg aagtgttacg gg 22

〈210〉 4

〈211〉 19

〈212〉 DNA

〈213〉 Tabacco cv.

〈400〉 4

gttgactccc taccctctt 19

〈210〉 5

〈211〉 512

〈212〉 PRT

〈213〉 Tabacco cv.

〈400〉 5

Met Ala Ala Lys Ser Ser Ser Ser Ser Thr Thr Thr Asn Val Val Thr

1 5 10 15

Leu Lys Ala Ala Trp Val Leu Pro Gln Arg Thr Gln Asn Ile Arg Glu

20 25 30

Val Tyr Glu Val Gly Arg Lys Leu Gly Gln Gly Gln Phe Gly Thr Thr

35 40 45

Phe Glu Cys Thr Arg Arg Ala Ser Gly Gly Lys Phe Ala Cys Lys Ser

50 55 60

Ile Pro Lys Arg Lys Leu Leu Cys Lys Glu Asp Tyr Glu Asp Val Trp

65 70 75 80

Arg Glu Ile Gln Ile Met His His Leu Ser Glu His Ala Asn Val Val

85 90 95

Arg Ile Glu Gly Thr Tyr Glu Asp Ser Thr Ala Val His Leu Val Met

100 105 110

Glu Leu Cys Glu Gly Gly Glu Leu Phe Asp Arg Ile Val Gln Lys Gly

115 120 125

His Tyr Ser Glu Arg Gln Ala Ala Arg Leu Ile Lys Thr Ile Val Glu

130 135 140

Val Val Glu Ala Cys His Ser Leu Gly Val Met His Arg Asp Leu Lys

145 150 155 160

Pro Glu Asn Phe Leu Phe Asp Thr Ile Asp Glu Asp Ala Lys Leu Lys

165 170 175

Ala Thr Asp Phe Gly Leu Ser Val Phe Tyr Lys Pro Gly Glu Ser Phe

180 185 190

Cys Asp Val Val Gly Ser Pro Tyr Tyr Val Ala Pro Glu Val Leu Arg

195 200 205

Lys Leu Tyr Gly Pro Glu Ser Asp Val Trp Ser Ala Gly Val Ile Leu

210 215 220

Tyr Ile Leu Leu Ser Gly Val Pro Pro Phe Trp Ala Glu Ser Glu Pro

225 230 235 240

Gly Ile Phe Arg Gln Ile Leu Leu Gly Lys Leu Asp Phe His Ser Glu

245 250 255

Pro Trp Pro Ser Ile Ser Asp Ser Ala Lys Asp Leu Ile Arg Lys Met

260 265 270

Leu Asp Gln Asn Pro Lys Thr Arg Leu Thr Ala His Glu Val Leu Arg

275 280 285

His Pro Trp Ile Val Asp Asp Asn Ile Ala Pro Asp Lys Pro Leu Asp

290 295 300

Ser Ala Val Leu Ser Arg Leu Lys Gln Phe Ser Ala Met Asn Lys Leu

305 310 315 320

Lys Lys Met Ala Leu Arg Val Ile Ala Glu Arg Leu Ser Glu Glu Glu

325 330 335

Ile Gly Gly Leu Lys Glu Leu Phe Lys Met Ile Asp Thr Asp Asn Ser

340 345 350

Gly Thr Ile Thr Phe Asp Glu Leu Lys Asp Gly Leu Lys Asp Gly Leu

355 360 365

Lys Arg Val Gly Ser Glu Leu Met Glu Ser Glu Ile Lys Asp Leu Met

370 375 380

Asp Ala Ala Asp Ile Asp Lys Ser Gly Thr Ile Asp Tyr Gly Glu Phe

385 390 395 400

Ile Ala Ala Thr Val His Leu Asn Lys Leu Glu Arg Glu Glu Asn Leu

405 410 415

Val Ser Ala Phe Ser Tyr Phe Asp Lys Asp Gly Ser Gly Tyr Ile Thr

420 425 430

Leu Asp Glu Ile Gln Gln Ala Cys Lys Asp Phe Gly Leu Asp Asp Ile

435 440 445

His Ile Asp Asp Met Ile Lys Glu Ile Asp Gln Asp Asn Asp Gly Gln

450 455 460

Ile Asp Tyr Gly Glu Phe Ala Ala Met Met Arg Lys Gly Asn Gly Gly

465 470 475 480

Ile Gly Arg Arg Thr Met Arg Lys Thr Leu Asn Leu Arg Asp Ala Leu

485 490 495

Gly Leu Val Asp Asn Gly Ser Asn Gln Val Ile Glu Gly Tyr Phe Lys

500 505 510

〈210〉 6

〈211〉 21

〈212〉 DNA

〈213〉 Tabacco cv.

〈400〉 6

gacaaggacg ggagtgggta t 21

〈210〉 7

〈211〉 35

〈212〉 DNA

〈213〉 Tabacco cv.

〈400〉 7

gactcgagtc gacatcgatt tttttttttt ttttt 35

〈210〉 8

〈211〉 17

〈212〉 DNA

〈213〉 Tabacco cv.

〈400〉 8

gactcgagtc gacatcg 17

〈210〉 9

〈211〉 21

〈212〉 DNA

〈213〉 Tabacco cv.

〈400〉 9

aggggctacg tagtaaggac t 21

〈210〉 10

〈211〉 21

〈212〉 DNA

〈213〉 Tabacco cv.

〈400〉 10

attctcaggc ttaaggtccc t 21

〈210〉 11

〈211〉 308

〈212〉 PRT

〈213〉 Tabacco cv.

〈400〉 11

Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Phe Leu Phe Ser Ala Asp Asp Phe Met

1 5 10 15

Val Lys Ser Lys Ala Thr Asp Phe Gly Leu Ser Val Phe Tyr Lys Pro

20 25 30

Gly Gln Lys Phe Thr Asp Ile Val Gly Ser Pro Tyr Tyr Val Ala Pro

35 40 45

Glu Val Leu Arg Lys Cys Tyr Gly Pro Gly Ser Asp Val Trp Ser Ala

50 55 60

Gly Val Ile Leu Tyr Thr Leu Leu Cys Gly Ala Pro Pro Phe Met Ala

65 70 75 80

Asp Ser Glu Pro Gly Val Ala Leu Gln Ile Leu His Gly Asp Leu Asp

85 90 95

Phe Lys Ser Asp Pro Trp Pro Thr Ile Ser Glu Ser Ala Lys Asp Leu

100 105 110

Ile Arg Lys Met Leu Glu Gln Asp Pro Lys Arg Arg Leu Thr Ala His

115 120 125

Glu Val Leu Arg His Pro Trp Ile Val Asp Glu Asn Ile Ala Pro Asp

130 135 140

Lys Pro Leu Gly Pro Ala Val Leu Ser Arg Leu Lys Gln Phe Ser Ala

145 150 155 160

Met Asn Lys Ile Lys Lys Met Ala Leu Arg Val Ile Ala Glu Arg Leu

165 170 175

Ser Glu Glu Glu Ile Val Gly Leu Lys Glu Met Phe Lys Met Ile Asp

180 185 190

Thr Asp Asn Ser Gly Thr Val Thr Phe Phe His Leu Lys Asp Gly Leu

195 200 205

Lys Arg Val Gly Ser Gln Leu Gly Glu Ser Glu Ile Lys Asp Leu Met

210 215 220

Asp Ala Ala Asp Val Asp Asn Ser Gly Thr Ile Asp Tyr Gly Glu Phe

225 230 235 240

Val Thr Ala Ala Met His Leu Asn Lys Ile Lys Arg Glu Asp His Leu

245 250 255

Val Ser Ala Phe Ser Tyr His Asp Lys Asp Gly Ser Gly Tyr Ile Glu

260 265 270

Val Asp Glu Ile Arg Gln Ala Leu Glu Glu Phe Gly Val Pro Asp Thr

275 280 285

Ser Leu Glu Asp Met Ile Lys Glu Val Asp Thr Asp Asn Asp Gly Gln

290 295 300

Ile Asp Tyr Gly

305

Claims

a) 서열 번호 1에 기재된 뉴클레오티드 서열,

b) 서열 번호 1에 기재된 서열의 RNA 유사체,

c) 상기 a) 또는 b)에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는

d) 뉴클레오티드 길이가 20개 이상이고 엄중 조건하에서 도 3에 도시된 폴리펩티드를 암호하는 게놈 DNA에 하이브리드하는 상기 a), b) 또는 c)의 핵산 단편을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 도 2에 도시된 뉴클레오티드 1 내지 170을 포함하는 것이 특징인 폴리뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 도 2에 도시된 뉴클레오티드 160 내지 560을 포함하는 것이 특징인 폴리뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 도 2에 도시된 뉴클레오티드 550 내지 920을 포함하는 것이 특징인 폴리뉴클레오티드.
제1항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 작제물.
제5항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 결합된 조절 인자를 더 포함하는 것이 특징인 핵산 작제물.
제6항에 있어서, 조절 인자가 유도성 조절 인자인 것이 특징인 핵산 작제물.
제7항에 있어서, 조절 인자가 식물 병원균에 대한 응답 반응으로 유도되는 것이 특징인 핵산 작제물.
제1항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 작제물을 함유하는 돌연변이 식물.
제9항에 있어서, 핵산 작제물이 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 결합된 조절 인자를 더 포함하는 것이 특징인 돌연변이 식물.
제10항에 있어서, 조절 인자가 유도성 조절 인자인 것이 특징인 돌연변이 식물.
제11항에 있어서, 조절 인자가 식물 병원균에 대한 응답 반응으로 유도되는 것이 특징인 돌연변이 식물.
제11항에 있어서, 조절 인자가 유인제에 대한 응답 반응으로 유도되는 것이 특징인 돌연변이 식물.
제9항에 있어서, 식물이 쌍자엽 식물인 것이 특징인 돌연변이 식물.
제14항에 있어서, 식물이 솔라나시에(Solanaceae) 과의 구성원인 것이 특징인 돌연변이 식물.
제15항에 있어서, 식물이 니코티아나(Nicotiana) 식물인 것이 특징인 돌연변이 식물.
제16항에 있어서, 식물이 니코티아나 타바컴(Nicotiana tabacum)인 것이 특징인 돌연변이 식물.
아미노산 약 250개 내지 약 550개를 가진 폴리펩티드를 발현하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 돌연변이 식물로서, 상기 폴리펩티드가 도 3에 도시된 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것이 특징인 돌연변이 식물.
제18항에 있어서, 폴리펩티드가 도 3에 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것이 특징인 돌연변이 식물.
제18항에 있어서, 식물이 쌍자엽 식물인 것이 특징인 돌연변이 식물.
제20항에 있어서, 식물이 솔라나시에 과의 구성원인 것이 특징인 돌연변이 식물.
제1항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 식물 유래의 DNA 또는 RNA에 하이브리드화하는 단계를 포함하는 것이 특징인 폴리뉴클레오티드의 사용 방법.
제22항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드와 서열 동일성이 약 70% 이상인 식물 DNA 또는 RNA의 분절을 확인하는 단계를 더 포함하는 것이 특징인 사용 방법.
제23항에 있어서, 상기DNA 또는 RNA 분절 중 최소한 일부를 클로닝하는 단계를 더 포함하는 것이 특징인 사용 방법.
제24항에 있어서, 클로닝된 일부가 서열 동일성이 70% 이상인 분절에 인접한 DNA를 더 포함하는 것이 특징인 사용 방법.
(a) 제5항에 기재된 핵산 작제물을 식물 세포로 도입시키는 단계, 및

(b) 이 식물 세포로부터 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물을 생장시키는 단계를 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드의 발현으로 식물의 내병성이 변화되는 것이 특징인 식물의 내병성을 변화시키는 방법.
제26항에 있어서, 핵산 작제물이 상기 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 결합된 유도성 조절 인자를 더 포함하고 발현이 그 조절 인자에 의해 조절되는 것이 특징인 방법.
제27항에 있어서, 발현이 유인제나 식물 병원균에 식물을 노출시켰을때 조절 인자에 의해 유도되는 것이 특징인 방법.
약 250개 내지 약 550개의 아미노산을 가지며 도 3에 도시된 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
제29항에 있어서, 폴리펩티드가 도 3에 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것이 특징인 폴리펩티드.